Summary
Vaskulære reaktioner af arteriel lungecirkulation kan undersøges ved hjælp af intrapulmonal arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er). Denne undersøgelse beskriver isolationen af IPA i detaljer og de protokoller, der anvendes til undersøgelse af vasorelaxation som reaktion på fysiologiske stimuli.
Abstract
Den intrapulmonale arterie (IPA) og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) isoleret fra rottelunger kan bruges til at studere de underliggende mekanismer for vasokonstriktion og vasorelaxation. Efter isolering af IPA og VSMC'er kan egenskaberne ved vaskulære reaktioner under fysiologiske og patologiske tilstande vurderes i fravær af ydre faktorer såsom nervesignaler, hormoner, cytokiner osv. IPA- og VSMC'erne tjener således som fremragende modeller til undersøgelse af vaskulær fysiologi / patofysiologi sammen med forskellige eksperimentelle undersøgelser, såsom modulering af farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, calciumbilleddannelse osv. Her har vi brugt en teknik til at isolere IPA til at undersøge vaskulære reaktioner i et orgelbadsopsætning. IPA-segmenter blev monteret på organbadkammeret via intraluminale ledninger og stimuleret af forskellige farmakologiske midler. Ændringerne i IPA vaskulær tone (dvs. vasokonstriktion og vasorelaxation) blev registreret ved hjælp af et isometrisk krafttransducer og fysiologisk dataanalysesoftwareprogram. Vi implementerede flere eksperimentelle protokoller, som kan tilpasses til at undersøge mekanismerne for vasorelaxation / vasokonstriktion til undersøgelse af de farmakologiske aktiviteter af fytokemiske eller syntetiske lægemidler. Protokollerne kan også bruges til at evaluere lægemidlernes roller i modulering af forskellige sygdomme, herunder pulmonal arteriel hypertension. IPA-modellen giver os mulighed for at undersøge koncentrations-responskurven, som er afgørende for vurderingen af lægemidlers farmakodynamiske parametre.
Introduction
Den pulmonale vaskulatur er et lavtryks vaskulært system, hvor hovedfunktionen er at levere deoxygeneret blod til lungernes gasudvekslingsområde. Lungearterierne i lungerne er arrangeret i grene parallelt med bronchialtræet, hvilket i sidste ende danner et omfattende netværk af kapillærer, der er kontinuerligt over flere alveoler og endelig kommer sammen i venler og vener. Den vaskulære tone i lungearterien styres af flere faktorer, der involverer interaktionen mellem endotelet og vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er)1.
I denne undersøgelse fokuserer vi på den endotelafhængige og -uafhængige vasorelaxation af den intrapulmonale arterie (IPA). Med hensyn til den endotelafhængige vasorelaxation kan forskellige mekanismer, der forekommer på overfladen af endotelceller, øge intracellulær Ca2+ koncentration (f.eks. acetylcholin [ACh] binder med muskarinreceptor [M3]), hvilket fører til dannelse af nitrogenoxid (NO), prostacyclin (PGl2) og endotelafledt hyperpolariserende faktor (EDHF) (figur 1 ). NO er den vigtigste endotelafledte afslappende faktor syntetiseret fra L-arginin ved endotelnitrogenoxidsyntase (eNOS)2, som derefter dissocierer ud af endotelcellerne til VSMC'er (figur 1) og stimulerer det opløselige guanylylcyklase (sGC) enzym; dette enzym ændrer guanosintrifosfat (GTP) til cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP), som aktiverer proteinkinase G (PKG) og reducerer cytosoliske Ca2+ niveauer og dermed forårsager vasorelaxation (figur 1). PGl2 syntetiseres af endotelceller via cyclo-oxygenase (COX) vejen 3,4. Det binder med prostacyclinreceptoren (IP) på VSMC'er og stimulerer adenylcyklase (AC) enzymet, som derefter omdanner adenosintrifosfat (ATP) til cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) (figur 1)3,4. cAMP aktiverer proteinkinase A (PKA), hvilket reducerer cytosoliske Ca2+ niveauer og forårsager vasorelaxation5 (figur 1). EDHF-stien deltager også i endotelafhængig vasorelaxation via forskellige endotelmediatorer og elektriske begivenheder. Aktiveringen af EDHF-vejen fører til hyperpolarisering af VSMC'er, hvorved spændingsstyrede Ca 2+ kanaler (VOCC'er) lukkes, hvilket reducerer intracellulære Ca 2+ niveauer og inducerer vasorelaxation 6. Den endoteluafhængige vasorelaxation forekommer direkte på VSMC'er via flere mekanismer, såsom reduktion af intracellulært Ca 2+ niveau, hæmning af myosin lyskædekinase (MLCK), aktivering af myosin lyskædephosphatase (MLCP) og reduktion af Ca2+ følsomhed over for det kontraktile maskineri af VSMC'er. I denne undersøgelse fokuserer vi på vasorelaxation forårsaget af åbningen af forskellige K + -kanaler, blokaden af VOCC'er og inhiberingen af Ca 2+ frigivelse fra det sarkoplasmatiske retikulum7, hvilket fører til reduktion af intracellulære Ca2+ niveauer og dermed reducerer VSMC myosin lyskædephosphorylering og myosin-actinbinding eller krydsbrodannelse, henholdsvis, i sidste ende resulterer i vasorelaxation.
Teknikken til evaluering af vasokonstriktions- og vasoafslapningsmålinger i isoleret IPA er veletableret for gnavere, men dataene varierede afhængigt af de eksperimentelle protokoller. Denne undersøgelse beskriver den metode, der anvendes til at evaluere de vaskulære reaktiviteter af rotte IPA-præparater in vitro, som blev foretaget i mangel af eksterne faktorer, der modulerede vaskulær respons in vivo, såsom nervesignaler, hormoner, cytokiner, blodtryk osv.
Vi anvendte flere eksperimentelle protokoller ved hjælp af planteekstraktet som et eksempel til at studere IPA's vaskulære reaktiviteter. Forskellige blokkere (figur 1) blev brugt til at identificere mekanismerne for endotelafhængig og -uafhængig vasorelaxation induceret af planteekstraktet. Ikke desto mindre kan de samme protokoller tilpasses til at evaluere IPA's vaskulære reaktioner på lægemidler, ekstrakter eller fytokemikalier, der anvendes til behandling af forskellige lungepatologier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene udført i denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Naresuan University Animal Care and Use Committee (NUACUC), protokolnummer NU-AE620921, til pleje og brug af dyr til videnskabelige formål.
1. Sammensætning af fysiologiske opløsninger
- Krebs-opløsning formuleres ved at opløse kemikalier i destilleret vand for at opnå de endelige koncentrationer som følger: 122 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl2 og 11 mM glucose8. Opløsningens pH-værdi justeres til 7,3 med 1 M NaOH, og forvarmes til 37 °C inden brug.
- Der fremstilles kold Krebs-opløsning på samme måde som nævnt i trin 1.1. til brug som isolationsmedium for IPA som beskrevet i trin 2.
2. Isolering af intrapulmonal arterie (IPA)
- Anæstetik 8 uger gamle Wistar-hanrotter med intraperitoneal injektion af natriumthiopental (100 mg/kg)9. Kontroller rotterne for deres reaktion på smertefulde stimuli i dyb søvn ved hjælp af tang fastspændt til deres fødder, og sørg derefter for, at rotterne ikke har en fodtrækningsreaktion, før de aflives i trin 2.2.
- Skær rottens midterste brystkasse og hjerteterminalen op med en saks (størrelse 14 cm). Find derefter lungens rod med en saks (størrelse 14 cm). Høst hele lungen ved at skære med en saks og nedsænk den i kold Krebs-opløsning10,11.
- Skær en enkelt lap af lungen med en saks (størrelse 11 cm) og læg den på en petriskål (størrelse 9 cm) med den mediale side/rod af lungen vendt opad (figur 2A, B). Overhold og identificer justeringen af venen, bronkierne og arterien fra top til bund (figur 2B).
- Skær bronchus i længderetningen op med en saks (størrelse 11 cm). Brug derefter tangen (størrelse 11 cm) til at få fat i spidsen af bronchus. Insekter forsigtigt og fjern bronchus og vener ud af lungen. Bemærk, at IPA altid er anatomisk justeret under bronchus.
- Derefter kan den vigtigste IPA visualiseres (figur 2C). Brug tangen (størrelse 11 cm) til at gribe spidsen af IPA og dissekere den forsigtigt ud af lungevævet med en saks (størrelse 11 cm).
- Den isolerede IPA opbevares i kold Krebs-opløsning, indtil organbadsenheden er konfigureret (pH 7,3 og temperatur 4 °C)1 1.
3. Isolering af vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er)
- Isoler IPA som tidligere beskrevet i trin 2. Skær IPA'ens hovedgren i længderetningen op med en saks (størrelse 11 cm) og skær den i små strimler (2 mm) (figur 3A).
- IPA-strimlerne nedsænkes i et dissociationsmedium (DM)10,12 indeholdende 110 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaH 2 PO4, 10 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,03 mM phenolrød, 10 mM taurin, 0,5 mM EDTA, 2 mM MgCl 2, 11 mM glucose og 0,16 mM CaCl 2, og juster pH-værdien til 7,0 med 1 M NaOH. Strimlerne inkuberes i 1 time ved 4 °C i DM indeholdende 1 mg/ml papain, 0,04% bovin serumalbumin (BSA) og 0,4 mM 1,4- dithiothreitol (DTT), og der inkuberes yderligere ved 37 °C i 15 min. Der tilsættes 1 mg/ml collagenase type 1A i DM og inkuberes yderligere ved 37 °C i 5 min.
BEMÆRK: DM er en løsning, der bruges til at bevare cellens levedygtighed. Papain og collagenase type 1A er enzymer, der nedbryder de ekstracellulære matrixproteiner for at isolere enkeltceller. BSA er et serumalbuminprotein, der anvendes til stabilisering af enzymer under opbevaring og enzymatiske reaktioner. DTT er et reduktionsmiddel, der bruges til at stabilisere og fremme enzymernes aktivitet under celleisoleringsprocessen. Taurin er aminosvovlsyre, der anvendes til stabilisering af cellemembranen og celleintegriteten. - Overfør vævene til frisk DM og spred ved blid trituration ved hjælp af en glas Pasteur-pipette (figur 3B). Fortsæt med at triturere, indtil isolerede VSMC'er bliver synlige i badeopløsningen under mikroskopet (figur 3C).
BEMÆRK: Frisk isolerede VSMC'er kan bruges til at studere vaskulær fysiologi / patofysiologi sammen med forskellige eksperimentelle undersøgelser, såsom modulering af farmakologiske midler, patch-clamp elektrofysiologisk analyse, calciumbilleddannelse osv. Denne undersøgelse fokuserer imidlertid kun på vasorelaxation af isoleret IPA ved hjælp af orgelbadteknikken.
4. Orgelbad teknik
- Isoler IPA som tidligere beskrevet i trin 2. Skær IPA's hovedgren i ringe med ~2 mm længde (figur 2D)13.
- Sæt IPA-ringene i orgelbadskamre (figur 4) ved at gevind dem på to rustfri ståltråde med en diameter på 40 μm (figur 2E)11,13,14.
- Fastgør ledninger i rustfrit stål monteret med IPA-ringe til de isometriske krafttransducere, der er tilsluttet dataindsamlingsanordningen og computersystemet installeret med den passende fysiologiske software til dataoptagelse og analyse, og hæv derefter forsigtigt IPA-ringens spænding til 1 g11.
- Lad fartøjssegmenterne balancere i ca. 45 minutter ved en hvilespænding på 1 g. I løbet af ligevægtsperioden skal du sørge for, at Krebs-opløsningen udskiftes regelmæssigt hvert 15. minut. Efter denne ækvilibreringsperiode testes skibenes levedygtighed ved at måle deres vasokonstriktion til høj ekstracellulær K + (80 mM) opløsning indeholdende 47,4 mM NaCl, 80 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM NaHPO4, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 og 11 mM glucose10,11.
- Vurder tilstedeværelsen eller fraværet af endotel ved at beregne afslapningsresponset på acetylcholin (1 x 10-5 M) i ringe, der er indgået på forhånd med phenylephrin (PE, 1 x 10-5 M) (Bemærk, at vaskulære sammentrækninger forbliver stabile i 1 time efter tilsætning af PE). Betragt ringene som endotelintakte, hvis de kvantificerer for mere end 70% afslapning (figur 5A). Hvis de har mindre end 10% afslapning, skal du betragte ringene som endotel-denuded13 (figur 5B). Fjern endotelet mekanisk ved forsigtigt at gnide inde i beholderen med en lille ledning for at fremkalde denudation.
- Ligevægtig igen arterieringene i 30 minutter før starten af testforsøgene.
5. Vasorelaxant respons på planteekstrakt
- Undersøg den afslappende virkning af planteekstraktet ved at prækontrahere IPA-ringe med PE (1 x 10-5 M).
- Derefter tilsættes forsigtigt planteekstraktet (1-1.000 μg / ml) kumulativt til endotelintakte ringe og endoteldenuderede ringe for at inducere vasorelaxation (figur 6A, B) og for at opnå en koncentrationsafhængig responskurve (figur 6C).
- Sørg for, at virkningen af dimethylsulfoxid (DMSO), der anvendes som opløsningsmiddel, også vurderes på samme måde som en negativ kontrol (figur 6C).
6. Mekanisme for planteekstraktinduceret vasorelaxation via endotelet
- Evaluer planteekstraktets vasorelaxerende virkningsmekanisme via endotelnitrsyresyntase (eNOS), cyclo-oxygenase (COX)13 og endotelafledte hyperpolariserende faktor (EDHF) veje ved at inkubere de endotelintakte IPA-ringe i 30 minutter med følgende hæmmere (figur 7A): 1 x 10-4 M NG-nitro-L-argininmethylester (L-NAME, en eNOS-hæmmer)9, 1 x 10-5 M indomethacin (en COX-hæmmer)9, eller en kombination af 1 x 10-7 M apamin (en lille calciumaktiveret kaliumkanalblokker) og 1 x 10-7 M charybdotoxin (en calciumaktiveret kaliumkanalblokker med stor konduktans), inden der induceres sammentrækninger af IPA med 1 x 10-5 M PE.
- Derefter, efter at sammentrækningerne til PE stabiliseres, tilsættes kumulative koncentrationer (0,1-1.000 μg / ml) af planteekstraktet.
- Virkningerne af planteekstrakt præsenteres som en procentvis afslapning af IPA-ringene i nærvær af hæmmere sammenlignet med IPA-ringenes respons uden hæmmere (figur 7B-D), og koncentrations-responskurven konstrueres.
7. Mekanisme for planteekstraktinduceret vasorelaxation via vaskulær glat muskel K + kanaler
- Pre-inkubere endotel-denuderede IPA-ringe i 30 minutter med 1 x 10-3 M 4-aminopyridin (4-AP), en blokker af spændingsstyret kaliumkanal (KV) (figur 8A), 1 x 10-5 M glibenclamid, en blokering af ATP-følsom kaliumkanal (KATP) eller 1 x 10-7 M iberiotoxin, en blokker med stor konduktans Ca2+-aktiverede K+ kanaler (KCa), før inducering af sammentrækninger af IPA med 1 x 10-5 M PE.
- Derefter tilsættes kumulative koncentrationer af planteekstraktet.
- Virkningerne af planteekstrakt præsenteres som en procentvis afslapning af IPA-ringene med inhibitor sammenlignet med IPA-ringene uden hæmmer (figur 8B-D), og koncentrations-responskurven konstrueres.
8. Mekanisme for planteekstraktinduceret vasorelaxation via hæmning af ekstracellulær calcium (Ca2+) tilstrømning i VSMC'er
- Præinkuberede endotel-denuderede IPA-ringe i 30 minutter i Ca2+-fri Krebs-opløsning indeholdende 1 mM ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddikesyre (EGTA) (figur 9A).
- Udskift derefter badeopløsningen med Ca2 + fri-80 mM K+ opløsning i 10 minutter for at depolarisere VSMC'erne, som derefter åbner VOCC'erne (figur 9A).
- Tilsæt kumulativtCaCl2 (0,01-10 mM) for at inducere vasokonstriktion af IPA og konstruere koncentrations-responskurven (figur 9A).
- Gentag denne protokol i de samme IPA-ringe, men inkuber dem med planteekstrakt eller 1 μM nicardipin (L-type Ca 2+ kanalblokker) i Ca 2+ indeholdende 80 mM K + opløsning i 10 minutter efterfulgt af den kumulative tilsætning af CaCl28.
- Til sidst skal du sammenligne det kontraktile respons med den maksimale sammentrækning, der tidligere er fremkaldt af kontrol CaCl2-udfordringer (figur 9B).
9. Mekanisme for planteekstraktinduceret vasorelaxation via hæmning af intracellulær calcium (Ca2+) frigivelse fra det sarkoplasmatiske retikulum (SR)
- Udsæt endotel-denuderede IPA-ringe for 80 mM K + -opløsning i ca. 5 minutter, depolarisering af VSMC'erne, åbning af VOCC'erne og i sidste ende generering af Ca2+ -belastning i SR (figur 10A).
- Badeopløsningen udskiftes i 10 minutter med Ca2+-fri Krebs-opløsning indeholdende 1 mM EGTA (figur 10A).
- Udfordre derefter IPA-ringene med 1 x 10-5 M PE, som aktiverer phospholipase C / IP3-vejen , hvilket i sidste ende frigiver Ca2+ fra SR og fremkalder en forbigående sammentrækning af IPA (figur 10A).
- Gentag den samme protokol for at fastslå ligeledes forbigående sammentrækninger til PE.
- Udfordr IPA-ringene igen med 80 mM K+ opløsning i ca. 5 min, og udskift derefter badeopløsningen med Ca2+-fri Krebs-opløsning indeholdende 1 mM EGTA med eller uden planteekstrakt i 10 min.
- Udfordre igen IPA-ringene med 1 x 10-5 M PE.
- Sammenlign IPA-sammentrækningerne induceret af PE mellem tilstanden med og uden planteekstraktet (figur 10B).
10. Statistisk analyse
- ±Sammenlign disse værdier ved hjælp af den studerendes t-test eller analyser ved en variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey-Kramer post hoc-testen ved hjælp af passende statistisk software. Anse forskellene ved p < 0,05 for at være statistisk signifikante. Her var der n = 6 rotter/forsøgsprotokol.
BEMÆRK: Optagelse af vasokonstriktion og vasorelaxation kan vurderes med passende software installeret på computeren. For eksempel viser figur 5A , at når blodkarrene stimuleres af PE, der forårsager sammentrækning, kan dette observeres fra den øgede spænding i den oprindelige sporing. Sporingen stabiliseres på 20-30 min, hvilket betragtes som en 100% sammentrækning. Derefter stimulerer ACh blodkarrene og forårsager afslapning, som kunne observeres fra den nedsatte spænding i den oprindelige sporing. Således beregnes den reducerede spænding som procentdelen sammenlignet med 100% sammentrækning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen i denne undersøgelse er udviklet til at bestemme de optimale eksperimentelle betingelser for måling af fysiologiske fænomener observeret i de vaskulære reaktioner af isolerede IPA-præparater. Pilotforsøgene blev udført for at beskrive de potentielle resultater, der hjælper forståelsen af de vaskulære virkninger og det mekaniske grundlag for planteekstraktets vasorelaxante virkning, som følger.
Vasorelaxant virkning af planteekstraktet
Som vist i figur 6A,B, i endotelintakt IPA (E+), fremkaldte planteekstraktet et koncentrationsafhængigt respons af vasorelaxation (EC50 = 66,88 μg/ml, figur 6C). Udryddelse af endotel (E-) reducerede dybt vasorelaxationen induceret af planteekstraktet (p < 0,01), som afspejlet i stigningen i EC 50 med 2,2 gange (E-, EC50 = 150,60 μg/ml, figur 6C). Køretøjet, DMSO, havde ingen effekt. Således producerede planteekstraktet vasorelaxation hovedsageligt via en endotelafhængig vej og delvist via en endoteluafhængig vej.
Mekanisme for vasorelaxant virkning af planteekstraktet via endotelafhængige veje
Som vist i figur 7 reducerede brugen af L-NAME til hæmning af eNOS (figur 7B) og kombinationen af apamin plus charybdotoxin til blokering af EDHF (figur 7D) åbenbart det vasorelaxante respons på planteekstraktet. Dette forskubbede koncentrations-responskurven til højre og øgede EC50 uden at ændre E-max-værdierne. Tværtimod viste indomethacin (en COX-hæmmer) (figur 7C) ingen effekt på det vasorelaxerende respons på planteekstraktet.
Karakterisering af K+ kanalernes rolle i planteekstraktets vasorelaxante virkning
I de endotel-denuderede IPA-ringe reducerede K Ca-kanalblokker (iberiotoxin) det vasorelaxante respons på planteekstraktet (figur 8C), mens blokkere af Kv (4-AP) eller KATP (glibenclamid) kanaler ikke ændrede vasorelaxation induceret af planteekstraktet (figur 8B, D).
Mekanisme for vasorelaxant virkning af planteekstraktet via ekstracellulær Ca2+ tilstrømningshæmning
For at undersøge, om mekanismen for vasorelaxant virkning af planteekstraktet involverede ekstracellulær Ca 2+ tilstrømningshæmning, blev vasokonstriktionen af endoteldenuderede IPA-ringe fremkaldt af 1 x 10-5-1 x 10-2 M CaCl2 i Ca2+-fri Krebs-opløsning inkorporeret med 80 mM K + for at aktivere VOCC'erne (figur 9A, B). Forinkubation med planteekstraktet (68 μg/ml, EC50-værdi) hæmmede CaCl 2-induceret sammentrækning (p < 0,001 vs. køretøj).
Mekanisme for vasorelaxant virkning af planteekstraktet via hæmning af intracellulær Ca2+ frigivelse fra SR
For at undersøge, om frigivelsen af intracellulær Ca 2+ fra SR spillede nogen rolle i den vasorelaxerende virkning, blev de endoteldenuderede IPA-ringe præinkuberet med Ca2+-fri Krebs-opløsning efterfulgt af tilsætning af PE (1 x 10-5 M), hvilket gav en forbigående sammentrækning (figur 10A). Derefter blev dette eksperiment i den samme IPA-ring replikeret i nærværelse af enten køretøjs- eller planteekstrakt. I forhold til køretøjet reducerede planteekstraktet signifikant (p < 0,001) sammentrækningen induceret af PE (figur 10B).
Figur 1: Vaskulær toneregulering via endotelafhængige og -uafhængige veje. AA = arachidonsyre, ACh = acetylcholin, AC = Adenylylcyclase, ATP = adenosin 5'-triphosphat, cAMP = cyklisk adenosinmonophosphat, cGMP = cyklisk guanosinmonophosphat, COX = cyclooxygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotelafledt hyperpolariserende faktor, eNOS = Endotelnitrogenoxidsyntase, G q = G-proteintypeq, G s = G-proteintypes, GTP = guanosintrifosfat, IP = Prostacyclinreceptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisphosphat, IP3 R = IP3-receptor, IK Ca = Mellemliggende konduktans Ca 2+-aktiveret K + -kanal, KV = Spændingsstyrede kaliumkanaler, K ATP =ATP-følsomme kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktiverede K + -kanaler, M3 = Muscarin receptor, MEGJ = Myoendotelgab junction, NO = Nitrogenoxid, PE = Phenylephrin, BGB 2 = Prostacyclin, PGs = Prostaglandiner, PIP2 = Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphat, PKA = Proteinkinase A, PKG = Proteinkinase G, PLA 2 = Phospholipase A2, PLC = Phospholipase C, ROCC'er = Receptoropererede Ca 2+ kanaler, RYR = Ryanodinreceptor, sGC = Opløselig guanylylcyclase, SK Ca = Lille konduktans Ca 2+-aktiveret K+ kanal, SR = Sarcoplasmisk retikulum, VOCC'er = SpændingsdrevneCa 2+ kanaler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Nøgletrin i rottens intrapulmonale arterie (IPA) isolation. (A) Billedet viser rottelunger med IPA. (B) Dissektion af den mediale side / rod af lungen, der vender opad. (C) Visualiseret hoved IPA efter fjernelse af vener og bronkier. D) Isoleret IPA. (E) IPA-ringene blev monteret på et par tråde i rustfrit stål til en vaskulær responsundersøgelse ved hjælp af orgelbadteknikken. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Nøgletrin i IPA vaskulære glatte muskelceller (VSMC'er) isolation. (A) Isoleret IPA blev skåret i små strimler og nedsænket i dissociationsmedium (DM). (B) Trituration af vaskulære strimler for at isolere VSMC'er. (C) Isolerede VSMC'er efter blid trituration. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk illustration af det udstyr, der blev brugt til at teste vaskulær reaktivitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentativ registrering, der viser vasorelaxation af IPA-ringe forudkontraheret med 10 μM PE med 10 μM acetylcholin (ACh). (A) Endotel-intakt ring (E+) og (B) endotel-denuded (E-) ring. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Vasorelaxation af IPA ved planteekstraktet. (A) Repræsentativ registrering, der viser vasorelaxation af IPA-ringe af planteekstraktet (1-1.000 μg/ml), der er indgået på forhånd med 10 μM PE i endotelintakte ringe (E+) og (B) endotel-denuderede (E-) ringe. C) Koncentrations-responskurver for vasorelaxation induceret af planteekstraktet i IPA-ringe (E+, n = 6 og E-, n = 6). Vasorelaxation udtrykkes som en procentdel af sammentrækningen induceret af PE. Alle data udtrykkes som gennemsnit ± SEM. **p < 0,01, ***p < 0,001 sammenlignet med køretøj. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7. Mekanismerne i planteekstraktinduceret IPA-vasorelaxation via den endotelafhængige vej. (A) Repræsentativ registrering, der viser vasorelaxation af planteekstraktet (1-1.000 μg/ml) af endotelintakte IPA-ringe (E+) præinkuberet med L-NAME (eNOS-hæmmer) og udliciteret med 10 μM PE. (B-D) Koncentrations-responskurver for de planteekstraktinducerede vasorelaxations af endotelintakte (E+) IPA-ringe, der er indgået på forhånd med PE og præinkuberet med hæmmere af forskellige endotelsignaleringsveje, herunder (B) 100 μM L-NAVN, (C) 10 μM indomethacin eller (D) 0,1 μM apamin plus 0,1 μM charybdotoxin. Værdier er midler ± SEM. (n = 6). **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8. Effekt af K+ kanalblokkere på den planteekstraktinducerede IPA-vasorelaxation. (A) Repræsentativ registrering, der viser vasorelaxation af planteekstraktet (1-1.000 μg/ml) af endotel-denuderede (E-) IPA-ringe inkuberet med 4-AP (K V-kanalblokker) og udliciteret med 10 μM PE. (B-D) Koncentrations-responskurver for den planteekstraktinducerede vasorelaxation af endotel-denuded (E-) IPA-ringe, der er indgået på forhånd med PE og præinkuberet med forskellige K+ kanalblokkere, herunder (B) 1 mM 4-AP, (C) 10 μM glibenclamid eller (D) 30 nM iberiotoxin. Værdier er midler ± SEM. (n = 6). p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9. Effekt af planteekstraktet på ekstracellulær Ca2+ tilstrømning. (A) Repræsentative optegnelser, der viser CaCl 2-induceret sammentrækning af IPA-ringe i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af planteekstraktet. IPA-ringe blev badet i Ca2+fri høj K+-opløsning (80 mM) indeholdende 10 mM EGTA, og sammentrækningen fremkaldt af en kumulativ koncentration af CaCl2 blev målt. Denne protokol blev derefter gentaget alene (kontrol, n = 6) eller i nærværelse af planteekstraktet (n = 6). (B) Koncentrations-responskurver for CaCl 2-induceret sammentrækning af IPA-ringe i fravær (kontrol) eller tilstedeværelse af planteekstraktet eller 1 μM nicardipin (L-type Ca2+ kanalblokker). CaCl 2-induceret sammentrækning blev beregnet som procentdel af den maksimale sammentrækning registreret fra den første CaCl2-applikation og udtrykt som gennemsnit ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001 sammenlignet med nicardipin. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10. Effekt af planteekstraktet på Ca2+ frigivelse fra det sarkoplasmatiske retikulum (SR). (A) Repræsentativ registrering, der viser phenylephrin (PE) -induceret sammentrækning af IPA-ringe ved Ca2+ frigivelse fra SR af endoteldenuderede IPA-ringe i nærværelse af DMSO (kontrol) og 10 μM planteekstrakt. Dataene er procentvis sammentrækning til 10 μM PE-inducerede sammentrækninger sammenlignet med sammentrækninger produceret af den oprindelige protokol uden planteekstraktet. Værdier er midler ± SEM. **p < 0,01 sammenlignet med køretøj. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Foreslået mekanisme for vasodilatorvirkning af planteekstraktet på rotteintrapulmonal arterie via endotelafhængige og -uafhængige veje AA = arachidonsyre, ACh = acetylcholin, AC = Adenylylcyclase, ATP = adenosin 5'-triphosphat, cAMP = cyklisk adenosinmonophosphat, cGMP = cyklisk guanosinmonophosphat, COX = cyclooxygenase, DAG = Diacylglycerol, EDHF = Endotelafledt hyperpolariserende faktor, eNOS = Endotelnitrogenoxidsyntase, Gq = G-protein type q, G s = G-protein types, GTP = guanosintrifosfat, IP = Prostacyclin receptor, IP 3 = Inositol 1, 4, 5 trisphosphat, IP 3 R = IP 3receptor, IK Ca = Mellemliggende konduktans Ca 2+-aktiveret K + kanal, KV = Spændingsstyrede kaliumkanaler, KATP = ATP-følsomme kaliumkanaler, K Ca = Stor konduktansCa 2+-aktiveret K + kanaler, M3 = Muscarin receptor, MEGJ = Myoendotelial gab junction, NO = Nitrogenoxid, PE = Phenylephrin, BGB 2 = Prostacyclin, PGs = Prostaglandiner, PIP 2 = Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphat, PKA = Proteinkinase A, PKG = Proteinkinase G, PLA 2 = Phospholipase A 2, PLC = Phospholipase C, ROCCs = Receptor-opererede Ca2+ kanaler, RYR = Ryanodine receptor, sGC = Opløselig guanylylcyklase, SK Ca = Lille konduktansCa 2+-aktiveret K+ kanal, SR = Sarkoplasmatisk retikulum, VOCC'er = Spændingsbetjente Ca2+ kanaler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette manuskript beskriver vi teknikken til isolering af rotte IPA og VSMC'er. Flere eksperimentelle protokoller er blevet anvendt til at undersøge det vaskulære respons af IPA in vitro, som kan bruges til at karakterisere den farmakologiske virkning og mekanistiske grundlag for IPA-vasorelaxation induceret af planteekstrakt.
Med hensyn til planteekstraktets endotelafhængige vasodilatorvirkning blev forskellige blokkere såsom L-NAME (eNOS), indomethacin (COX) og apamin + charybdotoxin (EDHF) anvendt. De repræsentative data viste både positive resultater (dvs. signifikant reduktion af vasodilatorrespons i nærvær af enten eNOS- eller EDHF-hæmmere) og negative resultater (dvs. ingen ændring i vasodilatorrespons i nærvær af COX-hæmmeren), hvilket tyder på, at planteekstraktet virker via eNOS- og EDHF-endotelvejene. Den endoteluafhængige vasorelaxanteffekt induceret af planteekstraktet blev evalueret via involvering af K + -kanalerne, ekstracellulær Ca 2+ tilstrømning og Ca2+ frigivelse fra SR. Resultaterne viste, at vasorelaxation som reaktion på planteekstraktet blev reduceret af en blokering af K Ca-kanaler (iberiotoxin), men ikke af en blokering af KV-kanaler (4-AP) eller en blokering af KATP-kanaler (glibenclamid), hvilket tyder på, at ekstraktet virker via åbningen af KCa-kanaler. Desuden blev CaCl 2-induceret vasokonstriktion reduceret af planteekstraktet, hvilket tyder på, at dets mekanisme involverede hæmning af VOCC'er på VSMC'erne eller interferens med interaktionerne mellem Ca2+ og kontraktile maskiner. Supplerende undersøgelser bør udføres for yderligere at analysere dens detaljerede mekaniske virkning. Desuden blev den forbigående sammentrækning til PE i Ca 2+-fri Krebs reduceret, hvilket indikerer, at planteekstraktet hæmmede frigivelsen af Ca2+ fra SR, hvilket førte til reduktion af vasokonstriktion. Et resumé af den fortolkede mekanisme for planteekstraktets vasorelaxante virkning er illustreret i figur 11.
De forsøgsprotokoller, der foreslås i denne undersøgelse, er teknisk gennemførlige og viser god reproducerbarhed; Ikke desto mindre er visse afgørende skridt afgørende for at sikre succes. For det første skal sammensætningen af den fysiologiske opløsning opretholdes nøjagtigt under forberedelsen for at sikre, at proceduren fungerer korrekt. Det er også vigtigt at undgå at røre ved, strække eller beskadige lungearterien under forberedelsen. Mediet skal udskiftes kontinuerligt hvert 15. minut (3 gange) for at stabilisere test og evaluering, når lungearterien er anbragt i organbadkammeret. Beholderens forspænding skal øges til lidt over det krævede niveau og derefter gradvist reduceres, indtil det optimale er opnået (dvs. 1 g).
Flere eksperimentelle protokoller, såsom levedygtigheden af blodkar, tilstedeværelsen af endotelceller og virkningen af planteekstrakter på afslapning af blodkar, evalueres ved hjælp af denne teknik. Den belyste procedure for isolering af rotte IPA kan tilpasses andre arter (f.eks. Mus, kanin og menneske). Ikke desto mindre kan de optimale betingelser, der kræves til samling af et orgelbad, variere mellem forskellige dyremodeller og kan tilpasses i overensstemmelse hermed. Det er vigtigt, at de eksperimentelle betingelser ikke er en nøjagtig replikation af fysiologiske tilstande, og resultaterne kan ikke ekstrapoleres direkte til in vivo-fænomenet .
Denne IPA-isolationsmetode og vaskulære responsmålinger er praktiske tilgange til evaluering af vaskulær fysiologi, patologi og farmakologi. Det gør det muligt for forskere at studere vasokonstriktion og vasorelaxation i et isoleret, men velkontrolleret miljø. Derudover kan den tilpasses til at studere den terapeutiske virkning af lægemidler, der anvendes til pulmonal vaskulær patologi, såsom pulmonal arteriel hypertension.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende National Research Council of Thailand, Center of Excellence for Innovation in Chemistry (PERCH-CIC) og International Research Network (IRN61W0005) for at yde økonomisk støtte og Institut for Fysiologi Fakultet for Medicinsk Videnskab, Naresuan University, for støtte til forskningsfaciliteter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632 CAS NO. 348-12-3 |
|
| 4-aminopyridine (4-AP) | Aldrich Chemical | A78403 CAS NO. 504-24-5 |
|
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 CAS NO. 60-31-1 |
|
| Apamin | Sigma-Aldrich | A9459 CAS NO. 24345-16-2 |
|
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 CAS NO. 9048-46-8 |
|
| Calcium choride | Ajax Finechem | AJA960 CAS NO. 1707055184 |
|
| Charybdotoxin | Sigma-Aldrich | C7802 CAS NO. 95751-30-7 |
|
| Collagenase type 1A | Sigma-Aldrich | C9891 CAS NO. 9001-12-1 |
From Clostridium histolyticum |
| D(+)-Glucose monohydrate | Millipore Corporation | K50876942 924 CAS NO. 14431-43-7 |
|
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 CAS NO. 67-68-5 |
|
| Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 CAS NO. 67-42-5 |
|
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 CAS NO. 60-00-4 |
|
| Forceps 11 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Forceps 14 cm. | Rustless Dumoxel | - | |
| Glibenclamide | Sigma-Aldrich | G6039 CAS NO. 16673-34-0 |
|
| GraphPad Prism program | Software version 5.0 (San Diego, CA, USA) | ||
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 CAS NO. 7365-45-9 |
|
| Iberiotoxin | Sigma-Aldrich | I5904 CAS NO. 1002546960 |
recombinant from Mesobuthus tamulus |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 CAS NO. 53-86-1 |
|
| Labchart Program | Software version 7.0 (A.D. Instrument, Castle Hill, Australia). | ||
| Magnesium chloride | Ajax Finechem | 296 CAS NO. 1506254995 |
|
| Male Wistar rats | Nomura Siam International Co. Ltd., Bangkok, Thailand | ||
| NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) | Sigma-Aldrich | N5751 CAS NO. 51298-62-5 |
|
| Nicardipine | Sigma-Aldrich | N7510 CAS NO. 54527-84-3 |
|
| Organ bath 15 mL. | - | - | Specific order by the researchers |
| Papain | Sigma-Aldrich | P4762 CAS NO. 9001-73-4 |
FromPapaya Latex |
| Phenal red | Sigma-Aldrich | P5530 CAS NO. 34487-61-1 |
|
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 CAS NO. 61-76-7 |
|
| Potassium chloride | Kemaus | KA383 CAS NO. 7447-40-7 |
|
| Potassium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | EC231-913-4 CAS NO. 7778-77-0 |
|
| S+A2:E36odium chloride | Kemaus | KA465 CAS NO. 7647-14-5 |
|
| Scissors 11 cm. | Spall Stainless | - | |
| Scissors 14 cm. | Spall Stainless | - | |
| Sodium bicarbonate | Ajax Finechem | 475 CAS NO. 912466 |
|
| Sodium dihydrogenphosphate | Aldrich Chemical | 33,198-8 CAS NO. 7558-80-7 |
|
| Sodium hydroxide | Ajax Finechem | 482 CAS NO. 1506196602 |
|
| Sodium thiopental | Anesthal | JPN3010002 CAS NO. 1C 314/47 |
|
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 CAS NO. 107-35-7 |
|
| Waterbath WBU 45 | Memmert | 2766 CAS NO. - |
References
- Lyle, M. A., Davis, J. P., Brozovich, F. V. Regulation of pulmonary vascular smooth muscle contractility in pulmonary arterial hypertension: Implications for therapy. Frontiers in Physiology. 8, 614 (2017).
- Cyr, A. R., Huckaby, L. V., Shiva, S. S., Zuckerbraun, B. S. Nitric oxide and endothelial dysfunction. Critical Care Clinics. 36 (2), 307-321 (2020).
- Ruan, K. -H. Advance in understanding the biosynthesis of prostacyclin and thromboxane A2 in the endoplasmic reticulum membrane via the cyclo-oxygenase pathway. Mini Reviews in Medicinal Chemistry. 4 (6), 639-647 (2004).
- Del Pozo, R., Hernandez Gonzalez, I., Escribano-Subias, P. The prostacyclin pathway in pulmonary arterial hypertension: A clinical review. Expert Review of Respiratory Medicine. 11 (6), 491-503 (2017).
- Morgado, M., Cairrão, E., Santos-Silva, A. J., Verde, I. Cyclic nucleotide-dependent relaxation pathways in vascular smooth muscle. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (2), 247-266 (2012).
- Schmidt, K., de Wit, C. Endothelium-derived hyperpolarizing factor and myoendothelial coupling: The in vivo perspective. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Fan, G., Cui, Y., Gollasch, M., Kassmann, M. Elementary calcium signaling in arterial smooth muscle. Channels. 13 (1), 505-519 (2019).
- Wisutthathum, S., et al. Extract of Aquilaria crassna leaves and mangiferin are vasodilators while showing no cytotoxicity. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 9 (4), 237-242 (2019).
- Kamkaew, N., Paracha, T. U., Ingkaninan, K., Waranuch, N., Chootip, K. Vasodilatory effects and mechanisms of action of Bacopa monnieri active compounds on rat mesenteric arteries. Molecules. 24 (12), 2243 (2019).
- Chootip, K., Kennedy, C., Gurney, A. Characterization of P2 receptors mediating contraction of the rat isolated pulmonary vasculature. British Journal of Pharmacology. 131, 167 (2000).
- Paracha, T. U., et al. Elucidation of vasodilation response and structure activity relationships of N2, N4-disubstituted quinazoline 2, 4-diamines in a rat pulmonary artery model. Molecules. 24 (2), 281 (2019).
- Chootip, K., Gurney, A. M., Kennedy, C. Multiple P2Y receptors couple to calcium-dependent, chloride channels in smooth muscle cells of the rat pulmonary artery. Respiratory Research. 6 (1), 1-10 (2005).
- Wisutthathum, S., et al. Eulophia macrobulbon extract relaxes rat isolated pulmonary artery and protects against monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension. Phytomedicine. 50, 157-165 (2018).
- Kruangtip, O., et al. Curcumin analogues inhibit phosphodiesterase-5 and dilate rat pulmonary arteries. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (1), 87-95 (2015).
