Medicine

संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए इंट्रापल्मोनरी धमनी और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं का अलगाव

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63686

Kittiwoot To-on¹, Usana Chatturong¹, Teerapap Panklai², Iyapa Palang¹, Anjaree Inchan¹, Sutthinee Wisutthathum³, Tamkeen Urooj Paracha⁴, Phapada Apaikawee¹, Krongkarn Chootip¹

¹Department of Physiology, Faculty of Medical Science and Center of Excellence for Innovation in Chemistry, Naresuan University, ²Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, ³Cosmetics and Natural Products Research Center, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Naresuan University, ⁴Snyder Institute for Chronic Diseases, Airways Inflammation Research Group, Department of Physiology and Pharmacology, University of Calgary

Summary

धमनी फुफ्फुसीय परिसंचरण की संवहनी प्रतिक्रियाओं को इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) का उपयोग करके खोजा जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में आईपीए के अलगाव और शारीरिक उत्तेजनाओं के जवाब में वैसोरलैक्सेशन की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया गया है।

Abstract

चूहे के फेफड़ों से अलग इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) का उपयोग वाहिकासंकीर्णन और वासोरेक्सेशन के अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। आईपीए और वीएसएमसी को अलग करने के बाद, तंत्रिका संकेतों, हार्मोन, साइटोकिन्स आदि जैसे बाहरी कारकों की अनुपस्थिति में शारीरिक और रोग संबंधी स्थितियों में संवहनी प्रतिक्रियाओं की विशेषताओं का आकलन किया जा सकता है। इस प्रकार, आईपीए और वीएसएमसी विभिन्न प्रयोगात्मक जांचों के साथ-साथ संवहनी शरीर विज्ञान / पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट मॉडल के रूप में काम करते हैं, जैसे कि फार्माकोलॉजिकल एजेंटों द्वारा मॉड्यूलेशन, पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण, कैल्शियम इमेजिंग, आदि। यहां, हमने अंग स्नान सेटअप में संवहनी प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए आईपीए को अलग करने के लिए एक तकनीक का उपयोग किया है। आईपीए खंडों को इंट्राल्यूमिनल तारों के माध्यम से अंग स्नान कक्ष पर रखा गया था और विभिन्न औषधीय एजेंटों द्वारा उत्तेजित किया गया था। आईपीए संवहनी टोन (यानी, वाहिकासंकीर्णन और वासोरेक्सेशन) में परिवर्तन, एक आइसोमेट्रिक बल ट्रांसड्यूसर और शारीरिक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग करके दर्ज किए गए थे। हमने कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल लागू किए, जिन्हें फाइटोकेमिकल या सिंथेटिक दवाओं की औषधीय गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए वासोरेक्सेशन / वाहिकासंकीर्णन के तंत्र की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का उपयोग फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न बीमारियों को संशोधित करने में दवाओं की भूमिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए भी किया जा सकता है। आईपीए मॉडल हमें एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र की जांच करने की अनुमति देता है, जो दवाओं के फार्माकोडायनामिक मापदंडों का आकलन करने में महत्वपूर्ण है।

Introduction

फुफ्फुसीय वाहिका एक निम्न दबाव संवहनी प्रणाली है जिसमें मुख्य कार्य फेफड़ों के गैस विनिमय क्षेत्र में ऑक्सीजन रहित रक्त पहुंचाना है। फेफड़ों में फुफ्फुसीय धमनियों को ब्रोन्कियल पेड़ के समानांतर शाखाओं में व्यवस्थित किया जाता है, अंततः केशिकाओं का एक व्यापक नेटवर्क बनता है जो कई एल्वियोली पर निरंतर होता है और अंत में, वेन्यूल्स और नसों में एक साथ आता है। फुफ्फुसीय धमनी की संवहनी टोन को कई कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसमें एंडोथेलियम और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) ¹ के बीच बातचीत शामिल होती है।

इस अध्ययन में, हम इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) के एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र वासोरेक्सेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। एंडोथेलियम-निर्भर वैसोरलैक्सेशन के संबंध में, एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर होने वाले विभिन्न तंत्र इंट्रासेल्युलर सीए^{2 +} एकाग्रता (जैसे, एसिटाइलकोलाइन [एसीएच] मस्केरिनिक रिसेप्टर [एम 3] के साथ बांधता है) को बढ़ा सकता है, जिससे नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ), प्रोस्टासाइक्लिन (पीजीएल₂) और एंडोथेलियम-व्युत्पन्न हाइपरपोलराइज़िंग फैक्टर (ईडीएचएफ) का गठन होता है (चित्रा 1)। ). एनओ एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (ईएनओएस) ² द्वारा एल-आर्जिनिन से संश्लेषित मुख्य एंडोथेलियम-व्युत्पन्न आराम कारक है, जो तब एंडोथेलियल कोशिकाओं से वीएसएमसी (चित्रा 1) में विघटित हो जाता है और घुलनशील गुआनिल साइक्लेज (एसजीसी) एंजाइम को उत्तेजित करता है; यह एंजाइम ग्वानोसिन ट्राइफॉस्फेट (जीटीपी) को चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीजीएमपी) में बदल देता है, जो प्रोटीन काइनेज जी (पीकेजी) को सक्रिय करता है और साइटोसोलिक सीए^{2 +} स्तर को कम करता है, इस प्रकार वासोरेक्सेशन (चित्रा 1) का कारण बनता है। पीजीएल_{2 को} साइक्लो-ऑक्सीजनेज (सीओएक्स) मार्ग ^3,4 के माध्यम से एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित किया जाता है। यह वीएसएमसी पर प्रोस्टासाइक्लिन रिसेप्टर (आईपी) के साथ बांधता है और एडेनिल साइक्लेज (एसी) एंजाइम को उत्तेजित करता है, जो तब एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) को चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएमपी) में परिवर्तित करता है (चित्रा 1)^3,4)। सीएमपी प्रोटीन काइनेज ए (पीकेए) को सक्रिय करता है, साइटोसोलिक सीए^{2 +} के स्तर को कम करता है और वासोरेक्सेशन⁵ (चित्रा 1) का कारण बनता है। ईडीएचएफ मार्ग विभिन्न एंडोथेलियल मध्यस्थों और विद्युत घटनाओं के माध्यम से एंडोथेलियम-निर्भर वैसोरेक्सेशन में भी भाग लेता है। ईडीएचएफ मार्ग की सक्रियता वीएसएमसी के हाइपरपोलराइजेशन की ओर ले जाती है, इस प्रकार वोल्टेज संचालित सीए^{2 +} चैनल (वीओसी) को बंद कर देती है, इंट्रासेल्युलर सीए^{2 +} स्तर को कम करती है, और वैसोरलैक्सेशन⁶ को प्रेरित करती है। एंडोथेलियम-स्वतंत्र वैसोरलैक्सेशन कई तंत्रों के माध्यम से सीधे वीएसएमसी पर होता है, जैसे कि इंट्रासेल्युलर सीए^{2 +} स्तर में कमी, मायोसिन लाइट चेन किनेज (एमएलसीके) का निषेध, मायोसिन लाइट चेन फॉस्फेट (एमएलसीपी) की सक्रियता, और वीएसएमसी की सिकुड़ा हुआ मशीनरी के लिए सीए^{2 +} संवेदनशीलता में कमी। इस अध्ययन में, हम विभिन्न के ⁺ चैनलों के खुलने, वीओसी की नाकाबंदी और सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम⁷ से सीए^{2 +} रिलीज के निषेध के कारण वासोरेक्सेशन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिससे इंट्रासेल्युलर सीए 2 + स्तरों में कमी आती है, इस प्रकार^{क्रमशः} वीएसएमसी मायोसिन प्रकाश श्रृंखला फॉस्फोराइलेशन और मायोसिन-एक्टिन बाइंडिंग या क्रॉस-ब्रिज गठन कम हो जाता है। अंततः वासोरेक्सेशन के परिणामस्वरूप।

पृथक आईपीए में वाहिकासंकीर्णन और वासोरेलेक्सेशन माप का मूल्यांकन करने की तकनीक कृन्तकों के लिए अच्छी तरह से स्थापित है, लेकिन प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के आधार पर डेटा भिन्न होता है। वर्तमान अध्ययन में विट्रो में चूहे आईपीए तैयारी की संवहनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधि का वर्णन किया गया है, जो विवो में संवहनी प्रतिक्रिया को संशोधित करने वाले बाहरी कारकों की अनुपस्थिति में बनाया गया था, जैसे तंत्रिका संकेत, हार्मोन, साइटोकिन्स, रक्तचाप, आदि।

हमने आईपीए की संवहनी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में पौधे के अर्क का उपयोग करके कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को नियोजित किया। पौधे के अर्क द्वारा प्रेरित एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र वैसोरलैक्सेशन के तंत्र की पहचान करने के लिए विभिन्न ब्लॉकर्स (चित्रा 1) का उपयोग किया गया था। फिर भी, विभिन्न फुफ्फुसीय विकृति के उपचार के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी दवा, अर्क या फाइटोकेमिकल्स के लिए आईपीए की संवहनी प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन में किए गए प्रयोगों को वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नारेसुआन विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति (एनयूएसीयूसी), प्रोटोकॉल संख्या एनयू-एई 620921 की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. शारीरिक समाधानों की संरचना

अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए आसुत जल में रसायनों को घोलकर क्रेब्स समाधान तैयार करें: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH₂PO₄, 0.5 mM NaHPO₄, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂, और 11 mM ग्लूकोज⁸। समाधान के पीएच को 1 एम एनएओएच के साथ 7.3 पर समायोजित करें और उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
चरण 1.1 में उल्लिखित के समान ठंडा क्रेब्स समाधान तैयार करें। आईपीए के अलगाव माध्यम के रूप में उपयोग के लिए, जैसा कि चरण 2 में वर्णित है।

2. इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) का अलगाव

सोडियम थियोपेंटल (100 मिलीग्राम / ^{किग्रा) के} इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ 8 सप्ताह के नर विस्टार चूहों को एनेस्थेटाइज करें। चूहों को उनके पैरों पर क्लैंप का उपयोग करके गहरी नींद में दर्दनाक उत्तेजनाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रिया के लिए जांचें, फिर सुनिश्चित करें कि चूहों को चरण 2.2 में यूथेनाइज करने से पहले पैर खींचने-पीछे की प्रतिक्रिया न हो।
कैंची (आकार 14 सेमी) के साथ चूहे और हृदय टर्मिनल के मध्य वक्ष को काटें। फिर, कैंची (आकार 14 सेमी) के साथ फेफड़े की जड़ का पता लगाएं। कैंची से काटकर पूरे फेफड़े को काट लें और इसे ठंडे क्रेब्स घोल^10,11 में ^डुबो दें।
कैंची (आकार 11 सेमी) के साथ फेफड़े के एक लोब को स्लाइस करें और एक पेट्री डिश (आकार 9 सेमी) पर रखें, जिसमें फेफड़े की मध्यवर्ती तरफ / जड़ ऊपर की ओर हो (चित्र 2 ए, बी)। ऊपर से नीचे तक नस, ब्रोंचिया और धमनी के संरेखण का निरीक्षण और पहचान करें (चित्रा 2 बी)।
ब्रोन्कस को कैंची (आकार 11 सेमी) के साथ अनुदैर्ध्य रूप से काटें। फिर, ब्रोंकस की नोक को पकड़ने के लिए बल (आकार 11 सेमी) का उपयोग करें। धीरे से विच्छेदन करें और ब्रोंकस और नसों को फेफड़ों से बाहर निकालें। ध्यान दें कि आईपीए हमेशा ब्रोंकस के नीचे शारीरिक रूप से संरेखित होता है।
उसके बाद, मुख्य आईपीए की कल्पना की जा सकती है (चित्रा 2 सी)। आईपीए की नोक को पकड़ने के लिए बल (आकार 11 सेमी) का उपयोग करें और कैंची (आकार 11 सेमी) के साथ फेफड़ों के ऊतकों से सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें।
पृथक आईपीए को ठंडे क्रेब्स समाधान में रखें जब तक कि अंग स्नान असेंबली स्थापित न हो जाए (पीएच 7.3 और तापमान 4 डिग्री सेल्सियस)¹¹।

3. संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) का अलगाव

चरण 2 में पहले वर्णित आईपीए को अलग करें। कैंची (आकार 11 सेमी) के साथ आईपीए की मुख्य शाखा को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें और छोटी स्ट्रिप्स (2 मिमी) में काट लें (चित्रा 3 ए)।
आईपीए स्ट्रिप्स को एक पृथक्करण माध्यम (डीएम) ^10,12 में डुबोएं जिसमें 110 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल, 0.5 एमएम केएच₂पीओ₄, 0.5 एमएम एनएएच₂पीओ₄, 10 एमएम एनएएचसीओ₃, 10 एमएम एचईपीईएस, 0.03 एमएम फिनोल लाल, 10 एमएम टॉरिन, 0.5 एमएम ईडीटीए, 2 एमएम एमजीसीएल₂, 11 एमएम ग्लूकोज, 2 एमएमजीसीएल 2, 11 एमएम ग्लूकोज,₁₁ एमएम ग्लूकोज शामिल हैं। और पीएच को 1 एम एनएओएच के साथ 7.0 में समायोजित करें। 1 मिलीग्राम /एमएल पपैन, 0.04% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), और 0.4 एमएम 1,4- डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी) युक्त डीएम में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए स्ट्रिप्स को इनक्यूबेट करें, और आगे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। डीएम में 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेज टाइप 1 ए जोड़ें और आगे 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
नोट: डीएम सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक समाधान है। पपैन और कोलेजनेज टाइप 1 ए एंजाइम हैं जो एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन को तोड़ते हैं। बीएसए एक सीरम एल्बुमिन प्रोटीन है जिसका उपयोग भंडारण और एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के दौरान एंजाइमों के स्थिरीकरण के लिए किया जाता है। डीटीटी एक कम करने वाला एजेंट है जिसका उपयोग सेल अलगाव प्रक्रिया के दौरान एंजाइमों की गतिविधि को स्थिर करने और बढ़ावा देने के लिए किया जाता है। टॉरिन एमिनो सल्फ्यूरिक एसिड है जिसका उपयोग कोशिका झिल्ली और कोशिका अखंडता को स्थिर करने के लिए किया जाता है।
ऊतकों को ताजा डीएम में स्थानांतरित करें और ग्लास पाश्चर पिपेट (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके कोमल ट्राइट्यूरेशन द्वारा फैलते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत स्नान समाधान में पृथक वीएसएमसी दिखाई देने तक ट्राइट्यूरेट करते रहें (चित्रा 3 सी)।
नोट: ताजा पृथक वीएसएमसी का उपयोग संवहनी शरीर विज्ञान / पैथोफिज़ियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही विभिन्न प्रयोगात्मक जांच, जैसे फार्माकोलॉजिकल एजेंटों द्वारा मॉड्यूलेशन, पैच-क्लैंप इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण, कैल्शियम इमेजिंग, आदि। हालांकि, वर्तमान अध्ययन केवल अंग स्नान तकनीक का उपयोग करके पृथक आईपीए के वासोरेक्सेशन पर केंद्रित है।

4. अंग स्नान तकनीक

चरण 2 में पहले वर्णित आईपीए को अलग करें। आईपीए की मुख्य शाखा को ~ 2 मिमी लंबाई (चित्रा 2 डी) ¹³ के छल्ले में काटें।
आईपीए छल्ले को अंग स्नान कक्षों (चित्रा 4) में चिपकाएं, उन्हें दो 40 μm व्यास स्टेनलेस स्टील तारों (चित्रा 2E)^11,13,14 पर पिरोकर।
डेटा अधिग्रहण डिवाइस से जुड़े आइसोमेट्रिक बल ट्रांसड्यूसर और डेटा रिकॉर्डिंग और विश्लेषण के लिए उपयुक्त शारीरिक सॉफ्टवेयर के साथ स्थापित कंप्यूटर सिस्टम में आईपीए रिंग के साथ लगाए गए स्टेनलेस स्टील के तारों को संलग्न करें, फिर धीरे से आईपीए रिंग के तनाव को 1 जी¹¹ तक बढ़ाएं।
पोत खंडों को 1 ग्राम के आराम के तनाव पर लगभग 45 मिनट के लिए बराबर करने दें। संतुलन अवधि के दौरान, सुनिश्चित करें कि क्रेब्स समाधान नियमित रूप से हर 15 मिनट में बदला जाता है। संतुलन की इस अवधि के बाद, 47.4 एमएम एनएसीएल, 80 एमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपीईएस, 0.5 एमएम केएच 2_{पीओ 4}, 0.5 एमएम एनएएचपीओ 4, 1.8 एमएम सीएसीएल 2, 1 एमएम_{एमजीसीएल} ₂, और 11^{एमएम ग्लूकोज 10,11} वाले उच्च बाह्य के ⁺ (80 एमएम) समाधान के लिए उनके वाहिकासंकीर्णन को मापकर वाहिकाओं की व्यवहार्यता का परीक्षण ^{करें।}
फेनिलफ्राइन (पीई, 1 x 10⁻⁵ एम) के साथ पूर्व-अनुबंधित छल्ले में एसिटाइलकोलाइन (1 x 10−⁵ एम) के लिए विश्राम प्रतिक्रिया की गणना करके एंडोथेलियम की उपस्थिति या अनुपस्थिति का आकलन करें (ध्यान दें कि पीई जोड़ने के बाद संवहनी संकुचन 1 घंटे तक स्थिर रहते हैं)। रिंग्स को एंडोथेलियम-बरकरार के रूप में मानें यदि वे 70% से अधिक छूट के लिए मात्रा निर्धारित करते हैं (चित्रा 5 ए)। यदि उनके पास 10% से कम छूट है, तो छल्ले को एंडोथेलियम-डिन्यूडेड¹³ (चित्रा 5 बी) के रूप में मानें। यांत्रिक रूप से एंडोथेलियम को एक छोटे तार के साथ पोत के अंदर धीरे से रगड़कर हटा दें ताकि निर्जलीकरण को प्रेरित किया जा सके।
परीक्षण प्रयोगों की शुरुआत से पहले 30 मिनट के लिए धमनी के छल्ले को फिर से बराबर करें।

5. पौधे निकालने के लिए वासोरलैक्सेंट प्रतिक्रिया

पीई (1 x 10⁻⁵ एम) के साथ आईपीए रिंग्स को प्रीकॉन्ट्रैक्ट करके पौधे के अर्क के आराम प्रभाव की जांच करें।
फिर, वासोरेलेक्सेशन (चित्रा 6 ए, बी) को प्रेरित करने और एकाग्रता-निर्भर प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 6 सी) प्राप्त करने के लिए एंडोथेलियम-बरकरार छल्ले और एंडोथेलियम-डिन्यूडेड रिंग्स में संचयी रूप से पौधे के अर्क (1-1,000 μg / mL) को सावधानीपूर्वक जोड़ें।
सुनिश्चित करें कि विलायक के रूप में उपयोग किए जाने वाले डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के प्रभाव का मूल्यांकन भी नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 6 सी) के रूप में सेवा करने के लिए किया जाता है।

6. एंडोथेलियम के माध्यम से पौधे के अर्क-प्रेरित वासोरेलेक्सेशन का तंत्र

एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (ईएनओएस), साइक्लो-ऑक्सीजनेज (सीओएक्स)¹³, और एंडोथेलियम-व्युत्पन्न हाइपरपोलराइज़िंग फैक्टर (ईडीएचएफ) मार्गों के माध्यम से पौधे के अर्क की कार्रवाई के वासोरलैक्सेंट तंत्र का मूल्यांकन निम्नलिखित अवरोधकों के साथ 30 मिनट के लिए एंडोथेलियम-बरकरार आईपीए रिंग्स को इंजेक्ट करके करें (चित्रा 7 ए): 1 x 10⁻⁴ एम एनजी-नाइट्रो-एल-आर्जिनिन मिथाइल एस्टर (एल-नाम, एक ईएनओएस अवरोधक) ⁹, 1 एक्स ^10-5 एम इंडोमेथसिन या 1 x 10⁻5 M PE के साथ IPA के संकुचन को प्रेरित करने से पहले 1 x 10−7 M apamin (एक छोटा ^{कैल्शियम-सक्रिय} पोटेशियम चैनल ब्लॉकर) और 1 x 10−7 M Charybdotoxin (एक मध्यवर्ती और बड़े-चालकता ^{कैल्शियम-सक्रिय} पोटेशियम चैनल ब्लॉकर) का संयोजन।
फिर, पीई में संकुचन स्थिर होने के बाद, पौधे के अर्क की संचयी सांद्रता (0.1-1,000 μg / mL) जोड़ें।
इनहिबिटर के बिना आईपीए रिंग्स की प्रतिक्रिया की तुलना में इनहिबिटर की उपस्थिति में आईपीए रिंग्स के प्रतिशत छूट के रूप में पौधे निकालने के प्रभाव को प्रस्तुत करें (चित्रा 7 बी-डी) और एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करें।

7. संवहनी चिकनी मांसपेशी के ⁺ चैनलों के माध्यम से पौधे निकालने से प्रेरित वासोरेलेक्सेशन का तंत्र

प्री-इनक्यूबेट एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए रिंग्स 30 मिनट के लिए 1 x 10⁻³ एम 4-एमिनोपाइरिडाइन (4-एपी), वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम चैनल (_केवी) (चित्रा 8 ए), 1 एक्स 10-5 एम ग्लिबेंक्लामाइड का एक अवरोधक, एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनल (के_{एटीपी}) का एक अवरोधक, या 1 x ^10-7 एम इबेरियोटॉक्सिन, बड़े चालकता सीए^{2 +} सक्रिय के ⁺ चैनलों का एक_{अवरोधक।} 1 x 10⁻⁵ एम पीई के साथ आईपीए के संकुचन को प्रेरित करने से पहले।
फिर, पौधे के अर्क की संचयी सांद्रता जोड़ें।
अवरोधक के बिना आईपीए छल्ले की तुलना में अवरोधक के साथ आईपीए छल्ले के प्रतिशत छूट के रूप में पौधे के अर्क के प्रभाव को प्रस्तुत करें (चित्रा 8 बी-डी) और एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करें।

8. वीएसएमसी में बाह्य कैल्शियम (सीए²⁺) प्रवाह के निषेध के माध्यम से पौधे निकालने-प्रेरित वासोरेक्सेशन का तंत्र

प्री-इनक्यूबेट एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए सीए^{2 +} -मुक्त क्रेब्स समाधान में 30 मिनट के लिए रिंग करता है जिसमें 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (2-एमिनोइथाइलेदर)-एन, एन, एन', एन-टेट्राएसिटिक एसिड (ईजीटीए) होता है (चित्रा 9 ए)।
फिर, वीएसएमसी को विध्रुवीकृत करने के लिए 10 मिनट के लिए स्नान समाधान को सीए^{2 +} फ्री -80 एमएम के ⁺ समाधान के साथ बदलें, जो तब वीओसी (चित्रा 9 ए) खोलता है।
आईपीए के वाहिकासंकीर्णन को प्रेरित करने और एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र (चित्रा 9 ए) का निर्माण करने के लिए संचयी रूप से सीएसीएल₂ (0.01-10 एमएम) जोड़ें।
इस प्रोटोकॉल को उसी आईपीए रिंग्स में दोहराएं, लेकिन उन्हें 10 मिनट के लिए सीए^{2 +} में पौधे के अर्क या 1 μM nicardipine (L-प्रकार Ca² + चैनल अवरोधक) के साथ पूर्व-इनक्यूबेट करें जिसमें 80 mM K ⁺ समाधान होता है, जिसके बाद CaCl₂⁸ का संचयी जोड़ होता है।
अंत में, नियंत्रण CaCl₂ चुनौतियों (चित्रा 9 बी) द्वारा पहले प्राप्त अधिकतम संकुचन के लिए सिकुड़ा हुआ प्रतिक्रिया की तुलना करें।

9. सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) से इंट्रासेल्युलर कैल्शियम (सीए²⁺) रिलीज के निषेध के माध्यम से पौधे के अर्क-प्रेरित वासोरेलेक्सेशन का तंत्र

एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए रिंग्स को लगभग 5 मिनट के लिए 80 एमएम के ⁺ समाधान में उजागर करें, वीएसएमसी को डीपोलराइज़ करें, वीओसी को खोलें, और अंततः एसआर में सीए^{2 +} लोडिंग उत्पन्न करें (चित्रा 10 ए)।
10 मिनट के लिए स्नान समाधान को सीए^{2 +} मुक्त क्रेब्स समाधान के साथ बदलें जिसमें 1 एमएम ईजीटीए (चित्रा 10 ए) होता है।
फिर, 1 x 10⁻⁵ एम पीई के साथ आईपीए रिंग्स को चुनौती दें, जो फॉस्फोलिपेज़ सी / आईपी₃ मार्ग को सक्रिय करता है, अंततः एसआर से सीए^{2 +} जारी करता है और आईपीए के क्षणिक संकुचन को जन्म देता है (चित्रा 10 ए)।
पीई में समान क्षणिक संकुचन का पता लगाने के लिए एक ही प्रोटोकॉल दोहराएं।
लगभग 5 मिनट के लिए 80 mM K⁺ समाधान के साथ IPA रिंग्स को फिर से चुनौती दें, फिर स्नान समाधान को Ca^{2 +} -मुक्त क्रेब्स समाधान के साथ बदलें जिसमें 10 मिनट के लिए पौधे के अर्क के साथ या उसके बिना 1 mM EGTA होता है।
फिर, 1 x 10⁻⁵ एम पीई के साथ आईपीए रिंग्स को चुनौती दें।
पौधे के अर्क के साथ और बिना स्थिति के बीच पीई द्वारा प्रेरित आईपीए संकुचन की तुलना करें (चित्रा 10 बी)।

10. सांख्यिकीय विश्लेषण

परिणामों को एसईएम ± माध्य के रूप में व्यक्त करें। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके इन मूल्यों की तुलना करें या उपयुक्त सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ट्यूकी-क्रेमर पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद विचरण (एनोवा) के विश्लेषण द्वारा विश्लेषण करें। पी < 0.05 पर अंतर को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण मानते हैं। यहां, एन = 6 चूहे / प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल थे।
नोट: वाहिकासंकीर्णन और वासोरेक्सेशन की रिकॉर्डिंग का मूल्यांकन कंप्यूटर पर स्थापित उपयुक्त सॉफ़्टवेयर के साथ किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 ए से पता चलता है कि, जब रक्त वाहिकाओं को पीई द्वारा संकुचन के कारण उत्तेजित किया जाता है, तो यह मूल अनुरेखण के बढ़े हुए तनाव से देखा जा सकता है। ट्रेसिंग 20-30 मिनट में स्थिर हो जाएगी, जिसे 100% संकुचन माना जाता है। उसके बाद, एसीएच रक्त वाहिकाओं को उत्तेजित करता है, जिससे विश्राम होता है, जिसे मूल अनुरेखण के कम तनाव से देखा जा सकता है। इस प्रकार, कम तनाव की गणना 100% संकुचन की तुलना में प्रतिशत के रूप में की जाती है।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में प्रोटोकॉल को पृथक आईपीए तैयारी की संवहनी प्रतिक्रियाओं में देखी गई शारीरिक घटनाओं को मापने के लिए इष्टतम प्रयोगात्मक स्थितियों को निर्धारित करने के लिए विकसित किया गया है। पायलट प्रयोगों को संभावित परिणामों का वर्णन करने के लिए किया गया था जो संवहनी प्रभावों की समझ और पौधे के अर्क की वासोरलैक्सेंट कार्रवाई के यांत्रिक आधार में सहायता करते हैं, निम्नानुसार।

पौधे के अर्क का वासोरलैक्सेंट प्रभाव
जैसा कि चित्र 6 ए, बी में दिखाया गया है, एंडोथेलियम-बरकरार आईपीए (ई +) में, पौधे के अर्क ने वासोरेक्सेशन (ईसी₅₀ = 66.88 μg / mL, चित्रा 6 सी) की एकाग्रता-निर्भर प्रतिक्रिया प्राप्त की। एंडोथेलियम (ई-) के उन्मूलन ने पौधे के अर्क (पी < 0.01) द्वारा प्रेरित वासोरेक्सेशन को गहराई से कम कर दिया, जैसा कि ईसी₅₀ में 2.2 गुना (ई-, ईसी_{50 = 150.60} μg / mL, चित्रा 6C) की वृद्धि से परिलक्षित होता है। डीएमएसओ नाम के वाहन पर कोई असर नहीं पड़ा। इस प्रकार, पौधे के अर्क ने मुख्य रूप से एंडोथेलियम-निर्भर मार्ग के माध्यम से और आंशिक रूप से एंडोथेलियम-स्वतंत्र मार्ग के माध्यम से वासोरेक्सेशन का उत्पादन किया।

एंडोथेलियम-निर्भर मार्गों के माध्यम से पौधे के अर्क की वासोरेलैक्सेंट कार्रवाई का तंत्र
जैसा कि चित्र 7 में दिखाया गया है, ईएनओएस (चित्रा 7 बी) के निषेध के लिए एल-नाम का उपयोग करना और ईडीएचएफ (चित्रा 7 डी) को अवरुद्ध करने के लिए एपामिन प्लस चेरिब्डोटॉक्सिन के संयोजन ने स्पष्ट रूप से पौधे के अर्क के लिए वासोरेलेक्सेंट प्रतिक्रिया को कम कर दिया। इसने एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र को दाईं ओर स्थानांतरित कर दिया और ई_{अधिकतम} मूल्यों को बदले बिना ईसी₅₀ में वृद्धि की। इसके विपरीत, इंडोमेथासिन (एक सीओएक्स अवरोधक) (चित्रा 7 सी), ने पौधे के अर्क के लिए वासोरलैक्सेंट प्रतिक्रिया पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया।

पौधे के अर्क की वासोरलैक्सेंट कार्रवाई में के + चैनलों की भूमिका को चिह्नित करना
एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए रिंग्स में, के_सीए चैनल ब्लॉकर (इबेरियोटॉक्सिन) ने पौधे के अर्क (चित्रा 8 सी) के लिए वासोरेलेक्सेंट प्रतिक्रिया को कम कर दिया, जबकि के_वी (4-एपी) या के_{एटीपी} (ग्लिबेनक्लामाइड) चैनलों के ब्लॉकर्स ने पौधे के अर्क (चित्रा 8 बी, डी) द्वारा प्रेरित वैसोरेक्सेशन को संशोधित नहीं किया।

बाह्य सीए ^{2 +} प्रवाह निषेध के माध्यम से पौधे के अर्क की वासोरेलेक्सेंट कार्रवाई का तंत्र
यह जांचने के लिए कि क्या पौधे के अर्क की वासोरलैक्सेंट कार्रवाई के तंत्र में बाह्य सीए^{2 +} प्रवाह अवरोध शामिल था, एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए रिंग्स के वाहिकासंकीर्णन को 1 x 10-5-1 x ^10-2 एम सीएसीएल₂ द्वारा सीए^{2 +} मुक्त क्रेब्स समाधान में 80 एमएम के ⁺ के साथ शामिल किया गया था ताकि वीओसी को सक्रिय किया जा सके (चित्रा 9 ए, बी)। पौधे के अर्क (68 μg / mL, EC₅₀मान) के साथ पूर्व-इनक्यूबेशन ने CaCl_{2-प्रेरित} संकुचन (p < 0.001 बनाम वाहन) को रोक दिया।

एसआर से इंट्रासेल्युलर सीए ^{2 +} रिलीज के निषेध के माध्यम से पौधे के अर्क की वासोरलैक्सेंट कार्रवाई का तंत्र
यह जांचने के लिए कि क्या एसआर से इंट्रासेल्युलर सीए^{2 +} की रिहाई ने वासोरलैक्सेंट प्रभाव में कोई भूमिका निभाई है, एंडोथेलियम-डिन्यूडेड आईपीए रिंग्स को सीए^{2 +} -मुक्त क्रेब्स समाधान के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया था, इसके बाद पीई (1 x 10⁻⁵ एम) को जोड़ा गया, जिससे क्षणिक संकुचन हुआ (चित्रा 10 ए)। फिर, एक ही आईपीए रिंग में, इस प्रयोग को वाहन या पौधे के अर्क की उपस्थिति में दोहराया गया था। वाहन की तुलना में, पौधे के अर्क ने पीई (चित्रा 10 बी) द्वारा प्रेरित संकुचन को काफी कम (पी < 0.001) कर दिया।

चित्रा 1: एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र मार्गों के माध्यम से संवहनी टोन विनियमन। एए = एराकिडोनिक एसिड, एसीएच = एसिटाइलकोलाइन, एसी = एडेनिल साइक्लेज, एटीपी = एडेनोसिन 5'-ट्राइफॉस्फेट, सीएमपी = चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट, सीजीएमपी = चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट, सीओएक्स = साइक्लोऑक्सीजिनेज, डीएजी = डायसिलेग्लिसरॉल, ईडीएचएफ = एंडोथेलियम-व्युत्पन्न हाइपरपोलराइज़िंग फैक्टर, ईएनओएस = एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़, जी_क्यू = जी-प्रोटीन टाइप क्यू_{, जी एस} = जी- प्रोटीन टाइप क्यू, जी एस = जी - प्रोटीन टाइप₃ , जी एस = जी - प्रोटीन टाइप₃, जी टी पी आर = आईपी₃ रिसेप्टर, आईके_सीए = मध्यवर्ती चालकता सीए^{2 +} -सक्रिय के ⁺ चैनल, के_वी= वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम चैनल, के_{एटीपी} = एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनल, के_सीए = बड़ा चालकता सीए^{2 +} सक्रिय के ⁺ चैनल, एम 3 = मस्केरिनिक रिसेप्टर, एमईजीजे = मायोएंडोथेलियल गैब जंक्शन, एनओ = नाइट्रिक ऑक्साइड, पीई = फेनिलफ्राइन, पीजीआई₂ = प्रोस्टासाइक्लिन, पीजी_एस = प्रोस्टाग्लैंडिंस, पीआईपी₂ = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 4,5 बिस्फॉस्फेट, पीकेए = प्रोटीन काइनेज ए, पीकेजी = प्रोटीन काइनेज जी, पीएलए₂ = फॉस्फोलिपेज़ ए₂, पीएलसी = फॉस्फोलिपेज़ सी, आरओसीसी = रिसेप्टर-संचालित सीए^{2 +} चैनल, आरवाईआर = रायनोडिन रिसेप्टर, एसजीसी = घुलनशील गुआनिल साइक्लेज, एसके_सीए = लघु चालकता सीए^{2 +} सक्रिय के ⁺ चैनल, एसआर = सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम, वीओसी = वोल्टेज संचालित सीए^{2 +} चैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2: चूहे के इंट्रापल्मोनरी धमनी (आईपीए) अलगाव के प्रमुख चरण। (ए) चित्र में आईपीए के साथ चूहे के फेफड़े को दर्शाया गया है। (बी) फेफड़े के सामने की ओर के मध्यवर्ती पक्ष/जड़ का विच्छेदन। (सी) नसों और ब्रोन्चिया को हटाने के बाद मुख्य आईपीए की कल्पना की। (डी) पृथक आईपीए। (ई) अंग स्नान तकनीक का उपयोग करके संवहनी प्रतिक्रिया अध्ययन के लिए आईपीए रिंग्स को स्टेनलेस-स्टील तारों की एक जोड़ी पर लगाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3: आईपीए संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (वीएसएमसी) अलगाव के प्रमुख चरण। (ए) पृथक आईपीए को छोटी पट्टियों में काट दिया गया और पृथक्करण माध्यम (डीएम) में डुबोया गया। (बी) वीएसएमसी को अलग करने के लिए संवहनी स्ट्रिप्स का ट्राइट्यूरेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4: संवहनी प्रतिक्रिया का परीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरणों का योजनाबद्ध चित्रण। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 5: आईपीए छल्लों के वैसोरेक्सेशन को दर्शाता है जो 10 μM PE के साथ 10 μM एसिटाइलकोलाइन (ACh) (A) एंडोथेलियम-बरकरार रिंग (E+) और (B) एंडोथेलियम-डिन्यूडेड (E-) रिंग के साथ पूर्व-अनुबंधित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 6: पौधे के अर्क द्वारा आईपीए का वासोरेक्सेशन। (ए) पौधे के अर्क (1-1,000 μg/mL) द्वारा IPA छल्ले के वासोरेक्सेशन को दर्शाता है, जो एंडोथेलियम-बरकरार रिंग्स (E+) और (B) एंडोथेलियम-डिन्यूडेड (E-) रिंग्स में 10 μM PE के साथ पूर्व-अनुबंधित होता है। (सी) आईपीए रिंग्स (ई +, एन = 6 और ई-, एन = 6) में पौधे के अर्क द्वारा प्रेरित वासोरेक्सेशन के एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र। वासोरलैक्सेशन को पीई द्वारा प्रेरित संकुचन के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। सभी डेटा को एसईएम ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है। ** पी < 0.01, *** पी < वाहन की तुलना में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 7. एंडोथेलियम-निर्भर मार्ग के माध्यम से पौधे के अर्क-प्रेरित आईपीए वासोरेक्सेशन के तंत्र। (ए) एंडोथेलियम-बरकरार आईपीए रिंग्स (ई +) के पौधे के अर्क (1-1,000 μg / mL) द्वारा वासोरेक्सेशन को दर्शाने वाला प्रतिनिधि रिकॉर्ड एल-नाम (ईएनओएस अवरोधक) के साथ पूर्वनिर्धारित और 10 μM PE के साथ पूर्व-अनुबंधित। (बी-डी) एंडोथेलियम-बरकरार (ई +) आईपीए रिंग्स के पौधे के अर्क-प्रेरित वासोरेक्सेशन की एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र पीई के साथ पूर्व-अनुबंधित होते हैं और विभिन्न एंडोथेलियल सिग्नलिंग मार्गों के अवरोधकों के साथ प्रीक्यूबेट होते हैं, जिनमें (बी) 100 एसएम एल-एनएएम, (सी) 10 μM इंडोमेथासिन, या (डी) 0.1 μM apamin प्लस 0.1 μM charybdotoxin शामिल हैं। मान SEM ± अर्थ हैं। (n = 6)। ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 8. पौधे के अर्क-प्रेरित आईपीए वैसोरलैक्सेशन पर के ⁺ चैनल ब्लॉकर्स का प्रभाव। (ए) एंडोथेलियम-डीन्यूडेड (ई-) आईपीए रिंग्स के पौधे के अर्क (1-1,000 μg/mL) द्वारा वासोरेक्सेशन को दर्शाने वाला प्रतिनिधि रिकॉर्ड 4-एपी (_केवीचैनल ब्लॉकर) के साथ इनक्यूबेट किया जाता है और 10 μM PE के साथ पूर्व अनुबंधित होता है। (बी-डी) एंडोथेलियम-डीन्यूडेड (ई-) आईपीए रिंग्स के पौधे के अर्क-प्रेरित वासोरेक्सेशन की एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र पीई के साथ पूर्व-अनुबंधित होते हैं और विभिन्न के ⁺ चैनल ब्लॉकर्स के साथ प्रीक्यूबेट होते हैं, जिनमें (बी) 1 एमएम 4-एपी, (सी) 10 μM ग्लिबेनक्लामाइड, या (डी) 30 एनएम आइबेरियोटॉक्सिन शामिल हैं। मान SEM ± अर्थ हैं। (n = 6)। पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 9. बाह्य सीए^{2 +} प्रवाह पर पौधे के अर्क का प्रभाव। (ए) प्रतिनिधि रिकॉर्ड पौधे के अर्क की अनुपस्थिति (नियंत्रण) या उपस्थिति में आईपीए छल्ले के सीएसीएल_{2-प्रेरित} संकुचन को दर्शाते हैं। आईपीए के छल्ले को^{सीए 2 +} मुक्त उच्च के ⁺ -समाधान (80 एमएम) में स्नान किया गया था जिसमें 10 एमएम ईजीटीए था और सीएसीएल₂ की संचयी एकाग्रता द्वारा उत्पन्न संकुचन को मापा गया था। इस प्रोटोकॉल को तब अकेले (नियंत्रण, एन = 6) या पौधे के अर्क (एन = 6) की उपस्थिति में दोहराया गया था। (बी) पौधे के अर्क की अनुपस्थिति (नियंत्रण) या उपस्थिति में आईपीए छल्ले के सीएसीएल_{2-प्रेरित} संकुचन के लिए एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र या 1 μM nicardipine (L-प्रकार Ca²⁺ चैनल ब्लॉकर)। CaCl_{2-प्रेरित} संकुचन की गणना पहले CaCl₂ अनुप्रयोग से दर्ज अधिकतम संकुचन के प्रतिशत के रूप में की गई थी और nicardipine की तुलना < में SEM के ± औसत के रूप < में व्यक्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 10. सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) से सीए^{2 +} रिलीज पर पौधे के अर्क का प्रभाव। (ए) डीएमएसओ (नियंत्रण) और 10 एसएम पौधे निकालने की उपस्थिति में एंडोथेलियम-डीन्यूडेड आईपीए रिंग्स के एसआर से सीए^{2 +} रिलीज द्वारा आईपीए रिंग्स के फेनिलफ्राइन (पीई) प्रेरित संकुचन को दर्शाने वाला प्रतिनिधि रिकॉर्ड। डेटा पौधे के अर्क के बिना प्रारंभिक प्रोटोकॉल द्वारा उत्पादित संकुचन की तुलना में 10 μM पीई-प्रेरित संकुचन के प्रतिशत संकुचन है। मान SEM ± साधन हैं। **p वाहन की तुलना में 0.01 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 11: एंडोथेलियम-निर्भर और -स्वतंत्र मार्गों के माध्यम से चूहे के इंट्रापल्मोनरी धमनी पर पौधे के अर्क की वासोडिलेटर कार्रवाई का प्रस्तावित तंत्र एए = एराकिडोनिक एसिड, एसीएच = एसिटाइलकोलाइन, एसी = एडेनिल साइक्लेज, एटीपी = एडेनोसिन 5'-ट्राइफॉस्फेट, सीएमपी = चक्रीय एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट, सीजीएमपी = चक्रीय गुआनोसिन मोनोफॉस्फेट, सीओएक्स = साइक्लोऑक्सीजिनेज, डीएजी = डायसिलेग्लिसरॉल, ईडीएचएफ = एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस, ईएनओस = एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस_, ईएनओस = एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस, ईएनओएस = एंडोथेलियल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस, एडीएनओएस = = जी-प्रोटीन प्रकार क्यू, जी_एस = जी-प्रोटीन प्रकार एस, जीटीपी = गुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट, आईपी = प्रोस्टासाइक्लिन रिसेप्टर, आईपी₃ = इनोसिटोल 1, 4, 5 ट्राइसफॉस्फेट, आईपी₃आर = आईपी₃ रिसेप्टर, आईके_सीए = मध्यवर्ती चालकता सीए^{2 +} -सक्रिय के ⁺ चैनल, के_वी= वोल्टेज-गेटेड पोटेशियम चैनल, के_{एटीपी} = एटीपी-संवेदनशील पोटेशियम चैनल, के_सीए = बड़ा चालकता सीए^{2 +} सक्रिय के ⁺ चैनल, एम 3 = मस्केरिनिक रिसेप्टर, एमईजीजे = मायोएंडोथेलियल गैब जंक्शन, एनओ = नाइट्रिक ऑक्साइड, पीई = फेनिलफ्राइन, पीजीआई₂ = प्रोस्टासाइक्लिन, पीजी_एस = प्रोस्टाग्लैंडिंस, पीआईपी₂ = फॉस्फेटिडिलिनोसिटोल 4,5 बिस्फॉस्फेट, पीकेए = प्रोटीन काइनेज ए, पीकेजी = प्रोटीन काइनेज जी, पीएलए₂ = फॉस्फोलिपेज़ ए₂, पीएलसी = फॉस्फोलिपेज़ सी, आरओसीसी_{= रिसेप्टर} संचालित सीए^{2 +} चैनल, आरवाईआर = रयानोडाइन रिसेप्टर, एसजीसी = घुलनशील ^{2 +} सक्रिय के ⁺ चैनल, एसआर = सरकोप्लाज्मिक रेटिकुलम_,वीओसी = वोल्टेज संचालित सीए^{2 +} चैनल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम चूहे आईपीए और वीएसएमसी के अलगाव के लिए तकनीक का वर्णन करते हैं। विट्रो में आईपीए की संवहनी प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल नियोजित किए गए हैं, जिसका उपयोग पौधे के अर्क द्वारा प्रेरित आईपीए वासोरेक्सेशन के औषधीय प्रभाव और यांत्रिक आधार को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है।

पौधे के अर्क के एंडोथेलियम-निर्भर वासोडिलेटर कार्रवाई के बारे में, विभिन्न ब्लॉकर्स जैसे एल-एनएएम (ईएनओएस), इंडोमेथासिन (सीओएक्स), और एपामिन + चारिब्डोटॉक्सिन (ईडीएचएफ) को नियोजित किया गया था। प्रतिनिधि डेटा ने सकारात्मक परिणाम (यानी, ईएनओएस या ईडीएचएफ अवरोधकों की उपस्थिति में वासोडिलेटर प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण कमी) और नकारात्मक परिणाम (यानी, सीओएक्स अवरोधक की उपस्थिति में वासोडिलेटर प्रतिक्रिया में कोई बदलाव नहीं) दोनों दिखाए, यह सुझाव देते हुए कि पौधे का अर्क ईएनओएस और ईडीएचएफ एंडोथेलियल मार्गों के माध्यम से कार्य करता है। पौधे के अर्क द्वारा प्रेरित एंडोथेलियम-स्वतंत्र वैसोरलैक्सेंट प्रभाव का मूल्यांकन एसआर से के ⁺ चैनलों, बाह्य सीए^{2 +} प्रवाह और सीए^{2 +} रिलीज की भागीदारी के माध्यम से किया गया था। परिणामों से पता चला है कि पौधे के अर्क के जवाब में वासोरेक्सेशन को के_सीए चैनलों (इबेरियोटॉक्सिन) के एक अवरोधक द्वारा कम किया गया था, लेकिन_केवी चैनलों (4-एपी) के ब्लॉकर या के_{एटीपी} चैनलों (ग्लिबेनक्लामाइड) के ब्लॉकर द्वारा नहीं, यह सुझाव देते हुए कि अर्क के_सीए चैनलों के उद्घाटन के माध्यम से कार्य करता है। इसके अलावा, सीएसीएल_{2-प्रेरित} वाहिकासंकीर्णन को पौधे के अर्क द्वारा कम कर दिया गया था, यह सुझाव देते हुए कि इसके तंत्र में वीएसएमसी पर वीओसी का निषेध या सिकुड़ा हुआ मशीनरी के साथ सीए^{2 +} की बातचीत में हस्तक्षेप शामिल था। इसकी विस्तृत यांत्रिक कार्रवाई का विश्लेषण करने के लिए पूरक अध्ययन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सीए^{2 +} मुक्त क्रेब्स में पीई के लिए क्षणिक संकुचन कम हो गया था, यह दर्शाता है कि पौधे के अर्क ने एसआर से सीए^{2 +} की रिहाई को रोक दिया, जिससे वाहिकासंकीर्णन में कमी आई। पौधे के अर्क की वासोरलैक्सेंट क्रिया के व्याख्या तंत्र का सारांश चित्र 11 में चित्रित किया गया है।

वर्तमान अध्ययन में प्रस्तावित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से व्यवहार्य हैं और अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाते हैं; फिर भी, सफलता सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम आवश्यक हैं। सबसे पहले, शारीरिक समाधान की संरचना को तैयारी के दौरान ठीक से बनाए रखा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि प्रक्रिया ठीक से काम करती है। इसके अलावा, तैयारी के दौरान फुफ्फुसीय धमनी को छूने, खींचने या नुकसान पहुंचाने से बचना महत्वपूर्ण है। अंग स्नान कक्ष में फुफ्फुसीय धमनी चिपकने के बाद परीक्षण और मूल्यांकन को स्थिर करने के लिए माध्यम को लगातार हर 15 मिनट (3 बार) में प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। पोत के पूर्व-तनाव को आवश्यक स्तर से थोड़ा ऊपर बढ़ाया जाना चाहिए और फिर धीरे-धीरे कम किया जाना चाहिए जब तक कि इष्टतम प्राप्त नहीं हो जाता (यानी, 1 ग्राम)।

कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, जैसे रक्त वाहिकाओं की व्यवहार्यता, एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपस्थिति, और रक्त वाहिकाओं के विश्राम पर पौधे के अर्क का प्रभाव, इस तकनीक द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। चूहे आईपीए के अलगाव के लिए स्पष्ट प्रक्रिया को अन्य प्रजातियों (जैसे, माउस, खरगोश और मानव) से जोड़ा जा सकता है। फिर भी, अंग स्नान की असेंबली के लिए आवश्यक इष्टतम स्थितियां विभिन्न पशु मॉडलों के बीच भिन्न हो सकती हैं और तदनुसार अनुकूलित की जा सकती हैं। महत्वपूर्ण रूप से, प्रयोगात्मक स्थितियां शारीरिक स्थितियों की सटीक प्रतिकृति नहीं हैं, और परिणामों को सीधे विवो घटना में विस्तारित नहीं किया जा सकता है।

यह आईपीए अलगाव विधि और संवहनी प्रतिक्रिया माप संवहनी शरीर विज्ञान, विकृति विज्ञान और फार्माकोलॉजी का मूल्यांकन करने के लिए व्यावहारिक दृष्टिकोण हैं। यह शोधकर्ताओं को एक अलग लेकिन अच्छी तरह से नियंत्रित वातावरण में वाहिकासंकीर्णन और वाहिकासंकीर्णन का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इसे फुफ्फुसीय संवहनी विकृति के लिए उपयोग की जाने वाली दवाओं की चिकित्सीय कार्रवाई का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे फुफ्फुसीय धमनी उच्च रक्तचाप।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक वित्तीय सहायता प्रदान करने के लिए थाईलैंड की राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, रसायन विज्ञान में नवाचार के लिए उत्कृष्टता केंद्र (PERCH-CIC), और अंतर्राष्ट्रीय अनुसंधान नेटवर्क (IRN61W0005) और अनुसंधान सुविधा सहायता के लिए फिजियोलॉजी फैकल्टी ऑफ मेडिकल साइंस, नरेसुआन विश्वविद्यालय के विभाग को स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	D0632 CAS NO. 348-12-3
4-aminopyridine (4-AP)	Aldrich Chemical	A78403 CAS NO. 504-24-5
Acetylcholine	Sigma-Aldrich	A6625 CAS NO. 60-31-1
Apamin	Sigma-Aldrich	A9459 CAS NO. 24345-16-2
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153 CAS NO. 9048-46-8
Calcium choride	Ajax Finechem	AJA960 CAS NO. 1707055184
Charybdotoxin	Sigma-Aldrich	C7802 CAS NO. 95751-30-7
Collagenase type 1A	Sigma-Aldrich	C9891 CAS NO. 9001-12-1	From Clostridium histolyticum
D(+)-Glucose monohydrate	Millipore Corporation	K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540 CAS NO. 67-68-5
Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889 CAS NO. 67-42-5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884 CAS NO. 60-00-4
Forceps 11 cm.	Rustless Dumoxel	-
Forceps 14 cm.	Rustless Dumoxel	-
Glibenclamide	Sigma-Aldrich	G6039 CAS NO. 16673-34-0
GraphPad Prism program	Software version 5.0 (San Diego, CA, USA)
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375 CAS NO. 7365-45-9
Iberiotoxin	Sigma-Aldrich	I5904 CAS NO. 1002546960	recombinant from Mesobuthus tamulus
Indomethacin	Sigma-Aldrich	I7378 CAS NO. 53-86-1
Labchart Program	Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia).
Magnesium chloride	Ajax Finechem	296 CAS NO. 1506254995
Male Wistar rats	Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand
NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)	Sigma-Aldrich	N5751 CAS NO. 51298-62-5
Nicardipine	Sigma-Aldrich	N7510 CAS NO. 54527-84-3
Organ bath 15 mL.	-	-	Specific order by the researchers
Papain	Sigma-Aldrich	P4762 CAS NO. 9001-73-4	FromPapaya Latex
Phenal red	Sigma-Aldrich	P5530 CAS NO. 34487-61-1
Phenylephrine	Sigma-Aldrich	P6126 CAS NO. 61-76-7
Potassium chloride	Kemaus	KA383 CAS NO. 7447-40-7
Potassium dihydrogenphosphate	Aldrich Chemical	EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0
S+A2:E36odium chloride	Kemaus	KA465 CAS NO. 7647-14-5
Scissors 11 cm.	Spall Stainless	-
Scissors 14 cm.	Spall Stainless	-
Sodium bicarbonate	Ajax Finechem	475 CAS NO. 912466
Sodium dihydrogenphosphate	Aldrich Chemical	33,198-8 CAS NO. 7558-80-7
Sodium hydroxide	Ajax Finechem	482 CAS NO. 1506196602
Sodium thiopental	Anesthal	JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625 CAS NO. 107-35-7
Waterbath WBU 45	Memmert	2766 CAS NO. -