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Medicine

Estudio de la mecanodetección murina del intestino delgado de partículas luminales

Published: March 18, 2022 doi: 10.3791/63697
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,4
1Enteric NeuroScience Program (ENSP), Division of Gastroenterology & Hepatology, Department of Medicine, Mayo Clinic, 2Medical Scientist Training Program (MSTP), Mayo Clinic, 3Easy Learning Labs, 4Department of Physiology & Biomedical Engineering (PBME), Mayo Clinic
* These authors contributed equally

Summary

Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado.

Abstract

La motilidad gastrointestinal (GI) es crítica para la digestión y absorción normales. En el intestino delgado, que absorbe los nutrientes, la motilidad optimiza la digestión y la absorción. Por esta razón, algunos de los patrones de motilidad en el intestino delgado incluyen segmentación para la mezcla de contenidos luminales y peristaltismo para su propulsión. Las propiedades físicas de los contenidos luminales modulan los patrones de motilidad del intestino delgado. La estimulación mecánica de los circuitos mecanosensoriales gastrointestinales mediante el tránsito de contenidos luminales y la motilidad intestinal subyacente inicia y modula patrones motores gastrointestinales complejos. Sin embargo, los mecanismos mecanosensoriales que impulsan este proceso siguen siendo poco conocidos. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas para diseccionar cómo el intestino delgado maneja materiales de diferentes propiedades físicas. Para estudiar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes tamaños, hemos modificado un método in vivo establecido para determinar el tránsito del intestino delgado. Hacemos ratones vivos con líquido fluorescente o pequeñas perlas fluorescentes. Después de 30 minutos, diseccionamos los intestinos para obtener imágenes de la distribución de contenidos fluorescentes en todo el tracto gastrointestinal. Además de las mediciones de alta resolución del centro geométrico, utilizamos binning de tamaño variable y análisis espectral para determinar cómo los diferentes materiales afectan el tránsito del intestino delgado. Hemos explorado cómo un mecanismo de "toque intestinal" recientemente descubierto afecta la motilidad del intestino delgado utilizando este enfoque.

Introduction

El tracto gastrointestinal (GI) humano es un sistema de órganos de varios pies de largo, aproximadamente aproximado como un tubo de diferentes dimensiones y propiedades físicas1. A medida que el contenido se mueve a través de su longitud, la función principal del tracto gastrointestinal es absorber sustancias críticas para la vida. El intestino delgado es específicamente responsable de la absorción de nutrientes. El tránsito del intestino delgado está estrechamente regulado para que coincida con las funciones de digestión y absorción, lo que resulta en varios patrones de motilidad. Bayliss y Starling describieron la "ley del intestino"2 en 1899, mostrando el programa de propulsión contráctil en el intestino conocido hoy como el reflejo peristáltico; El segmento proximal al bolo alimentario se contrae para impulsarlo hacia adelante, y el segmento distal se relaja para recibirlo. En teoría, este patrón por sí solo podría ser suficiente para transportar material por vía oral, pero más de un siglo de investigación ha pintado una imagen más compleja de la actividad contráctil en el tracto gastrointestinal. En humanos se reconocen tres períodos de motilidad del intestino delgado: el complejo motor migratorio (MMC), el período de ayuno y el período postprandial3. Los mismos patrones han sido reportados en ratones 4,5. El MMC es un patrón motor cíclico conservado en la mayoría de los mamíferos 6,7. La MMC tiene un patrón característico de cuatro fases que sirve como un marcador clínico útil en los trastornos gastrointestinales funcionales7. Las cuatro fases, en orden de ocurrencia, son (I) inactividad, (II) contracciones irregulares de baja amplitud, (III) contracciones regulares de alta amplitud y (IV) período de reducción de la actividad decreciente7. La MMC marca el patrón motor principal del período de ayuno3. Las MMC del período de ayuno aclaran el contenido del intestino delgado en preparación para la próxima comida.

Los patrones motores del período postprandial están optimizados para las funciones digestivas y absorbentes3. Independientemente de la composición calórica, el tránsito inicial es rápido a lo largo del intestino delgado, el contenido se extiende a lo largo del intestino y el tránsito posteriormente se ralentiza8. La absorción se optimiza aumentando el área de superficie de contacto y ralentizándola para aumentar el tiempo de residencia. Una vez que los nutrientes están dentro de la luz, el patrón dominante consiste en contracciones cercanas (separadas por <2 cm) descoordinadas (contracciones de segmentación), con algunas contracciones superpuestas de gran amplitud que abarcan toda la longitud del intestino delgado (contracciones peristálticas)9. Las contracciones de segmentación mezclan el contenido intraluminal en su lugar. Las grandes contracciones peristálticas ocasionales impulsan el contenido hacia el colon.

El momento de esta transición de regreso a las MMC depende del volumen de alimentos y la composición calórica10. Por lo tanto, el intestino delgado toma muestras de señales luminales para regular cuándo hacer la transición entre los períodos de motilidad. Las señales mecánicas, como las propiedades físicas del contenido luminal11, el volumen luminal y la tensión de la pared, activan las células mecanorreceptoras en la pared GI 12,13,14,15,16. De hecho, el aumento del componente sólido de una comida conduce a un aumento en el tránsito del intestino delgado17. Especulamos que las propiedades físicas, como el estado líquido o sólido del contenido intraluminal, deben involucrar diferentes mecanorreceptores debido a las diversas fuerzas que generan en la pared GI18.

El estándar de oro para medir el tránsito GI in vivo en humanos, como en ratones, es el uso de trazadores radiactivos medidos por gammagrafía cuando salen del estómago o transitan a lo largo del colon19,20. En los mamíferos, las bucles del intestino delgado de manera impredecible, lo que dificulta la obtención de imágenes in vivo de manera confiable, pero se están logrando avances21. Además, actualmente hay una falta de herramientas para cuantificar cómo el intestino delgado maneja partículas de diferentes propiedades y tamaños. El punto de partida aquí fue una técnica estándar de oro que estandariza el estudio del tránsito del intestino delgado 22,23,24 y la función de barrera 22. Consiste en gavagar ratones con un material fluorescente, esperando que la motilidad GI transporte el material, extirpando el tracto gastrointestinal, segmentándolo en varias secciones desde el estómago hasta el colon, seccionando y homogeneizando los contenidos intraluminales para la cuantificación de fluorescencia. Hicimos dos mejoras. Primero, alteramos la composición del contenido gavagado para incluir perlas microscópicas fluorescentes para determinar cómo el intestino delgado distribuye las partículas físicas. En segundo lugar, mejoramos la resolución espacial al obtener imágenes de todo el tracto gastrointestinal desde el estómago hasta el colon ex vivo y utilizamos binning de tamaño variable para estandarizar nuestro análisis en animales. Postulamos que esto revela nuevos conocimientos sobre el equilibrio de las contracciones propulsivas versus segmentadas durante la fase postprandial.

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Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) de Mayo Clinic.

1. Configuración

  1. Ratones rápidos de 8 a 10 semanas de edad durante 4 h. Proporcionar a los ratones acceso al agua.
    NOTA: Utilizamos ratones machos C57BL / 6J de tipo salvaje para todos los experimentos presentados aquí, pero se pueden realizar en ratones de cualquier cepa, género y genotipo.
  2. Enfriar 15 ml de agua destilada en un tubo cónico de 50 ml en un refrigerador a 4 °C.
  3. Caliente otros 15 ml de agua destilada en un vaso de precipitados usando una placa caliente con una barra agitadora magnética a aproximadamente 80-90 ° C.
  4. Medir 0,5% de metilcelulosa para un total de 30 ml (0,15 g).
  5. Agregue suavemente metilcelulosa a 15 ml de agua caliente para que no se aglutine. La solución de metilcelulosa estará turbia durante este proceso.
  6. Una vez disuelto, retire el vaso de precipitados de la placa caliente y agregue los 15 ml de agua fría al vaso de precipitados caliente.
  7. Colocar en nevera a 4 °C hasta que la solución esté clara, aproximadamente 15-20 min.
  8. Cuando esté claro, pesar 3 mg de isotiocianato de rodamina (RITC)-dextrano por 5 ml de solución de metilcelulosa al 0,5% y mezclar para combinar. Esta es la condición líquida en la sección Resultados representativos .
    1. Alternativamente, pesar 25 mg de microesferas de polietileno fluorescente y mezclar con 200 μL de la solución de metilcelulosa hasta que esté bien incorporada. La incorporación completa de microesferas está asegurada por vórtice antes de la sonda nasogástrica. El experimentador debe visualizar la distribución homogénea de microesferas suspendidas en la mezcla.
    2. Como la solución RITC-dextrano es sensible a la luz, refrigere la solución. Prepare la solución RITC-dextrano y la mezcla de microshpere por adelantado y úsela dentro de los 2 meses. Vuelva a suspender la mezcla de microesferas antes de usarla.
      NOTA: Las microesferas de diferentes tamaños se utilizan para estudiar el manejo gastrointestinal de diferentes materiales. En la sección Resultados representativos , demostramos los resultados del uso de microesferas pequeñas (diámetro: 75-90 μm) y más grandes (diámetro: 180-212 μm).

2. Sonda de contenido intraluminal

  1. Prepare el sonda nasogástrica conectando una sonda de alimentación de 18 Ga x 50 mm a una jeringa de 1 ml y extrayendo 200 μL de solución RITC o solución de microesfera.
  2. Sujetar manualmente al animal en ayunas utilizando la técnica de sujeción con una sola mano25. Consulte la información de la institución sobre las técnicas adecuadas de restricción murina.
  3. Inserte suavemente la sonda de alimentación a través de la boca y el esófago del ratón hasta que entre en el estómago.
    NOTA: El paso de sonda es crítico para un experimento exitoso. Requiere manos experimentadas que puedan insertar consistentemente el tubo aproximadamente a la misma distancia en cada ratón. Este paso debe ser estandarizado por los experimentadores que llevan a cabo el protocolo. El mismo experimentador debe hacer gavage todas las cohortes de ratones que se compararán entre sí.
  4. Expulse lentamente el contenido de la jeringa hacia el estómago y retire con cuidado el tubo del ratón.
  5. Siguiendo el gavage, devuelve el ratón a la jaula.
  6. Deseche el tubo nasogásico.
  7. Repita el proceso según sea necesario para el número deseado de animales.

3. Disección intestinal

  1. Antes de comenzar las disecciones, encienda el instrumento de imágenes in vivo para permitir que alcance la temperatura.
  2. Sacrifica el ratón 30 minutos después del sonda nasogástrica. Use la inhalación de dióxido de carbono para sacrificar al ratón, seguida de una dislocación cervical para garantizar una eutanasia exitosa.
  3. Después de confirmar la eutanasia exitosa, coloque el ratón en posición supina en una etapa de disección y fije sus cuatro apéndices en el escenario para tener acceso al abdomen. Mojar la superficie del abdomen con etanol al 70% para mojar los pelos abdominales.
  4. Use pinzas de microdisección (# 5) para tirar de la piel y adquirir tijeras quirúrgicas afiladas para hacer una incisión transversal a 1 cm por encima del ano. Para exponer la cavidad intraperitoneal, continúe la incisión verticalmente hacia arriba del abdomen hasta la caja torácica.
  5. Mueva suavemente el ciego hacia la izquierda con las pinzas de microdisección para exponer el colon distal.
  6. Cortar el colon distal con tijeras de microdisección justo proximal al recto.
  7. Desenrede suavemente el colon, el ciego y el intestino delgado tirando lentamente en la dirección opuesta.
    NOTA: Mantener los intestinos disecados en un segmento continuo creará la mayor facilidad para el investigador. Las rasgaduras y desgarros a lo largo del segmento harán que los pasos posteriores sean más difíciles.
  8. Use tijeras de microdisección para cortar proximal al estómago.
  9. Use fórceps para transferir los intestinos disecados a la hoja de medición (Figura 1). Coloque el estómago a 0 mm y coloque los intestinos a lo largo de la regla hasta 200 mm. Use tijeras de microdisección para cortar a 200 mm. Repita este proceso de alineación de los intestinos de 0 mm a 200 mm a lo largo de las reglas mientras permanece seguro de que la orientación de los intestinos no se confunde.
    1. Tenga cuidado de evitar estirar los intestinos mientras se alinea con las reglas.
  10. Una vez que el tejido esté dispuesto en la regla, coloque el ciego de modo que esté paralelo con el tejido pero no en contacto directo con él (si se encuentra fluorescencia dentro de esa región, entonces se necesitará una clara distinción de diferencia entre el ciego y los intestinos).
  11. Coloque la hoja de medición con el tejido diseccionado en un área oscura para que la fluorescencia se pueda preservar hasta que sea hora de obtener imágenes.

4. Imágenes ex vivo

  1. Abra el software de imágenes in vivo e inicie sesión.
  2. Inicialice el instrumento de imagen para que esté listo para la adquisición de imágenes.
  3. Establezca los campos 'Excitación' y 'Emisión' en el color correspondiente utilizado para el talón o el sonda RITC. Rojo (líquido): excitación 535 nm /emisión 600 nm. Verde (microesferas): excitación 465 nm /emisión 520 nm.
  4. Establezca la exposición en 'Auto'.
  5. Seleccione el campo de visión.
  6. Antes de colocar la hoja de medición en el instrumento, asegúrese de que los intestinos no se hayan desplazado durante el transporte.
  7. Coloque la hoja de medición en el instrumento dentro del campo de visión.
  8. Cierre de forma segura la puerta del instrumento y seleccione Instantánea para fotografiar el campo de visión.
  9. Guarde las imágenes recopiladas en una unidad flash para su análisis. Guarde capturas individuales de las imágenes fluorescentes y fotográficas. Una superposición de la fotografía y la fluorescencia indica la ubicación del material fluorescente en el tracto gastrointestinal (Figura 1).
    NOTA: Se recomienda guardar los archivos en el formato Archivo de imagen de etiqueta (.tif) para el procesamiento posterior.

5. Análisis

  1. Abra los archivos de imagen fluorescente y fotográfica en un software de edición de imágenes.
  2. Ajuste el tamaño de píxel de ambas imágenes para que tengan exactamente las mismas dimensiones (nuestra convención era establecer ambas imágenes en 1280 píxeles por 850 píxeles [altura x anchura]).
  3. Cierre el archivo de fotografía. Los siguientes pasos implican solo la imagen fluorescente.
  4. Utilice una herramienta de borrador para eliminar el fondo y hacerlo transparente. Es posible que se necesite un borrador para eliminar parches del fondo restante.
  5. Cree una nueva capa. Conviértalo en un fondo completamente negro para la señal fluorescente. Esto se puede lograr eligiendo un relleno negro para la capa y arrastrando la capa para que quede debajo de la capa con la imagen fluorescente.
  6. Guarde la nueva imagen fluorescente, que contiene solo la señal fluorescente sobre un fondo negro, como un nuevo archivo .tif.
  7. Abra las nuevas imágenes fluorescentes y fotográficas en ImageJ.
  8. Convierta cada imagen en una imagen de 32 bits eligiendo Imagen > Tipo > 32 bits.
  9. Cree una imagen combinada de ambos seleccionando Imagen > Color > Combinar canales. En el cuadro de diálogo que se abre, seleccione el archivo de fotografía para el canal gris y el archivo fluorescente debajo de cualquier canal de color.
  10. Desactive la escala de la imagen combinada seleccionando Analizar > Establecer escala > Haga clic para quitar escala.
  11. Seleccione la herramienta "Rectángulo" en ImageJ.
  12. Dibuje un rectángulo alrededor de una sección del intestino delgado. Preste mucha atención al ancho de esta región de interés (ROI), ya que debe permanecer constante entre todos los ROI. El valor nominal no es esencial, solo que se mantiene consistente en todos los ROI dibujados en esta imagen [dado que el intestino delgado se hace cargo de varias filas, los ROI individuales se dibujarán sobre cada sección del intestino delgado en una fila diferente (Figura 1)]. La figura 2 muestra la ubicación del valor de ancho en la barra de herramientas ImageJ.
  13. Duplique el ROI seleccionando Imagen > Duplicar. Seleccione sólo el canal correspondiente al canal de color.
  14. Utilice la herramienta rectangular de nuevo para dibujar un ROI sobre toda la nueva imagen.
  15. Recupere un perfil de la fluorescencia seleccionando Analizar > perfil de trazado. El gráfico resultante traza en el eje y la intensidad promedio de cada píxel a lo largo de la longitud del ROI. Esto se seleccionó en el paso 5.12 para ser la longitud de la sección analizada del intestino delgado
  16. Abra la lista de valores y cópielos en un software de hoja de cálculo.
  17. Repita los pasos 5.12-5.16 para cada sección del intestino delgado en una fila de regla diferente. Siga pegando los valores en el mismo archivo de hoja de cálculo inmediatamente debajo de cada conjunto anterior de valores, de modo que todas las filas continuas de esa columna contengan el valor de intensidad promedio para toda la longitud del intestino delgado.
  18. En el software de hoja de cálculo, multiplique cada valor de intensidad promedio por el ancho constante del rectángulo ROI creado en el paso 5.12. Esto producirá el valor de intensidad real a lo largo del intestino delgado en cada punto.
    NOTA: Diferentes animales tendrán ligeras variaciones en la longitud del intestino delgado. Para evitar que las diferencias de longitud afecten el resultado del análisis de datos posteriores, la cadena de valores de intensidad debe agruparse en un número constante de contenedores en todas las muestras experimentales (la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5 muestran los resultados para tres tamaños de contenedores).
  19. Divida el número de valores de intensidad por el número de contenedores deseados. El cociente resultante S determina el número de valores de intensidad que se incluyen en cada contenedor.
  20. Determine el contenedor donde irá cada valor de intensidad sin procesar utilizando una fórmula de resumen. Este paso coloca cada valor de intensidad sin procesar en un contenedor. Cada valor de intensidad sin procesar se indexa cronológicamente con el entero N. El cociente N/S determina el número de bin asignado a cada valor bruto. La fórmula de redondeo debe redondear este cociente a un número entero sin decimales.
  21. Genere el valor de cada contenedor mediante una fórmula averageif. El objetivo es promediar los valores brutos asignados a un contenedor específico en el Paso 5.20. Por lo tanto, los argumentos en la fórmula deben ser: (1) contenedores asignados generados en el Paso 5.20, (2) número de bin, (3) valores de intensidad sin procesar.
    NOTA: El primer análisis que podemos realizar en los datos agrupados es un análisis del centro geométrico, que cuantifica hasta qué punto observamos la mayor intensidad fluorescente a lo largo del intestino delgado (Figura 4).
  22. Normalice cada valor de intensidad sobre la intensidad fluorescente total. En otras palabras, divide cada valor de intensidad por la suma de todas las intensidades.
  23. Multiplique cada valor normalizado por el número de bin. El producto refleja el peso relativo de cada contenedor, contribuyendo a la intensidad fluorescente total.
  24. La suma de todos los valores generados en el Paso 5.23 produce el número de contenedor en el centro de la señal fluorescente. Divide por el número de contenedores para expresar el centro geométrico como la fracción del intestino delgado recorrida por el centro fluorescente.
    NOTA: Para reflejar la distribución espacial de la señal, el siguiente paso es generar el espectro de potencia del conjunto de datos de intensidad binned (Figura 5).
  25. Abra un asistente de transformada rápida de Fourier (FFT) en el software de hoja de cálculo. Seleccione la entrada como el conjunto de datos agrupados y la salida como un conjunto vacío del mismo número de filas que las bandejas.
  26. Extraiga el componente de valor real del FFT.
  27. Eleva cada valor real de la FFT a la segunda potencia. Esto produce un conjunto de datos de espectros de potencia.
  28. Seleccione la primera mitad del conjunto de datos de espectros de potencia y muévalo para que quede por debajo de la segunda mitad. Esto tiene el efecto de centrar los espectros de potencia alrededor de la frecuencia central cuando se traza en el siguiente paso.
  29. Trazar los espectros de potencia en el eje y de un gráfico x-y donde los valores del eje x son el rango de -1 x (número de contenedores/2) a (número de contenedores/2) -1. En el caso de 1000 contenedores, los valores del eje oscilarían entre -500 y 499.
  30. Los espectros de potencia para cada animal deben compararse sobre la base de la propagación de picos distintos de cero y las alturas de estos picos distintos de cero.

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Representative Results

Mostramos resultados representativos desde el Paso 3 en adelante. La Figura 1 muestra los intestinos explantados intactos, con mediciones fluorescentes superpuestas. El estómago (púrpura) se coloca a lo largo del mismo eje que el intestino delgado (naranja), pero preferimos mover el ciego (azul) hacia un lado para evitar la superposición con el intestino grueso (naranja). Como se evidencia en el panel izquierdo, esto no siempre es posible debido al tamaño del órgano. Cortamos el intestino delgado a ~ 200 mm para maximizar la cobertura de segmentos continuos, pero esto no siempre es posible debido a que el mesenterio limita la capacidad de desplegar los intestinos, y nuestra preferencia por no cortar estructuras como pellets fluorescentes o el ciego. La intensidad roja en el panel izquierdo de la Figura 1 y las intensidades verdes de los paneles medio y derecho se clasifican en contenedores de diferentes tamaños para generar la Figura 3. Solo se extraen las intensidades dentro de los ROI (intestino delgado) naranja para su análisis. La longitud completa del intestino delgado (cada ROI naranja en cada panel) se extrae para su análisis. Los ROI naranjas tienen el mismo ancho que se muestra en ImageJ (Figura 2). Se unen colocando todas las intensidades en secuencia antes del binning. La Figura 3 muestra el promedio de trazas fluorescentes ± SEM por cohorte; Consulte la leyenda de la figura para obtener información específica.

Las dos últimas figuras muestran los resultados de los análisis: centro geométrico y espectro de potencia. El centro geométrico mide la ubicación promedio de las señales fluorescentes en la Figura 3, ponderando el promedio por la intensidad de la señal de cada contenedor. Por lo tanto, los picos más altos en la traza acercan el promedio a la posición de ese pico. El centro geométrico no caracteriza completamente la distribución espacial de los contenidos intraluminales. Por ejemplo, el mismo centro geométrico se puede obtener de un bolo concentrado en un solo punto y una señal extendida centrada alrededor del mismo punto. Esta limitación de la medición del centro geométrico es evidente en la comparación entre líquidos y perlas más grandes (Figura 3 y Figura 4). La mayor parte de la traza fluorescente líquida se centra alrededor de dos picos tempranos, mientras que las cuentas más grandes muestran múltiples picos a lo largo de toda la longitud del intestino delgado (Figura 3, paneles izquierdo y derecho). El rastro fluorescente de las cuentas más grandes está más distribuido, pero promedia hasta un punto similar al del líquido, independientemente de la granularidad de agrupación, lo que resalta la limitación de centrarse únicamente en el centro geométrico (Figura 4). Para tener en cuenta la naturaleza distributiva de las contracciones del intestino delgado, hemos incorporado un análisis espectral de potencia en el protocolo. El análisis del espectro de potencia funciona deconstruyendo la distribución de fluorescencia en el espacio en múltiples curvas sinusoides de diferentes frecuencias espaciales. Cada frecuencia espacial refleja la distancia entre dos puntos seleccionados al azar en la traza de fluorescencia. Algunas de estas distancias ocurren con más frecuencia que otras, por lo que a cada una se le atribuye una fuerza (poder). La potencia se correlaciona con la frecuencia con la que dos puntos aleatorios están separados por esa distancia. Al trazar el espectro de potencia (Figura 5), podemos demostrar cuántas frecuencias espaciales contribuyen a la señal medida (dispersión del espectro) y comparar la fuerza relativa de esas contribuciones (altura del espectro). Esto nos permite describir cuantitativamente la propagación de la fluorescencia a lo largo del tracto gastrointestinal.

Figure 1
Figura 1. Los intestinos disecados se explantan y se colocan en papel laminado antes de la fotografía y la medición de fluorescencia. La intensidad de la fluorescencia se superpone y se pseudocolorea para que coincida con la fluorescencia nativa del material gavagado. Izquierda: isotiocianato de rodamina líquido (RITC) fluoresce en el espectro rojo; Medio: pequeño (diámetro: 75-90 μm), y Derecha: más grande (diámetro: 180-212 μm) ambas fluorescen en el espectro verde. Las cajas púrpura, naranja, azul y rosa rodean las regiones de interés (ROI) en el estómago, el intestino delgado, el ciego y el colon en cada espécimen, respectivamente. El ancho de cada ROI se mantiene constante en todas las filas para evitar confusiones al calcular la intensidad de fluorescencia bruta durante el análisis posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Ubicación del ancho de la región de interés (en píxeles) en la barra de herramientas de ImageJ (subrayado amarillo). Para reiterar, el ancho se muestra en píxeles solo si se ha eliminado la escala (Paso 5.10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Trazas de fluorescencia a lo largo del intestino delgado. La línea denota la fluorescencia promedio en un contenedor dado. El área sombreada denota el error estándar de la media (SEM). La distribución del material fluorescente varía según las propiedades del material de los contenidos intraluminales (columnas). Izquierda: distribución líquida (n = 7 ratones) a través de unos pocos segmentos del intestino delgado 30 min después de la sonda nasogástrica. Medio y derecha: las perlas pequeñas (n = 6 ratones) y más grandes (n = 5 ratones) se distribuyen más ampliamente a lo largo del intestino delgado 30 minutos después de la sonda nasogástrica. El aumento del número de contenedores utilizados para ordenar los mismos conjuntos de datos sin procesar revela características de seguimiento granular irresolubles con menos contenedores (filas). Los contenedores más pequeños disminuyen la incertidumbre de medición, aumentan la resolución espacial y reflejan mejor el componente distributivo de las contracciones del intestino delgado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. El centro geométrico de la distribución de fluorescencia en el intestino delgado 30 min después de la sonda nasogástrica con RITC líquido, perlas pequeñas (75-90 μm) y perlas más grandes (180-212 μm) (media ± SEM, n = 7, n = 6, n = 5, ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni). El tamaño del contenedor no afecta la interpretación de tránsito de que las perlas pequeñas se transportan más distalmente que los líquidos 30 minutos después de la sonda nasogástrica, pero las cuentas más grandes se distribuyen tan ampliamente que no hay diferencias significativas en su centro geométrico en comparación con los líquidos y las cuentas pequeñas (*P < 0.05. ns = no estadísticamente significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. Los espectros de potencia se clasifican por propiedad de material (columnas) y tamaño de contenedor (filas). Las mejoras en la resolución espacial y el binning más pequeño son evidentes. Fila superior: se pueden distinguir pocas diferencias en los espectros ampliamente agrupados. Fila inferior: a medida que los tamaños de los contenedores se reducen, podemos apreciar frecuencias dominantes significativas presentes en el espectro de las cuentas más grandes, pero no en el de las cuentas pequeñas. Algunas, pero no todas, de esas frecuencias dominantes adicionales, están presentes en el espectro líquido. Usando los espectros de la fila inferior, podemos comparar con las trazas fluorescentes en la Figura 3. En la Figura 3, la traza fluorescente líquida muestra dos picos prominentes, que se correlacionan con algunos picos dominantes en el espectro de potencia. La traza de pequeñas perlas en la Figura 3 muestra un solo pico dominante, que se correlaciona con un solo pico dominante en el espectro de potencia. La traza de cuentas más grandes en la Figura 3 muestra picos más dominantes. En consecuencia, el espectro de potencia muestra un mayor número de frecuencias dominantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El tracto gastrointestinal, al igual que otros órganos tubulares, como los vasos sanguíneos, requiere sensores mecánicos y efectores para mantener la homeostasis26,27,28. Sin embargo, el tracto gastrointestinal es único en el sentido de que las propiedades físicas de los materiales que lo atraviesan no son constantes a lo largo de las comidas. Los contenidos intraluminales de diversas propiedades físicas (sólido, líquido y gaseoso) transitan por el intestino, generando diferentes entradas mecánicas a los mecanorreceptores gastrointestinales. De hecho, diferentes estímulos mecánicos en el colon son detectados y transmitidos por distintas vías29.

Este protocolo es técnicamente accesible para cualquier persona que realice el trabajo rutinario del ratón, pero algunos pasos críticos requieren mucha atención. Encontramos que los ratones en ayunas son importantes antes de comenzar el estudio, ya que elimina la contribución de las comidas anteriores diluyendo la señal fluorescente. Además, los ratones alimentados con una dieta estándar exhiben fluorescencia intraluminal de los componentes de la dieta, específicamente el componente de clorofila30. Mediante el ayuno y la selección de fluoróforos, evitamos que la fluorescencia chow interfiera con las condiciones controladas de los experimentos descritos en este protocolo. Recomendamos que los experimentadores confirmen de forma independiente que el período de ayuno seleccionado es suficiente para eliminar la fluorescencia no específica en el intestino delgado, ya que esto puede variar según la cepa, la edad o el sexo. El experimentador debe evaluar visualmente la distribución homogénea de los contenidos gavagados. De lo contrario, habrá incertidumbre en su entrega y en los resultados del estudio. Gavages debe ser realizado consistentemente por el mismo experimentador, preferiblemente alguien que haya desarrollado experiencia con la técnica. El experimentador debe apuntar a la entrega constante de contenido al estómago. Encontrar fluorescencia en el esófago o exclusivamente en el estómago son motivos para excluir a un animal del análisis, ya que no está claro si el intestino delgado tenía el mismo acceso al contenido gavagado. Después de la gavaging, los tiempos de espera pueden acortarse a 15 minutos o extenderse a 90 minutos, dependiendo de si las fases de tránsito temprano o tardío son de interés22. El protocolo original que utiliza sonda nasogástrica líquida demostró que la mayoría del material reside en el intestino delgado después de 30 minutos. Además, si bien es fundamental trabajar con prisa durante la etapa de disección, se debe tener cuidado de no alterar la ubicación del contenido intraluminal y no romper el tracto gastrointestinal.

Este protocolo evolucionó a partir de enfoques previamente publicados que agrupaban físicamente el intestino delgado cortándolo en cinco a 10 segmentos y homogeneizando el contenido intraluminal antes de la medición de fluorescencia/radiactividad22,23,24. El enfoque anterior fue significativo porque estandarizó la medición del tránsito del intestino delgado. El intestino delgado se enrolla notoriamente en patrones complicados e impredecibles dentro de la cavidad abdominal. Los estudios de tránsito basados en imágenes son desafiantes independientemente de la especie31,32. Si bien nuestro protocolo sigue siendo un experimento terminal que no se puede expandir a los humanos, mejoramos significativamente la resolución espacial y aprovechamos esa mejora para resolver los tránsitos regionales y traducirlos en una medición imparcial de la propagación dentro del intestino delgado (espectro de potencia).

En este protocolo, la resolución espacial está limitada por la resolución de la cámara en el sistema de imágenes. Dado que el binning normaliza la longitud del intestino delgado entre los animales, podemos comparar directamente la posición promedio del contenido intraluminal. La Figura 3 demuestra claramente el suavizado drástico, el aumento de la incertidumbre y la disminución de la resolución como resultado del gran tamaño del contenedor. El centro geométrico cuantifica el centro de fluorescencia a lo largo del tracto gastrointestinal (Figura 4). Como era de esperar, esta medición no se ve afectada significativamente por el tamaño del contenedor. El espectro de potencia es un método imparcial y complementario que estandariza el análisis de picos y dispersiones en las trazas fluorescentes de la Figura 3. La mejora de la resolución mejora los espectros calculados, lo que permite demostrar diferencias visibles entre trazas fluorescentes (Figura 5). A baja resolución (10 contenedores), sería difícil distinguir entre líquidos y cuentas más grandes, ya sea por el centro geométrico o las evaluaciones del espectro, aunque al observar las trazas fluorescentes se desprende claramente que no se distribuyen de manera similar en el espacio. A mayor resolución (1000 contenedores), los centros geométricos siguen siendo similares (debido al hecho de que el centro geométrico es una medida promedio), pero el espectro de potencia se puede utilizar de manera confiable para diferenciar entre ambas cohortes. Vale la pena señalar que las trazas fluorescentes son susceptibles de otros tipos de análisis, como las mediciones de vanguardia. Los cambios anticipados en el centro geométrico se pueden utilizar durante los cálculos del tamaño de la muestra antes de embarcarse en los experimentos. Sabiendo que los líquidos tienen un centro geométrico de aproximadamente 0.4-0.518, utilizamos al menos cinco ratones en cada grupo para resolver estadísticamente cambios de hasta el 45%.

Ampliamos el alcance y utilizamos este protocolo para estudiar el tránsito de sólidos dentro del intestino delgado. Al igual que con los líquidos, introducimos las microesferas sólidas en el estómago. El esfínter pilórico se encuentra en la transición estómago-intestino delgado. Este esfínter funciona como un filtro de exclusión de tamaño. En ratones, el límite de tamaño es de ~ 300 μm, con partículas <300 μm que no encuentran resistencia al ingresar al intestino delgado33, pero este enfoque también funciona con partículas ligeramente más grandes que utilizamos en un estudio reciente18. Elegimos nuestros tamaños de microesferas aquí para proporcionar una gama de tamaños que complementan el estudio reciente. Utilizamos dos preparaciones comerciales de perlas fluorescentes que tienen diámetros de 75-90 μm y 180-212 μm. La Figura 1 muestra una densidad de fluorescencia y perfiles similares en el estómago en todas las cohortes, lo que sugiere que ni los líquidos ni las partículas son retenidos diferencialmente por el estómago. Los datos originales presentados aquí demuestran cómo el intestino delgado de los ratones de tipo salvaje maneja los líquidos y sólidos microscópicos de manera diferente. Hasta ahora, hemos utilizado cuentas de un rango de tamaño por experimento independiente. Los estudios futuros pueden centrarse en cómo se manejan las mezclas de partículas de diferentes tamaños y mezclar fluidos fluorescentes de diversas propiedades físicas con perlas fluorescentes para determinar cómo el intestino delgado maneja mezclas de quimo más realistas.

Las diferencias de distribución reportadas aquí sugieren una diferencia en los patrones de motilidad activados por materiales de diferentes propiedades. Postulamos que el equilibrio de segmentación versus contracciones propulsivas determina qué tan lejos y cuán homogéneamente los materiales transitan el intestino delgado. El centro geométrico de las pequeñas perlas está más lejos a lo largo del intestino delgado en comparación con los líquidos, lo que sugiere que las partículas sólidas pequeñas participan en contracciones propulsivas. Por otro lado, mientras que el centro geométrico para cuentas más grandes es similar a un líquido, el análisis espectral muestra diferencias significativas en la distribución espacial, lo que podría ser el resultado de contracciones más segmentadas en la configuración de cuentas más grandes. Nuestra hipótesis es que el intestino delgado utiliza la discriminación de tamaño, un tipo de circuito mecanosensorial, como una de las entradas que alimentan la decisión del equilibrio entre los tipos de contracción. Por ejemplo, las neuronas Dogiel tipo II son neuronas mecanosensoriales que se especula que desempeñan un papel en la dirección del cambio de contracciones propulsivas a segmentadoras16,34. Estas intrigantes especulaciones requieren más investigación para determinar los mecanismos por los cuales el tracto gastrointestinal detecta las propiedades físicas y las transduce a salidas fisiológicas como las contracciones.

Creemos que este protocolo será útil como una herramienta adicional para cerrar la brecha entre las moléculas y las células y la función de los órganos. Reconocimos que los mecanorreceptores epiteliales GI comparten similitudes estructurales y de desarrollo con los mecanorreceptores cutáneos35. Utilizando el protocolo descrito anteriormente, ayudamos a demostrar el papel sensorial del "toque intestinal" donde estos mecanorreceptores epiteliales GI detectan estímulos mecánicos ligeros y participan en la sensibilidad táctil intrínseca18. Anticipamos que este protocolo será igualmente útil para estudiar cómo otros circuitos sensoriales contribuyen al tránsito del intestino delgado.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

Agradecemos a la Sra. Lyndsay Busby por la asistencia administrativa y al Sr. Joel Pino por el apoyo de los medios de comunicación. Las subvenciones de los NIH apoyaron este trabajo: DK123549, AT010875, DK052766, DK128913 y Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (DK084567).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 664 other mice can be used with this protocol
Dissection tools n/a n/a
Excel software Microsoft n/a used for spreadsheet analysis
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 75-90um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 75-90um - 10g "smaller beads" in the manuscript
Fluorescent Green Polyethylene Microspheres 1.00g/cc 180-212um - 10g Cospheric UVPMS-BG-1.00 180-212um - 10g "larger beads" in the manuscript
Gavage needles Instech FTP-18-50-50
ImageJ software n/a n/a used to extract fluorescence profile
Laminated ruler paper (prepared in-house) n/a n/a
Methyl cellulose (viscosity: 400 cP) Sigma M0262
Photoshop software Adobe n/a used for image processing
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran Sigma r8881-100mg "liquid" condition in the manuscript
Xenogen IVIS 200 Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system

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Estudio de la mecanodetección murina del intestino delgado de partículas luminales
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Mercado-Perez, A., Wegner, A., Knutson, K., Zumchak, M., Beyder, A. Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates. J. Vis. Exp. (181), e63697, doi:10.3791/63697 (2022).

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