Summary
A lipidômica baseada em espectrometria de massa Shotgun fornece um instantâneo quantitativo sensível de um amplo espectro de classes lipídicas simultaneamente em uma única medição de vários tecidos de roedores.
Abstract
Os lipídios desempenham um papel vital como componentes essenciais de todas as células procarióticas e eucarióticas. Os constantes avanços tecnológicos na espectrometria de massas tornaram a lipidômica uma poderosa ferramenta analítica para monitorar as composições do lipidoma tecidual em estados homeostáticos e patológicos. Este trabalho apresenta um protocolo passo-a-passo para um método de análise lipídica shotgun que suporta a detecção e quantificação simultâneas de algumas centenas de espécies de lipídios moleculares em diferentes amostras de tecidos e biofluidos em alto rendimento. Este método aproveita a injeção direta automatizada de nanofluxo de um extrato lipídico total cravado com padrões internos marcados sem separação cromatográfica em um instrumento de espectrometria de massa de alta resolução. A partir de quantidades de submicrogramas de tecido de roedores, a análise de EM leva 10 min por amostra e cobre até 400 lipídios de 14 classes lipídicas em tecido pulmonar de camundongos. O método aqui apresentado é adequado para estudar mecanismos de doenças e identificar e quantificar biomarcadores que indicam toxicidade precoce ou efeitos benéficos em tecidos de roedores.
Introduction
A fumaça do cigarro (SC) é reconhecida como um dos principais fatores de risco associados ao desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas do pulmão, incluindo carcinoma pulmonar, bronquite e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)1. Além do impacto pulmonar, a exposição ao SC desempenha um papel significativo no desenvolvimento de outras doenças, como a doença arterial coronariana aterosclerótica e a doença vascularperiférica1. As doenças cardiovasculares, juntamente com a DPOC, são a primeira e a terceira causas de morte no mundo, respectivamente. As abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Modelos in vivo de ratos e camundongos de nariz ou corpo inteiro são comumente usados para estudar os efeitos a longo prazo da exposição ao SC.
Por exemplo, geralmente, 6 meses de exposição à fumaça induzem anormalidades histológicas e funcionais nos pulmões murinos que mimetizam as da doença humana, incluindo enfisema, remodelamento das vias aéreas e hipertensão pulmonar, embora as alterações sejam relativamente leves em comparação com aquelas observadas em fumantes humanos de longa duração2. Em tecidos animais e humanos, estudos têm observado uma ampla gama de alterações moleculares em resposta à exposição ao SC, incluindo respostas ao estresse oxidativo, inflamação e alterações estruturais teciduais 3,4. Não surpreendentemente, a exposição ao SC também tem sido relatada como tendo um impacto de longo alcance sobre o lipidoma pulmonar, incluindo efeitos sobre os lipídios surfactantes, mediadores de sinalização lipídica e lipídios estruturais 4,5,6.
Para caracterizar as alterações lipídicas volumosas induzidas pela exposição a longo prazo do SC de pulmões de camundongos, realizamos uma análise rápida e quantitativa por espectrometria de massa com infusão direta de espingarda. Após a introdução do método lipidômico shotgun em 20057, esse método tem sido efetivamente utilizado para ampliar nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico8,9,10 em sistemas modelo como levedura 11, Caenorhabditis elegans 12 e Drosophila melanogaster13, bem como em uma ampla gama de tipos de amostras de mamíferos como linhagens celulares 14, 15,16 vários tecidos humanos17,18 e roedores19,20 e fluidos corpóreos21,22.
Nas últimas décadas, estudos têm revelado a complexidade das respostas celulares às mudanças ambientais, envolvendo milhares de proteínas, lipídios e metabólitos interconectados. Isso deixou claro que o uso de técnicas analíticas de última geração é essencial para obter uma visão aprofundada das máquinas moleculares e para descobrir toda a magnitude dos impactos fisiológicos exógenos. Nesse contexto, as impressões digitais lipídicas quantitativas e abrangentes produzidas por abordagens lipidômicas shotgun podem efetivamente agregar ao nosso conhecimento sobre o metabolismo celular lipídico 8,9,10.
Considerando a exposição ao SC como fator de risco para diversas doenças, as abordagens de avaliação de risco toxicológico têm historicamente se baseado no uso de modelos animais, como roedores. Shotgun lipidomics MS fornece uma ferramenta analítica rápida, sensível e quantitativa para avaliar a perturbação do lipidoma em vários tipos de amostras. A característica única da lipidômica shotgun é a análise automatizada por injeção direta de um extrato lipídico total - cravado com padrões internos marcados - sem separação cromatográfica em um instrumento MS de alta resolução usando um nanochip condutor gerando um nanospray de ionização por eletrospray (ESI)23.
A informação da relação massa/carga que é adquirida simultaneamente no modo MS1 fornece a pegada lipídica total de todos os lipídios endógenos intactos. Opcionalmente, o modo MS2/MS3, no qual as moléculas lipídicas de origem são fragmentadas e analisadas, fornece informações estruturais adicionais. A análise de dados requer software especializado e inclui a deconvolução de espectros e atribuições de picos em espectros agrupados que levam à identificação de lipídios e elucidação de estruturas químicas putativas. Além disso, a quantificação absoluta pode ser realizada através de uma mistura de padrões internos rotulados contendo pelo menos um padrão lipídico por classe lipídica de interesse. De modo geral, com a presente técnica, a análise da EM com poucos minutos por amostra pode abranger a identificação e quantificação de até 800 lipídios de 14 classeslipídicas24 em tecidos de roedores.
Protocol
Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados em uma instalação credenciada pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International e licenciada pela Agri-Food and Veterinary Authority of Singapore, com aprovação de um Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e em conformidade com o National Advisory Committee for Laboratory Animal Research Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes (NACLAR, 2004).
1. Coleta de amostras
- Realizar dissecções pulmonares de camundongos após 3 meses e 6 meses de exposição de camundongos ApoE−/− . Coletar os tecidos 16-24 h após a exposição, congelá-los rapidamente em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C antes de iniciar o fluxo de trabalho lipidômico. Garantir a coleta de um total de nove amostras de cada grupo de dissecção "ômica".
2. Tecido - pulverização das amostras
- Prepare o martelo magnético e consumíveis para moagem de tecidos. Pré-resfriar bolsas de tecido, pinças, tubos de transferência de tecido tampados com tampas, espátula plástica em "V" e tubos de coleta de plástico de 2 mL sobre gelo seco. Instale o suporte de tubo correspondente em um instrumento de martelo magnético. Ligue o martelo magnético e ajuste a potência de impacto para Alta.
- Coloque a amostra em uma bolsa de tecido; Insira a amostra através da abertura superior da bolsa de tecido usando pinças pré-resfriadas, se necessário. Coloque a amostra no centro da bolsa flexível, longe das bordas.
- Sele a bolsa de tecido rosqueando um tubo de coleta pré-resfriado na parte superior da bolsa de tecido.
- Congele rapidamente a amostra imergindo a bolsa flexível em nitrogênio líquido por 10 s.
- Ventilar o tubo de coleta; Solte o tubo por um giro de 1/4 para ventilação para evitar romper a bolsa quando o martelo magnético bater.
- Coloque a bolsa de tecido congelado no martelo magnético.
- Aplique o martelo magnético pressionando o botão de ativação para pulverizar a amostra. Se pedaços de tecido não pulverizados permanecerem na bolsa, congele a amostra em nitrogênio líquido novamente e repita para um segundo impacto.
- Retire a bolsa de tecido do martelo magnético, mantendo a amostra pulverizada no fundo. Para evitar que a amostra derreta, congele-a novamente imediatamente.
- Transfira a amostra para um tubo de coleta. Inverta rapidamente o tubo para que a bolsa de tecido fique na parte superior e toque na bolsa para transferir as partículas de tecido para o fundo do tubo de coleta.
NOTA: Esta etapa deve ser feita rapidamente para evitar o derretimento do tecido. - Transfira uma alíquota tecidual de 10 mg para um tubo de 2 ml para uma análise lipidómica adicional e armazene a amostra a -80 °C até que sejam realizadas novas etapas.
3. Homogeneização tecidual
- Ligue o instrumento lisador de tecido e ajuste a frequência de agitação em 30 Hz e a duração de agitação em 2 min. Preparar a solução tampão de homogeneização do tecido: bicarbonato de amónio 150 mM em água, com um pH de ~8,2.
- Retire as amostras do congelador de armazenamento, coloque no gelo e adicione quatro esferas de aço inoxidável nos tubos contendo o pó de tecido. Adicionar 0,5 ml de tampão bicarbonato de amónio 150 mM a cada amostra.
- Coloque os tubos de amostra nos suportes do lisor de tecido. Contrabalançar ambos os suportes com o mesmo número de tubos. Fixe os suportes no braço de retenção do lisor de tecido. Interrompa o tecido.
- Coloque os tubos sobre gelo e verifique visualmente se não há sobras de agregados de tecido no tubo. Se a ruptura tecidual estiver incompleta (agregados são vistos), repita o processo de interrupção realizando outro ciclo de tratamento. Coloque as amostras no gelo.
- Criar uma alíquota 1 de 100 μL da amostra em um tubo de 1,5 mL dedicado à determinação de proteínas. Centrifugar a 18.200 × g por 5 min a 10 °C.
- Determinar o teor de proteínas da alíquota 1 através do ensaio de Bradford (ver secção 4). Armazenar as amostras no gelo.
- Criar uma alíquota 2 de 20-100 μL do homogeneizado de reserva num novo microtubo de 2 ml para extracção de lípidos (ver secção 5). Se as amostras não forem imediatamente analisadas, mantenha-as no gelo até que a extração seja realizada.
NOTA: O volume final de extracção deve ser definido com base na quantidade total de proteínas. Deve estar na faixa de 0,015-0,045 mg de proteína por alíquota total.
4. Ensaio de determinação da proteína de Bradford
NOTA: As amostras dos estudos devem ser randomizadas antes do início da análise, e a randomização é respeitada para todas as etapas do processamento da amostra.
- Alíquota centrifugada diluída 1 sobrenadante 2x com tampão bicarbonato de amónio.
NOTA: O fator de diluição depende da concentração do homogeneizado de tecido. Para soluções mais concentradas, aplicar um fator mais alto para que a concentração determinada caia na faixa dinâmica do ensaio. - Preparar uma curva padrão de albumina de soro bovino (BSA) de acordo com a Tabela 1. Vórtice os tubos padrão. Centrifugar os tubos a 18.200 × g por 15 s à temperatura ambiente.
- Dos tubos padrão previamente preparados, transfira 6 μL de cada um dos espaços em branco e padrões para uma placa de fundo plano de 96 poços de acordo com o layout da placa mostrado na Figura 1.
- Transfira as amostras previamente preparadas para a placa de fundo plano de 96 poços de acordo com a disposição da placa descrita na Figura 1.
- Adicione 250 μL do Reagente Bradford a cada poço usando uma pipeta multicanal e misture. Incubar por 5 min.
- Meça a absorbância a um comprimento de onda de 595 nm usando um leitor de placas.
- Calcular as concentrações de proteínas nas alíquotas com base na curva padrão.
NOTA: O factor de diluição utilizado no início do procedimento deve ser considerado no cálculo das concentrações de proteínas.
5. Extração de BUME
NOTA: Evite o uso de tubos plásticos de baixa ligação para extração lipidômica, uma vez que os solventes orgânicos fortes liberam plastificantes e criam um fundo forte durante a análise da amostra.
- Preparar tubos de 1,5 mL com 100 μL de solução de bicarbonato de amônio em cada tubo das amostras em branco total (TB), branco padrão interno (ISB) e controle de qualidade (QC), considerando que 1 amostra de CQ é colocada entre cada conjunto de 10 amostras. Mantenha todas as amostras no gelo.
- Adicionar 10 μL de pool de plasma humano a todas as amostras de CQ. Spike 10 μL de solução padrão interna em todas as amostras ISB, QC e estudo (ou seja, todas as amostras, exceto TB).
NOTA: Para material de controle de qualidade, use qualquer plasma K2EDTA disponível comercialmente em pool. Quantificar a concentração lipídica no plasma agrupado usando o protocolo mencionado após o recebimento e manter esses intervalos como referências para todas as análises em que o material de CQ é usado. Use o plasma NIST apenas para aplicações mais direcionadas ou para verificação de método global, onde a precisão do ensaio precisa ser abordada. - Adicionar 300 μL de mistura -20 °C butanol/metanol (3/1, v/v) a cada amostra. Agitar a 450 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente no termomisturador.
- Adicionar 300 μL da mistura heptano/acetato de etilo (3/1, v/v). Agitar a 450 × g durante 10 minutos à temperatura ambiente no misturador.
- Adicionar 300 μL da mistura de ácido acético a 1%. Agitar durante 5 min a 450 × g à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 360 μL da fase superior para um novo tubo autoblocante de 2 mL 2.
NOTA: A extração líquido-líquido pode resultar na mudança de posições do limite de fase de uma maneira dependente da amostra, o que pode resultar em uma pequena discrepância de volume para a fase superior. Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário. - Adicionar 320 μL de heptano/acetato de etila (3/1, v/v) ao tubo de fase aquosa 1. Agitar a 450 × g durante 5 min à temperatura ambiente no misturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 320 μL da fase superior e combinar com a fracção do passo 5.11.
NOTA: Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário. - Adicionar 250 μL de heptano/acetato de etilo (3/1, v/v) à fase aquosa no tubo 1. Agitar a 450 × g durante 5 min à temperatura ambiente no termomisturador. Centrifugar a 2.800 × g por 5 min à temperatura ambiente. Transferir 200 μL da fase superior e combinar com as frações do passo 5.11 e do passo 5.15 no tubo 2.
NOTA: Ajuste o volume de coleta para a fase superior, se necessário. - Evaporar até à secura a 35 °C num concentrador a vácuo.
NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -20 °C até à análise, se necessário. - Redissolver em 300 μL de solução de mistura MS (acetato de amónio 7,5 mM em solução de isopropanol/metanol/clorofórmio, solução 4:2:1). Vórtice cada tubo por 5 s para garantir que tudo seja dissolvido. Centrifugar a 18.200 × g por 5 min a 4 °C.
- Transfira uma alíquota de 50 μL para a placa de microlitro de acordo com o layout da placa na Figura 2 para análise do modo de ionização positiva (colunas 1-6) e dilua com 50 μL da solução de mistura MS.
- Transferir uma alíquota de 20 μL para a placa MTP de acordo com o layout da placa na Figura 2 para análise do modo de ionização negativa (colunas 7-12) e diluir com 80 μL de mistura MS. Embrulhe a placa com papel alumínio e mantenha a 4 °C antes da análise.
6. Análise da EM
- Calibrar um espectrômetro de massa (MS) nos modos positivo e negativo de acordo com as instruções do fabricante 5 dias ou menos antes da análise.
- Instale a nanofonte de infusão direta antecipadamente, garantindo que ela esteja devidamente alinhada contra o capilar de transferência do MS. Instale um chip de bico de 4,1 μm no suporte do chip e configure-o no software.
- Use os seguintes parâmetros para a configuração do método de modo positivo e negativo: pressão de gás de 1,25 psi; tensão de fonte de 1,1 kV; 5 μL de volume de injeção da amostra; fechamento de contato de saída Rel1 para 2,5 s; 5 min de prazo de entrega; resfriamento da placa a 4 °C.
- Configure a fila de sequência de análise para o robô de infusão direta no modo positivo.
- Configure o método MS para o modo positivo usando as seguintes configurações do MS:
- Ajuste a temperatura capilar em 250 °C e o nível de RF da lente S em 65,0. Realize a aquisição de MS de varredura completa de 0 a 1 min na faixa de 550-1000 m/z com resolução de 140.000 com controle de ganho automatizado de 1 ×106 e tempo máximo de injeção de 50 ms. Aplique a massa de bloqueio de 680,48022.
- Defina o método de aquisição MS/MS independente de dados entre o intervalo de tempo de 1 e 5 min com resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 250 m/z. Use um controle de ganho automatizado para MS2 em 1 × 105 e tempo máximo de injeção de 64 ms, uma energia de colisão de 20 NCE e uma janela de isolamento de 1 m/z. Use a lista de massa de inclusão de 550 a 1.000 m/z, com um passo de massa de 1 Da.
- Para a aquisição em modo negativo, ajuste a temperatura capilar em 250 °C e o nível de RF do S-Lens em 65,0 no arquivo de ajuste MS.
- Use as seguintes configurações do método MS: modo de aquisição de varredura completa de 0 a 1 min com resolução de 140.000 cobrindo a faixa de 400-940 m/z, controle de ganho automatizado de 1 × 106; tempo máximo de injeção de 50 ms; Use uma massa de bloqueio de 529,46262.
- Ajuste a aquisição do MS2 no modo DIA entre 1 e 5 min da corrida a uma resolução de 17.500 com uma primeira massa fixa de 150 m/z; controle de ganho automatizado de 1 × 105; 64 ms de tempo máximo de injeção; e 35NCE de energia de colisão. Use a lista de massa de inclusão de 400 a 940 com um passo de massa de 1 Da.
- Crie a fila de sequência de análise no software MS no modo positivo . Aguarde que a aquisição da amostra seja acionada por um sinal de fechamento de contato proveniente do robô de infusão direta para cada amostra.
- Quando a análise do modo positivo estiver concluída, crie a fila de sequência para o robô de infusão direta no modo negativo .
- Configure a fila de sequência de análise no software MS no modo negativo .
7. Processamento de dados
- Para converter os arquivos de dados dos modos positivo e negativo do formato .raw para o formato .mzML, use o software conversor.
NOTA: Os arquivos de dados dos modos positivo e negativo devem ser convertidos separadamente (devido às suas diferentes configurações de aquisição e diferentes limites de ruído).- Preencha as seguintes configurações para executar a conversão de arquivos: o fator de limite de ruído é 3 e 5 para MS e MS2, respectivamente; ativar a função de remoção de ruído para MS e MS2, compactação de dados, varreduras médias MS2 e coleta de pico. Definir limiares de TIC para modos positivo e negativo (por exemplo, 10.000 e 5.000; a serem definidos com base no nível de ruído da amostra específica produzida por um instrumento específico). Gere relatórios XLC e PDF ao final do processamento.
- Realizar a identificação lipídica. Defina os seguintes parâmetros (exemplo) de configurações de importação de arquivos : janela de seleção ±0,5 Da (depende da janela de seleção no método MS); intervalo de tempo 2-300 s (depende do tempo de varredura no método MS); ausência de massas de calibração para MS e MS2; transferir e arredondar a faixa de massa dos arquivos de metadados do software Peak by Peak (massa mínima [MS]) e ( massa mínima [MS2]); tolerância de 3 ppm e 10 ppm para SM e MS2, respectivamente; manter vazio o campo de limite MS e MS2 , filtro de frequência, deslocamento MS1 e PMO; Correção isotópica para SM e MS2 selecionadas; gradiente de resolução de transferência do arquivo de metadados do conversor como (Ajuste linear de resolução [MS]) e como (Ajuste linear de resolução [MS2]).
NOTA: A identificação lipídica nos modos positivo e negativo deve ser realizada separadamente devido às suas diferentes configurações de aquisição. - Depois que os dados forem importados, vá para o menu Executar e carregue os arquivos MFQL para identificação lipídica.
NOTA: Para informações detalhadas sobre a estrutura dos QVFM, consultar a publicação de Herzog et al.25. Veja alguns exemplos de arquivos MFQL no https://wiki.mpi-cbg.de/lipidx/MFQL_library e veja a discussão. Todas as MFQLs usadas para o processamento de dados são fornecidas nos Materiais Suplementares. - Quantificar as espécies identificadas no nível de MS dividindo a intensidade de massa precursora da característica lipídica pela respectiva intensidade do padrão interno marcado e, em seguida, multiplicando o quociente pela concentração do padrão interno marcado. Normalizar a concentração lipídica final por quantidade de proteína total medida pelo ensaio de Bradford.
8. Procedimento de verificação do CQ
NOTA: Um procedimento de verificação de qualidade é uma etapa essencial para verificar a reprodutibilidade técnica do método. Para este fim, um pool de plasma comercial é analisado para determinar os níveis endógenos de diferentes lipídios ao longo de 5 dias em 15 alíquotas idênticas por lote (total de cinco lotes). Note que, neste caso, um pipeline de avaliação de dados foi criado como uma aplicação web Shiny usando o ambiente de software estatístico R.
- Defina o intervalo de aceitação de referência como o valor médio calculado para todos os cinco lotes ±3 desvios padrão.
- Aplicar as regras de aceitação "pass" para cada lote analítico: 90% dos alvos de referência devem passar, considerando que um composto de referência representa uma classe lipídica. Por exemplo, se 15 destinos de referência forem incluídos na verificação de CQ, certifique-se de que 13 destinos passem para que o lote seja aceito.
NOTA: Em outras palavras, 68% das amostras de CQ por composto de referência devem passar para que os dados dessa classe lipídica sejam aceitos. - Se o lote do estudo não cumprir os critérios de aceitação para a verificação do CQ, repita o procedimento.
9. Estimativa da quantidade (relativa) de ácidos graxos conjugados
- Para cada classe lipídica, estimar as quantidades de ácidos graxos conjugados com base em suas intensidades MS2.
NOTA: Devido a diferenças de fragmentação e ionização, os valores derivados foram destinados apenas para comparações de abundância relativa entre grupos de amostra, em vez de, por exemplo, estimar a contribuição relativa de um ácido graxo específico para o pool geral de ácidos graxos conjugados de uma classe lipídica. - Normalizar as intensidades MS2 dos fragmentos de ácidos graxos pela intensidade média dos fragmentos de ácidos graxos do padrão interno correspondente. Com base na concentração do padrão interno e no peso tecidual medido, deriva-se uma "concentração normalizada" para os ácidos graxos conjugados. Somar esses valores por classe lipídica para estimar a quantidade total de cada ácido graxo conjugado por amostra.
10. Análise estatística
- Realizar análise estatística. Ajuste um modelo linear para cada condição e o grupo de controle correspondente e calcule valores de p a partir de uma estatística t para dados transformados em log2. Use o método de taxa de descoberta falsa de Benjamini-Hochberg para corrigir vários efeitos de teste.
OBS: Lipídios com valores de p ajustados < 0,05 são considerados diferencialmente abundantes. Aqui, a análise estatística foi realizada no ambiente estatísticoR26.
Representative Results
Aqui, como resultados representativos, apresentamos dados que ilustram como a lipidômica shotgun pode ser usada para estudar os efeitos da SC nos pulmões de camundongos. O protocolo de análise lipídica shotgun foi aplicado com sucesso em um estudo in vivo para análise comparativa de dois grupos de amostras: tecidos pulmonares dissecados de nove camundongos fêmeas de Apoe−/− expostos ao SC (grupo 3R4F; controle positivo) e igual número de camundongos mantidos sob condições de ar fresco (grupo sham) como controle negativo coletado aos 3 meses, 4 meses e 6 meses de tempo de exposição. Os animais foram mantidos sob ar fresco filtrado e condicionado a 22 °C ± temperatura de 2 °C e umidade de 55% ± 15% e alimentados com dieta pellet irradiada por gama. O regime de luz foi mantido em 12 h por dia. Até oito camundongos foram alojados por cada gaiola. Os cigarros de referência 3R4F para o tratamento de exposição foram adquiridos da Universidade de Kentucky para gerar o aerossol 3R4F CS (600 μg de material particulado total TPM/L aerossol) para uma concentração-alvo de exposição equivalente a 28 μg de nicotina/L.CS fumaça de cigarros 3R4F foi produzida usando máquinas rotativas de 30 portas, de acordo com Phillips et al.27 . Com base no Health Canada Intensive Smoking Protocol, 55 mL de volume de sopro, um sopro por 30 s e 100% de bloqueio dos orifícios de ventilação foram aplicados aos cigarros 3R4F para proporcionar exposição suficiente. Todos os detalhes adicionais sobre o desenho do estudo foram relatados anteriormente27,28.
No total, ~400 espécies de lipídios moleculares das 14 classes lipídicas mais abundantes foram identificadas e quantificadas (Figura 3). A concentração total normalizada de lipídios por classe foi ligeiramente elevada para as classes lipídicas PE, PEO, PC, PCO, PI e PG, e alguma downregulation foi observada para os lipídios SM, LPE e PA (Figura 3A), enquanto nenhuma diferença pôde ser observada para TAGs e PS. Curiosamente, níveis elevados de lipídios plasmologênicos de PCO e PEO no grupo CS foram relatados em células inflamatórias29 . Uma das funções intracelulares dos lipídios plasmalogênicos é a atividade antioxidante. Sob exposição a espécies reativas de oxigênio (ROS) e nitrogênio (RNS), oxidação seletiva de plasmalogênios em comparação com diacilfosfolipídios foi relatada30. A ligação éter-enila na estrutura química dos plasmalogênios é sensível ao ataque de radicais ao estresse oxidativo31. Os principais produtos de ataque radical são os ácidos eicosatetraenóicos hidroxilados, fosfolipídios 2-monoacilglicerol, pentadecanol, ácidos fórmicos, α-hidroxialdeídos de vários comprimentos de cadeia, 1-formil-2-aracdonilglicerofosfolipídeo e lisofosfolipídios.
Esses resultados mostram que, dentre as características moleculares baseadas na fórmula molecular total, 100-120 compostos foram significativamente impactados pela exposição ao SC (Figura 3D). A deconvolução detalhada das informações de fragmentação do MS2 e a normalização das intensidades de sinal dos fragmentos permitiram a definição aproximada da quantidade total de cada ácido graxo conjugado (AG) representado em cada classe lipídica (Figura 3E) e a comparação desses dados entre os grupos exposto e controle. Observou-se uma clara diminuição tanto nos AGs totalmente saturados quanto naqueles com apenas algumas insaturações, principalmente no contexto de lisolipídios. Em contraste, os ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) na composição das classes de fosfolipídios PC, PE e PG estavam elevados no grupo CS para todos os momentos. Os casos extremos de PC e PG conjugados com ácido eicosapentanóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA) foram detectados exclusivamente no grupo de exposição 3R4F CS (Figura 3E, cor vermelha).
Figura 1: Disposição da placa para distribuição da amostra no ensaio de Bradford. As amostras em branco e padrão são colocadas em triplicata nas colunas 1-3; amostras desconhecidas são colocadas em duplicado nas colunas 4-11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Disposição da placa de microtitulação de 96 poços para análise por espectrometria de massa de espingarda. A distribuição das amostras em branco, padrão, desconhecida e CQ para aquisição no modo de ionização positiva é mapeada no lado esquerdo da placa (colunas 1-6); Todas as amostras para o modo de ionização negativa são colocadas à direita (colunas 7-12). Abreviações: pos = positivo; CQ = controle de qualidade; neg = negativo; TB = total em branco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise lipidômica de pulmões de camundongos expostos à fumaça de cigarro. Camundongos Apoe−/− foram expostos ao SC do cigarro de referência 3R4F ou ao ar fresco (sham). (A) Concentrações de classes lipídicas e número de espécies lipídicas por classe. Para cada classe, o número de espécies lipídicas quantificadas é dado entre parênteses. Intervalos de confiança médios e de 95% para cada classe lipídica, separadamente para cada tipo de exposição (agregados em três momentos). (B) Gráficos vulcânicos mostrando o tamanho do efeito (mudança log2 dobra) e a significância (valor p ajustado por FDR -log10) das espécies lipídicas quantificadas para a comparação 3R4F CS versus sham nos três momentos. Lipídios significativamente elevados são marcados em amarelo; lipídios significativamente diminuídos são marcados no ciano (valor de p ajustado por FDR < 0,05). (C) Abundância diferencial das 25 espécies lipídicas com as maiores alterações de dobras médias absolutas. As alterações de dobras log2 para a comparação 3R4F CS versus sham são codificadas por cores, e a significância estatística é indicada: *: valor de p ajustado por FDR < 0,01; X: Valor de p ajustado por FDR < 0,05. (D) Gráficos de comparação. Os coeficientes de correlação para as comparações de mudança de dobra são codificados por cores, e o número de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados é indicado (números totais nas margens). Os gráficos de pizza mostram a porcentagem de lipídios diferencialmente abundantes compartilhados com a mesma direção de mudança (sinal de CF). Asterisk indica uma sobreposição significativa dos lipídios diferencialmente abundantes. (E) Abundância diferencial de AGs conjugados por classe lipídica. Mapa de calor como no painel C para ácidos graxos conjugados com diferenças significativas de abundância entre 3R4F e exposição simulada em todos os três momentos (valor de p ajustado por FDR < 0,05). A quantidade de cada ácido graxo por classe lipídica foi estimada com base nas intensidades de SM2 dos fragmentos de ácidos graxos. Abreviações: CS = fumaça de cigarro; FDR = taxa de descoberta falsa; CF = mudança de dobra; AF = ácidos graxos; PC = fosfatidilcolina; PS = fosfatidilserina; TAG = triacilglicerol; SM = esfingomielina; PEO = fosfatidiletanolamina plasmalogênica; PE = fosfatidiletanolamina; PG = fosfatidil glicerol; IP = fosfatidilinositol; DAG = diacilglicerol; SE = esterol/ésteres de colesterol; PCO = fosfatidilcolina plasmalogen; LPC = fosfatidilcolina liso; LPE = liso fosfatidiletanolamina; PA = ácido fosfatídico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Concentração final de SCQ (mg/mL) | Solução de BSA a 2 mg/mL (μL) | Tampão bicarbonato de amônio (μL) |
| 1 | 50 | 50 |
| 0.75 | 37.5 | 62.5 |
| 0.5 | 25 | 75 |
| 0.25 | 12.5 | 87.5 |
| 0.125 | 12.5 | 187.5 |
| 0.0625 | 50 de 0,125 mg/ml solução | 50 |
| 0 | 0 | 100 |
Tabela 1: Esquema de diluição do padrão interno BSA para a curva de calibração do ensaio de Bradford. Abreviação: BSA = albumina de soro bovino.
Informações suplementares: arquivos MFQL usados para identificação lipídica LipidXplorer. O pacote .zip consiste nos arquivos MFQL individuais necessários, cada um nomeado seguindo este padrão:
Discussion
Embora os avanços na SM tenham gerado uma variedade de métodos para monitorar com precisão muitas espécies lipídicas, o perfil lipídico prévio de vários tecidos de mamíferos não mostrou resultados consistentes e, consequentemente, as funções específicas dos lipídios permanecem obscuras. Em comparação com a análise funcional de proteínas, para a qual estão disponíveis abordagens mais robustas para nocautear a expressão de determinados compostos, a maioria dos lipídios não pode ser seletivamente desligada ou superexpressa nos tecidos, dificultando a avaliação funcional dos lipídios. O perfil avançado das concentrações de lipidoma tecidual pode fornecer uma abordagem alternativa para identificar associações entre lipídios circulantes e doenças humanas.
Na avaliação de métodos lipidômicos abrangentes capazes de cobrir qualitativa e quantitativamente o perfil lipídico endógeno de qualquer tecido de camundongo, demos preferência ao método lipidômico shotgun. Em geral, dois tipos opostos de análise de amostra são possíveis: ou uma triagem completamente não direcionada de lipídios usando separação baseada em cromatografia líquida (LC) com detecção espectrométrica de massa adicional para revelar a complexidade lipídica total da amostra, ou abordagens direcionadas, que permitem principalmente a quantificação muito precisa de lipídios específicos de interesse. Em contraste, a forte característica do fluxo de trabalho lipidômico apresentado é a rápida cobertura abrangente de centenas de lipídios endógenos de classes lipídicas predefinidas, que ainda podem ser realizadas de forma semiquantitativa robusta.
As eficiências de ionização de diferentes classes lipídicas são estrutura-dependentes e podem variar drasticamente dependendo das diferentes condições experimentais de ionização. Em contraste com os métodos de separação baseados em LC, a análise shotgun minimiza essas diferenças devido à infusão simultânea direta do extrato lipídico inteiro sob as mesmas condições de ionização no instrumento MS. O uso de análogos lipídicos isotopicamente marcados ou padrões não endógenos estruturalmente semelhantes permite a semi-quantificação de todas as classes lipídicas. A lipidômica shotgun fornece baixa variabilidade inter e intra-corrida durante a análise da SM; Como resultado, esse método produz coeficientes de variação21 mais baixos do que os métodos baseados em cromatografia líquida não direcionada, que requerem múltiplos padrões para quantificação adequada. É importante ressaltar que, embora nenhuma curva de calibração externa seja utilizada no método atual, o método ainda é considerado totalmente quantitativo32.
Um nível de padrão interno marcado (ou padrão não rotulado que não é expresso endogenamente) por classe lipídica é suficiente para a quantificação da maioria dos lipídios. Poucas publicações relataram a validação parcial do método lipidômico shotgun. Por exemplo, em Gryzbek et al.17 e Surma et al.21, curvas de calibração inversas foram preparadas usando padrões internos e uma quantidade fixa de matriz amostral. A linearidade foi avaliada pela regressão linear dos teores de lipídios log-transformados e suas intensidades e relatada como R2 e inclinação, respectivamente. O limite de detecção (LOD) e o limite de quantificação (LOQ) foram determinados por regressão linear ponderada baseada em uma relação sinal-ruído de 3 para LOD e 10 para LOQ. Para a maioria das classes lipídicas, o LOQ foi definido entre 2-9,8 pmol para o tecido adiposo e 0,05-5μM no plasma. Em ambos os casos, padrões internos únicos não endógenos por classe foram usados para derivar estimativas para todos os lipídios da classe. No entanto, neste trabalho, não fornecemos LOD/LOQ devido a várias preocupações: a matriz endógena não é livre de compostos e a matriz substituta para tecidos não está disponível - com isso, a espícula de pequenas quantidades conhecidas de padrões não é possível. Nós não realizamos uma abordagem clássica de quantificação direcionada com o uso de uma série de curvas de calibração de um determinado composto normalizado por seu padrão isotopicamente marcado idêntico devido à inexistência de padrões puros e à disponibilidade muito limitada de lipídios marcados isotopicamente. Os detectores Orbitrap realizam automaticamente a conversão do sinal transiente aplicando uma transformação de Fourier, e algum sinal já é substituído - como resultado, a faixa de concentração mais baixa será apenas linear até algum sinal mínimo, abaixo do qual a molécula não será mais detectável. Os valores sinal-ruído do software Xcalibur dependem da relação m/z da molécula; Como resultado, os compostos de cada classe lipídica, contendo diferentes combinações de ácidos graxos, terão diferentes valores de ruído. Além disso, os valores de LOQ/LOQ estão estritamente ligados ao tipo de matriz, e quando a quantificação do lipidoma é feita em diferentes tecidos de roedores, isso deve ser refletido pela avaliação de LOQs para cada tipo de tecido individualmente.
De fato, o método oferece uma alta faixa de quantificação dinâmica linear de até quatro ordens de magnitude33 e sensibilidade muito boa para cobrir os lipídios estruturais endógenos mais importantes, que podem ser aumentadas por melhorias técnicas na aquisição de MS32. Os coeficientes de variação das concentrações médias de lipídios foram, em sua maioria, inferiores a 15%, o que significa que a lipidômica shotgun atende aos requisitos da Food and Drug Administration (FDA) como método a ser considerado para estudos de boas práticas de laboratório (BPL) e boas práticas clínicas (BPL)34.
No entanto, deve-se notar que, devido à sua polaridade diferente, algumas classes lipídicas tornam-se muito mais impactadas pela contribuição de AGs conjugados específicos. Isso leva à distorção na resposta de intensidade em misturas equimolares contendo uma ampla gama de AGs conjugados, resultando em viés de quantificação, como destacado por Koivusalo et al.35 para classes de fosfolipídios. Vale ressaltar que esses autores apresentaram dados para uma ampla gama de AGs, de 24 a 48 cadeias de comprimento, o que provavelmente não reflete a situação em uma amostra biológica real. A resposta para as espécies poli-insaturadas foi 40% maior do que para as espécies totalmente saturadas, mas esse efeito só foi observado para concentrações mais elevadas. Quando a mistura foi progressivamente diluída, o efeito da insaturação diminuiu gradualmente e praticamente desapareceu a 0,1 pmol/μL por espécie. Além disso, todas as medidas foram realizadas em instrumentos armadilha de íons e triplos quadrupolos e não em equipamentos Q-Exactive.
Outra vantagem do fluxo de trabalho apresentado é a sua flexibilidade técnica, que permite a adaptação aos requisitos específicos do projeto. Por exemplo, qualquer protocolo de extração lipídica - como os métodos Bligh e Dyer 36 modificados, éter metil terc-butílico37 ou butanol-metanol38 - pode ser usado para preparar um extrato lipídico total antes da análise de EM. A principal limitação da extração clorofórmio-metanol é que a fase inferior contém a fração lipídica, o que dificulta o trabalho rotineiro e, principalmente, a automação; Além disso, a toxicidade do clorofórmio deve ser considerada. A extração com éter terc-butílico é amplamente utilizada para análise lipídica de amostras de plasma37, e uma versão automatizada tem sido proposta21. Neste caso, optou-se pelo método BUME por proporcionar recuperações ainda melhores para as classes lipídicas PG, PI, PA e PS fortificadas38, menor consumo de solvente e possibilidade de automação39, enquanto as concentrações totais quantificadas para amostras de tecido extraídas pelos três métodos foram comparáveis. Além disso, embora a extração da amostra tenha sido realizada manualmente no presente trabalho, também é possível obter resultados reprodutíveis e precisos a partir de grandes conjuntos de amostras por meio do preparo automatizado de amostras e extração lipídica em um formato de 96 poços40,41. Isso permite implementar a análise lipidômica em estudos clínicos e toxicológicos em larga escala.
No presente trabalho, realizamos a aquisição dos modos positivo e negativo do MS separadamente, sem troca de polaridade, como descrito por Schuhmann et al.42. A estabilidade do sinal do nanomate é melhor no modo negativo para uma solução ligeiramente menos concentrada do que no modo positivo. Além disso, desenvolvemos um procedimento totalmente rastreável com software conversor de arquivos .raw para mzML, que fornece os valores a serem especificados no software LipidXplorer - com isso, cálculos de inclinação de resolução manual não são necessários. Também aplicamos diferentes substituições de ajuste de ruído porque, no modo positivo, os níveis de ruído dos espectros são maiores do que no modo negativo. Todas as etapas foram otimizadas para análises de rotina rastreáveis e de alto rendimento.
Para identificação, a análise lipidômica shotgun pode explorar o comportamento único de diferentes classes lipídicas, que formam adutos únicos em diferentes modos de polaridade. Neste método, espécies de PC e PE com a mesma massa molecular que se sobrepõem no modo de ionização positiva podem ser completamente separadas no modo de ionização negativa, pois PC forma adutos de acetato ou formato, e PE é ionizado em uma forma desprotonada. Além disso, a deconvolução estrutural (parcial) é possível para o método utilizando não apenas a fórmula molecular, mas também a estrutura de ácidos graxos em massa. Por exemplo, a identificação de AG no nível de carbono total e contagem de insaturação total funciona para todos os fosfolipídios, DAGs, TAGs e lisofosfolipídios. A quantificação bottom-up de cada forma isomérica pode ser parcialmente realizada para algumas das classes de fosfolipídios43 , mas é muito mais complexa para DAGs e TAGs devido à resposta desigual ao sinal de diferentes AGs nos espectros MS2.
Também é importante enfatizar a necessidade de implementar procedimentos adequados de controle de qualidade, totalmente alinhados com as recentes iniciativas nesse campo44. Como desejamos garantir a rastreabilidade e a reprodutibilidade adequada dos dados entre e dentro do laboratório, uma série de etapas foram tomadas, como a randomização adequada das amostras para todas as etapas da análise, o trabalho com misturas padrão certificadas pelo fornecedor, a inclusão de amostras de controle de qualidade, procedimentos para verificar a aceitação ou rejeição do lote e a criação de um banco de dados interno para acompanhar o desempenho do CQ a longo prazo. Também consistente com essas iniciativas é a necessidade de um método padronizado para abordar a estabilidade da amostra. Em geral, a maioria dos lipídios estruturais não é impactada pela oxidação lipídica, que é mais relevante para oxilipinas, lipídios oxidados e ácidos graxos poli-insaturados, que são, portanto, muito mais sensíveis às condições de armazenamento e manuseio. No entanto, a correta avaliação da estabilidade da amostra ainda é uma tarefa tecnicamente desafiadora.
No entanto, este protocolo tem uma limitação quando se trata de determinar níveis submoleculares de compostos. Considerando que não há separação do extrato total, todas as isoformas de lipídios com a mesma massa molecular, mas diferentes composições de ácidos graxos são fundidas na análise de EM. Para a maioria das classes, é possível obter deconvolução parcial da estrutura usando as razões de fragmentação de fragmentos residuais de ácidos graxos em MS2. No entanto, a quantificação independente de cada isoforma continua sendo uma tarefa particularmente desafiadora devido às grandes diferenças nos comportamentos de fragmentação de diferentes isoformas e ao fato de que padrões químicos puros não estão disponíveis em grande variedade o suficiente para definir os valores de compensação. Outra limitação é que o processo de ESI inevitavelmente gera artefatos, resultando na geração artificial de picos para alguns lipídios, como DAGs, Pas e AGs, o que pode levar a quantificações errôneas.
A seguir, resumimos as partes mais críticas do protocolo com base em nossa experiência. A primeira está relacionada ao fato de que cada tipo de tecido de camundongo tem um perfil lipídico único em termos de quantidade lipídica e razões de classe. Com isso, as quantidades iniciais do tecido com base no conteúdo de proteína total antes da extração devem ser cuidadosamente determinadas para não saturar o sinal de MS e não sair da faixa de quantificação dinâmica devido à agregação lipídica em altas concentrações33 ou - no extremo oposto - fornecer sinal MS suficiente para cobrir os principais compostos lipídicos para cada classe lipídica.
O segundo aspecto crítico é garantir um alinhamento adequado da posição da saída do chip de nanofonte de infusão direta com o capilar de transferência do espectrômetro de massa. Considerando que a calibração completa do espectrômetro de massa em ambos os modos é realizada semanalmente, a troca entre a fonte de calibração e a configuração do chip da nanofonte pode ser a razão para uma variabilidade dramática na intensidade do sinal devido ao desalinhamento durante a instalação.
Outra parte crítica do protocolo é o manuseio cuidadoso da mistura de padrões internos. Como essa mistura contém uma quantidade significativa de diclorometano, uma vez aberta, ela deve ser consumida rapidamente para evitar armazenamento prolongado e usos múltiplos que levam à evaporação e mudança de concentração artificial. Além disso, é importante o manuseio consistente da mistura padrão após a remoção do armazenamento de -20 °C, uma vez que as diferenças de temperatura podem levar a inconsistências de volume durante a pipetagem com pipetas de almofada de ar. Uma opção seria substituir o diclorometano no tampão de ressuspensão padrão por metanol puro, o que poderia melhorar a conveniência de manuseio, mas poderia afetar negativamente a solubilidade de algumas classes lipídicas e, assim, diminuir a precisão de quantificação para essas classes lipídicas.
A parte crítica final é o processamento de dados. O fluxo de trabalho de processamento de dados está combinando a conversão de software Peak by Peak do formato .raw para .mzML, aplicando a média de varredura MS2 e a filtragem de ruído MS1 e MS2, bem como a coleta de pico e a compactação de dados. Como alternativa, o software Proteowizard também pode ser usado para conversão de dados, mas, neste caso, várias configurações no LipidXplorer devem ser definidas manualmente. Toda a complexidade da lipidômica shotgun está particularmente concentrada na etapa de deconvolução dos espectros MS1 e MS2 de injeção direta. O software de código aberto LipidXplorer importa os espectros convertidos do formato de arquivo mzML com base na precisão de massa, resolução de massa e a inclinação de sua mudança com o aumento de m/z. O software mescla vários espectros individuais de MS e MS/MS adquiridos dentro de uma execução de análise. Depois, ele alinha picos individuais dentro de diferentes tiragens de amostragem, e, em cada aglomerado de picos alinhados, substitui suas massas por sua massa média ponderada por intensidade única, enquanto suas abundâncias em cada arquivo de dados permanecem intocadas. Massas representativas de clusters de pico alinhados e intensidades de pico individuais são armazenadas em um banco de dados mestre de varredura. O banco de dados mestre de varredura contém todos os espectros MS1 e MS2 gerados para todas as amostras no lote e pode ser descomplicado para identificações lipídicas por consultas escritas na linguagem de consulta de fragmentação molecular (MFQL).
Em geral, o método abrange a identificação de lipídios DAG, TAG e SE com base no modo positivo e lipídios PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC e LPE com base na aquisição do modo negativo. Durante a identificação lipídica, a correção isotópica é realizada para MS1 e MS2, e intensidades ajustadas são relatadas no arquivo de saída .xlsx. Alternativamente, vários outros softwares estão disponíveis para processar dados de espingarda, como ALEX45 e LipidHunter46.
Os ácidos graxos - principais componentes nucleares e da membrana celular - são armazenados na forma de fosfolipídios para posterior conversão em moléculas bioativas. Eles podem ser convertidos pelas enzimas lisofosfolipídeas aciltransferases em lisofosfolipídios pela via de Lands47. A enzima LPCAT3, por exemplo, é conhecida por apresentar alta especificidade para incorporar AA em intermediários de lisofosfatidilcolina e lisofosfatidilserina. A expressão relativamente alta dessas enzimas foi relatada dentro de células inflamatórias, como macrófagos alveolares e células epiteliais brônquicas47, levando à liberação de maiores proporções relativas de fosfolipídios contendo AA nessas células. Entretanto, após sua liberação dos fosfolipídios de membrana pela fosfolipase A2, a conversão dos AGPI em vários tipos de mediadores lipídicos é catalisada por muitas enzimas48. Além disso, esses AGPI podem se tornar substrato para a produção de prostaglandinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias via ação das enzimas ciclooxigenase (COX)-1 e COX-247. Os fosfolipídios são uma das fontes de mediadores lipídicos liberados em locais particulares onde esses mediadores são necessários para demonstrar seus efeitos biológicos.
O pulmão é um órgão complexo que compreende vários tipos de células, cada uma desempenhando papéis sobrepostos e de nicho na facilitação do desenvolvimento e função pulmonar normal. Poucos estudos foram feitos para isolar e traçar o perfil de diferentes tipos celulares no pulmão de camundongos ou humanos (por exemplo, células alveolares tipo 2)49,50; outros tipos celulares pulmonares importantes não foram caracterizados. Outro estudointeressante51 foi realizado para isolar e realizar análise lipídica de células endoteliais, epiteliais, mesenquimais e mistas do pulmão de camundongos. Observou-se que a concentração de AGPI incorporados na PCO e PG foi enriquecida nas células imunes. Considerando o fato de que o SC induz um aumento de células imunes dentro do pulmão (4-5 vezes), avaliado pelo lavado broncoalveolar (LBA)52, as alterações lipídicas totais observadas neste estudo poderiam ser explicadas por um aumento cumulativo no recrutamento de células imunes no pulmão de camundongos.
Em conclusão, a distorção observada de ácidos graxos monoinsaturados e AGPI incorporados em fosfolipídios pode refletir o excesso de certos AGs dentro da célula e/ou constituir um recurso intracelular de precursores de oxilipina que são superproduzidos sob estresse oxidativo e condições inflamatórias. No entanto, dados adicionais sobre EPA livre, DHA e outras oxilipinas são essenciais para esclarecer esse ponto e estão fora do escopo da aplicação do método atual.
Disclosures
Todos os autores são funcionários da Philip Morris International. A Philip Morris International é a única fonte de financiamento e patrocinadora deste projeto.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer à equipe do estudo e, especialmente, agradecer a assistência técnica e o apoio das equipes de biopesquisa e aerossol do PMI R&D, Philip Morris International Research Laboratories Pte. Ltd., Singapura, e PMI R&D, Philip Morris Products S.A., Neuchâtel, Suíça. Os autores agradecem a Sam Ansari pela gestão do biobanco e agradecem o apoio do Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy pela edição de um rascunho do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
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