Summary
Här presenteras en beskrivning av den enkla och relativt snabba isoleringen av Caenorhabditis elegans genomiskt DNA från ett eller ett fåtal djur med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt vävnadskit. Den resulterande gDNA-beredningen är en lämplig mall för PCR.
Abstract
Genomisk DNA-extraktion från enstaka eller några Caenorhabditis elegans har många nedströmsapplikationer, inklusive PCR för genotypningslinjer, kloning och sekvensering. De traditionella proteinas K-baserade metoderna för genomisk DNA-extraktion från C. elegans tar flera timmar. Kommersiella extraktionssatser som effektivt bryter upp C. elegans-nagelbandet och extraherar genomiskt DNA är begränsade. En enkel, snabbare (~ 15 min) och kostnadseffektiv metod för att extrahera C. elegans genomiskt DNA som fungerar bra för klassrums- och forskningsapplikationer rapporteras här. Denna DNA-extraktionsmetod är optimerad för att använda enstaka eller några få sena larver (L4) eller vuxna nematoder som utgångsmaterial för att få en pålitlig mall för att utföra PCR. Resultaten indikerar att DNA-kvaliteten är lämplig för att förstärka genmål av olika storlekar med PCR, vilket möjliggör genotypning av enstaka eller några djur även vid utspädningar till en femtiondel av det genomiska DNA från en enda vuxen per reaktion. De rapporterade protokollen kan på ett tillförlitligt sätt användas för att snabbt producera DNA-mall från ett enda eller ett litet prov av C. elegans för PCR-baserade applikationer.
Introduction
Här presenteras två relaterade protokoll för lysning av Caenorhabditis elegans för att göra DNA tillgängligt för PCR-baserade applikationer. PCR är en vanlig molekylär teknik som används för många applikationer, inklusive genotypning och förstärkning av DNA-fragment för kloning och sekvensering, bland andra. Den lilla (1 mm), frilevande rundmasken C. elegans är ett populärt djursystem för biologisk forskning. Att erhålla lämpligt genomiskt DNA från ett enda djur eller några djur är tillräckligt för att förstärka sekvensen med PCR. Sena L4-larver och vuxna innehåller endast ~ 1 000 somatiska celler (inklusive vissa multinukleära, polyploida celler), bakterieceller och (om djuret är en gravid hermafrodit) avkomma i utero1. Dessa djur skyddas dock av en nagelband som måste störas för att extrahera det genomiska DNA2. Standardmetoder för att förbereda nematodgenomisk DNA-mall för PCR involverar flera steg och tar flera timmar. Djuren fryses först i masklysbuffert som innehåller proteinas K (−70 °C eller lägre) i minst 15–45 minuter (längre rekommenderas enligt vissa protokoll)3,4,5,6. Detta steg sprickor öppnar djuren.
Efter frysning inkuberas djuren i 1 timme vid 60-65 °C för att proteinaset K ska fungera, sedan inaktiveras enzymet i 15-30 minuter vid 95 °C. Proteinaset K förstör nukleaserna som bryter ner DNA. Inaktiveringen av proteinas K före PCR är viktig för att förhindra att proteinaset K bryter ner DNA-polymeraset. De två kitbaserade protokollen som beskrivs här är snabba, pålitliga och kostnadseffektiva metoder för att extrahera genomiskt DNA från antingen ett enda djur eller några nematoder för daglig forskning och undervisning i laboratorieapplikationer. Satsen som användes optimerades ursprungligen av tillverkaren för att extrahera DNA från djurvävnad, saliv och hår7. Den använder en proprietär vävnadsberedningslösning och extraktionslösning för att lysera celler och göra genomiskt DNA tillgängligt. En proprietär neutraliseringslösning neutraliserar sedan de komponenter som kan hämma PCR (t.ex. salter, joner och Mg2+-bindande molekyler).
Vid genotypning kan ett enda djur testas. Vid bestämning av om en stam är homozygot ger testning av sex eller fler avkommor från ett enda djur högt förtroende för att en linje är homozygot eller inte (det finns en 0,02% chans att slumpmässigt välja sex homozygota mutanta avkommor från en heterozygot förälder [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Denna metod 1) är enkel, med färre steg än proteinas K-metoden, och 2) minskar mallberedningstiden till 15 min. Resultaten i detta arbete visar att det utvecklade protokollet fungerar robust för att extrahera genomiskt DNA från enstaka eller några maskar, vilket på ett tillförlitligt sätt kan användas för nedströmsapplikationer som inte kräver högrenat DNA, inklusive PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans underhåll
OBS: N2 (vild typ) och blmp-1 (tm548) C. elegans stammar bibehölls på standardplattor för nematodtillväxtmedier (NGM) vid 20 °C.
- Förbered NGM-plattorna genom att lösa upp 23 005 g NGM-pulver i 973 ml vatten i en 2-liters kolv. Täck kolvöppningen med aluminiumfolie (eller autoklaverbart lock som möjliggör avluftning) och säkra beläggningen med autoklavtejp. Autoklav för att lösa upp pulvret och sterilisera innehållet med en steriliseringscykel på minst 30 min.
- Kyl mediet till 60 °C i ett vattenbad.
- Tillsätt 25 ml steril 1 M fosfatbuffert (KH2PO4) till det kylda mediet, pH 6,0; 1 ml 1 M kalciumkloridlösning; och 1 ml 1 M magnesiumsulfatlösning.
- Rör om mediet på en magnetisk omrörningsplatta för att få en homogen blandning och för att förhindra ojämn kylning och stelning (~ 5 min). Se till att omrörningsstången snurrar tillräckligt snabbt för att skapa en virvel men inte så snabbt att bubblor introduceras (~ 250-300 rpm).
- Häll ~ 25 ml av mediet i varje 10 cm petriplatta (~ 40 plattor totalt). Torka plattorna vid rumstemperatur över natten (vanligtvis 16-25 °C).
- Odla en koloni av Escherichia coli OP50 i 30-50 ml LB-buljong över natten vid 37 °C.
- Frö varje platta med 500 μl E. coli OP50-kultur och låt dem torka vid rumstemperatur före användning (vanligtvis 16–25 °C)8. Förvara plattorna vid 4 °C i upp till 3 veckor.
- Överför C. elegans till fröade plattor med hjälp av en trådplockning eller annan metod och låt dem växa till L4 eller vuxenstadiet vid den temperatur som krävs för stammen (vanligtvis 16–25 °C, 1–2 dagar om djuren pläterades utsvultna som dauers, 3–4 dagar om djuren pläterades som embryon)8.
2. DNA-extraktion med en mask
OBS: Denna metod är användbar för att extrahera DNA från en enda mask (en mask i 1,8 μL av total volym). En masterblandning kan göras om flera maskar kommer att lyseras samtidigt.
- Programmera en termocykling för en cykel vid 55 °C i 10 min följt av 95 °C i 3 min (lysprogram).
- Alikvot 0,8 μl av extraktionslösningen från satsen till innerväggen i ett 0,2 ml PCR-rör på is. Tillsätt 0,2 μl av vävnadsberedningslösningen från satsen till droppen av extraktionslösningen. Blanda genom pipettering.
- Identifiera ett L4 eller vuxendjur under ett dissekerande mikroskop9. För att identifiera L4-hermafroditer, leta efter en karakteristisk vulva som är synlig som en blek halvcirkel i mitten av djuret. Identifiera vuxna hermafroditer genom att leta efter de största djuren på plattan som kan ha ovala embryon synliga i livmodern.
- Använd en platinatrådsplockning och överför det valda djuret till lösningen10.
- Centrifugera röret kort (2-3 s, ≤6 000 rpm/2 000 × g) vid rumstemperatur för att samla upp innehållet i botten av röret.
- Placera röret i termocyklern och kör lysprogrammet som är inställt på steg 2.1.
- När programmet är klart, centrifugera röret kort och placera det på is. Tillsätt 0,8 μl av neutraliseringslösningen från satsen till blandningen. Blanda genom pipettering.
- Centrifugera röret kort vid rumstemperatur (2-3 s, ≤6 000 rpm/2 000 × g).
- Använd lysaten direkt för PCR eller förvara den vid 4 °C eller −20 °C för framtida bruk.
OBS: Extraherat DNA är stabilt vid 4 °C eller −20 °C i minst 6 månader7.
3. DNA-extraktion av några individer
OBS: Denna metod är användbar för att extrahera DNA från några maskar. En masterblandning kan beredas om flera stammar kommer att lyseras samtidigt.
- Programmera termocyklern under en cykel vid 55 °C i 10 min följt av 95 °C i 3 min (lysprogram).
- Alikvot 2,0 μl av extraktionslösningen från satsen till innerväggen i ett 0,2 ml PCR-rör på is. Tillsätt 0,5 μl av vävnadsberedningslösningen från satsen till droppen extraktionslösning. Blanda genom pipettering.
- Identifiera L4 eller vuxna djur under ett dissekerande mikroskop9. L4-hermafroditer har en karakteristisk vulva som är synlig som en blek halvcirkel i mitten av djuret. Vuxna hermafroditer är de största djuren på plattan och kan ha ovala embryon synliga i livmodern.
- Överför några djur till lösningen med hjälp av en platinatrådsplockning: 9 djur ger 1 djurekvivalent genomiskt DNA per 0,5 μL lysat och 16 djur ger ~ 1 djurekvivalent med genomiskt DNA i 0,25 μL (3,5 nematoder / μL)10.
OBS: Det är svårt att överföra mer än 16 djur till denna volym. - Centrifugera röret kort vid rumstemperatur (2-3 s, ≤6 000 rpm/2 000 × g).
- Placera röret i termocyklern och kör lysprogrammet som är inställt på steg 3.1.
- När programmet är klart, centrifugera röret kort och placera det på is. Tillsätt 2 μL av neutraliseringslösningen från satsen till blandningen. Blanda genom pipettering.
- Centrifugera röret kort vid rumstemperatur (2-3 s, ≤6 000 rpm/2 000 × g).
- Använd direkt lysen för PCR eller förvara den vid 4 °C eller −20 °C för framtida bruk.
OBS: Extraherat DNA är stabilt vid 4 °C eller −20 °C i minst 6 månader7.
4. PCR-reaktion
OBS: En nedströms tillämpning av denna masklysteknik, som detekterar en deletionsmutation med hjälp av ett snabbt polymeras, beskrivs. Effektiviteten hos de två masklysprotokollen för att producera genomiskt mall-DNA för framgångsrik PCR vid utspädningar till 1/50av en mask per reaktion demonstreras också.
- Extrahera DNA från en enda mask och 16 maskar med hjälp av vildtyp N2 och mutanta stammar, som beskrivs ovan i steg 2 och steg 3.
- Förbered 2-, 10-, 20- och 50-faldiga utspädningar av enmask-DNA från vilda N2-djur.
- Ställ in PCR-reaktioner enligt tillverkarens protokoll med hjälp av primers som är specifika för intressesekvensen och PCR-mastermix med varmstart (tabell 1 och tabell 2). Använd 1 μl outspädd DNA eller 2 μl utspätt DNA som mall i varje reaktion.
- Bekräfta PCR-produkterna genom gelelektrofores och avbildning11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genomiskt DNA från en enda eller några vuxna av vild typ extraherades med hjälp av det kommersiella kitet eller det traditionella lysprotokollet för att jämföra effekten av dessa två metoder. Dessa lysater användes sedan som mallar för PCR för att förstärka antingen ett större mål på ~ 2 100 bp (kodning av blmp-1) eller ett mindre mål på ~ 500 bp (kodning av en del av sma-10). Båda metoderna gav framgångsrikt lämpliga PCR-produkter (figur 1A).
Därefter demonstrerades förmågan hos kit-extraherat genomiskt DNA att fungera som mall för en mängd olika DNA-polymeraser. Extraherat genomiskt DNA användes som mall för att förstärka en 0,5 kb-produkt med fyra polymeraser som har olika kapacitet (inklusive hastighet, trohet och produktstorlek). Produkter av förväntad storlek genererades av dessa polymeraser med hjälp av mall från en en-vuxen lys eller en nio-vuxen lys (Figur 1B). Mallsekvensen och återgivningen av PCR-polymeraserna för att korrekt förstärka mallsekvensen kan bekräftas genom sekvensering (kompletterande figur S1). Detta resultat visar att det genomiska DNA som extraheras från kitprotokollen ger en lämplig mall för en rad polymeraser.
PCR-effekten testades med olika koncentrationer av det genomiska DNA som extraherades från ett enda djur med hjälp av det kommersiella kitet. DNA späddes ut med 2-, 10-, 20- eller 50-faldigt, och motsvarande ungefär en halv, en tiondel, en tjugondel och en femtiondel av en mask per reaktion användes för PCR. Dessa DNA-mallkoncentrationer stödde förstärkningen av antingen ett större mål på ~ 2,1 kb eller ett mindre mål på ~ 0,5 kb (figur 1C)12. Medan ett DNA-koncentrationsberoende utbyte av PCR-produkten på 0,5 kb observerades, verkade PCR-produktutbytet på 2,1 kb likvärdigt i alla reaktioner.
För att visa att dessa protokoll producerar genomiskt DNA från C. elegans som är lämpligt för PCR-genotypning extraherades genomiskt DNA från enstaka och 16 vildtyps- och blmp-1-funktionsförlustmutanter (blmp-1 (tm548)). Blmp-1-genen kodar för en transkriptionsfaktor med viktiga roller i distal spetscellmigration, kroppsstorlek och utveckling 12,13,14,15,16. Blmp-1-mutanten har en 810 bp-radering som tar bort delar av exon 3 och intron 315. Primers designades som resulterar i en 2,134 bp-produkt när DNA-mallen av vild typ används och en 1,324 bp-produkt om blmp-1 (-) DNA används. PCR-produkter av lämpliga storlekar detekterades med användning av 1 μl antingen enkelmask (cirka 0,5 maskar per reaktion) eller 16-masklys från L4-stegade djur (3,5 maskar per reaktion) (figur 1D). Detta resultat visar att kit-extraherat genomiskt DNA med hjälp av något av protokollen ger lika effektiva mallar för PCR till genotyplinjer.
Dessa resultat visar att C. elegans genomiska DNA-preparat som använder ett kommersiellt vävnads-DNA-extraktionskit från enstaka och flera djur på ett tillförlitligt sätt kan användas som mallar för PCR.
Figur 1: DNA-preparat med hjälp av ett kommersiellt kit från enstaka nematoder och flera nematoder möjliggör robust förstärkning med PCR. PCR-produkter laddades på 1% agarosgel i 1x TAE-buffert (5 μL (A,B) eller 10 μL (C,D) och kördes vid 90-100 V i 30 min till 2 h. En 2-log DNA-stege användes för alla geler. (A) Jämförelse av DNA-lys med kit med traditionella proteinas K-metoder för att skapa mall med hjälp av två primeruppsättningar. Vuxna av vild typ lystes och motsvarande ett djur användes som mall för alla reaktioner. Banor 1-4, 2,1 kb produkt. Lane 1, PCR från single-worm lysis av proteinase K. Lane 2, PCR från single-worm lysis med kit-metoden. Lane 3, PCR från nio-maskmasklys med proteinas K. Lane 4, PCR från nio-maskmasklys med kitmetoden. Banor 5-8, 0,5 kb produkt. Lane 5, PCR från single-worm lysis av proteinase K. Lane 6, PCR från single-worm lysis med kit-metoden. Lane 7, PCR från niomaskmasklys med proteinas K. Lane 8, PCR från niomaskmasklys med kitmetoden. (B) Kitmetoden för DNA-lys ger en lämplig mall för PCR med flera polymeraser. Vuxna av vild typ lyserades med kitmetoden, och motsvarande hälften av ett djur användes som PCR-mall för en 0,5 kb produkt. Se materialförteckningen för polymerasdetaljer. Lane 1, PCR från en enmasklys med ett höghastighetspolymeras. Lane 2, PCR från en nio-masklys med ett höghastighetspolymeras. Lane 3, PCR från en enmasklys med ett Taq-polymeras . Lane 4, PCR från en niomasklys med ett Taq-polymeras . Lane 5, PCR från en enmasklys med ett hifi-polymeras. Lane 6, PCR från en niomasklys med ett hifi-polymeras. Lane 7, PCR från en enmasklys med ett höghastighetspolymeras med hög trohet. Lane 8, PCR från en nio-masklys med ett höghastighets, högkvalitativt polymeras. (C) Utspädningar av en vild typ av L4-masklys utgör mall för PCR. Banor 1-5, 2,1 kb produkt. Banor 6-10, 0,5 kb mål. Körfält 1 och körfält 6, outspädd DNA. Lane 2 och lane 7, 2-faldigt utspätt DNA. Lane 3 och lane 8, 10-faldigt utspätt DNA. Lane 4 och lane 9, 20-faldigt utspätt DNA. Lane 5 och lane 10, 50-faldigt utspätt DNA. (D) Genotypning av blmp-1-locus med PCR med 1 μl enkel- och 16-mask-DNA-preparat som mall. Lane 1, PCR från vildtyp enkelmasklys. Lane 2, PCR från blmp-1(-) single-worm lysis. Lane 3, PCR från vild typ 16-masklys. Lane 4, PCR från blmp-1(-) 16-masklys. Förkortningar: prep = beredningsmetod; kb = kilobas; st. = nematodstadium; = utspädning av DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Mål | Primer namn | Sekvens | ||
| Blmp-1 | framåt | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| omvända | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| sma-10 | framåt | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| omvända | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| Sekvensering | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tabell 1: Lista över primers.
| A. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR Master Mix | 12,5 μl | 12,5 μl |
| Framåt grundfärg | 0,2 μM (slutlig koncentration) | 0,5 μM (slutlig koncentration) |
| Omvänd primer | 0,2 μM (slutlig koncentration) | 0,5 μM (slutlig koncentration) |
| mall DNA | variabel | 1 μl |
| Nukleasfritt vatten | till 25 μl | till 25 μl |
| B. | Pol C |
| PCR 5x buffert | 2,5 μl |
| 10 mM dNTP | 2,0 μl |
| Framåt grundfärg | 0,2 μM (slutlig koncentration) |
| Omvänd primer | 0,2 μM (slutlig koncentration) |
| mall DNA | variabel |
| Polymeras | 0,5 μl |
| Nukleasfritt vatten | till 25 μl |
| C. PCR-program som används för figur 1B | ||
| temperatur | Tid | Cykler |
| 98 °C | 2 minuter | 1 |
| 98 °C | 1 minuter | 30 |
| 55 °C | 1 minuter | |
| 72 °C | 1 minuter | |
| 72 °C | 1 minuter | 1 |
| 4 °C | hålla | |
| D. PCR-program som används för kompletterande figur S1 | ||
| temperatur | Tid | Cykler |
| 98 °C | 30 s | 1 |
| 98 °C | 10 s | 30 |
| 57 °C | 20 sekunder | |
| 72 °C | 50 s | |
| 72 °C | 2 minuter | 1 |
| 4 °C | hålla | |
Tabell 2: PCR-reaktionskomponenter.
Kompletterande figur S1: Sekvensering för bekräftelse av kvaliteten på genomiskt DNA framställt med ett kommersiellt kit. Resultaten från två sekvenseringsreaktioner matchar helt den förväntade sekvensen av över 1 600 nukleotider DNA förstärkt av ett höghastighetspolymeras med hög trohet (Pol E) från en 16-masklys (tabell 1, tabell 2A och tabell 2D). Sekvensering av läsändar trimmades för att ta bort basläsningar av låg kvalitet. Justering utfördes med hjälp av EMBL-EBI-verktyget för flersekvensjustering MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att bestämma genotyperna av C. elegans är ett viktigt steg när man utför genetiska korsningar för att skapa nya C. elegans-stammar . Genomisk DNA-extraktion med hjälp av en enda eller få C. elegans är ett avgörande steg för att genotypa C. elegans. Detta protokoll beskriver genomisk DNA-extraktion från C. elegans med hjälp av ett kommersiellt kit. Denna metod är snabb och fungerar robust. Det genomiska DNA som extraheras med denna metod kan användas för nedströmsapplikationer, inklusive genotypning, sekvensering och kloning. Den beskrivna DNA-extraktionsmetoden har optimerats för genotypning av C. elegans genetiska korsningar med enstaka och några L4 eller vuxna djur som utgångsmaterial för DNA-mallen. Motsvarande en femtiondel av ett djur (figur 1C) till 3,5 djur (figur 1D) gav en lämplig mall för att förstärka mål-DNA-sekvenser med PCR. Detta protokoll (med utspädning) ger tillräckligt med mall (vid 2 μl/reaktion) för högst 45 reaktioner från en enda mask och för 100 reaktioner från 16 djur. Även med en mask per reaktion ger dessa protokoll ett kostnadseffektivt sätt att extrahera DNA från C. elegans. Med tanke på protokollets enkelhet, robusthet och snabbhet är det väl lämpat för både forskning och klassrumsapplikationer.
Eftersom protokollet innefattar pipettering av små volymer reagens rekommenderas beredning av en masterblandning för flera reaktioner, god pipetteringsteknik och användning av välkalibrerade pipetter för att säkerställa konsistens. Att använda 0,5-1 μl outspädd DNA-mall från antingen en- eller 9-16-djurs lyser fungerar vanligtvis för en 25 μL PCR-reaktion med hjälp av en hot-start PCR-masterblandning, men optimering av mallkoncentrationen kan krävas. Reagenserna måste förvaras på is under hela experimentet. För att undvika upprepad frysning och upptining av DNA-extraktionslösningarna, vilket kan minska enzymprestandan, rekommenderas att reagenserna alikvoteras och förvaras vid −20 °C.
För nedströmsapplikationer som kräver PCR minskar användningen av en snabbstart, höghastighets PCR-mastermix ytterligare den totala tiden jämfört med PCR-reaktionsblandningen som tillhandahålls i den kommersiella vävnadssatsen. Höghastighetspolymeraser kan förstärka produkter på mindre än 1 kb på 5-10 s (se materialtabellen och tabell 2 för polymerasbeskrivningar), medan satsens PCR-reaktionsblandning använder ett Taq DNA-polymeras med en förstärkningshastighet på ~ 1 kb / min7. Produkter från vissa PCR kan laddas direkt i en agarosgel för elektrofores, vilket ytterligare minskar stegen och tiden. Denna reaktionsbuffert är också kompatibel med restriktionsenzymsmältning. Högkvalitativa DNA-polymeraser fungerar också robust med DNA extraherat med detta protokoll (figur 1B). Medan de polymeraser som användes konsekvent fungerade med hjälp av kit-extraherad mall, kan användningen av andra polymeraser ge bättre resultat beroende på mallen, primeruppsättningsegenskaper, produktstorlek och trohet som krävs. Om problem uppstår efter PCR, såsom inget målband förstärkt eller ytterligare band förstärkta, kan ytterligare optimering av primerns arbetsförhållanden eller DNA-mallkoncentration krävas. Det rekommenderas starkt att lämpliga kontroller, inklusive DNA-mall av vild typ och användning av primers som har visat sig fungera, används.
Denna metod kommer inte att vara lämplig för applikationer som kräver högrenad eller ett högt utbyte av DNA-mall. Även om antalet beredda djur och reaktionsvolymen kan skalas upp, är det DNA som framställts med denna metod inte separerat från organismskräp och kanske inte är tillräckligt rent för mycket känsliga tillämpningar såsom helgenomsekvensering.
De stora fördelarna med denna metod jämfört med de befintliga traditionella genomiska DNA-extraktionsmetoderna inkluderar kortare tid och enklare, enklare steg. I framtiden kan denna metod skalas upp, anpassas för att extrahera C. elegans genomiskt DNA för andra nedströmsapplikationer och användas för att extrahera DNA från andra nematodarter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
N2-stammen och E. coli OP50-bakterierna erhölls från Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Stammen blmp-1(tm548) erhölls från National Bioresource Project, Japan. Författarna tackar WormBase. Detta arbete stöddes av NIH R01GM097591 till T.L.G., intern finansiering från Texas Woman's University till T.L.G och TWU: s Center for Student Research till M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
