Summary
为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒，我们修改了一种既定的 体内 方法来确定小肠运输。
Abstract
胃肠道 （GI） 蠕动对于正常的消化和吸收至关重要。在吸收营养的小肠中，运动性优化了消化和吸收。出于这个原因，小肠中的一些运动模式包括用于混合管腔内容物的分割和用于推进它们的蠕动。管腔内容物的物理性质调节小肠蠕动的模式。通过通过腔内容物和潜在的肠道蠕动对胃肠道机械感觉回路进行机械刺激，启动和调节复杂的胃肠道运动模式。然而，驱动这一过程的机械感觉机制仍然知之甚少。这主要是由于缺乏工具来剖析小肠如何处理不同物理性质的材料。为了研究小肠如何处理不同大小的颗粒，我们修改了一种既定的 体内 方法来确定小肠运输。我们用荧光液体或微小的荧光珠给活小鼠灌胃。30分钟后，我们解剖肠道，对荧光内容物在整个胃肠道中的分布进行成像。除了几何中心的高分辨率测量外，我们还使用可变尺寸的分档和光谱分析来确定不同材料如何影响小肠运输。我们已经探索了最近发现的“肠道接触”机制如何使用这种方法影响小肠蠕动。
Introduction
人类胃肠道（GI）是一个多英尺长的器官系统，大致近似为不同尺寸和物理性质的管子1。当内容物在其长度上移动时，胃肠道的主要功能是吸收对生命至关重要的物质。小肠专门负责营养吸收。小肠的运输受到严格调节，以匹配消化和吸收功能，从而产生各种运动模式。贝利斯和斯塔林在1899年描述了“肠道定律”2 ，展示了肠道中的收缩推进程序，今天称为蠕动反射;食物推注近端的节段收缩以推动其前进，远端节段放松以接收它。从理论上讲，仅这种模式就足以以流产方式运输材料，但一个多世纪的研究已经描绘了胃肠道收缩活动的更复杂的图景。人类认识到三个小肠运动期：迁移运动复合体 （MMC）、禁食期和餐后期3.在小鼠4，5中也报道了相同的模式。MMC是一种在大多数哺乳动物中保守的循环运动模式6，7。MMC 具有特征性的四相模式，可作为功能性胃肠道疾病的有用临床标志物7。这四个阶段按发生顺序依次是（I）静止，（II）不规则的低振幅收缩，（III）有规律的高振幅收缩，以及（IV）活动下降的斜坡下降期7。MMC标志着禁食期的主要运动模式3。禁食期的MMC清除小肠内容物，为下一餐做准备。
餐后运动模式针对消化和吸收功能进行了优化3.无论热量成分如何，最初的运输沿着小肠快速，内容物沿着肠道的长度传播，随后运输减慢8。通过增加接触表面积并减慢其速度以增加停留时间来优化吸收。一旦营养物质进入管腔内，主导模式包括紧密（相距 <2 cm）的不协调收缩（分段收缩），以及一些叠加的大幅度收缩跨越整个小肠长度（蠕动收缩）9。分段收缩将腔内内容物混合到位。偶尔大的蠕动收缩将内容物推向结肠。
这种过渡回MMC的时间取决于食物量和热量成分10。因此，小肠样本管腔提示以调节何时在运动期之间过渡。机械线索，例如管腔内容物11 的物理性质、管腔体积和壁张力，与胃肠道壁 12、13、14、15、16 中的机械感受器细胞接触。事实上，增加膳食的固体成分会导致小肠运输的增加17。我们推测物理性质，例如腔内内容物的液体或固态，必须与不同的机械感受器接触，因为它们在胃肠道壁上产生的各种力18。
测量人类体内胃肠道运输的金标准，如小鼠，是使用闪烁扫描测量的放射性示踪剂，因为它们离开胃或沿着结肠运输19，20。在哺乳动物中，小肠袢以不可预测的方式使小肠难以在体内可靠地成像，但正在取得进展21。此外，目前缺乏量化小肠如何处理不同特性和大小的颗粒的工具。这里的起点是一种黄金标准技术，该技术标准化了小肠运输22，23，24和屏障功能22的研究。它由用荧光材料管饲小鼠组成，等待胃肠道运动来运输材料，切除胃肠道，将其从胃到结肠分成几个部分，切片并匀浆腔内内容物以进行荧光定量。我们做了两项改进。首先，我们改变了管饲内容物的组成，包括荧光微珠，以确定小肠如何分布物理颗粒。其次，我们通过对从胃到结肠的整个胃肠道离体成像来提高空间分辨率，并使用可变大小的分箱来标准化我们对动物的分析。我们假设这揭示了对餐后阶段推进性收缩与分段性收缩平衡的新见解。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
此处描述的所有方法均已获得妙佑医疗国际机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。
1. 设置
- 快速8至10周龄小鼠4小时。为老鼠提供水。
注意：我们使用野生型雄性C57BL / 6J小鼠进行此处介绍的所有实验，但它们可以在任何品系，性别和基因型的小鼠上进行。 - 在4°C冰箱的50mL锥形管中冷却15mL蒸馏水。
- 使用带有磁力搅拌棒的热板在烧杯中将另外15mL蒸馏水加热至约80-90°C。
- 测量 0.5% 甲基纤维素，总共 30 mL （0.15 g）。
- 将甲基纤维素轻轻加入 15 mL 热水中，使其不会结块。在此过程中，甲基纤维素溶液将是浑浊的。
- 溶解后，从热板上取出烧杯，将 15 mL 冷冻水加入热烧杯中。
- 放入4°C冰箱直至溶液澄清，约15-20分钟。
- 澄清后，每 5 mL 0.5% 甲基纤维素溶液中称取 3 mg 异硫氰酸罗丹明 （RITC）-葡聚糖，混合混合。这是 代表性结果 部分中的液体状态。
- 或者，称取25mg荧光聚乙烯微球，并与200μL甲基纤维素溶液混合直至充分掺入。在管饲前通过涡旋确保微球的彻底掺入。实验者 必须 可视化混合物中悬浮微球的均匀分布。
- 由于 RITC-葡聚糖溶液对光敏感，因此请冷藏溶液。提前准备RITC-葡聚糖溶液和微什佩尔混合物，并在2个月内使用。使用前重悬微球混合物。
注意：不同大小的微球用于研究不同材料的胃肠道处理。在 代表性结果 部分，我们展示了使用小（直径：75-90μm）和较大（直径：180-212μm）微球的结果。
2.腔内内容物管饲法
- 通过将 18 Ga x 50 mm 进料管连接到 1 mL 注射器并吸取 200 μL RITC 溶液或微球溶液来制备管饲法。
- 使用单手约束技术手动约束禁食的动物25.请参阅该机构关于正确小鼠约束技术的信息。
- 轻轻地将喂食管插入小鼠的口腔和食道，直到它进入胃。
注意：管饲步骤对于成功的实验至关重要。它需要经验丰富的双手，能够始终如一地将管子插入每个鼠标大致相同的距离。此步骤需要由执行协议的实验人员进行标准化。同一个实验者应该给所有将相互比较的小鼠队列进行管饲。 - 慢慢将注射器内容物排出胃中，并小心地从鼠标上取出管子。
- 管饲后，将鼠标放回笼子。
- 处理管饲管。
- 根据需要对所需数量的动物重复该过程。
3.肠道清扫术
- 在开始解剖之前，打开 体内 成像仪器以使其达到温度。
- 管饲后30分钟处死小鼠。使用吸入二氧化碳处死小鼠，然后颈椎脱位以确保安乐死成功。
- 确认成功安乐死后，将鼠标仰卧放在解剖台上，并将其四个附属物固定在载物台上以进入腹部。用70%乙醇润湿腹部表面以润湿腹毛。
- 使用显微解剖钳拉扯皮肤并获得锋利的手术剪刀，在肛门上方1厘米处做一个横向切口。要暴露腹膜腔，请继续垂直向上腹部切口，直到肋骨。
- 用微夹钳轻轻地将盲肠向左移动，露出结肠远端。
- 用直肠近端的微解剖剪刀切开远端结肠。
- 向相反方向缓慢拉动，轻轻解开结肠、盲肠和小肠。
注意：将解剖的肠保持在连续的节段中将为研究者创造最大的便利。沿段撕裂将导致后续步骤更加困难。 - 使用显微解剖剪刀剪开胃的近端。
- 使用镊子将解剖的肠转移到测量表上（图1）。将胃放在0毫米处，并沿着尺子排列肠子直到200毫米。使用微解剖剪刀切割 200 毫米。重复这个过程，沿着标尺将肠道从0毫米对齐到200毫米，同时确信肠道的方向不会混淆。
- 小心避免在对齐尺子时拉伸肠道。
- 一旦组织排列在尺子上，排列盲肠使其与组织平行但不直接接触（如果在该区域内发现任何荧光，则需要盲肠和肠道之间的明显差异）。
- 将带有解剖组织的测量片放在黑暗区域，以便可以保留荧光，直到成像为止。
4. 离体成像
- 打开 体内 成像软件并登录。
- 初始化成像仪器，使其准备好进行图像采集。
- 将“激发”和“发射”字段设置为用于磁珠或RITC管饲法的相应颜色。红色（液体）：激发 535 nm/发射 600 nm。绿色（微球）：激发465纳米/发射520纳米。
- 将曝光设置为“自动”。
- 选择视野。
- 在将测量表放入仪器之前，请确保肠道在运输过程中没有移动。
- 将测量表放入视野内的仪器中。
- 牢固地关闭仪器的门，然后选择 快照 以拍摄视野。
- 将收集的照片保存到闪存驱动器进行分析。保存荧光和照片图像的单独捕获。照片和荧光的叠加表示荧光物质在胃肠道中的位置（图1）。
注意：我们建议将文件保存为标记图像文件 （.tif） 格式以供下游处理。
5. 分析
- 在图片编辑软件中打开荧光和照片图像文件。
- 调整两个图像的像素大小，使它们具有完全相同的尺寸（我们的惯例是将两个图像设置为 1280 x 850 像素 [高 x 宽]）。
- 关闭照片文件。以下步骤仅涉及荧光图像。
- 使用橡皮擦工具去除背景并使其透明。可能需要橡皮擦来去除剩余背景的补丁。
- 创建新图层。使其成为荧光信号的全黑背景。这可以通过选择黑色填充到图层并将图层拖动到带有荧光图像的图层下方来实现。
- 将新的荧光图像（仅包含黑色背景上的荧光信号）另存为新的.tif文件。
- 在 ImageJ 中打开新的荧光灯和照片图像。
- 通过选择“图像 >类型”> 32 位，将每个图像转换为 32 位图像。
- 通过选择“图像 >颜色”>“合并通道”来创建两者的合并图像。在打开的对话框中，选择灰色通道的照片文件和任何彩色通道下的荧光文件。
- 通过选择 “分析>设置比例”>单击以删除比例来关闭合并图像的比例。
- 在 ImageJ 中选择“矩形”工具。
- 在小肠的一部分周围画一个矩形。密切注意此感兴趣区域 （ROI） 的宽度，因为它应在所有 ROI 之间保持不变。标称值不是必需的，只是在此图像上绘制的所有ROI中保持一致[由于小肠占据几行，因此将在不同行的小肠的每个部分上绘制单独的ROI（图1）]。 图 2 显示了宽度值在 ImageJ 工具栏中的位置。
- 通过选择图像 >复制来复制投资回报率。仅选择与彩色通道对应的通道。
- 再次使用矩形工具在整个新图像上绘制 ROI。
- 通过选择 分析>图轮廓来检索荧光的轮廓。生成的图形在 y 轴上绘制沿 ROI 长度的每个像素的平均强度。在步骤5.12中选择这是分析的小肠切片的长度
- 打开值列表并将其复制到电子表格软件。
- 对不同标尺行上的小肠的每个部分重复步骤5.12-5.16。继续将值粘贴到同一电子表格文件中的每组前一组值的正下方，以便该列中的所有连续行都包含整个小肠长度的平均强度值。
- 在电子表格软件中，将每个平均强度值乘以在步骤5.12中创建的ROI矩形的恒定宽度。这将在每个点产生沿小肠的实际强度值。
注意：不同的动物在小肠长度上会略有不同。为了防止长度差异影响下游数据分析的结果，需要将强度值串分箱到所有实验样品中一致数量的箱中（图3、图4和图5显示了三种箱大小的结果）。 - 将强度值的数量除以所需的箱数。生成的商 S 确定每个箱中包含的强度值的数量。
- 使用综述公式确定每个原始强度值将去向的箱。此步骤将每个原始强度值放入箱中。每个原始强度值都按时间顺序使用整数 N 进行索引。商 N/S 确定分配给每个原始值的箱数。舍入公式应将此商四舍五入为没有小数的整数。
- 使用 averageif 公式生成每个条柱的值。目标是平均步骤 5.20 中分配给特定箱的原始值。因此，公式中的参数应该是：（1） 在步骤 5.20 中生成的分配箱，（2） 箱数，（3） 原始强度值。
注意：我们可以对分箱数据执行的第一个分析是几何中心分析，它量化了我们沿小肠观察到的最高荧光强度的程度（图4）。 - 在总荧光强度上归一化每个强度值。换句话说，将每个强度值除以所有强度的总和。
- 将每个规范化值乘以箱数。该产品反映了每个箱的相对重量，有助于总荧光强度。
- 将步骤5.23中生成的所有值相加，得到荧光信号中心的箱数。除以箱数，将几何中心表示为荧光中心行进的小肠分数。
注意：为了反映信号的空间分布，下一步是生成分档强度数据集的功率谱（图5）。 - 在电子表格软件中打开快速傅立叶变换 （FFT） 向导。选择输入作为分箱数据集，选择输出作为与箱相同行数的空集。
- 提取FFT的实际值分量。
- 将FFT的每个实际值提高到二次方。这会产生功率谱数据集。
- 选择功率谱数据集的前半部分并将其移动，使其位于后半部分下方。这具有在下一步绘制功率谱时将功率谱围绕中心频率中心的效果。
- 在 x-y 图的 y 轴上绘制功率谱，其中 x 轴值是从 -1 x（箱数/2）到（箱数/2）-1 的范围。对于 1000 个箱，轴值的范围为 -500 到 499。
- 应根据非零峰的扩散和这些非零峰的高度来比较每种动物的功率谱。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们显示了从步骤3开始的代表性结果。 图1 显示了完整的外植肠道，荧光测量值叠加。胃（紫色）与小肠（橙色）沿同一轴放置，但我们更喜欢将盲肠（蓝色）移到一侧，以防止与大肠（橙色）重叠。如左图所示，由于器官大小的原因，这并不总是可能的。我们在~200毫米处切开小肠以最大限度地覆盖连续节段，但这并不总是可能的，因为肠系膜限制了展开肠道的能力，以及我们倾向于不切开荧光颗粒或盲肠等结构。图1左侧面板中的红色强度和 中间 和右侧面板中的绿色强度被分类到不同大小的箱中，以生成 图3。仅提取橙色ROI（小肠）内的强度进行分析。提取小肠的全长（每个面板中的每个橙色ROI）进行分析。橙色ROI的宽度相同，如ImageJ所示（图2）。在分箱之前，通过按顺序放置所有强度将它们缝合在一起。 图3 显示了每个队列的平均荧光迹线±SEM;有关详细信息，请参阅图例。
最后两个图显示了分析的结果：几何中心和功率谱。几何中心测量 图3中荧光信号的平均位置，通过每个箱的信号强度对平均值进行加权。因此，迹线中较高的峰值使平均值更接近该峰值的位置。几何中心无法完全表征腔内内容物的空间分布。例如，可以从集中在单个点的推注和围绕同一点的扩散信号中获得相同的几何中心。几何中心测量的这种局限性在液体和较大磁珠之间的比较中很明显（图3 和 图4）。大部分液体荧光迹线以两个早期峰为中心，而较大的磁珠则沿小肠的整个长度显示多个峰（图3，左图和右图）。较大磁珠的荧光迹线分布更分散，但无论分档粒度如何，它的平均点与液体相似，这突出了仅聚焦几何中心的局限性（图 4）。为了解释小肠收缩的分布性质，我们将功率谱分析纳入了协议。功率谱分析的工作原理是将空间中的荧光分布解构为不同空间频率的多条正弦曲线。每个空间频率反映了荧光迹线中两个随机选择的点之间的距离。其中一些距离比其他距离更频繁地出现，因此每个距离都归因于强度（功率）。功率与两个随机点之间被该距离分隔的频率相关。通过绘制功率谱（图5），我们可以演示有多少空间频率对测量信号（频谱的扩展）有贡献，并比较这些贡献的相对强度（频谱的高度）。这使我们能够定量描述荧光沿胃肠道的扩散。
图1.在摄影和荧光测量之前，将解剖的肠取出并放置在层压尺纸上。 荧光强度被叠加和假着色以匹配强饲材料的天然荧光。左：液体异硫氰酸罗丹明（RITC）在红色光谱中发出荧光;中间：小（直径：75-90 μm）和右：较大（直径：180-212 μm）微珠均在绿色光谱中发出荧光。紫色、橙色、蓝色和粉红色框分别围绕每个标本中胃、小肠、盲肠和结肠的感兴趣区域 （ROI）。每个ROI的宽度在行之间保持一致，以避免在下游分析期间计算原始荧光强度时产生混淆。 请点击此处查看此图的大图。
图2.ImageJ 工具栏中感兴趣区域宽度（以像素为单位）的位置（黄色下划线）。 重申一下，仅当比例被删除时，宽度才会以像素为单位显示（步骤 5.10）。 请点击此处查看此图的大图。
图3.沿着小肠长度的荧光迹线。 线表示给定箱的平均荧光。阴影区域表示平均值的标准误差 （SEM）。荧光材料的分布根据腔内内容物（柱）的材料特性而变化。左：管饲后30分钟液体（n = 7只小鼠）分布在几个小肠段。中右：小（n = 6只小鼠）和较大的（n = 5只小鼠）珠子在管饲后30分钟沿小肠分布得更宽。增加用于对相同原始数据集进行排序的箱数，可以发现使用较少的箱（行）无法解析的粒度跟踪特征。较小的箱子可降低测量不确定性，提高空间分辨率，并更好地反映小肠收缩的分布成分。 请点击此处查看此图的大图。
图4.用液体RITC，小珠子（75-90μm）和较大珠子（180-212μm）管饲后30分钟小肠荧光分布的几何中心（平均±SEM，n = 7，n = 6，n = 5，单因子方差分析与Bonferroni校正）。 料箱大小不影响小珠子在管饲后 30 分钟比液体更远的运输解释，但较大的磁珠分布如此广泛，以至于与液体和小珠子相比，它们的几何中心没有显着差异（*P < 0.05. ns = 无统计学意义）。 请点击此处查看此图的大图。
图5.功率谱按材料属性（列）和箱大小（行）分类。 空间分辨率的提高和更小的分箱是显而易见的。顶行：在广泛分箱的光谱中几乎无法区分差异。底行：随着箱尺寸的缩小，我们可以欣赏到较大磁珠频谱中存在的显着主导频率，但在小磁珠的频谱中则不然。这些额外的主频率中的一些（但不是全部）存在于液体频谱中。使用底行光谱，我们可以与 图3中的荧光迹线进行比较。 在图3中，液体荧光迹线显示两个突出的峰，与功率谱中的几个主峰相关。 图3 中的小磁珠迹线显示单个主峰，与功率谱中的单个主峰相关。 图3 中较大的磁珠迹线显示更多的显峰。因此，功率谱显示出更多的主频率。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
胃肠道与其他管状器官（如血管）一样，需要机械传感器和效应器来维持稳态26，27，28。然而，胃肠道的独特之处在于，穿过它的材料的物理性质在膳食中不是恒定的。各种物理性质（固体、液体和气体）的腔内内容物通过肠道，对胃肠道机械感受器产生不同的机械输入。事实上，结肠中的不同机械刺激通过不同的途径感知和传递29。
从技术上讲，任何执行常规鼠标工作的人都可以访问该协议，但需要密切关注一些关键步骤。我们发现在开始研究之前，禁食小鼠很重要，因为它消除了先前膳食稀释荧光信号的贡献。此外，喂食标准饮食的小鼠表现出来自饮食成分的腔内荧光，特别是叶绿素成分30。通过禁食和荧光团选择，我们防止食物荧光干扰本协议中概述的实验的受控条件。我们建议实验者独立确认所选的禁食期足以消除小肠中的非特异性荧光，因为这可能因菌株、年龄或性别而异。实验者应目视评估管饲内容物的均匀分布。否则，它们的交付和研究结果将存在不确定性。管饲应始终由同一实验者进行，最好是具有该技术经验的人。实验者应致力于将内容物一致地输送到胃部。在食道中或仅在胃中发现荧光是将动物排除在分析之外的理由，因为不确定小肠是否具有相同的途径来获取管饲内容物。管饲后，等待时间可以缩短到 15 分钟或延长到 90 分钟，具体取决于早期还是晚期运输阶段是否感兴趣22.使用液体强饲法的原始方案表明，大部分材料在30分钟后驻留在小肠中。此外，虽然在解剖步骤中匆忙工作至关重要，但必须注意不要干扰腔内内容物的位置，也不要使胃肠道破裂。
该方案是从先前发表的方法演变而来的，该方法通过将小肠切成5到10个片段并在荧光/放射性测量之前均质化腔内内容物来物理分箱22，23，24。以前的方法很重要，因为它标准化了小肠运输的测量。众所周知，小肠在腹腔内以复杂和不可预测的模式循环。无论物种如何，基于成像的运输研究都是具有挑战性的 31，32.虽然我们的协议仍然是一个无法扩展到人类的终端实验，但我们显着提高了空间分辨率，并利用这种改进来解决区域过境问题，并将其转化为对小肠内扩散（功率谱）的无偏测量。
在此协议中，空间分辨率受到成像系统中相机分辨率的限制。由于分箱使动物的小肠长度标准化，因此我们可以直接比较腔内内容物的平均位置。 图3 清楚地显示了大箱尺寸导致的剧烈平滑、不确定性增加和分辨率降低。几何中心量化沿胃肠道的荧光中心（图4）。正如预期的那样，该测量值不受箱大小的显着影响。功率谱是一种无偏且互补的方法，可标准化 图3中荧光迹线中的峰和扩散分析。提高分辨率可改善计算的光谱，从而可以显示荧光迹线之间的可见差异（图5）。在低分辨率（10个箱）下，无论是通过几何中心还是光谱评估，都很难区分液体和较大的磁珠，即使从荧光迹线中可以清楚地看出它们在空间中的分布并不相似。在更高的分辨率（1000个箱）下，几何中心仍然相似（因为几何中心是平均测量值），但功率谱可以可靠地用于区分两个队列。值得注意的是，荧光迹线适用于其他类型的分析，例如前沿测量。在开始实验之前，可以在样本数量计算期间使用几何中心的预期变化。知道液体的几何中心约为0.4-0.518，我们在每组中至少使用五只小鼠来统计解决高达45%的变化。
我们扩大了范围，并使用该协议来研究小肠内固体的运输。与液体一样，我们将固体微球灌胃。幽门括约肌位于胃-小肠过渡处。该括约肌用作尺寸排除过滤器。在小鼠中，大小截止值为~300μm，颗粒<300μm在进入小肠时没有遇到阻力33，但这种方法也适用于我们在最近的研究中使用的稍大的颗粒18。我们在这里选择了微球大小，以提供一系列大小，以补充最近的研究。我们使用了两种直径为75-90μm和180-212μm的商业荧光珠制剂。 图1 显示了不同队列中胃中相似的荧光密度和分布，表明胃中没有差异地保留液体和颗粒。这里提供的原始数据展示了野生型小鼠的小肠如何处理液体和微观固体。到目前为止，我们在每个独立实验中使用了一个尺寸范围的磁珠。未来的研究可以集中在如何处理不同大小颗粒的混合物，以及将各种物理性质的荧光液与荧光珠混合，以确定小肠如何处理更真实的乳糜混合物。
这里报告的分布差异表明，由不同性质的材料激活的运动模式存在差异。我们假设分段与推进收缩的平衡决定了材料通过小肠的距离和均匀程度。与液体相比，小珠子的几何中心沿着小肠更远，这表明小固体颗粒参与推进收缩。另一方面，虽然较大磁珠的几何中心与液体相似，但光谱分析显示空间分布存在显着差异，这可能是较大磁珠设置中更多分割收缩的结果。我们假设小肠利用大小判别（一种机械感觉回路）作为决定收缩类型之间平衡的输入之一。例如，Dogiel II型神经元是机械感觉神经元，推测其在指导从推进性收缩到分段收缩的转换中发挥作用16，34。这些有趣的推测需要进一步研究，以确定胃肠道感知物理特性并将其转化为生理输出（如收缩）的机制。
我们相信该协议将有助于弥合从分子到细胞再到器官功能的差距的附加工具。我们认识到胃肠道上皮机械感受器与皮肤机械感受器具有发育和结构相似性35。使用上述协议，我们帮助证明了“肠道触摸”的感觉作用，其中这些胃肠道上皮机械感受器感知光机械刺激并参与内在触觉敏感性18。我们预计该协议将证明同样有助于研究其他感觉回路如何促进小肠运输。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有。
Acknowledgments
我们感谢林赛·巴斯比夫人的行政协助和乔尔·皮诺先生的媒体支持。NIH拨款支持这项工作：DK123549，AT010875，DK052766，DK128913和妙佑医疗国际胃肠病学细胞信号传导中心（DK084567）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 664 | other mice can be used with this protocol |
| Dissection tools | n/a | n/a | |
| Excel software | Microsoft | n/a | used for spreadsheet analysis |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g | "smaller beads" in the manuscript |
| Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g | Cospheric | UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g | "larger beads" in the manuscript |
| Gavage needles | Instech | FTP-18-50-50 | |
| ImageJ software | n/a | n/a | used to extract fluorescence profile |
| Laminated ruler paper (prepared in-house) | n/a | n/a | |
| Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) | Sigma | M0262 | |
| Photoshop software | Adobe | n/a | used for image processing |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma | r8881-100mg | "liquid" condition in the manuscript |
| Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
References
- Stevens, C. E., Hume, I. D. Comparative Physiology of the Vertebrate Digestive System. 2nd ed. , Cambridge University Press. (2004).
- Bayliss, W. M., Starling, E. H. The movements and innervation of the small intestine. The Journal of Physiology. 24 (2), 99-143 (1899).
- Husebye, E. The patterns of small bowel motility: physiology and implications in organic disease and functional disorders. Neurogastroenterology and Motility. (11), 141-161 (1999).
- Bush, T. G., et al. Effects of alosetron on spontaneous migrating motor complexes in murine small and large bowel in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (4), 974-983 (2001).
- Der-Silaphet, T., et al. Interstitial cells of cajal direct normal propulsive contractile activity in the mouse small intestine. Gastroenterology. 114 (4), 724-736 (1998).
- Szurszewski, J. H. A migrating electric complex of the canine small intestine. American Journal of Physiology. 217 (6), 1757-1763 (1969).
- Deloose, E., et al. The migrating motor complex: control mechanisms and its role in health and disease. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (5), 271-285 (2012).
- Johansoon, C., Ekelund, K. Relation between body weight and the gastric and intestinal handling of an oral caloric load. Gut. 17, 456-462 (1976).
- Sarna, S. K., et al. Spatial and temporal patterns of human jejunal contractions. American Journal of Physiology. 257 (1), 423-432 (1989).
- Hall, K. E., El-Sharkawy, T. Y., Diamant, N. E. Vagal control ofcanine postprandial upper gastrointestinal motility. American Journal of Physiology. 250, 501-510 (1986).
- Mayer, E. A. Gut feelings: the emerging biology of gut-brain communication. Nature Reviews Neuroscience. 12 (8), 453-466 (2011).
- Alcaino, C., et al. A population of gut epithelial enterochromaffin cells is mechanosensitive and requires Piezo2 to convert force into serotonin release. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Sciences. 115 (32), 7632-7641 (2018).
- Kugler, E. M., et al. Mechanical stress activates neurites and somata of myenteric neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 342 (2015).
- Mazzuoli, G., Schemann, M. Mechanosensitive enteric neurons in the myenteric plexus of the mouse intestine. PloS One. 7 (7), 39887 (2012).
- Won, K. J., Sanders, K. M., Ward, S. M. Interstitial cells of Cajal mediate mechanosensitive responses in the stomach. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (41), 14913-14918 (2005).
- Mao, Y., Wang, B., Kunze, W. Characterization of myenteric sensory neurons in the mouse small intestine. Journal of Neurophysiology. 96 (3), 998-1010 (2006).
- McIntyre, A., et al. Effect of bran, ispaghula, and inert plastic particles on gastric emptying and small bowel transit in humans: the role of physical factors. Gut. 40 (2), 223-227 (1997).
- Treichel, A. J., et al. Specialized mechanosensory epithelial cells in mouse gut intrinsic tactile sensitivity. Gastroenterology. 162 (2), 535-547 (2022).
- Bharucha, A. E., Anderson, B., Bouchoucha, M. More movement with evaluating colonic transit in humans. Neurogastroenterology and Motility. 31 (2), 13541 (2019).
- Camilleri, M., et al. Human gastric emptying and colonic filling of solids characterized by a new method. American Journal of Physiology. 257 (2), 284-290 (1989).
- Wang, D., et al. Trans-illumination intestine projection imaging of intestinal motility in mice. Nature Communications. 12 (1), 1682 (2021).
- Woting, A., Blaut, M. Small intestinal permeability and gut-transit time determined with low and high molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextrans in C3H mice. Nutrients. 10 (6), 685 (2018).
- Miller, M. S., Galligan, J. J., Burks, T. F. Accurate measurement of intestinal transit in the rat. The Journal of Pharmacologial and Toxicological Methods. 6 (3), 211-217 (1981).
- Moore, B. A., et al. Inhaled carbon monoxide suppresses the development of postoperative ileus in the murine small intestine. Gastroenterology. 124 (2), 377-391 (2003).
- Machholz, E., et al. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
- Baeyens, N., Schwartz, M. A. Biomechanics of vascular mechanosensation and remodeling. Molecular Biology of the Cell. 27 (1), 7-11 (2016).
- Ye, G. J., Nesmith, A. P., Parker, K. K. The role of mechanotransduction on vascular smooth muscle myocytes' cytoskeleton and contractile function. The Anatomical Record (Hoboken). 297 (9), 1758-1769 (2014).
- Mercado-Perez, A., Beyder, A. Gut feelings: mechanosensing in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. , 1-14 (2022).
- Brierley, S. M., et al. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- Inoue, Y., et al. Diet and abdominal autofluorescence detected by in vivo fluorescence imaging of living mice. Molecular Imaging. 7 (1), 21-27 (2008).
- Szarka, L. A., Camilleri, M. Methods for the assessment of small-bowel and colonic transit. Seminars in Nuclear Medicine. 42 (2), 113-123 (2012).
- Padmanabhan, P., et al. Gastrointestinal transit measurements in mice with 99mTc-DTPA-labeled activated charcoal using NanoSPECT-CT. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 3 (1), 1-8 (2013).
- Jang, S. F., et al. Size discrimination in rat and mouse gastric emptying. Biopharmaceutics and Drug Disposition. 34 (2), 107-124 (2013).
- Zhu, Y. F., et al. Enteric sensory neurons communicate with interstitial cells of Cajal to affect pacemaker activity in the small intestine. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 446 (7), 1467-1475 (2014).
- Treichel, A. J., Farrugia, G., Beyder, A. The touchy business of gastrointestinal (GI) mechanosensitivity. Brain Research. 1693, 197-200 (2018).
