Summary
ליפידומיה מבוססת ספקטרומטריית מסות Shotgun מספקת תמונת מצב כמותית רגישה של ספקטרום רחב של סוגי שומנים בו זמנית במדידה אחת מרקמות מכרסמים שונות.
Abstract
שומנים ממלאים תפקיד חיוני כמרכיבים חיוניים של כל התאים הפרוקריוטים והאיקריוטים. שיפורים טכנולוגיים מתמידים בספקטרומטריית מסות הפכו את הליפידומיה לכלי אנליטי רב עוצמה לניטור הרכבי ליפידום של רקמות במצבים הומיאוסטטיים כמו גם במצבי מחלה. מאמר זה מציג פרוטוקול שלב אחר שלב לשיטת ניתוח שומנים של רובה ציד, התומכת בזיהוי וכימות בו זמנית של כמה מאות מיני שומנים מולקולריים בדגימות שונות של רקמות ונוזלים ביולוגיים בתפוקה גבוהה. שיטה זו ממנפת הזרקה ישירה אוטומטית של ננו-זרימה של תמצית שומנים כוללת עם תקנים פנימיים מסומנים ללא הפרדה כרומטוגרפית למכשיר ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. החל מכמויות תת-מיקרוגרם של רקמת מכרסמים, ניתוח הטרשת הנפוצה אורך 10 דקות לכל דגימה ומכסה עד 400 שומנים מ-14 סוגי שומנים ברקמת ריאה של עכבר. השיטה המוצגת כאן מתאימה היטב לחקר מנגנוני מחלה ולזיהוי וכימות סמנים ביולוגיים המצביעים על רעילות מוקדמת או השפעות מועילות בתוך רקמות מכרסמים.
Introduction
עשן סיגריות מוכר כגורם סיכון עיקרי הקשור להתפתחות מחלות דלקתיות כרוניות של הריאה, כולל קרצינומה ריאתית, ברונכיטיס ומחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD)1. מעבר להשפעה על הריאות, חשיפה לניתוח קיסרי ממלאת תפקיד משמעותי בהתפתחות מחלות נוספות כגון מחלת עורקים כליליים טרשתיים ומחלות כלי דם היקפיים1. מחלות לב וכלי דם, יחד עם COPD, הן סיבות המוות המובילות הראשונה והשלישית בעולם, בהתאמה. גישות הערכת סיכונים טוקסיקולוגיות הסתמכו באופן היסטורי על שימוש במודלים של בעלי חיים כגון מכרסמים. מודלים של חולדות ועכבר עם אף בלבד או גוף מלא משמשים בדרך כלל לחקר ההשפעות ארוכות הטווח של חשיפה לניתוח קיסרי.
לדוגמה, בדרך כלל, 6 חודשים של חשיפה לעשן גורמים להפרעות היסטולוגיות ותפקודיות בריאות מורין המחקות את אלה של מחלות אנושיות, כולל אמפיזמה, עיצוב מחדש של דרכי הנשימה ויתר לחץ דם ריאתי, אם כי השינויים קלים יחסית לאלה שנצפו אצל מעשנים אנושיים לטווח ארוך2. הן ברקמות של בעלי חיים והן ברקמות אנושיות, מחקרים הבחינו במגוון רחב של שינויים מולקולריים בתגובה לחשיפה לניתוח קיסרי, כולל תגובות לעקה חמצונית, דלקת ושינויים ברקמות מבניות 3,4. באופן לא מפתיע, חשיפה לניתוח קיסרי דווחה גם כבעלת השפעה מרחיקת לכת על הליפידום של הריאות, כולל השפעות על שומנים פעילי שטח, מתווכי איתות שומנים ושומנים מבניים 4,5,6.
כדי לאפיין את השינויים בשומנים בתפזורת הנגרמים על ידי חשיפה ארוכת טווח ל-CS של ריאות עכברים, ביצענו ניתוח מהיר וכמותי של ספקטרומטריית מסה בעירוי ישיר של רובה ציד. לאחר הצגת שיטת הליפידומיה של רובה הציד בשנת 20057, שיטה זו שימשה ביעילות להרחבת הידע שלנו על מטבוליזם תאי שומנים 8,9,10 במערכות מודל כגון שמרים 11, Caenorhabditis elegans12, ו- Drosophila melanogaster13, כמו גם במגוון רחב של סוגי דגימות יונקים כגון קווי תאים 14, 15,16 רקמות אנושיות שונות17,18 ומכרסמים19,20 ונוזלי גוף 21,22.
במהלך העשורים האחרונים, מחקרים חשפו את המורכבות של תגובות תאיות לשינויים סביבתיים, המערבות אלפי חלבונים, שומנים ומטבוליטים המחוברים זה לזה. עובדה זו הבהירה כי שימוש בטכניקות אנליטיות חדישות חיוני להשגת מבט מעמיק על המכונות המולקולריות ולחשיפת מלוא עוצמתן של ההשפעות הפיזיולוגיות האקסוגניות. בהקשר זה, טביעות האצבע השומניות המקיפות והכמותיות המיוצרות על ידי גישות ליפידומיה של רובה ציד יכולות להוסיף ביעילות לידע שלנו על מטבוליזם תאי שומנים 8,9,10.
בנוגע לחשיפה לניתוח קיסרי כגורם סיכון למספר מחלות, גישות להערכת סיכונים טוקסיקולוגיות הסתמכו באופן היסטורי על שימוש במודלים של בעלי חיים כגון מכרסמים. Shotgun lipidomics MS מספק כלי אנליטי מהיר, רגיש וכמותי להערכת הפרעות ליפידום בסוגי דגימה רבים. התכונה הייחודית של ליפידומיה של רובה ציד היא ניתוח הזרקה ישירה אוטומטית של תמצית שומנים כוללת - מתובל עם תקנים פנימיים מסומנים - ללא הפרדה כרומטוגרפית למכשיר MS ברזולוציה גבוהה באמצעות ננו-שבב מוליך המייצר ננו-ספריי יינון אלקטרוספריי (ESI)23.
מידע יחס המסה לטעינה שנרכש בו-זמנית במצב MS1 מספק את טביעת הרגל השומנית הכוללת של כל הליפידים האנדוגניים השלמים. לחלופין, מצב MS2/MS3, שבו מולקולות השומנים האב מקוטעות ומנותחות, מספק מידע מבני נוסף. ניתוח נתונים דורש תוכנה מיוחדת וכולל דה-קונבולוציה של ספקטרום ומשימות שיא בספקטרום מאוגד המובילות לזיהוי שומנים והבהרת מבנה כימי משוער. בנוסף, ניתן לבצע כימות מוחלט על ידי זינוק תערובת תקנים פנימית מסומנת המכילה לפחות תקן שומנים אחד לכל סוג שומנים מעניין. בסך הכל, עם הטכניקה הנוכחית, ניתוח טרשת נפוצה לוקח כמה דקות לכל דגימה יכול לכסות זיהוי וכימות של עד 800 שומנים מ 14 קבוצות שומנים24 ברקמות מכרסמים.
Protocol
כל ההליכים המערבים בעלי חיים בוצעו במתקן שהוסמך על ידי האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה בינלאומית ומורשה על ידי הרשות החקלאית למזון ווטרינרי של סינגפור, באישור ועדה מוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים ובהתאם לוועדה הלאומית המייעצת להנחיות מחקר בחיות מעבדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים למטרות מדעיות (NACLAR, 2004).
1. איסוף דוגמאות
- בצע דיסקציות ריאה של עכברים לאחר 3 חודשים ו-6 חודשים של חשיפה של עכברי ApoE−/− . אספו את הרקמות 16-24 שעות לאחר החשיפה, הקפיאו אותן בחנקן נוזלי ואחסנו בטמפרטורה של -80°C לפני תחילת זרימת העבודה הליפידומית. ודא איסוף של סך של תשע דגימות מכל קבוצת דיסקציה "omics".
2. רקמה - כתישה של הדגימות
- הכינו את הפטיש המגנטי והחומרים המתכלים לטחינת רקמות. שקיות רקמה Precool, מלקחיים, צינורות העברת רקמות מכוסים עם כובעים, מרית פלסטיק "V" וצינורות איסוף פלסטיק 2 מ"ל על קרח יבש. התקן את מחזיק הצינור המתאים במכשיר פטיש מגנטי. הפעל את הפטיש המגנטי והגדר את עוצמת הפגיעה לגבוהה.
- לטעון את הדגימה לתוך נרתיק רקמות; הכנס את הדגימה דרך הפתח העליון של נרתיק הרקמה באמצעות מלקחיים מקוררים מראש במידת הצורך. הניחו את הדגימה במרכז השקית הגמישה, הרחק מהקצוות.
- אטמו את נרתיק הטישו על ידי הברגת צינור איסוף מקורר מראש לחלק העליון של נרתיק הרקמה.
- יש להקפיא את הדגימה בהצמדה על ידי טבילת השקיק הגמיש בחנקן נוזלי למשך 10 שניות.
- אוורור צינור האיסוף; שחררו את הצינור לסיבוב של 1/4 לאוורור כדי למנוע קרע של השקית כאשר הפטיש המגנטי פוגע.
- טען את נרתיק הרקמה הקפוא על הפטיש המגנטי.
- החל את הפטיש המגנטי על ידי לחיצה על כפתור ההפעלה כדי לכתוש את הדגימה. אם חתיכות רקמה לא כתושות נשארות בכיס, יש להקפיא שוב את הדגימה בחנקן נוזלי ולחזור על הפעולה לפגיעה שנייה.
- הסר את נרתיק הרקמה מהפטיש המגנטי, ושמור את הדגימה המרוסקת בתחתית. כדי למנוע מהדגימה להימס, הקפא אותה שוב באופן מיידי.
- העבירו את הדגימה לשפופרת איסוף. הפוך במהירות את הצינור כך ששקית הרקמה תהיה בחלק העליון, והקש על השקית כדי להעביר את חלקיקי הרקמה לתחתית צינור האיסוף.
הערה: שלב זה צריך להיעשות במהירות כדי למנוע התכה של הרקמה. - להעביר aliquot רקמה 10 מ"ג לתוך צינור 2 מ"ל לניתוח ליפדומי נוסף ולאחסן את הדגימה ב -80 ° C עד צעדים נוספים מבוצעים.
3. הומוגניזציה של רקמות
- הפעל את מכשיר לייזר הרקמה והגדר את תדירות הרעידה ל- 30 הרץ ואת משך הרעידה ל- 2 דקות. הכן את תמיסת חיץ הומוגניזציה רקמות: 150 mM אמוניום ביקרבונט במים, עם pH של ~ 8.2.
- הוציאו את הדגימות ממקפיא האחסון, הניחו על קרח והוסיפו ארבעה חרוזי נירוסטה לצינורות המכילים את אבקת הרקמות. הוסף 0.5 מ"ל של 150 mM חיץ אמוניום ביקרבונט לכל דגימה.
- הניחו את צינורות הדגימה במחזיקי לייזר הרקמות. אזנו את שני המחזיקים עם אותו מספר צינורות. מקבעים את המחזיקים לתוך זרוע האחיזה של לייזר הרקמות. לשבש את הרקמה.
- הניחו את הצינורות על קרח ובדקו ויזואלית שאין שאריות של צברי רקמות בצינור. אם הפרעה ברקמה אינה שלמה (נראים אגרגטים), חזור על תהליך ההפרעה על ידי ביצוע מחזור טיפול נוסף. מניחים את הדגימות על קרח.
- צור aliquot 1 מתוך 100 μL של הדגימה בצינור 1.5 מ"ל ייעודי לקביעת חלבון. צנטריפוגה אותו ב 18,200 × גרם במשך 5 דקות ב 10 ° C.
- לקבוע את תכולת החלבון של aliquot 1 על ידי בדיקת ברדפורד (ראה סעיף 4). אחסנו את הדגימות על קרח.
- צור aliquot 2 של 20-100 μL של הומוגנט המניות במיקרו-צינור חדש של 2 מ"ל למיצוי שומנים (ראה סעיף 5). אם הדגימות אינן מנותחות מיד, שמור אותן על קרח עד לביצוע המיצוי.
הערה: יש להגדיר את נפח המיצוי הסופי על בסיס כמות החלבון הכוללת. זה חייב להיות בטווח של 0.015-0.045 מ"ג חלבון לכל aliquot כולל.
4. בדיקת קביעת חלבון ברדפורד
הערה: דגימות המחקר צריכות להיות אקראיות לפני תחילת הניתוח, והאקראיות מכובדת עבור כל שלבי עיבוד הדגימה.
- aliquot צנטריפוגה 1 supernatant 2x עם חיץ אמוניום ביקרבונט.
הערה: גורם הדילול תלוי בריכוז ההומוגנט של הרקמה. עבור פתרונות מרוכזים יותר, להחיל גורם גבוה יותר, כך הריכוז שנקבע נופל בטווח הדינמי של הבדיקה. - הכינו עקומת אלבומין בסרום בקר (BSA) לפי טבלה 1. מערבלים את הצינורות הסטנדרטיים. צנטריפוגה את הצינורות ב 18,200 × גרם במשך 15 שניות בטמפרטורת החדר.
- מהצינורות הסטנדרטיים שהוכנו קודם לכן, העבירו 6 μL כל אחד מהשפופרות הריקות והסטנדרטיות ללוח בעל תחתית שטוחה של 96 בארות בהתאם לפריסת הלוחות המוצגת באיור 1.
- העבירו את הדגימות שהוכנו קודם לכן לצלחת בעלת 96 בארות בעלות תחתית שטוחה בהתאם לפריסת הלוחות המתוארת באיור 1.
- הוסף 250 μL של מגיב ברדפורד לכל באר באמצעות פיפטה רב ערוצית ולערבב. דוגרים במשך 5 דקות.
- מדוד את הבליעה באורך גל של 595 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
- חישוב ריכוזי החלבון באליציטוטים בהתבסס על עקומת התקן.
הערה: יש לקחת בחשבון את גורם הדילול המשמש בתחילת ההליך בעת חישוב ריכוזי החלבון.
5. מיצוי BUME
הערה: הימנע משימוש בצינורות פלסטיק בעלי קישור נמוך למיצוי ליפידומיה, מכיוון שהממסים האורגניים החזקים משחררים פלסטיסייזרים ויוצרים רקע חזק במהלך ניתוח הדגימה.
- הכינו צינורות של 1.5 מ"ל עם 100 מיקרוליטר של תמיסת אמוניום ביקרבונט בכל צינור של סך הכל ריק (TB), ריק סטנדרטי פנימי (ISB) ודגימות בקרת איכות (QC), בהתחשב בכך שדגימת QC אחת ממוקמת בין כל קבוצה של 10 דגימות. שמור את כל הדגימות על קרח.
- הוסף 10 μL של פלזמה אנושית משולבת לכל דגימות QC. ספייק 10 μL של תמיסה סטנדרטית פנימית לכל דגימות ISB, QC ומחקר (כלומר, כל הדגימות למעט שחפת).
הערה: עבור חומרי בקרת איכות, השתמש בכל פלזמה K2EDTA הזמינה מסחרית. כמת את ריכוז השומנים בפלזמה מאוגמת באמצעות הפרוטוקול שהוזכר עם קבלתו ושמור טווחים אלה כהפניות לכל הניתוחים שבהם נעשה שימוש בחומר QC. השתמש בפלזמה של NIST רק עבור יישומים ממוקדים יותר או עבור אימות שיטה גלובלי, שבו יש להתייחס לדיוק של הבדיקה. - הוסיפו 300 μL של −20°C תערובת בוטאנול/מתנול (3/1, v/v) לכל דגימה. נערו ב 450 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer.
- הוסף 300 μL של תערובת heptane/ethyl אצטט (3/1, v/v). נערו ב 450 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer.
- מוסיפים 300 μL של תערובת חומצה אצטית 1%. נערו במשך 5 דקות ב 450 × גרם בטמפרטורת החדר על thermomixer. צנטריפוגה ב 2,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. העברת 360 μL של השלב העליון לצינור נעילה עצמית חדש 2 מ"ל 2.
הערה: מיצוי נוזל-נוזל יכול לגרום לשינוי מיקומים של גבול הפאזה באופן תלוי דגימה, מה שעלול לגרום לפער נפח קל עבור השלב העליון. התאם את נפח האיסוף לשלב העליון במידת הצורך. - הוסף 320 μL של הפטאן/אתיל אצטט (3/1, v/v) לצינור פאזת המים 1. נערו ב 450 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer. צנטריפוגה ב 2,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים 320 μL של השלב העליון ומשלבים עם השבר משלב 5.11.
הערה: במידת הצורך, התאם את אמצעי האחסון של האוסף לשלב העליון. - הוסף 250 μL של הפטאן/אתיל אצטט (3/1, v/v) לשלב המים בצינור 1. נערו ב 450 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על thermomixer. צנטריפוגה ב 2,800 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים 200 μL של השלב העליון ומשלבים עם השברים משלב 5.11 ושלב 5.15 בצינור 2.
הערה: במידת הצורך, התאם את אמצעי האחסון של האוסף לשלב העליון. - יש להתאדות ליובש ב-35°C ברכז ואקום.
הערה: ניתן לאחסן דגימות מיובשות בטמפרטורה של -20°C עד לניתוח, במידת הצורך. - מתמוסס מחדש ב-300 מיקרוליטר של תמיסת תערובת טרשת נפוצה (7.5 מ"מ אמוניום אצטט באיזופרופנול/מתנול/כלורופורם, תמיסת 4:2:1). מערבול כל צינור במשך 5 שניות כדי להבטיח שהכל מומס. צנטריפוגה ב 18,200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
- העבירו אליציטוט של 50 μL לצלחת המיקרוליטר בהתאם לפריסת הלוחות באיור 2 לניתוח מצב יינון חיובי (עמודות 1-6) ודללו עם 50 μL של תמיסת תערובת MS.
- העבירו אליציטוט של 20 μL לתוך לוח MTP בהתאם לפריסת הלוחות באיור 2 לניתוח מצב יינון שלילי (עמודות 7-12) ודללו עם תערובת של 80 μL של MS. עטפו את הצלחת בנייר כסף ושמרו על טמפרטורה של 4°C לפני הניתוח.
6. ניתוח טרשת נפוצה
- כיול ספקטרומטר מסה (MS) הן במצב חיובי והן במצב שלילי בהתאם להוראות היצרן 5 ימים או פחות לפני הניתוח.
- התקן את מקור ננו העירוי הישיר מראש, וודא שהוא מיושר כראוי כנגד נימי ההעברה של הטרשת הנפוצה. התקן שבב זרבובית 4.1 מיקרומטר במחזיק השבב והגדר אותו בתוכנה.
- השתמש בפרמטרים הבאים להגדרת שיטת מצב חיובי ושלילי : לחץ גז של 1.25 psi; מתח מקור של 1.1 קילו וולט; 5 μL של נפח הזרקת דגימה; סגירת מגע פלט Rel1 עבור 2.5 שניות; 5 דקות של זמן אספקה; קירור הצלחת ב-4°C.
- הגדר את תור רצף הניתוח עבור רובוט העירוי הישיר במצב חיובי.
- הגדר את שיטת MS למצב חיובי באמצעות הגדרות MS הבאות:
- הגדר את טמפרטורת הנימים על 250 ° C ואת רמת RF עדשת S על 65.0. בצע סריקה מלאה של טרשת נפוצה מ-0 עד 1 דקות בטווח של 550-1000 m/z ברזולוציה של 140,000 עם בקרת הגברה אוטומטית של 1 ×106 וזמן הזרקה מרבי של 50 אלפיות השנייה. החל מסת מנעול של 680.48022.
- הגדר שיטת רכישה MS/MS שאינה תלויה בנתונים בין טווח הזמן של 1 ו - 5 דקות ברזולוציה של 17,500 עם מסה ראשונה קבועה של 250 m/z. השתמש בבקרת הגברה אוטומטית עבור MS2 ב- 1 ×10 5 וזמן הזרקה מרבי של 64 אלפיות השנייה, אנרגיית התנגשות של 20 NCE וחלון בידוד של 1 m/z. השתמש ברשימת מסת ההכללה מ- 550 עד 1,000 m/z, עם צעד מסה של 1 Da.
- עבור הרכישה במצב שלילי, הגדר את הטמפרטורה הנימית ב 250 °C ואת רמת RF S-Lens ב 65.0 בקובץ כוונון MS.
- השתמש בהגדרות הבאות של שיטת MS: מצב רכישה של סריקה מלאה מ- 0 עד דקה אחת ברזולוציה של 140,000 המכסה את טווח 400-940 m/z, בקרת הגברה אוטומטית של 1 × 106; זמן הזרקה מרבי של 50 ms; השתמש במסת מנעול של 529.46262.
- הגדר רכישת MS2 במצב DIA בין דקה אחת לחמש דקות של הפעלה ברזולוציה של 17,500 עם מסה ראשונה קבועה של 150 m/z; בקרת רווח אוטומטית של 1 × 105; 64 מילישניות של זמן הזרקה מרבי; ו-35NCE של אנרגיית התנגשות. השתמש ברשימת ההכללה ההמונית מ- 400 ל- 940 עם צעד המוני של 1 Da.
- צור את תור רצף הניתוח בתוכנת MS במצב חיובי . המתן עד שרכישת הדגימה תופעל על ידי אות סגירת מגע המגיע מרובוט העירוי הישיר עבור כל דגימה.
- כאשר ניתוח המצב החיובי הושלם, צור את תור הרצף עבור רובוט העירוי הישיר במצב שלילי .
- הגדר את תור רצף הניתוח בתוכנת MS במצב שלילי .
7. עיבוד נתונים
- כדי להמיר את קבצי הנתונים מהמצב החיובי והשלילי מתבנית .raw לתבנית .mzML, השתמש בתוכנת הממיר.
הערה: יש להמיר קובצי נתונים ממצבים חיוביים ושליליים בנפרד (עקב הגדרות הרכישה השונות שלהם וסף רעש שונה).- מלא את ההגדרות הבאות כדי לבצע המרת קבצים: גורם סף הרעש הוא 3 ו- 5 עבור MS ו- MS2, בהתאמה; הפעל את פונקציית הסרת הרעשים הן עבור MS והן עבור MS2, דחיסת נתונים, סריקות MS2 ממוצעות ואיסוף שיא. הגדר ספי TIC עבור מצבים חיוביים ושליליים (לדוגמה, 10,000 ו- 5,000; יוגדרו בהתבסס על רמת הרעש של הדגימה המסוימת המיוצרת על ידי מכשיר מסוים). צור דוחות XLC ו- PDF בסוף העיבוד.
- בצע את זיהוי השומנים. הגדר את הפרמטרים הבאים (לדוגמה) של הגדרות ייבוא קבצים: חלון הבחירה ±0.5 Da (תלוי בחלון הבחירה בשיטת MS); טווח זמן 2-300 שניות (תלוי בזמן הסריקה בשיטת MS); ללא מסות כיול עבור MS ו- MS2; להעביר ולעגל כלפי מעלה את טווח המסה מקבצי מטה-נתונים של תוכנת Peak by Peak (מסה מינימלית [MS]) ו-(מסה מינימלית [MS2]); סובלנות של 3 עמודים לדקה ו- 10 עמודים לדקה עבור MS ו- MS2, בהתאמה; השאר ריק את שדה הסף MS ו- MS2, מסנן התדרים, היסט MS1 ו- PMO; תיקון איזוטופי עבור MS ו- MS2 שנבחר; העבר מעבר צבע של רזולוציה מקובץ המטה-נתונים של הממיר כ- (התאמה ליניארית של רזולוציה [MS]) וכ- (התאמה ליניארית של רזולוציה [MS2]).
הערה: זיהוי שומנים במצב חיובי ושלילי חייב להתבצע בנפרד בגלל הגדרות הרכישה השונות שלהם. - לאחר ייבוא הנתונים, עבור אל תפריט הפעלה והעלה את קבצי MFQL לזיהוי שומנים.
הערה: למידע מפורט על המבנה של MFQLs, עיין בפרסום של הרצוג ואחרים. ראה כמה דוגמאות של קבצי MFQL ב- https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library וראה את הדיון. כל MFQL המשמשים לעיבוד הנתונים מסופקים בחומרים המשלימים. - כמת את המינים המזוהים ברמת הטרשת הנפוצה על ידי חלוקת עוצמת המסה המקדימה של תכונת השומנים בעוצמה המתאימה של התקן הפנימי המסומן ולאחר מכן הכפלת המנה בריכוז התקן הפנימי המסומן. נרמל את ריכוז השומנים הסופי לכל כמות של חלבון כולל שנמדדה על ידי מבחן ברדפורד.
8. נוהל בדיקת QC
הערה: הליך בדיקת איכות הוא שלב חיוני כדי לאמת את השחזור הטכני של השיטה. לשם כך, פלזמה מסחרית משותפת מנותחת כדי לקבוע את הרמות האנדוגניות של שומנים שונים במשך 5 ימים ב -15 aliquots זהים לכל אצווה (סה"כ חמש אצוות). שים לב שבמקרה זה, צינור הערכת נתונים נוצר כיישום אינטרנט מבריק באמצעות סביבת התוכנה הסטטיסטית R.
- הגדר את טווח קבלת הייחוס כערך הממוצע המחושב עבור כל חמש האצוות ±3 סטיות תקן.
- החלת כללי הקבלה "עובר" עבור כל אצווה אנליטית: 90% מיעדי הייחוס חייבים לעבור, בהתחשב בכך שתרכובת ייחוס אחת מייצגת מחלקת שומנים אחת. לדוגמה, אם 15 יעדי ייחוס כלולים באימות QC, ודא ש-13 יעדים עוברים כדי שהאצווה תתקבל.
הערה: במילים אחרות, 68% מדגימות QC לכל תרכובת ייחוס חייבות לעבור כדי שהנתונים עבור מחלקת שומנים זו יתקבלו. - אם אצוות המחקר אינה עומדת בתנאי הקבלה לבדיקת QC, חזור על ההליך.
9. הערכת כמויות (יחסיות) של חומצות שומן מצומדות (יחסית)
- עבור כל קבוצת שומנים, הערך את כמויות חומצות השומן המצומדות בהתבסס על עוצמות MS2 שלהן.
הערה: בשל הבדלי פיצול ויינון, הערכים הנגזרים נועדו רק להשוואות שפע יחסיות בין קבוצות מדגם ולא למשל להערכת התרומה היחסית של חומצת שומן מסוימת למאגר חומצות השומן המצומדות הכולל של קבוצת שומנים. - לנרמל את עוצמות MS2 של שברי חומצות שומן על ידי העוצמה הממוצעת של שברי חומצות שומן של התקן הפנימי המתאים. בהתבסס על ריכוז התקן הפנימי ומשקל הרקמה הנמדדת, יש לגזור "ריכוז מנורמל" עבור חומצות השומן המצומדות. סכמו ערכים אלה לכל מחלקת שומנים כדי להעריך את הכמות הכוללת של כל חומצת שומן מצומדת לדגימה.
10. ניתוח סטטיסטי
- לבצע ניתוח סטטיסטי. התאם מודל ליניארי לכל תנאי ולקבוצת הבקרה המתאימה, וחשב ערכי p מסטטיסטיקת t עבור נתונים מותמרים log2. השתמש בשיטת שיעור גילוי השווא של בנימיני-הוכברג כדי לתקן אפקטים מרובים של בדיקה.
הערה: שומנים עם ערכי p מותאמים < 0.05 נחשבים לנפוצים באופן דיפרנציאלי. כאן בוצע ניתוח סטטיסטי בסביבה הסטטיסטית R26.
Representative Results
כאן, כתוצאות מייצגות, אנו מציגים נתונים הממחישים כיצד ניתן להשתמש בליפידומיה של רובה ציד כדי לחקור את ההשפעות של ניתוח קיסרי על ריאותיהם של עכברים. פרוטוקול ניתוח השומנים של רובה הציד יושם בהצלחה במחקר in vivo לניתוח השוואתי של שתי קבוצות דגימות: רקמות ריאה שנותחו מתשע נקבות עכברי Apoe−/− שנחשפו ל-CS (קבוצת 3R4F; בקרה חיובית) ומספר שווה של עכברים שהוחזקו בתנאי אוויר צח (קבוצת דמה) כביקורת שלילית שנאספה לאחר 3 חודשים, נקודות זמן חשיפה של 4 חודשים ו-6 חודשים. בעלי החיים הוחזקו תחת אוויר צח מסונן וממוזג בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס ± 2 מעלות צלזיוס ו -55% ± 15% לחות והוזנו בדיאטת גלולות המוקרנות בגמא. משטר האור נשמר בשעה 12 שעות ביום. עד שמונה עכברים שוכנו בכל כלוב. סיגריות ייחוס 3R4F לטיפול בחשיפה נרכשו מאוניברסיטת קנטקי כדי לייצר את תרסיס 3R4F CS (600 מיקרוגרם של חומר חלקיקי כולל TPM/L) עבור ריכוז חשיפה למטרה שווה ערך ל -28 מיקרוגרם ניקוטין / L.CS עשן מסיגריות 3R4F יוצר באמצעות 30 מכונות עישון סיבוביות על פי פיליפס ואחרים . בהתבסס על פרוטוקול העישון האינטנסיבי של Health Canada, 55 מ"ל נפח נשיפה, נשיפה אחת לכל 30 שניות וחסימה של 100% של חורי אוורור הוחלו על סיגריות 3R4F כדי לספק חשיפה מספקת. כל הפרטים הנוספים על תכנון המחקר דווחו בעבר27,28.
בסך הכל, ~400 מיני שומנים מולקולריים מ-14 קבוצות השומנים הנפוצות ביותר זוהו וכומתו (איור 3). ריכוז השומנים המנורמל הכולל בכיתה היה מעט גבוה יותר עבור קבוצות השומנים PE, PEO, PC, PCO, PI ו-PG, ונצפתה ירידה מסוימת בוויסות עבור שומנים SM, LPE ו-PA (איור 3A), בעוד שלא ניתן היה לראות הבדל עבור TAGs ו-PS. באופן מעניין, רמות גבוהות של שומנים פלסמלוגנים PCO ו-PEO בקבוצת CS דווחו בתאי דלקת29 . אחד התפקידים התוך-תאיים של שומנים פלסמלוגנים הוא פעילות נוגדת חמצון. תחת חשיפה למיני חמצן תגובתי (ROS) וחנקן (RNS), דווח על חמצון סלקטיבי של פלסמלוגנים בהשוואה לפוספוליפידים דיאציל30. הקשר אניל-אתר במבנה הכימי של פלסמלוגנים רגיש להתקפה רדיקלית על עקה חמצונית31. המוצרים העיקריים של התקפה רדיקלית הם חומצות איקוסאטראנואיות הידרוקסילציה, פוספוליפידים 2-מונואצילגליצרול, פנטדקנול, חומצות פורמיות, α-הידרוקסיאלדהידים באורכי שרשרת שונים, 1-פורמיל-2-ארכידונויל גליצרופוספוליפיד, וליזופוספוליפידים.
התוצאות האלה מראות שבין התכונות המולקולריות המבוססות על הנוסחה המולקולרית הכוללת, 100-120 תרכובות הושפעו באופן משמעותי מחשיפה לניתוח קיסרי (איור 3D). הדה-קונבולוציה המפורטת של מידע הפיצול MS2 והנורמליזציה של עוצמות אות המקטע אפשרו הגדרה משוערת של הכמות הכוללת של כל חומצת שומן מצומדת (FA) המיוצגת בכל מחלקת שומנים (איור 3E) והשוואה של נתונים אלה בין קבוצות חשופות וקבוצת ביקורת. נצפתה ירידה ברורה הן ב-FAs רוויים לחלוטין והן באלה עם מעט אי-רוויות, בעיקר בהקשר של ליזו-ליפידים. לעומת זאת, חומצות שומן רב בלתי רוויות (PUFA) בהרכב של מחלקות פוספוליפידים PC, PE ו-PG היו גבוהות בקבוצת CS עבור כל נקודות הזמן. המקרים הקיצוניים של PC ו-PG מצומדים לאיקוסאפנטנואית (EPA) וחומצה דוקוסהקסנואית (DHA) זוהו באופן בלעדי בקבוצת החשיפה ל-3R4F CS (איור 3E, צבע אדום).
איור 1: פריסת לוחות לפיזור דגימות בניסוי ברדפורד. דוגמאות ריקות וסטנדרטיות ממוקמות במשולש בעמודות 1-3; דוגמאות לא ידועות ממוקמות בשכפול בעמודות 4-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פריסת לוחות של לוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות לניתוח ספקטרומטריית מסות של רובה ציד. התפלגות דגימות ריקות, סטנדרטיות, לא ידועות ו- QC לרכישה במצב יינון חיובי ממופה בצד שמאל של הלוח (עמודות 1-6); כל הדגימות למצב יינון שלילי ממוקמות מימין (עמודות 7-12). קיצורים: pos = חיובי; QC = בקרת איכות; neg = שלילי; TB = ריק מוחלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח ליפידומיה של רובה ציד של ריאות עכברים שנחשפו לעשן סיגריות. עכברי Apoe−/− נחשפו ל-CS מסיגריית הייחוס 3R4F או אוויר צח (דמה). (A) ריכוזי מחלקת שומנים ומספר מיני השומנים בכל מחלקה. עבור כל מחלקה, מספר מיני השומנים המכומתים נתון בסוגריים. רווח בר-סמך ממוצע ו-95% עבור כל קבוצת שומנים, בנפרד עבור כל סוג חשיפה (מצטבר על פני שלוש נקודות זמן). (B) חלקות הר געש המציגות את גודל ההשפעה (שינוי קיפול log2) ואת המשמעות (-log10 FDR-adjusted p value) של מיני השומנים המכומתים עבור השוואת 3R4F CS לעומת השוואה מזויפת בשלוש נקודות הזמן. שומנים גבוהים באופן משמעותי מסומנים בצהוב; ירידה משמעותית בשומנים מסומנת בציאן (ערך p מותאם FDR < 0.05). (C) שפע דיפרנציאלי של 25 מיני השומנים עם השינויים הגדולים ביותר בקפל הממוצע האבסולוטי. שינויי קיפול Log2 עבור השוואת 3R4F CS לעומת דמה מקודדים בצבעים, ומובהקות סטטיסטית מסומנת: *: ערך p מותאם FDR < 0.01; X: ערך p מותאם FDR < 0.05. (ד) חלקות השוואה. מקדמי המתאם להשוואות הקיפול-שינוי מסומנים בצבעים, ומצוין מספר השומנים המשותפים השופעים דיפרנציאלית (סה"כ מספרים בשוליים). תרשימי עוגה מציגים את אחוז השומנים המשותפים השופעים באופן דיפרנציאלי עם אותו כיוון שינוי (סימן FC). כוכבית מצביעה על חפיפה משמעותית של השומנים השופעים באופן דיפרנציאלי. (E) שפע דיפרנציאלי של FAs מצומדים לכל מחלקת שומנים. מפת חום כמו בלוח C עבור חומצות שומן מצומדות עם הבדלי שפע משמעותיים בין 3R4F וחשיפה דמה בכל שלוש נקודות הזמן (ערך p מותאם FDR < 0.05). הכמות של כל חומצת שומן לכל קבוצת שומנים הוערכה בהתבסס על עוצמות MS2 של שברי חומצות שומן. קיצורים: CS = עשן סיגריות; FDR = שיעור גילוי כוזב; FC = שינוי קיפול; FA = חומצות שומן; PC = פוספטידילכולין; PS = פוספטידיל-סרין; TAG = טריאצילגליצרול; SM = ספינגומיילין; PEO = פלסמלוגן פוספטידיל-אתנולמין; PE = פוספטידיל-אתנולמין; PG = פוספטידיל גליצרול; PI = פוספטידילינוזיטול; DAG = דיאצילגליצרול; SE = אסטרים סטרול / כולסטריל; PCO = פלסמלוגן פוספטידילכולין; LPC = ליסו פוספטידילכולין; LPE = lyso phosphatidylethanolamine; PA = חומצה פוספטידית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז סופי BSA (מ"ג/מ"ל) | תמיסת BSA במינון 2 מ"ג/מ"ל (μL) | מאגר אמוניום ביקרבונט (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 מתוך תמיסת 0.125 מ"ג/מ"ל | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
טבלה 1: סכימת דילול של התקן הפנימי BSA עבור עקומת הכיול עבור מבחן ברדפורד. קיצור: BSA = אלבומין בסרום בקר.
מידע משלים: קבצי MFQL המשמשים לזיהוי שומנים LipidXplorer. חבילת .zip מורכבת מקבצי MFQL הנדרשים בנפרד, שכל אחד מהם נקרא לפי תבנית זו: <קיצור מחלקת ליפידים>_<מצב יינון>_MS2.mfql (למשל, PE_neg_MS2.mfql). שמות הקבצים לזיהוי סטנדרטי פנימי עם תווית כוללים את התג D7(D9) בתג <קיצור ליפידים> (לדוגמה, PED7_neg_MS2.mfql). קבצי MFQL אלה משמשים לאימות כמות הדאוטריום בתקן הפנימי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
למרות שההתקדמות בטרשת נפוצה הניבה מגוון שיטות לניטור מדויק של מיני שומנים רבים, פרופיל השומנים הקודם של רקמות יונקים שונות לא הראה תוצאות עקביות, וכתוצאה מכך, הפונקציות הספציפיות לרקמות מסוימות של ליפידים נותרו לא ברורות. בהשוואה לניתוח פונקציונלי של חלבונים, שעבורו קיימות גישות חזקות יותר כדי לדפוק את הביטוי של תרכובות מסוימות, רוב השומנים לא ניתן לכבות באופן סלקטיבי או לבטא יתר על המידה ברקמות, מה שהופך את ההערכה הפונקציונלית של שומנים קשה. פרופיל מתקדם של ריכוזי ליפידום ברקמה עשוי לספק גישה חלופית לזיהוי קשרים בין שומנים במחזור הדם לבין מחלות אנושיות.
בהערכת שיטות ליפידומיקה מקיפות המסוגלות לכסות איכותית וכמותית את פרופיל השומנים האנדוגני של כל רקמת עכבר, נתנו עדיפות לשיטת הליפידומיה של רובה הציד. באופן כללי, שני סוגים מנוגדים של ניתוח דגימות אפשריים: או סינון בלתי ממוקד לחלוטין של שומנים באמצעות הפרדה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית (LC) עם זיהוי ספקטרומטרי מסה נוסף כדי לחשוף את מורכבות השומנים הכוללת של הדגימה, או גישות ממוקדות, המאפשרות בעיקר כימות מדויק מאוד של שומנים ספציפיים בעלי עניין. לעומת זאת, התכונה החזקה של זרימת העבודה הליפידומית של רובה הציד המוצגת היא כיסוי מקיף ומהיר של מאות ליפידים אנדוגניים ממחלקות שומנים מוגדרות מראש, שעדיין ניתן לבצע באופן סמי-כמותי חזק.
יעילות היינון של סוגי שומנים שונים היא תלוית מבנה ויכולה להשתנות באופן דרסטי בהתאם לתנאי היינון הניסיוניים השונים. בניגוד לשיטות הפרדה מבוססות LC, ניתוח רובה ציד ממזער הבדלים אלה בשל עירוי ישיר בו זמנית של תמצית השומנים כולה באותם תנאי יינון לתוך מכשיר הטרשת הנפוצה. השימוש באנלוגים ליפידים מסומנים איזוטופית או בתקנים לא אנדוגניים דומים מבחינה מבנית מאפשר כימות למחצה של כל מחלקות השומנים. Shotgun lipidomics מספק שונות נמוכה בין ותוך ריצה במהלך ניתוח טרשת נפוצה; כתוצאה מכך, שיטה זו מייצרת מקדמים נמוכים יותר של וריאציה21 מאשר שיטות מבוססות כרומטוגרפיה נוזלית לא ממוקדת, הדורשות סטנדרטים מרובים לכימות הולם. חשוב לציין, כי אמנם לא נעשה שימוש בעקומת כיול חיצונית בשיטה הנוכחית, אך השיטה עדיין נחשבת כמותית לחלוטין32.
רמה אחת של תקן פנימי מסומן (או תקן ללא תווית שאינו מבוטא אנדוגני) לכל מחלקת שומנים מספיקה לכימות של רוב השומנים. רק פרסומים מעטים דיווחו על אימות חלקי של השיטה לשיטת ליפידומיה של רובה ציד. לדוגמה, ב- Gryzbek et al.17 וב- Surma et al.21, עקומות כיול הפוכות הוכנו באמצעות תקנים פנימיים וכמות קבועה של מטריצת דגימה. הלינאריות הוערכה על ידי רגרסיה ליניארית של כמויות שומנים מותמרות עץ ועוצמתן ודווחה כ-R2 ושיפוע, בהתאמה. גבול הזיהוי (LOD) וגבול הכימות (LOQ) נקבעו על ידי רגרסיה ליניארית משוקללת המבוססת על יחס אות לרעש של 3 עבור LOD ו-10 עבור LOQ. עבור רוב סוגי השומנים, LOQ הוגדר בין 2-9.8 pmol עבור רקמת שומן ו 0.05-5μM בפלזמה. בשני המקרים, נעשה שימוש בתקנים פנימיים בודדים שאינם אנדוגניים לכל מחלקה כדי לגזור אומדנים עבור כל השומנים בכיתה. עם זאת, בעבודה זו, איננו מספקים LOD / LOQ בשל מספר חששות: המטריצה האנדוגנית אינה נטולת תרכובות, והמטריצה החלופית לרקמות אינה זמינה - עם זאת, ספייק של כמויות קטנות ידועות של תקנים אינו אפשרי. איננו מבצעים גישת כימות ממוקדת קלאסית עם שימוש בסדרת עקומת כיול של תרכובת מסוימת המנורמלת על ידי התקן האיזוטופי הזהה שלה בשל אי קיומם של תקנים טהורים והזמינות המוגבלת מאוד של ליפידים המסומנים איזוטופית. גלאי אורביטרפ מבצעים אוטומטית את המרת האות הארעי על ידי החלת טרנספורמציית פורייה, וחלק מהאות כבר מוחלף - כתוצאה מכך, טווח הריכוז הנמוך יהיה ליניארי בלבד עד לאות מינימלי כלשהו, שמתחתיו המולקולה לא תהיה ניתנת לגילוי יותר. ערכי אות לרעש של תוכנת Xcalibur תלויים ביחס m/z של המולקולה; כתוצאה מכך, התרכובות של כל קבוצת שומנים, המכילות שילובים שונים של חומצות שומן, יהיו בעלי ערכי רעש שונים. יתר על כן, ערכי LOQ/LOQ קשורים אך ורק לסוג המטריצה, וכאשר כימות הליפידום נעשה ברקמות מכרסמים שונות, הוא צריך לבוא לידי ביטוי על ידי הערכת LOQs עבור כל סוג רקמה בנפרד.
למעשה, השיטה מציעה טווח כימות דינמי ליניארי גבוה של עד ארבעה סדרי גודל33 ורגישות טובה מאוד לכיסוי השומנים המבניים האנדוגניים החשובים ביותר, אשר ניתן להגדיל עוד יותר על ידי שיפורים טכניים ברכישת MS32. מקדמי השונות של ריכוזי השומנים הממוצעים היו לרוב מתחת ל-15%, כלומר הליפידומיה של רובה הציד עומדת בדרישות מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) כשיטה שיש לשקול למחקרי מעבדה טובה (GLP) ופרקטיקה קלינית טובה (GCLP)34.
עם זאת, יש לציין כי בשל הקוטביות השונה שלהם, כמה מחלקות שומנים להיות מושפעים הרבה יותר על ידי התרומה של FAs מצומדים ספציפיים. זה מוביל לעיוות בתגובת העוצמה בתערובות שווי משקל המכילות מגוון רחב של FAs מצומדים, וכתוצאה מכך הטיית כימות, כפי שהודגש על ידי Koivusalo et al.35 עבור מחלקות פוספוליפידים. יש לציין כי מחברים אלה הציגו נתונים עבור מגוון רחב של FAs, מאורך שרשרת 24-48, אשר ככל הנראה אינו משקף את המצב במדגם ביולוגי אמיתי. התגובה עבור מינים רב בלתי רוויים הייתה גבוהה ב-40% מאשר עבור מינים רוויים לחלוטין, אך השפעה זו נצפתה רק עבור ריכוזים גבוהים יותר. כאשר התערובת דוללה בהדרגה, ההשפעה של אי-רוויה פחתה בהדרגה וכמעט נעלמה ברמה של 0.1pmol/μL לכל מין. בנוסף, כל המדידות נעשו על מכשירי מלכודת יונים ומשולשים מרובעים ולא על ציוד Q-Exactive.
יתרון נוסף של זרימת העבודה המוצגת הוא הגמישות הטכנית שלה, המאפשרת התאמה לדרישות הפרויקט הספציפיות. לדוגמה, כל פרוטוקול מיצוי שומנים - כגון שיטות Bligh ו- Dyer36 ששונו, מתיל טרט-בוטיל אתר 37, או בוטנול-מתנול38 - יכול לשמש להכנת תמצית שומנים כוללת לפני ניתוח MS. המגבלה העיקרית של מיצוי כלורופורם-מתנול היא שהשלב התחתון מכיל את החלק השומני, מה שמסבך את העבודה השגרתית ובעיקר את האוטומציה; בנוסף, יש לקחת בחשבון את הרעילות של כלורופורם. מיצוי אתר Tert-butyl נמצא בשימוש נרחב לניתוח שומנים של דגימות פלזמה37, וגרסה אוטומטית הוצעה21. במקרה זה, בחרנו בשיטת BUME מכיוון שהיא מספקת התאוששות טובה עוד יותר עבור מחלקות השומנים PG, PI, PA ו- PS38, צריכת ממס נמוכה יותר ואפשרות אוטומציה39, בעוד שהריכוזים הכוללים שכומתו עבור דגימות רקמה שחולצו בכל שלוש השיטות היו דומים. בנוסף, בעוד שאילוץ הדגימה בוצע באופן ידני בעבודה הנוכחית, ניתן גם לקבל תוצאות ניתנות לשחזור ומדויקות מקבוצות מדגם גדולות על ידי הכנת דגימה אוטומטית ומיצוי שומנים בפורמט96 בארות 40,41. זה מאפשר ליישם ניתוח ליפידומיה במחקרים קליניים וטוקסיקולוגיים בקנה מידה גדול.
בעבודה הנוכחית ביצענו את רכישת הטרשת הנפוצה של מצבים חיוביים ושליליים בנפרד ללא החלפת קוטביות כפי שתואר על ידי Schuhmann et al.42. יציבות אות הננומט טובה יותר במצב שלילי לתמיסה מעט פחות מרוכזת מאשר במצב חיובי. בנוסף, פיתחנו הליך מעקב מלא עם תוכנת ממיר מקבצי .raw ל- mzML, המספק את הערכים שיש לציין בתוכנת LipidXplorer - עם זאת, חישובי שיפוע רזולוציה ידניים אינם נדרשים. יישמנו גם החלפות שונות של הגדרות רעש מכיוון שבמצב חיובי, רמות הרעש של הספקטרום גבוהות יותר מאשר במצב שלילי. כל השלבים עברו אופטימיזציה לניתוחים שגרתיים הניתנים למעקב ובתפוקה גבוהה.
לצורך זיהוי, ניתוח ליפידומיה של רובה ציד יכול לנצל את ההתנהגות הייחודית של מחלקות שומנים שונות, היוצרות אדדוקטים ייחודיים במצבי קוטביות שונים. בשיטה זו, מיני PC ו-PE בעלי מסה מולקולרית זהה החופפים במצב היינון החיובי ניתנים להפרדה מלאה במצב היינון השלילי, כאשר PC יוצר אצטט או פורמט adducts, ו-PE מיונן בצורה מפורקת. יתר על כן, דה-קונבולוציה מבנית (חלקית) אפשרית עבור השיטה המשתמשת לא רק בנוסחה המולקולרית אלא גם במבנה חומצות השומן בתפזורת. לדוגמה, זיהוי FA ברמת הפחמן הכולל וספירת אי-הרוויה הכוללת פועל עבור כל הפוספוליפידים, DAGs, TAGs וליזו-פוספוליפידים. ניתן לבצע את הכימות מלמטה למעלה של כל צורה איזומרית באופן חלקי עבור חלק ממחלקות הפוספוליפידים43 , אך הוא מורכב הרבה יותר עבור DAGs ו- TAGs עקב תגובת אות לא שווה של FAs שונים בספקטרום MS2.
כמו כן, חשוב להדגיש את הצורך ביישום נהלי בקרת איכות מתאימים, התואמים באופן מלא את היוזמות האחרונות בתחום זה44. מכיוון שאנו רוצים להבטיח עקיבות נתונים נאותה ויכולת שחזור בין ובתוך המעבדה, ננקטו מספר צעדים כגון אקראיות נכונה של הדגימות לכל שלבי הניתוח, עבודה עם תערובות סטנדרטיות מאושרות על ידי ספקים, הכללת דגימות בקרת איכות, נהלים לאימות קבלה או דחייה של אצווה, ויצירת מסד נתונים פנימי למעקב אחר ביצועי QC בטווח הארוך. כמו כן, עולה בקנה אחד עם יוזמות אלה הצורך בשיטה סטנדרטית לטיפול ביציבות הדגימה. באופן כללי, רוב השומנים המבניים אינם מושפעים מחמצון השומנים, הרלוונטי יותר עבור אוקסיליפינים, שומנים מחומצנים וחומצות שומן רב בלתי רוויות ולכן רגישים הרבה יותר לתנאי אחסון וטיפול. עם זאת, הערכה נכונה של יציבות המדגם היא עדיין משימה מאתגרת מבחינה טכנית.
עם זאת, פרוטוקול זה יש מגבלה כשמדובר בקביעת רמות submolecular של תרכובות. בהתחשב בכך שאין הפרדה של תמצית כוללת, כל האיזופורמים של שומנים עם מסה מולקולרית זהה אבל הרכבי חומצות שומן שונים מתמזגים בניתוח MS. עבור רוב הכיתות, ניתן להשיג deconvolution חלקי של המבנה באמצעות יחסי פיצול של שברי חומצות שומן שיורית MS2. עם זאת, הכימות הבלתי תלוי של כל איזופורם נותר משימה מאתגרת במיוחד בשל ההבדלים הגדולים בהתנהגויות הפיצול של איזופורמים שונים והעובדה שתקנים כימיים טהורים אינם זמינים במגוון גדול מספיק כדי להגדיר את ערכי הפיצוי. מגבלה נוספת היא שתהליך ESI מייצר באופן בלתי נמנע ממצאים, וכתוצאה מכך נוצר מלאכותי פסגות עבור שומנים מסוימים כגון DAGs, Pas ו- FAs, מה שעלול להוביל לכימות שגוי.
לאחר מכן, אנו מסכמים את החלקים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול בהתבסס על הניסיון שלנו. הראשון קשור לעובדה שלכל סוג רקמת עכבר יש פרופיל שומנים ייחודי הן מבחינת כמות השומנים והן מבחינת יחסי המחלקה. עם זאת, יש לקבוע בקפידה את הכמויות ההתחלתיות של הרקמה בהתבסס על תכולת החלבון הכוללת לפני המיצוי על מנת לא להרוות את אות הטרשת הנפוצה ולא לצאת מטווח הכימות הדינמי עקב צבירת שומנים בריכוזים גבוהים33 או - בקצה הנגדי - לספק מספיק אות MS כדי לכסות את תרכובות השומנים העיקריות עבור כל קבוצת שומנים.
ההיבט הקריטי השני הוא להבטיח יישור נאות של המיקום של שקע שבב ננו-מקור העירוי הישיר עם נימי ההעברה של ספקטרומטר המסות. בהתחשב בכך שכיול מלא של ספקטרומטר המסה בשני המצבים מתבצע מדי שבוע, החלפה בין מקור הכיול לבין מערך שבבי המקור ננו יכולה להיות הסיבה לשונות דרמטית בעוצמת האות עקב חוסר התאמה במהלך ההתקנה.
חלק קריטי נוסף בפרוטוקול הוא הטיפול הזהיר בתמהיל התקנים הפנימי. מכיוון שתערובת זו מכילה כמות משמעותית של דיכלורומתאן, לאחר פתיחתה, יש לצרוך אותה במהירות כדי למנוע אחסון ארוך ושימושים מרובים המובילים לאידוי ולשינוי ריכוז מלאכותי. יתר על כן, טיפול עקבי בתערובת הסטנדרטית לאחר הוצאתה מאחסון של -20 מעלות צלזיוס הוא חשוב, שכן הבדלי טמפרטורה יכולים להוביל לחוסר עקביות בנפח במהלך הפיפט עם פיפטות כרית אוויר. אפשרות היא להחליף את הדיכלורומתאן במאגר המתלים הסטנדרטי במתנול טהור, מה שיכול לשפר את נוחות הטיפול אך עלול להשפיע לרעה על המסיסות של חלק ממחלקות השומנים, ובכך להפחית את דיוק הכימות עבור מחלקות שומנים אלה.
החלק הקריטי האחרון הוא עיבוד נתונים. זרימת העבודה של עיבוד הנתונים משלבת את המרת התוכנה Peak by Peak מפורמט .raw לפורמט .mzML, החלת ממוצע סריקת MS2 וסינון רעשים MS1 ו- MS2, כמו גם איסוף שיא ודחיסת נתונים. כחלופה, תוכנת Proteowizard יכולה לשמש גם להמרת נתונים, אך במקרה זה, יש להגדיר מספר הגדרות ב- LipidXplorer באופן ידני. כל המורכבות של ליפידומיה של רובה ציד מרוכזת במיוחד בשלב של דה-קונבולוציה של הזרקה ישירה MS1 וספקטרום MS2. תוכנת הקוד הפתוח LipidXplorer מייבאת את הספקטרום שהומר מפורמט קובץ mzML בהתבסס על דיוק המסה, רזולוציית המסה ושיפוע השינוי שלה עם הגדלת m/z. התוכנה ממזגת מספר ספקטרום MS ו- MS/MS בודדים שנרכשו במהלך ריצת ניתוח. לאחר מכן, הוא מיישר פסגות בודדות בתוך ריצות מדגם שונות, ובכל אשכול של פסגות מיושרות, הוא מחליף את המסות שלהן במסה הממוצעת המשוקללת שלהן בעוצמה יחידה, בעוד שהשפע שלהן בכל קובץ נתונים נותר ללא שינוי. מסות מייצגות של אשכולות שיא מיושרים ועוצמות שיא בודדות מאוחסנות במסד נתונים של סריקה ראשית. מסד הנתונים הראשי של הסריקה מכיל את כל ספקטרום MS1 ו- MS2 שנוצר עבור כל הדגימות באצווה וניתן לפרק אותו לזיהוי שומנים באמצעות שאילתות שנכתבו בשפת שאילתת הפיצול המולקולרי (MFQL).
בסך הכל, השיטה מכסה זיהוי של שומנים DAG, TAG ו- SE המבוססים על מצב חיובי וליפידים PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC ו- LPE בהתבסס על רכישת מצב שלילי. במהלך זיהוי השומנים, מתבצע תיקון איזוטופי עבור MS1 ו- MS2, ועוצמות מותאמות מדווחות בקובץ הפלט .xlsx. לחלופין, מספר תוכנות אחרות זמינות לעיבוד נתוני רובה ציד, כגון ALEX45 ו- LipidHunter46.
חומצות שומן - מרכיבים גרעיניים עיקריים וקרום התא - מאוחסנים בצורה של פוספוליפידים להמרה נוספת למולקולות ביו-אקטיביות. הם יכולים להיות מומרים על ידי אנזימים lysophospholipid acyltransferase לתוך lysophospholipids דרך מסלול ארצות47. האנזים LPCAT3, למשל, ידוע כבעל סגוליות גבוהה לשילוב AA במתווכים lysophosphatidylcholine ו-lysophosphatidylsrine. הביטוי הגבוה יחסית של אנזימים אלה דווח בתאים דלקתיים, כגון מקרופאגים בנאדיות ותאי אפיתל סימפונות47, מה שהוביל לשחרור פרופורציות יחסיות גדולות יותר של פוספוליפידים המכילים AA בתאים אלה. עם זאת, לאחר שחרורם מפוספוליפידים ממברניים על ידי פוספוליפאז A2, ההמרה של PUFAs לסוגים שונים של מתווכי שומנים מזורזת על ידי אנזימים רבים48. יתר על כן, PUFAs אלה יכולים להפוך למצע לייצור פרוסטגלנדינים מעודדי דלקת ואנטי דלקתיים באמצעות הפעולה של אנזימים cyclooxygenase (COX)-1 ו- COX-247. פוספוליפידים הם אחד המקורות של מתווכי שומנים המשתחררים במקומות מסוימים שבהם מתווכים אלה נדרשים להדגים את ההשפעות הביולוגיות שלהם.
הריאה היא איבר מורכב המורכב ממספר סוגי תאים, שכל אחד מהם ממלא תפקידים חופפים ונישתיים בהקלה על התפתחות ותפקוד תקין של הריאה. רק מחקרים מעטים נעשו כדי לבודד ופרופיל סוגי תאים שונים בעכבר או בריאה האנושית (למשל, תאים מסוג נאדיות 2)49,50; סוגים אחרים של תאי ריאה עיקריים לא אופיינו. מחקר מעניין נוסף51 בוצע כדי לבודד ולבצע ניתוח שומנים של תאים אנדותליים, אפיתל, מזנכימליים ומעורבים של מערכת החיסון בריאה של עכבר. נצפה כי ריכוז PUFAs המשולבים ב- PCO ו- PG הועשר בתאי החיסון. בהתחשב בעובדה שניתוח קיסרי גורם לעלייה בתאי מערכת החיסון בריאה (פי 4-5), כפי שהוערך על-ידי שטיפת סימפונות (BAL)52, ניתן להסביר את סך השינויים בשומנים שנצפו במחקר זה על-ידי עלייה מצטברת בגיוס תאי מערכת החיסון בריאה של עכבר.
לסיכום, העיוות שנצפה של חומצות שומן חד בלתי רוויות ו- PUFA המשולבים בפוספוליפידים יכול לשקף את העודף של FAs מסוימים בתוך התא ו / או להוות משאב תוך תאי של מבשרי אוקסיליפין המיוצרים יתר על המידה תחת עקה חמצונית ותנאים דלקתיים. עם זאת, נתונים נוספים על EPA חופשי, DHA ואוקסיליפינים אחרים חיוניים להבהרת נקודה זו והם מחוץ לטווח היישום הנוכחי של השיטה.
Disclosures
כל הכותבים הם עובדי פיליפ מוריס אינטרנשיונל. פיליפ מוריס אינטרנשיונל היא מקור המימון והחסות היחיד לפרויקט זה.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לצוות המחקר ובמיוחד להודות על הסיוע הטכני והתמיכה של צוותי המחקר הביולוגי והאירוסולים במו"פ PMI, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., סינגפור, ו- PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, שוויץ. המחברים מודים לסם אנסארי על ניהול הביו-בנקאות ומודים על תמיכתו של סינדהורה בהרגאבי גופלה רדי על עריכת טיוטה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
References
- Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
- Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
- Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
- Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
- Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
- Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
- Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
- Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
- Talikka, M., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. Lyubimov, A., et al. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2016).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
- Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
- Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
- Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive 'shotgun' lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
- Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
- Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
- Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
- Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer's disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
- Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
- Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
- Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
- Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
- Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
- Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
- R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing. , Available from: https://www.R-project.org/ (2018).
- Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
- Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
- Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
- Nagan, N., Zoeller, R. A.
- Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
- Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry - Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
- Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
- Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
- Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
- Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
- Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
- Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
- Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
- Lipidomics Standards Initiative Consortium.
- Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
- Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
- Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
- Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
- Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
- Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
- Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).
