Summary
Las respuestas vasculares de la circulación pulmonar arterial se pueden explorar utilizando la arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC). El presente estudio describe el aislamiento de IPA en detalle y los protocolos utilizados para investigar la vasorelajación en respuesta a estímulos fisiológicos.
Abstract
La arteria intrapulmonar (IPA) y las células del músculo liso vascular (VSMC) aisladas de pulmones de rata se pueden usar para estudiar los mecanismos subyacentes de vasoconstricción y vasorelajación. Después de aislar el IPA y VSMCs, las características de las respuestas vasculares en condiciones fisiológicas y patológicas pueden evaluarse en ausencia de factores extrínsecos como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, etc. Por lo tanto, el IPA y los VSMC sirven como excelentes modelos para estudiar la fisiología / fisiopatología vascular, junto con diversas investigaciones experimentales, como la modulación por agentes farmacológicos, el análisis electrofisiológico de patch-clamp, las imágenes de calcio, etc. Aquí, hemos utilizado una técnica para aislar el IPA para investigar las respuestas vasculares en una configuración de baño de órganos. Los segmentos de IPA se montaron en la cámara de baño del órgano a través de cables intraluminales y fueron estimulados por diversos agentes farmacológicos. Los cambios en el tono vascular IPA (es decir, vasoconstricción y vasorelajación), se registraron utilizando un transductor de fuerza isométrica y un programa de software de análisis de datos fisiológicos. Implementamos varios protocolos experimentales, que pueden adaptarse para investigar los mecanismos de vasorelajación/vasoconstricción para estudiar las actividades farmacológicas de fármacos fitoquímicos o sintéticos. Los protocolos también se pueden utilizar para evaluar el papel de los fármacos en la modulación de diversas enfermedades, incluida la hipertensión arterial pulmonar. El modelo IPA nos permite investigar la curva concentración-respuesta, que es crucial para evaluar los parámetros farmacodinámicos de los fármacos.
Introduction
La vasculatura pulmonar es un sistema vascular de baja presión en el que la función principal es suministrar sangre desoxigenada al área de intercambio de gases de los pulmones. Las arterias pulmonares en los pulmones están dispuestas en ramas paralelas al árbol bronquial, formando finalmente una extensa red de capilares que es continua sobre varios alvéolos y, finalmente, uniéndose en vénulas y venas. El tono vascular de la arteria pulmonar está controlado por varios factores, que involucran la interacción entre el endotelio y las células del músculo liso vascular (CMV)1.
En este estudio, nos centramos en la vasorelajación dependiente e independiente del endotelio de la arteria intrapulmonar (IPA). Con respecto a la vasorelajación dependiente del endotelio, varios mecanismos que ocurren en la superficie de las células endoteliales podrían aumentar la concentración intracelular de Ca2+ (por ejemplo, la acetilcolina [ACh] se une con el receptor muscarínico [M3]), lo que lleva a la formación de óxido nítrico (NO), prostaciclina (PGl2) y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) (Figura 1 ). El NO es el principal factor relajante derivado del endotelio sintetizado a partir de la L-arginina por la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS)2, que luego se disocia de las células endoteliales a los VSMC (Figura 1) y estimula la enzima guanilil ciclasa soluble (sGC); esta enzima cambia el trifosfato de guanosina (GTP) en monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), que activa la proteína quinasa G (PKG) y reduce los niveles citosólicos de Ca2+, causando así vasorelajación (Figura 1). PGl2 es sintetizado por las células endoteliales a través de la vía de la ciclooxigenasa (COX) 3,4. Se une con el receptor de prostaciclina (IP) en los VSMC y estimula la enzima adenilil ciclasa (AC), que luego convierte el trifosfato de adenosina (ATP) en monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) (Figura 1)3,4. El AMPc activa la proteína quinasa A (PKA), reduciendo los niveles citosólicos deCa2+ y provocando vasorelajación5 (Figura 1). La vía EDHF también participa en la vasorelajación dependiente del endotelio a través de varios mediadores endoteliales y eventos eléctricos. La activación de la vía EDHF conduce a la hiperpolarización de los VSMC, cerrando así los canales de Ca 2+ operados por voltaje (VOCC), reduciendo los niveles intracelulares de Ca 2+ e induciendo vasorelajación 6. La vasorelajación independiente del endotelio ocurre directamente en los VSMC a través de varios mecanismos, como la reducción del nivel intracelular de Ca 2+, la inhibición de la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), la activación de la fosfatasa de cadena ligera de miosina (MLCP) y la reducción de la sensibilidad de Ca2+ a la maquinaria contráctil de los VSMC. En este estudio, nos centramos en la vasorelajación causada por la apertura de varios canales K +, el bloqueo de VOCC y la inhibición de la liberación de Ca 2+ del retículo sarcoplásmico7, lo que conduce a la reducción de los niveles intracelulares de Ca2+, disminuyendo así la fosforilación de la cadena ligera de miosina VSMC y la unión miosina-actina o la formación de puentes cruzados, respectivamente, en última instancia, resultando en vasorelajación.
La técnica para evaluar las mediciones de vasoconstricción y vasorelajación en IPA aislada está bien establecida para roedores, pero los datos variaron dependiendo de los protocolos experimentales. El presente estudio describe el método utilizado para evaluar las reactividades vasculares de preparaciones de IPA de rata in vitro, que se realizaron en ausencia de factores externos que modulan la respuesta vascular in vivo, como señales nerviosas, hormonas, citoquinas, presión arterial, etc.
Empleamos varios protocolos experimentales utilizando el extracto de la planta como ejemplo para estudiar las reactividades vasculares de IPA. Se utilizaron varios bloqueantes (Figura 1) para identificar los mecanismos de vasorelajación dependiente e independiente del endotelio inducidos por el extracto de la planta. Sin embargo, los mismos protocolos se pueden adaptar para evaluar las respuestas vasculares de IPA a cualquier fármaco, extracto o fitoquímico utilizado para el tratamiento de diversas patologías pulmonares.
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Protocol
Los experimentos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité de Ética del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Naresuan (NUACUC), número de protocolo NU-AE620921, para el cuidado y uso de animales con fines científicos.
1. Composición de las soluciones fisiológicas
- Formular la solución de Krebs disolviendo productos químicos en agua destilada para alcanzar las concentraciones finales de la siguiente manera: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0.5 mM KH 2 PO 4, 0.5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2 y 11 mM glucosa8. Ajustar el pH de la solución a 7,3 con NaOH 1 M y precalentar a 37 °C antes de su uso.
- Prepare la solución fría de Krebs de manera similar a la mencionada en el paso 1.1. para su uso como medio de aislamiento de IPA, como se describe en el paso 2.
2. Aislamiento de la arteria intrapulmonar (IPA)
- Anestesiar ratas Wistar macho de 8 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de tiopental sódico (100 mg/kg)9. Verifique a las ratas su reacción a estímulos dolorosos en el sueño profundo usando fórceps sujetos a sus pies, luego asegúrese de que las ratas no tengan una reacción de retroceso del pie antes de sacrificarlas en el paso 2.2.
- Abra el tórax medio de la rata y el terminal cardíaco con tijeras (tamaño 14 cm). Luego, localice la raíz del pulmón con tijeras (tamaño 14 cm). Cosechar todo el pulmón cortando con tijeras y sumergirlo en la solución fría de Krebs10,11.
- Cortar un solo lóbulo del pulmón con tijeras (tamaño 11 cm) y colocar sobre una placa de Petri (tamaño 9 cm) con el lado medial/raíz del pulmón hacia arriba (Figura 2A, B). Observe e identifique la alineación de la vena, los bronquios y la arteria de arriba a abajo (Figura 2B).
- Cortar el bronquio longitudinalmente con tijeras (tamaño 11 cm). Luego, use los fórceps (tamaño 11 cm) para agarrar la punta del bronquio. Diseccionar suavemente y extraer el bronquio y las venas del pulmón. Tenga en cuenta que el AFI siempre está alineado anatómicamente debajo del bronquio.
- Después de eso, se puede visualizar el IPA principal (Figura 2C). Use los fórceps (tamaño 11 cm) para agarrar la punta del AFI y diseccionarla cuidadosamente del tejido pulmonar con tijeras (tamaño 11 cm).
- Conservar el IPA aislado en una solución de Krebs fría hasta que se configure el conjunto del baño de órganos (pH 7,3 y temperatura 4 °C)1 1.
3. Aislamiento de células del músculo liso vascular (VSMCs)
- Aísle IPA como se describió anteriormente en el paso 2. Cortar la rama principal del AFI longitudinalmente con tijeras (tamaño 11 cm) y cortar en tiras pequeñas (2 mm) (Figura 3A).
- Sumergir las tiras IPA en un medio de disociación (MS)10,12 que contenga 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM rojo fenol, 10 mM taurina, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glucosa y 0,16 mM CaCl 2, y ajustar el pH a 7,0 con 1 M NaOH. Incubar las tiras durante 1 h a 4 °C en MS que contengan 1 mg/ml de papaína, 0,04% de albúmina sérica bovina (BSA) y 0,4 mM de 1,4-ditiothreitol (DTT), e incubar a 37 °C durante 15 min. Añadir 1 mg/ml de colagenasa tipo 1A en DM e incubar a 37 °C durante 5 min.
NOTA: La DM es una solución utilizada para preservar la viabilidad celular. La papaína y la colagenasa tipo 1A son enzimas que descomponen las proteínas de la matriz extracelular para aislar células individuales. BSA es una proteína de albúmina sérica utilizada para la estabilización de enzimas durante el almacenamiento y las reacciones enzimáticas. La TDT es un agente reductor utilizado para estabilizar y promover la actividad de las enzimas durante el proceso de aislamiento celular. La taurina es ácido sulfúrico amino utilizado para estabilizar la membrana celular y la integridad celular. - Transfiera los tejidos a MS fresca y disperse mediante una trituración suave utilizando una pipeta de vidrio Pasteur (Figura 3B). Siga triturando hasta que los VSMC aislados se hagan visibles en la solución de baño bajo el microscopio (Figura 3C).
NOTA: Los VSMC recién aislados se pueden utilizar para estudiar la fisiología / fisiopatología vascular, junto con varias investigaciones experimentales, como la modulación por agentes farmacológicos, el análisis electrofisiológico de patch-clamp, las imágenes de calcio, etc. Sin embargo, el presente estudio se centra sólo en la vasorelajación de la IPA aislada utilizando la técnica de baño de órganos.
4. Técnica de baño de órganos
- Aísle IPA como se describió anteriormente en el paso 2. Corte la rama principal del AFI en anillos de ~2 mm de longitud (Figura 2D)13.
- Fijar los anillos IPA en cámaras de baño de órganos (Figura 4) enroscándolos en dos alambres de acero inoxidable de 40 μm de diámetro (Figura 2E)11,13,14.
- Acople cables de acero inoxidable montados con anillos IPA a los transductores de fuerza isométricos conectados al dispositivo de adquisición de datos y al sistema informático instalado con el software fisiológico adecuado para el registro y análisis de datos, luego eleve suavemente la tensión del anillo IPA a 1 g11.
- Deje que los segmentos del vaso se equilibren durante unos 45 minutos a una tensión en reposo de 1 g. Durante el período de equilibrio, asegúrese de que la solución de Krebs se cambie regularmente cada 15 minutos. Después de este período de equilibrio, probar la viabilidad de los vasos midiendo su vasoconstricción a una solución extracelular alta de K+ (80 mM) que contiene 47,4 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 0,5 mM de KH 2 PO 4, 0,5 mM de NaHPO4, 1,8 mM de CaCl 2, 1 mM de MgCl2 y 11 mM de glucosa10,11.
- Evaluar la presencia o ausencia de endotelio calculando la respuesta de relajación a la acetilcolina (1 x 10− 5 M) en anillos precontraídos con fenilefrina (PE, 1 x 10−5 M) (Nótese que las contracciones vasculares permanecen estables durante 1 h después de añadir EP). Considere los anillos como endotelios intactos si cuantifican más del 70% de relajación (Figura 5A). Si tienen menos del 10% de relajación, considere los anillos como desnudos por endotelio13 (Figura 5B). Retire mecánicamente el endotelio frotando suavemente dentro del recipiente con un pequeño alambre para inducir la denudación.
- Nuevamente equilibre los anillos arteriales durante 30 minutos antes del inicio de los experimentos de prueba.
5. Respuesta vasorelajante al extracto de la planta
- Investigar el efecto relajante del extracto de la planta precontrayendo anillos IPA con PE (1 x 10−5 M).
- Luego, agregue cuidadosamente el extracto de la planta (1-1,000 μg / ml) acumulativamente a los anillos intactos del endotelio y los anillos desnudos del endotelio para inducir la vasorelajación (Figura 6A, B) y adquirir una curva de respuesta dependiente de la concentración (Figura 6C).
- Asegúrese de que el efecto del dimetilsulfóxido (DMSO) utilizado como solvente también se evalúe de manera similar para servir como control negativo (Figura 6C).
6. Mecanismo de vasorelajación inducida por extractos vegetales a través del endotelio
- Evaluar el mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal a través de las vías endotelial de óxido nítrico sintasa (eNOS), ciclooxigenasa (COX)13 y factor hiperpolarizante derivado del endotelio (EDHF) incubando los anillos IPA intactos del endotelio durante 30 min con los siguientes inhibidores (Figura 7A): 1 x 10−4 M NG-nitro-L-arginina éster metílico (L-NAME, un inhibidor de eNOS)9, 1 x 10−5 M indometacina (un inhibidor de la COX)9, o una combinación de 1 x 10−7 M de apamina (un pequeño bloqueador de los canales de potasio activado por calcio) y 1 x 10−7 M de caribdotoxina (un bloqueador de los canales de potasio activado por calcio de conductancia intermedia y de gran conductancia), antes de inducir contracciones de IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Luego, después de que las contracciones para estabilizar PE, agregue concentraciones acumuladas (0.1-1,000 μg / mL) del extracto de la planta.
- Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos IPA en presencia de inhibidores en comparación con la respuesta de los anillos IPA sin inhibidores (Figura 7B-D) y construir la curva concentración-respuesta.
7. Mecanismo de vasorelajación inducida por extracto vegetal a través de los canales K+ del músculo liso vascular
- Anillos IPA desnudos de endotelio preincubados durante 30 min con 1 x 10−3 M 4-aminopiridina (4-AP), un bloqueador del canal de potasio dependiente de voltaje (KV) (Figura 8A), 1 x 10−5 M glibenclamida, un bloqueador del canal de potasio sensible al ATP (KATP), o 1 x iberiotoxina 10−7 M, un bloqueador de canales K+ activados por Ca 2+ de gran conductancia (KCa), antes de inducir contracciones de IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Luego, agregue concentraciones acumuladas del extracto de la planta.
- Presentar los efectos del extracto vegetal como porcentaje de relajación de los anillos IPA con inhibidor en comparación con los anillos IPA sin inhibidor (Figura 8B-D) y construir la curva concentración-respuesta.
8. Mecanismo de vasorelajación inducida por extractos vegetales a través de la inhibición de la afluencia de calcio extracelular (Ca 2+) en VSMCs
- Anillos IPA desnudos de endotelio preincubados durante 30 min en solución de Krebs libre de Ca2+ que contiene 1 mM de etilenglicol-bis (2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-ácido tetraacético (EGTA) (Figura 9A).
- Luego, reemplace la solución de baño con una solución de Ca2 + libre-80 mM K+ durante 10 min para despolarizar los VSMC, que luego abren los VOCC (Figura 9A).
- Añadir acumulativamente CaCl2 (0,01-10 mM) para inducir la vasoconstricción del AFI y construir la curva concentración-respuesta (Figura 9A).
- Repita este protocolo en los mismos anillos IPA pero incubarlos previamente con extracto vegetal o 1 μM de nicardipina (bloqueador de canal Ca 2+ tipo L) en Ca2+ que contenga 80 mM de solución K+ durante 10 min seguido de la adición acumulativa de CaCl28.
- Por último, compare la respuesta contráctil con la contracción máxima previamente provocada por los desafíos de control de CaCl2 (Figura 9B).
9. Mecanismo de vasorelajación inducida por extracto vegetal mediante la inhibición de la liberación intracelular de calcio (Ca 2+) del retículo sarcoplásmico (RS)
- Exponga los anillos IPA desnudos de endotelio a una solución K+ de 80 mM durante aproximadamente 5 min, despolarizando los VSMC, abriendo los VOCC y, en última instancia, generando la carga de Ca2+ en el SR (Figura 10A).
- Sustituir la solución de baño durante 10 min por una solución de Krebs libre de Ca2+ que contenga 1 mM de EGTA (Figura 10A).
- Luego, desafíe los anillos IPA con 1 x 10−5 M PE, que activa la vía de fosfolipasa C/IP3 , liberando finalmente Ca2+ de la RS y evocando una contracción transitoria de IPA (Figura 10A).
- Repita el mismo protocolo para determinar contracciones transitorias similares a la EP.
- Vuelva a desafiar los anillos IPA con una solución de 80 mM K+ durante unos 5 minutos, luego reemplace la solución de baño con una solución de Krebs libre de Ca2+ que contenga 1 mM de EGTA con o sin el extracto de la planta durante 10 min.
- Una vez más, desafíe los anillos IPA con 1 x 10−5 M PE.
- Compare las contracciones de IPA inducidas por PE entre la condición con y sin el extracto de la planta (Figura 10B).
10. Análisis estadístico
- Expresar los resultados como media ± SEM. Compare estos valores utilizando la prueba t de Student o analice mediante un análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Tukey-Kramer utilizando un software estadístico adecuado. Considere que las diferencias en p < 0,05 son estadísticamente significativas. Aquí, había n = 6 ratas/protocolo experimental.
NOTA: El registro de vasoconstricción y vasorelajación se puede evaluar con el software adecuado instalado en la computadora. Por ejemplo, la Figura 5A muestra que, cuando los vasos sanguíneos son estimulados por la EP que causa la contracción, esto podría observarse a partir del aumento de la tensión del trazado original. El rastreo se estabilizará en 20-30 minutos, lo que se considera una contracción del 100%. Después de eso, la ACh estimula los vasos sanguíneos, causando relajación, que se pudo observar a partir de la disminución de la tensión del trazado original. Por lo tanto, la tensión reducida se calcula como el porcentaje en comparación con la contracción del 100%.
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Representative Results
El protocolo en el presente estudio ha sido desarrollado para determinar las condiciones experimentales óptimas para medir los fenómenos fisiológicos observados en las respuestas vasculares de preparaciones aisladas de IPA. Los experimentos piloto se realizaron para describir los resultados potenciales que ayudan a la comprensión de los efectos vasculares y la base mecanicista de la acción vasorelajante del extracto de la planta, de la siguiente manera.
Efecto vasorelajante del extracto vegetal
Como se muestra en la Figura 6A,B, en IPA (E+) intacta del endotelio, el extracto vegetal provocó una respuesta de vasorelajación dependiente de la concentración (EC50 = 66,88 μg/ml, Figura 6C). La erradicación del endotelio (E-) redujo profundamente la vasorelajación inducida por el extracto vegetal (p < 0,01), como se refleja en el aumento de la EC 50 en 2,2 veces (E-, EC50 = 150,60 μg/mL, Figura 6C). El vehículo, DMSO, no tuvo ningún efecto. Por lo tanto, el extracto de la planta produjo vasorelajación principalmente a través de una vía dependiente del endotelio y parcialmente a través de una vía independiente del endotelio.
Mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal a través de vías dependientes del endotelio
Como se muestra en la Figura 7, la utilización de L-NAME para la inhibición de eNOS (Figura 7B) y la combinación de apamino más caribdotoxina para bloquear EDHF (Figura 7D) evidentemente disminuyó la respuesta vasorelajante al extracto de la planta. Esto desplazó la curva de concentración-respuesta hacia la derecha y aumentó la EC50 sin alterar los valores de Emax. Por el contrario, la indometacina (un inhibidor de la COX) (Figura 7C), no mostró ningún efecto sobre la respuesta vasorelajante al extracto de la planta.
Caracterización del papel de los canales K+ en la acción vasorelajante del extracto vegetal
En los anillos IPA desnudos de endotelio, el bloqueador del canal KCa (iberiotoxina) disminuyó la respuesta vasorelajante al extracto de la planta (Figura 8C), mientras que los bloqueadores de los canales Kv (4-AP) o KATP (glibenclamida) no modificaron la vasorelajación inducida por el extracto de la planta (Figura 8B, D).
Mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal vía inhibición extracelular de la afluencia de Ca 2+
Para investigar si el mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal implicaba la inhibición extracelular de la afluencia de Ca 2+, la vasoconstricción de los anillos IPA desnudos de endotelio fue evocada por 1 x 10−5-1 x 10−2 M CaCl2 en una solución de Krebs libre de Ca2+ incorporada con 80 mM K+ para activar los COVOC (Figura 9A,B). La preincubación con el extracto vegetal (68 μg/mL, valor EC50) inhibió la contracción inducida por CaCl2 (p < 0,001 vs. vehículo).
Mecanismo de acción vasorelajante del extracto vegetal mediante la inhibición de la liberación intracelular de Ca2+ de la RS
Para examinar si la liberación de Ca 2+ intracelular de la RS jugó algún papel en el efecto vasorelajante, los anillos IPA desnudos de endotelio se incubaron previamente con una solución de Krebs libre de Ca2+, seguida de la adición de PE (1 x 10−5 M), produciendo una contracción transitoria (Figura 10A). Luego, en el mismo anillo IPA, este experimento se replicó en presencia de extracto de vehículo o planta. En comparación con el vehículo, el extracto vegetal redujo significativamente (p < 0,001) la contracción inducida por PE (Figura 10B).
Figura 1: Regulación del tono vascular a través de vías dependientes e independientes del endotelio. AA = ácido araquidónico, ACh = acetilcolina, AC = adenilciclasa, ATP = adenosina 5'-trifosfato, cAMP = monofosfato de adenosina cíclico, GMPc = monofosfato de guanosina cíclico, COX = ciclooxigenasa, DAG = diacilglicerol, EDHF = factor hiperpolarizante derivado del endotelio, eNOS = óxido nítrico sintasa endotelial, G q = proteína G tipoq, G s = proteína G tipos, GTP = trifosfato de guanosina, IP = receptor de prostaciclina, IP 3 = inositol 1, 4, 5 trifosfato, IP3 R = receptor IP3, IK Ca = conductancia intermedia Ca 2+-canal K+activado, KV = canales de potasio dependientes de voltaje, KATP = canales de potasio sensibles a ATP, K Ca = canales de conductancia grandeCa 2+ activado K+, M3 = receptor muscarínico, MEGJ = unión mioendotelial gab, NO = óxido nítrico, PE = fenilefrina, IGP 2 = prostaciclina, PGs = prostaglandinas, PIP2 = Fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato, PKA = Proteína quinasa A, PKG = Proteína quinasa G, PLA 2 = Fosfolipasa A2, PLC = Fosfolipasa C, ROCCs = Canales de Ca 2+ operados por receptor, RYR = Receptor de rianodina, sGC = Guanilil ciclasa soluble, SK Ca = Canal K+ activado por Ca 2+ de conductancia pequeña, SR = Retículo sarcoplásmico, COVOC = Canales deCa 2+ operados por voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Pasos clave del aislamiento de la arteria intrapulmonar (IPA) de rata. (A) La imagen muestra un pulmón de rata con IPA. (B) Disección del lado medial/raíz del pulmón hacia arriba. (C) IPA principal visualizado después de eliminar las venas y los bronquios. d) IPA aislada. (E) Los anillos IPA se montaron en un par de alambres de acero inoxidable para un estudio de respuesta vascular utilizando la técnica de baño de órganos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Pasos clave del aislamiento de las células del músculo liso vascular (VSMC) de la IPA. (A) La IPA aislada se cortó en pequeñas tiras y se sumergió en medio de disociación (DM). (B) Trituración de tiras vasculares para aislar VSMCs. (C) VSMCs aislados después de una trituración suave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ilustración esquemática del equipo utilizado para probar la reactividad vascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Registro representativo que muestra vasorelajación de los anillos IPA precontraídos con 10 μM PE por 10 μM de acetilcolina (ACh ). (A) Anillo endotelio intacto (E+) y (B) anillo endotelio denuado (E-). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Vasorelajación de IPA por el extracto de la planta. (A) Registro representativo que muestra vasorelajación de los anillos IPA por el extracto de la planta (1-1,000 μg / ml) precontraído con 10 μM PE en anillos endotelios intactos (E +) y (B) anillos desnudos de endotelio (E-). (C) Curvas concentración-respuesta de vasorelajación inducida por el extracto vegetal en anillos IPA (E+, n = 6 y E-, n = 6). La vasorelajación se expresa como un porcentaje de la contracción inducida por la EP. Todos los datos se expresan como media ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 en comparación con el vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Los mecanismos de la vasorelajación IPA inducida por el extracto de la planta a través de la vía dependiente del endotelio. (A) Registro representativo que muestra vasorelajación por el extracto vegetal (1-1.000 μg/mL) de anillos IPA (E+) intactos del endotelio preincubados con L-NAME (inhibidor de eNOS) y precontraídos con 10 μM PE. (B-D) Curvas de concentración-respuesta de las vasorelajaciones inducidas por extractos vegetales de anillos IPA intactos (E+) endotelio precontraídos con PE y preincubados con inhibidores de diversas vías de señalización endotelial, incluyendo (B) 100 μM L-NAME, (C) 10 μM indometacina, o (D) 0,1 μM de apamina más 0,1 μM de caribdotoxina. Los valores son medias ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Efecto de los bloqueadores del canal K+ en la vasorelajación IPA inducida por extracto de planta. (A) Registro representativo que muestra vasorelajación por el extracto vegetal (1-1,000 μg/mL) de anillos IPA desnudos de endotelio (E-) incubados con 4-AP (bloqueador del canal KV) y precontraídos con 10 μM PE. (B-D) Curvas de concentración-respuesta de la vasorelajación inducida por extracto vegetal de anillos IPA desnudos de endotelio (E-) precontraídos con PE y preincubados con varios bloqueadores de los canales K+, incluyendo (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenclamida, o (D) 30 nM iberiotoxina. Los valores son medias ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9. Efecto del extracto de la planta sobre la afluencia extracelular deCa2+. (A) Registros representativos que muestren la contracción inducida por CaCl2 de los anillos IPA en ausencia (control) o presencia del extracto de la planta. Los anillos de IPA se bañaron en una solución de Ca 2+ K + libre alta (80 mM) que contenía 10 mM de EGTA y se midió la contracción evocada por una concentración acumulada de CaCl2. Este protocolo se repitió solo (control, n = 6) o en presencia del extracto de la planta (n = 6). (B) Curvas de concentración-respuesta para la contracción inducida por CaCl2 de los anillos IPA en ausencia (control) o presencia del extracto vegetal o 1 μM de nicardipina (bloqueador de canales Ca2+ tipo L). La contracción inducida por CaCl 2 se calculó como porcentaje de la contracción máxima registrada desde la primera aplicación de CaCl2 y se expresó como media ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 en comparación con nicardipina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10. Efecto del extracto vegetal sobre la liberación deCa2+ del retículo sarcoplásmico (SR). (A) Registro representativo que muestra la contracción inducida por fenilefrina (PE) de los anillos IPA por la liberación de Ca2+ de la RS de los anillos IPA desnudos de endotelio en presencia de DMSO (control) y 10 μM de extracto vegetal. Los datos son contracciones porcentuales a 10 μM de contracciones inducidas por PE en comparación con las contracciones producidas por el protocolo inicial sin el extracto de la planta. Los valores son medias ± SEM. **p < 0,01 en comparación con el vehículo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11: Mecanismo propuesto de acción vasodilatadora del extracto de la planta en la arteria intrapulmonar de rata a través de vías dependientes e independientes del endotelio AA = ácido araquidónico, ACh = acetilcolina, AC = adenilciclasa, ATP = adenosina 5'-trifosfato, cAMP = monofosfato de adenosina cíclico, cGMP = monofosfato de guanosina cíclico, COX = ciclooxigenasa, DAG = diacilglicerol, EDHF = factor hiperpolarizante derivado del endotelio, eNOS = óxido nítrico sintasa endotelial, Gq = proteína G tipo q, G s = proteína G tipos, GTP = trifosfato de guanosina, IP = receptor de prostaciclina, IP 3 = inositol 1, 4, 5 trifosfato, IP 3 R = receptor IP 3, IK Ca= conductancia intermedia Ca 2+-activado canal K+, KV = canales de potasio dependientes de voltaje, KATP = canales de potasio sensibles a ATP, K Ca = Gran conductanciaCa 2+-activado K+ canales, M3 = receptor muscarínico, MEGJ = unión gab mioendotelial, NO = óxido nítrico, PE = fenilefrina, PGI 2 = prostaciclina, PGs = prostaglandinas, PIP 2 = fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato, PKA = proteína quinasa A, PKG = proteína quinasa G, PLA 2 = fosfolipasa A 2, PLC = fosfolipasa C, ROCCs = canales de Ca2+ operados por receptor, RYR = receptor de rianodina, sGC = guanilil ciclasa soluble, SKCa = Ca de conductancia pequeña Canal K+ activado por 2+, SR = retículo sarcoplásmico, VOCCs = canales Ca 2+ operados por voltaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito, describimos la técnica para el aislamiento de IPA de rata y VSMCs. Se han empleado varios protocolos experimentales para investigar la respuesta vascular de IPA in vitro, que se pueden utilizar para caracterizar el efecto farmacológico y las bases mecanicistas de la vasorelajación de IPA inducida por extracto de planta.
En cuanto a la acción vasodilatadora dependiente del endotelio del extracto vegetal, se emplearon varios bloqueadores como L-NAME (eNOS), indometacina (COX) y apamina + caribdotoxina (EDHF). Los datos representativos mostraron resultados positivos (es decir, reducción significativa de la respuesta vasodilatadora en presencia de inhibidores de eNOS o EDHF) y resultados negativos (es decir, ningún cambio en la respuesta vasodilatadora en presencia del inhibidor de la COX), lo que sugiere que el extracto de la planta actúa a través de las vías endoteliales eNOS y EDHF. El efecto vasorelajante independiente del endotelio inducido por el extracto de la planta se evaluó a través de la participación de los canales K +, la afluencia extracelular de Ca 2+ y la liberación de Ca2+ del SR. Los resultados mostraron que la vasorelajación en respuesta al extracto vegetal fue reducida por un bloqueador de los canales de KCa (iberiotoxina) pero no por un bloqueador de los canales KV (4-AP) o un bloqueador de los canales KATP (glibenclamida), lo que sugiere que el extracto actúa a través de la apertura de los canales KCa. Además, la vasoconstricción inducida por CaCl2 fue reducida por el extracto de la planta, lo que sugiere que su mecanismo implicaba la inhibición de los COV en los VSMC o la interferencia con las interacciones de Ca2+ con la maquinaria contráctil. Se deben realizar estudios complementarios para analizar más a fondo su acción mecanicista detallada. Además, la contracción transitoria a PE en Krebs libre de Ca 2+ se redujo, lo que indica que el extracto de la planta inhibió la liberación de Ca2+ de la RS, lo que llevó a la reducción de la vasoconstricción. Un resumen del mecanismo interpretado de la acción vasorelajante del extracto de la planta se ilustra en la Figura 11.
Los protocolos experimentales propuestos en el presente estudio son técnicamente factibles y muestran buena reproducibilidad; Sin embargo, ciertos pasos cruciales son esenciales para garantizar el éxito. En primer lugar, la composición de la solución fisiológica debe mantenerse con precisión durante la preparación para garantizar que el procedimiento funcione correctamente. Además, es vital evitar tocar, estirar o dañar la arteria pulmonar durante la preparación. El medio debe reemplazarse continuamente cada 15 minutos (3 veces) para estabilizar las pruebas y la evaluación una vez que la arteria pulmonar se fija en la cámara de baño de órganos. La pretensión del recipiente debe aumentarse ligeramente por encima del nivel requerido y luego disminuirse gradualmente hasta que se alcance el óptimo (es decir, 1 g).
Varios protocolos experimentales, como la viabilidad de los vasos sanguíneos, la presencia de células endoteliales y el efecto de los extractos de plantas en la relajación de los vasos sanguíneos, se evalúan mediante esta técnica. El procedimiento dilucidado para el aislamiento de IPA de rata puede estar en sintonía con otras especies (por ejemplo, ratón, conejo y humano). Sin embargo, las condiciones óptimas requeridas para el montaje de un baño de órganos pueden diferir entre varios modelos animales y pueden adaptarse en consecuencia. Es importante destacar que las condiciones experimentales no son una réplica exacta de las condiciones fisiológicas, y los resultados no pueden extrapolarse directamente al fenómeno in vivo .
Este método de aislamiento IPA y las mediciones de respuesta vascular son enfoques prácticos para evaluar la fisiología, patología y farmacología vascular. Permite a los investigadores estudiar la vasoconstricción y la vasorelajación en un ambiente aislado pero bien controlado. Además, se puede adaptar para estudiar la acción terapéutica de fármacos utilizados para la patología vascular pulmonar, como la hipertensión arterial pulmonar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Consejo Nacional de Investigación de Tailandia, al Centro de Excelencia para la Innovación en Química (PERCH-CIC) y a la Red Internacional de Investigación (IRN61W0005) por brindar apoyo financiero, y al Departamento de Fisiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de Naresuan, por el apoyo a las instalaciones de investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
