Summary
ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) היא טכניקה חזקה לפתיחה מכנית וחישה בזמן אמת של מערך אנסמבל של מבנים ביומולקולריים בתחומים ביופיזיים וביו-סנסורים.
Abstract
טכניקות של מולקולה בודדת המבוססות על עקרונות פלואורסצנטיים ומכנוכימיים מספקות רגישות מעולה בחישה ביולוגית. עם זאת, בשל היעדר יכולות תפוקה גבוהות, היישום של טכניקות אלה מוגבל בביופיזיקה. ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS) הדגימה תפוקה גבוהה בחקר קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים על ידי המרת מחקרים מכניכימיים של מולקולות בודדות לאלה של הרכבים מולקולריים. בפרוטוקול זה, המבנים המשניים של הדנ"א (i-motifs) נפרשו בזרימת הגזירה בין הרוטור לסטטור של קצה הומוגנייזר בקצבי גזירה של עד 77796/s. הודגמו ההשפעות של קצבי הזרימה והגדלים המולקולריים על כוחות הגזירה שחווה ה-i-motif. טכניקת EFS חשפה גם את הזיקה המחייבת בין מוטיבים של דנ"א לליגנדים. יתר על כן, הדגמנו תגובת כימיה של קליקים שיכולה להיות מופעלת על ידי כוח גזירה (כלומר, כימיה של מכניקה-קליק). תוצאות אלה מבססות את היעילות של שימוש בכוח גזירה כדי לשלוט על הקונפורמציה של מבנים מולקולריים.
Introduction
בספקטרוסקופיית כוח של מולקולה בודדת1 (SMFS), התכונות המכניות של מבנים מולקולריים בודדים נחקרו על ידי מכשירים מתוחכמים כגון מיקרוסקופ הכוח האטומי, פינצטה אופטית ופינצטה מגנטית 2,3,4. מוגבל על ידי אותה דרישת כיווניות של המולקולות במערך יצירת הכוח / גילוי או שדה הראייה הקטן בפינצטה מגנטית ובמיקרוסקופ כוח צנטריפוגה זעיר (MCF)5,6,7,8, רק מספר מוגבל של מולקולות ניתן לחקור בו זמנית באמצעות SMFS. התפוקה הנמוכה של SMFS מונעת את היישום הרחב שלה בתחום הזיהוי המולקולרי, הדורש מעורבות של קבוצה גדולה של מולקולות.
זרימת גזירה מספקת פתרון פוטנציאלי להפעלת כוחות על קבוצה מסיבית של מולקולות9. בזרימה נוזלית בתוך ערוץ, ככל שפני התעלה קרובים יותר לפני הערוץ, כך קצב הזרימהאיטי יותר 10. שיפוע מהירות זרימה כזה גורם ללחץ גזירה המקביל למשטח הגבול. כאשר מולקולה ממוקמת בזרימת גזירה זו, המולקולה מכוונת את עצמה מחדש כך שהציר הארוך שלה מתיישר עם כיוון הזרימה, כאשר כוח הגזירה מופעל על ציר11 הארוך. כתוצאה משינוי כיוון זה, כל המולקולות מאותו סוג (גודל ואורך הידיות) צפויות להתיישר באותו כיוון תוך שהן חוות את אותו כוח גזירה.
עבודה זו מתארת פרוטוקול לשימוש בזרימת גזירה כזו כדי להפעיל כוח גזירה על קבוצה מסיבית של מבנים מולקולריים, כפי שמודגם על ידי מוטיב ה- i של הדנ"א. בפרוטוקול זה נוצרת זרימת גזירה בין הרוטור לסטטור בקצה הומוגנייזר. המחקר הנוכחי מצא כי מבנה הדנ"א המקופל i-motif יכול להיפתח על ידי קצבי גזירה של 9724-97245 s−1. חוץ מזה, נמצא קבוע דיסוציאציה של 36 μM בין ליגנד L2H2-4OTD לבין מוטיב i. ערך זה עולה בקנה אחד עם זה של 31 μM שנמדד על ידי מבחן הסטת הג'ל12. יתר על כן, הטכניקה הנוכחית משמשת כדי לפתוח את מוטיב i, אשר יכול לחשוף את נחושת chelated (I) כדי לזרז תגובת קליק. פרוטוקול זה מאפשר אפוא לפתוח קבוצה גדולה של מבני i-motif עם מכשירים בעלות נמוכה בזמן סביר (קצר מ -30 דקות). בהתחשב בכך שטכניקת כוח הגזירה מגדילה באופן דרסטי את התפוקה של ספקטרוסקופיית הכוח, אנו מכנים טכניקה זו ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל (EFS). פרוטוקול זה נועד לספק הנחיות ניסיוניות כדי להקל על היישום של EFS מבוסס כוח גזירה זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל המאגרים והריאגנטים הכימיים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בחומרי הטבלה.
1. הכנת מיקרוסקופ כוח הגזירה
הערה: מיקרוסקופ כוח הגזירה מכיל שני חלקים, יחידת תגובה (הומוגנייזר) ויחידת גילוי (מיקרוסקופ פלואורסצנטי). ההגדלה של העינית היא 10x, וההגדלה של העדשה האובייקטיבית (אוויר) היא 4x.
- להרכיב את homogenizer ואת המיקרוסקופ על שולחן הרכבה. הרכיבו משקפי מגן והפעילו את המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את ההומוגנייזר כדי לוודא שקרן אור העירור באורך גל מתאים (כאן נעשה שימוש ב-488 ננומטר) עוברת דרך מרכז הקצה המתפזר של ההומוגנייזר.
- הכינו תא תגובה בעל תחתית שטוחה שגובהו 5 ס"מ ו-1.5 ס"מ 2X1.5 ס"מבחתך רוחב. כדי להקטין את הרקע, ודא שהחומר התא שנבחר אינו פלואורסצנטי, כגון משקפיים (לחלק מהפלסטיקים יש פלואורסצנציה).
- בחרו קצה פיזור הומוגנייזר מתאים שיכול לספק את כוח הגזירה הרצוי.
הערה: קצב הגזירה תלוי במרחק בין הרוטור לסטטור במהירות סיבוב קבועה11 על פי המשוואה הבאה:
כאשר μ היא הצמיגות הדינמית של המים ב-20 מעלות צלזיוס; D הוא הקוטר הפנימי של הסטטור; d הוא הקוטר החיצוני של הרוטור, ו-V הוא מהירות הגזירה (סל"ד/שנייה). - הדקו את תא התגובה בשלב הדגימה של המיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ולאחר מכן התאימו את התא כך שיחזיק את קצה הפיזור של ההומוגנייזר (איור 1). ודא שקצה הפיזור נמצא מעט מעל (~ 1 מ"מ) המשטח התחתון של תא התגובה.
- התאם את המיקום האנכי של ההומוגנייזר והתא יחד כדי להבטיח שהמיקוד של המיקרוסקופ יהיה על פני השטח של קצה הפיזור. לאחר מכן, התאימו את המיקום האופקי של קצה הפיזור כדי לוודא שאזור הגילוי (שדה הראייה) מוגדר בין הרוטור לסטטור (איור 1).
- הפעל את תעלות הפלואורסצנציה בהתאם לצבע הפלואורסצנטי ששימש בניסוי.
- לפני ניסוי הגזירה במהירות גבוהה, השתמש במים שעברו דה-יוניזציה (DI) כדי לבדוק את הגזירה במהירות גזירה נמוכה (למשל, 2,000 סל"ד) כדי להבטיח שקצה הפיזור יכול לעבוד כראוי מבלי לגעת בתא התגובה.
2. פתיחת i-מוטיבים עם ובלי ליגנדות
- הכן דנ"א i-motif טלומרי אנושי (טבלת חומרים) המסומן בצבע ובקוונצ'ר בשני קצותיו, בהתאמה, במי DI, כמתואר ב- Hu et al.11.
הערה: i-מוטיב המכיל רצף: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA. - לדלל את הדנ"א ל-5 מיקרומטר במאגר MES של 30 mM ב-pH 5.5 או pH 7.4. לתמיסת הדנ"א, הוסיפו ליגנד L2H2-4OTD, שסונתז על פי אברהם פונוז ואחרים, בטווח ריכוזים של 0-60 מיקרומטר. ערבבו את התמיסה בעדינות במשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif ללא אור.
- בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI שעברו דה-יוניזציה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ללא גזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI. יש להפחית את ערך הפלואורסצנציה ברקע בניתוחי הנתונים מאוחר יותר.
הערה: יש להימנע מאור תועה משלב זה ואילך. - הגדר את הפרמטרים של מצלמת CCD באמצעות התוכנה. הפרמטרים המומלצים הם כדלקמן: זמן חשיפה = 0.5 שניות, רגישות CCD = 1600, וזמן הקלטה = 20 דקות.
- באמצעות פיפט ארוך, מוסיפים את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק והנקי. מכסים את תא התגובה בקופסה שחורה. לאחר מכן, הפעל את ההומוגנייזר לבצע גזירה בקצב גזירה נבחר הנע בין 9,724 s−1 ל- 97,245 s−1 (נבחר באמצעות התוכנה המשויכת להומוגנייזר) למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת כדי להקליט את הנתונים.
- לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.
3. תגובת קליק המופעלת בכוח גזירה
- הכינו דנ"א i-motif במי DI. דגירה של 10 μM i-motif DNA ב-300 μL של 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת 150 μM CuCl וחומצה אסקורבית של 300 μM למשך 10 דקות כדי לקפל את מבני ה-i-motif (כל הריכוזים הם הריכוזים הסופיים בתמיסה).
הערה: CuCl הוא הזרז של תגובת הלחיצה. חומצה אסקורבית תמנע חמצון נחושת (I). - אולטרה לסנן את התמיסה עם מכשיר סינון אולטרה בכוח צנטריפוגלי של 14,300 x גרם. לחדש את התמיסה ל~500 μL עם 30 mM Tris buffer (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית 300 μM לאחר כל סינון.
- חזור על הסינון 3x.
- אסוף את התמיסה השיורית וצור נפח סופי של 300 μL על ידי הוספת 30 mM Tris (pH 7.4) בתוספת חומצה אסקורבית של 300 μM יחד עם 20 μM Calfluor 488 אזיד, 20 μM HPG ו- 10 μM TBTA. לאחר הוספת הריאגנטים, העבירו את התמיסה לחדר החושך.
הערה: יש להימנע מאור לאחר שלב זה. - בדוק ומזער את עוצמת הפלואורסצנטיות ברקע של תא התגובה המלא במי DI באמצעות המיקרוסקופ לפני ניסויי הגזירה. דרך קלה למזער את פלואורסצנטיות הרקע היא לשטוף את תא התגובה במי DI.
- הוסף את תמיסת הדנ"א לתא התגובה הריק עם פיפטה ארוכה, ולאחר מכן התחל את הטיית ההומוגנייזר בקצב גזירה של 63,209 s−1 למשך 20 דקות כאשר מצלמת ה- CCD מופעלת.
- לאחר הניסוי, הסר את התא ושטוף אותו במי DI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את ההתגלגלות המכנית והחישה בזמן אמת של מולקולות אנסמבל ב-EFS. באיור 1B, עוצמת הפלואורסצנטיות של דנ"א i-motif נצפתה עולה כאשר קצב הגזירה נע בין 9,724 s−1 ל-97,245 s−1 במאגר pH 5.5 MES. כבקרה, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה כאשר אותו דנ"א של מוטיב i הוזז בקצב של 63,209 s−1 במאגר pH 7.4 MES. הסיבה לכך היא שמיטיב ה-i אינו מתקפל ב-pH 7.414. בעבודה הקודמת מצאנו שככל שקצב הגזירה גבוה יותר, כך מתפתחת יותר ה-i-motif11. בהתבסס על התגלגלות מוטיב ה-i בפינצטה האופטית 11, כיילנו את כוח הגזירה לעומת קצב הגזירה כפי שמוצג באיור 1C, שתיאר כי ניתן להחיל עד 41 pN על זוג FRET שכותרתו i-motif בקצב גזירה של 77,796 s−1. באיור 2B הוערך הליגנד (L2H2-4OTD) שנקשר למולקולות ה-i-motif של הדנ"א שהיו נתונות לזרימת הגזירה, מה שהראה כי העלייה בעוצמת הפלואורסצנציה נעשתה פחות ברורה עם העלייה בריכוז L2H2-4OTD (0-60 מיקרומטר). מעקומת הקשירה (כלומר, תרשים של השברים המאוגדים של הליגנד לעומת ריכוז הליגנד החופשי) באיור 2C, נקבע קבוע דיסוציאציה (Kd) של 36 μM עבור האינטראקציה בין ליגנד L2H2-4OTD לבין מוטיב i11. כיישום מעשי של כוח גזירה לתגובות כימיות, איור 3 מראה תגובת מכנו-קליק שיכולה להיות מופעלת על-ידי זרימת הגזירה. באיור 3B, מוטיב ה-i-chelated Cu(I) נפרש בקצב הגזירה של 63,209 s−1, והנחושת ששוחררה (I) הפעילה את תגובת הקליק הפלואורוגנית המוצגת באיור 3A, וכתוצאה מכך עוצמת הפלואורסצנציה גדלה עם הזמן (איור 3C).
איור 1: פתיחה של מבנה הדנ"א של מוטיב i על-ידי זרימת גזירה ב-EFS. (A) סכמת התגלגלות של מבנה דנ"א בעל מוטיב i המסומן בזוג FRET (Cy5 ו-quencher) על-ידי זרימת הגזירה שנוצרת בהומוגנייזר ספסל. כניסה שמאלית: החום הבהיר מציין את הסטטור, והחום הכהה מציין את הרוטור. כניסה ימנית: עיגול הציאן המנוקד בין הרוטור לסטטור מציין את זרימת החיץ בתנאי גזירה. החץ העגול החום כהה מציין את כיוון הרוטור. חיצי הציאן בתצוגה המוגדלת של הכניסה הימנית מציינים את זרימת החיץ תחת הטיה. אורכו של כל חץ מתאר את מהירותו של זרם זרימה מסוים (חיצים ארוכים יותר מציינים מהירויות גבוהות יותר). (B) אחוז השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות בחישה בזמן אמת נובע מהתגלגלות מוטיב ה-i בקצבי גזירה שונים מ-9,724 s−1 ל-97,245 s−1. עקומות מוצקות מציינות את ההתאמה האקספוננציאלית. עוצמת הפלואורסצנטיות מנורמלת ביחס לערך המרבי שנצפה בניסוי. (C) דיאגרמה של קצב הגזירה לעומת כוח הגזירה עבור מוטיב i המוצג ב-(A). הקו האדום מתאר התאמה ליניארית (R2 = 1.00). נתון זה שונה מ- Hu et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: התגלגלות של מוטיבים i הקשורים בליגנדים . (A) סכמת ה-i-מוטיב המסומנת בזוג FRET (Cy5 ו-quencher) הקשורה לליגנד L2H2-4OTD13. (B) הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות של מוטיב ה-i עם ריכוזים הולכים וגדלים של ליגנד L2H2-4OTD (ורוד: 0 μM, ירוק: 6 μM, ציאן: 30 μM, אפור: 36 μM, שחור: 45 μM, וחום בהיר: 60 μM). עוצמת הפלואורסצנטיות מנורמלת ביחס לערך המרבי שנצפה בניסוי. (C) עקומת קשירה של מוטיב i בריכוזים חופשיים שונים של L2H2-4OTD. נתון זה שונה מ- Hu et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: תגובות מכנו-קליקים . (A) תגובת קליק פלואורוגנית בין קלפלואור 488 ל-HPG. התרכובת המוצגת בירוק היא תוצר התגובה הפלואורסצנטית. (B) מבנה הדנ"א של מוטיב i עם כלאט עם נחושת (I) ב-pH 7.4 סונן כדי להסיר נחושת לא מאוגדת (I) בתמיסה. מוטיב הנחושת (I) כלאט נפרש על ידי זרימת גזירה ב- EFS. הנחושת ששוחררה (I) זירזה את תגובת הלחיצה הפלואורוגנית, שהוצגה בצינורות הנימים (מימין למטה). (C) עלייה באחוזים של עוצמת הפלואורסצנטיות של תגובת הקליק בקצב גזירה של 63,209 s−1 למשך 20 דקות. העקומה הכהה מציינת את התאמת עוצמת הפלואורסצנטיות מתגובת קליק בקרה ללא דנ"א. העקומה הירוקה מייצגת את ההתאמה האקספוננציאלית. עוצמת הפלואורסצנטיות מנורמלת ביחס לערך המרבי שנצפה בניסוי. נתון זה שונה מ- Hu et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מאפשר חקירה בזמן אמת של התגלגלות מערך של מבנים ביומולקולריים על ידי כוח גזירה. התוצאות המוצגות כאן מדגישות כי מבנים של מוטיב דנ"א ניתנים לפתיחה על ידי כוח גזירה. התגלגלותו של מוטיב ה-i הקשור לליגנד ותגובות הקליק המופעלות בכוח הגזירה היו יישומים של הוכחת היתכנות עבור שיטת ספקטרוסקופיית כוח אנסמבל זו.
איור 1 מציג את מערך המכשירים. קצה מחולל ההומוגנייזר ותא התגובה אינם חייבים לבוא במגע זה עם זה, וזה קריטי כדי לאפשר זרימת גזירה יציבה בין הרוטור לסטטור ללא היווצרות בועות. עבור קצה הומוגנייזר מסחרי, עדיף לבחור אחד עם חור אוויר כדי להפחית היווצרות בועות. בנוסף, גודל תא התגובה לא צריך להיות גדול מדי, שכן תא גדול דורש פתרון מדגם יותר. להיפך, גובה מסוים של תא הגזירה נדרש כדי לכסות את הגוף העיקרי של קצה הומוגנייזר. כדי להפחית את השגיאה השיטתית, מוצע לשמור על אותו יישור במערך כדי לבצע את כל הניסויים הרלוונטיים. חשוב לציין כי הדנ"א שומר על שלמות, כפי שמעידה אלקטרופורזה בג'ל לאחר גזירה11.
מאיור 1B, הפלואורסצנטיות הרוויה עלתה כאשר קצב הגזירה נע בין 9724 s−1 ל-97245 s−1. לאחר שהתוויית עוצמת הפלואורסצנציה של הרמה לעומת קצב הגזירה, עוצמת הפלואורסצנציה לא עלתה עוד בקצב הגזירה מעל 97245 s−1, מה שמרמז על כך שכוח הגזירה הקשור שסופק על ידי קצב הגזירה (97245 s−1) כבר היה גבוה יותר מהכוח הנדרש לפתיחת מוטיב ה-i. לכן, עוצמת הפלואורסצנציה של הרמה ב- 97245 s−1 נלקחה כנקודת ייחוס (כלומר, המקבילה ל- 100% התגלגלות) כדי לחשב את אחוז מוטיב ה- i הלא נפרש בכל שיעור גזירה11. איור 1C מראה את כוח הגזירה שנוצר על מוטיב ה-i הטלומרי בקצב גזירה מסוים. כדי לבסס את הקשר בין כוח הגזירה לקצב הגזירה, בוצעה פתיחה מכנית של אותו מבנה i-motif טלומרי בפינצטה אופטית, וחלקה מצטברת של אחוז ההתגלגלות של ה-i-motif לעומת הכוח שורטטה על סמך היסטוגרמה של כוח הפתיחה של ה-i-motif בניסויי הפינצטה האופטיים11 . עבור מבני דנ"א שונים, מומלץ כיול כוח באמצעות פינצטה אופטית. בהתבסס על ההנחה שאחוזי ה-i-motif הפתוחים שקולים בין פתיחה מכנית מבוססת פינצטה בלייזר לבין פתיחה מבוססת כוח גזירה בכוח מסוים (כלומר, בהינתן שכיוון הכוח שחווה מוטיב ה-i דומה בשתי השיטות הללו, שנמצא לאורך הציר המתוח של שתי ידיות הדנ"א [שלוחות]), כיילנו את כוח הגזירה לעומת קצב הגזירה.
למרות שמכשירי ההומוגנייזר נגישים בקלות בכל מעבדה, ישנם כמה צעדים מרכזיים שיש לבצע בזהירות. ראשית, כדי לזהות ערכי פלואורסצנציה מדויקים, יש להגדיר את נתיב האור בין הרוטור לסטטור. שנית, בעת ביצוע ניסויי הגזירה על פי השלבים של פרוטוקול זה, חשוב לבדוק את הפלואורסצנציה לפני הניסוי. יש צורך להפחית את עוצמת הפלואורסצנטיות הגבוהה ברקע על ידי ניקוי כל ההתקנה היטב, במיוחד קצה ההומוגנייזר ותא התגובה. הניסוי צריך להתבצע בחדר חשוך כדי להפחית עוד יותר את האור התועה.
אחד היתרונות המשמעותיים ביותר של טכניקת EFS הוא הגמישות והרבגוניות שלה לפתיחה מכנית של אנסמבל של מבנים ביומולקולריים, כולל מבני חלבון, RNA ו- DNA. באופן מסורתי, ניסויי התגלגלות מכנית של אנסמבל דורשים תצורות ניסוי מורכבות. היתרון של EFS הוא בכך שהוא מפחית את המורכבות בעיצוב המכשיר, עם עלות מופחתת בהרבה. למרות ש- EFS יכול לבצע ניסויים בתפוקה גבוהה בזמן קצר יותר בהשוואה לטכניקות של מולקולה בודדת, ישנן כמה מגבלות, הכוללות את העובדה שגודל הכוח נקבע על ידי גודל המבנה המולקולרי. בנוסף, נדרש תיוג פלואורסצנטי של המולקולה שזוהתה. כדי להשיג כוחות גזירה גדולים יותר, החיבור של ידיות גזירה למולקולה המעניינת עשוי להיות נחוץ. עבור יישומים עתידיים, EFS מבוסס כוח גזירה יכול לשמש באופן פוטנציאלי לחקר תופעות מכנוכימיות שונות שבהן תגובות כימיות, כגון זיהוי אנליטי15 ופילמור של פולימרים סינתטיים, מושפעות מכוחות מכניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודת מחקר זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע [CBET-1904921] והמכונים הלאומיים לבריאות [NIH R01CA236350] ל- H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V.
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H.
