Summary
Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) является надежным методом механического разворачивания и зондирования в реальном времени ансамблевого набора биомолекулярных структур в биофизических и биосенсорных полях.
Abstract
Одномолекулярные методы, основанные на флуоресцентных и механохимических принципах, обеспечивают превосходную чувствительность в биологическом зондировании. Однако из-за отсутствия высоких пропускных возможностей применение этих методов ограничено в биофизике. Ансамблевая силовая спектроскопия (EFS) продемонстрировала высокую пропускную способность при исследовании массивного набора молекулярных структур путем преобразования механохимических исследований отдельных молекул в исследования молекулярных ансамблей. В этом протоколе вторичные структуры ДНК (i-мотивы) разворачивались в сдвиговом потоке между ротором и статором наконечника гомогенизатора со скоростью сдвига до 77796/с. Было продемонстрировано влияние скорости потока и размеров молекул на силы сдвига, испытываемые i-мотивом. Методика EFS также выявила сродство связывания между i-мотивами ДНК и лигандами. Кроме того, мы продемонстрировали химическую реакцию щелчка, которая может быть приведена в действие силой сдвига (т. Е. Химия механо-щелчка). Эти результаты устанавливают эффективность использования силы сдвига для контроля конформации молекулярных структур.
Introduction
В одномолекулярной силовой спектроскопии1 (SMFS) механические свойства отдельных молекулярных структур были изучены сложными инструментами, такими как атомно-силовой микроскоп, оптический пинцет и магнитный пинцет 2,3,4. Ограниченные одним и тем же требованием направленности молекул в силообразующих/детектирующих установках или малым полем зрения в магнитных пинцетах и миниатюрном центрифужном силовом микроскопе (MCF)5,6,7,8, только ограниченное количество молекул может быть исследовано одновременно с использованием SMFS. Низкая пропускная способность SMFS препятствует ее широкому применению в области молекулярного распознавания, что требует привлечения большого набора молекул.
Сдвиговой поток обеспечивает потенциальное решение для приложения сил к массивному набору молекул9. В потоке жидкости внутри канала, чем ближе к поверхности канала, тем медленнее скорость потока10. Такой градиент скорости потока вызывает напряжение сдвига, параллельное граничной поверхности. Когда молекула помещается в этот поток сдвига, молекула переориентируется так, что ее длинная ось выравнивается с направлением потока, поскольку сила сдвига прикладывается к длинной оси11. В результате этой переориентации ожидается, что все молекулы одного типа (размер и длина ручек) выровняются в одном направлении, испытывая при этом одинаковую силу сдвига.
Эта работа описывает протокол использования такого сдвигового потока для оказания силы сдвига на массивный набор молекулярных структур, примером чего является i-мотив ДНК. В этом протоколе между ротором и статором в наконечнике гомогенизатора генерируется сдвиговой поток. Настоящее исследование показало, что сложенная структура i-мотива ДНК может быть развернута со скоростью сдвига 9724-97245 s−1. Кроме того, между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом была обнаружена константа диссоциации 36 мкМ. Это значение согласуется с значением 31 мкМ, измеренным анализом сдвигагеля 12. Кроме того, современная техника используется для развертывания i-мотива, который может обнажить хелатную медь (I) для катализации реакции щелчка. Таким образом, этот протокол позволяет развернуть большой набор структур i-motif с недорогими инструментами за разумное время (менее 30 минут). Учитывая, что метод силы сдвига резко увеличивает пропускную способность силовой спектроскопии, мы называем эту технику ансамблевой силовой спектроскопией (EFS). Этот протокол направлен на предоставление экспериментальных руководящих принципов для облегчения применения этой EFS на основе сдвиговой силы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы и химические реагенты, используемые в этом протоколе, перечислены в таблице материалов.
1. Подготовка силового микроскопа сдвига
ПРИМЕЧАНИЕ: Микроскоп с силой сдвига состоит из двух частей: реакционного блока (гомогенизатора) и блока детектирования (флуоресцентного микроскопа). Увеличение окуляра составляет 10x, а увеличение объектива (воздуха) - 4x.
- Соберите гомогенизатор и микроскоп на монтажном столе. Наденьте очки и включите флуоресцентный микроскоп, а затем отрегулируйте гомогенизатор, чтобы убедиться, что луч света возбуждения соответствующей длины волны (здесь использовался 488 нм) проходит через центр диспергирующего наконечника гомогенизатора.
- Подготовьте реакционную камеру с плоским дном высотой 5 см и поперечным сечением 1,5 см2 х 1,5см2. Чтобы уменьшить фон, убедитесь, что выбранный материал камеры не флуоресцирует, например, стекла (некоторые пластмассы имеют флуоресценцию).
- Выберите подходящий диспергирующий наконечник гомогенизатора, который может обеспечить требуемую силу сдвига.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость сдвига зависит от расстояния между ротором и статором при фиксированной скорости вращения11 в соответствии со следующим уравнением:
где μ - динамическая вязкость воды при 20°С; D - внутренний диаметр статора; d - наружный диаметр ротора, а V - скорость сдвига (об/мин/с). - Зажмите реакционную камеру на стадии образца флуоресцентного микроскопа, а затем отрегулируйте камеру, чтобы удерживать диспергирующий наконечник гомогенизатора (рисунок 1). Убедитесь, что диспергирующий наконечник находится немного выше (~1 мм) нижней поверхности реакционной камеры.
- Отрегулируйте вертикальное положение гомогенизатора и камеры вместе, чтобы фокус микроскопа находился на поверхности диспергирующего наконечника. Затем отрегулируйте горизонтальное положение диспергирующего наконечника, чтобы убедиться, что область обнаружения (поле зрения) установлена между ротором и статором (рисунок 1).
- Включите флуоресцентные каналы в соответствии с флуоресцентным красителем, используемым в эксперименте.
- Перед экспериментом по высокоскоростному сдвигу используйте деионизированную (DI) воду для проверки сдвига с низкой скоростью сдвига (например, 2000 оборотов в минуту), чтобы убедиться, что диспергирующий наконечник может работать надлежащим образом, не касаясь реакционной камеры.
2. Разворачивание i-мотивов с лигандами и без них
- Получают человеческую теломерную i-мотивную ДНК (Таблицу материалов), помеченную красителем и гасителем на двух концах, соответственно, в воде DI, как описано в Hu et al.11.
ПРИМЕЧАНИЕ: i-мотив, содержащий последовательность: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC CCC TAA. - Разбавьте ДНК до 5 мкМ в буфере MES 30 мМ при рН 5,5 или рН 7,4. К раствору ДНК добавляют лиганд L2H2-4OTD, который был синтезирован по данным Abraham Punnoose et al.13, в диапазоне концентраций 0-60 мкМ. Смешивайте раствор осторожно в течение 10 мин, чтобы сложить структуры i-мотива без света.
- Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной деионизированной водой DI, с помощью флуоресцентного микроскопа без сдвига. Простым способом минимизации фоновой флуоресценции является промывка реакционной камеры водой DI. Значение фоновой флуоресценции должно быть вычтено в анализе данных позже.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага следует избегать рассеянного света. - Установите параметры ПЗС-камеры с помощью программного обеспечения. Рекомендуемые параметры следующие: время экспозиции = 0,5 с, чувствительность ПЗС = 1600 и время записи = 20 мин.
- Используя длинную пипетку, добавьте раствор ДНК в пустую и чистую реакционную камеру. Накройте реакционную камеру черным ящиком. Затем запустите гомогенизатор для выполнения сдвига с выбранной скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 с−1 до 97 245 с−1 (выбранного с помощью программного обеспечения, связанного с гомогенизатором) в течение 20 минут с включенной ПЗС-камерой для записи данных.
- После эксперимента снимите камеру и промыть ее водой DI.
3. Реакция щелчка с силой сдвига
- Подготовьте ДНК i-мотива в воде DI. Инкубировать 10 мкМ i-мотивной ДНК в 300 мкл 30 мМ буфера Tris (рН 7,4), дополненного 150 мкМ CuCl и 300 мкМ аскорбиновой кислоты в течение 10 мин для сворачивания структур i-мотива (все концентрации являются конечными концентрациями в растворе).
ПРИМЕЧАНИЕ: CuCl является катализатором реакции щелчка. Аскорбиновая кислота предотвратит окисление меди (I). - Ультрафильтрация раствора с помощью ультрафильтрационного устройства при центробежной силе 14 300 х г. Пополняйте раствор до ~500 мкл с буфером Tris 30 мМ (рН 7,4), дополненным 300 мкМ аскорбиновой кислотой после каждой фильтрации.
- Повторите фильтрацию 3x.
- Соберите остаточный раствор и сделайте конечный объем 300 мкл, добавив 30 мМ Tris (pH 7,4), дополненный 300 мкМ аскорбиновой кислотой вместе с 20 мкМ Calfluor 488 азида, 20 мкМ HPG и 10 мкМ TBTA. После того, как реагенты добавлены, переместите раствор в темную комнату.
ПРИМЕЧАНИЕ: После этого шага следует избегать освещения. - Проверьте и минимизируйте интенсивность фоновой флуоресценции реакционной камеры, заполненной водой DI, с помощью микроскопа перед экспериментами по сдвигу. Простым способом минимизации фоновой флуоресценции является промывка реакционной камеры водой DI.
- Добавьте раствор ДНК в пустую реакционную камеру с длинной пипеткой, а затем начните сдвиг гомогенизатора со скоростью сдвига 63 209 с−1 в течение 20 мин с включенной ПЗС-камерой.
- После эксперимента снимите камеру и промыть ее водой DI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показано механическое развертывание и зондирование в реальном времени ансамблевых молекул в EFS. На рисунке 1B интенсивность флуоресценции ДНК i-мотива увеличивалась со скоростью сдвига в диапазоне от 9 724 с−1 до 97 245 с−1 в буфере рН 5,5 MES. В качестве контроля интенсивность флуоресценции не увеличивалась, когда ту же i-мотивную ДНК сдвигали со скоростью 63 209 с−1 в буфере рН 7,4 MES. Это связано с тем, что i-мотив не складывается при рН 7,414. В предыдущей работе мы обнаружили, что чем выше скорость сдвига, тем больше разворачивается i-мотив11. Основываясь на развертывании i-мотива в оптическом пинцете11, мы откалибровали силу сдвига против скорости сдвига, как показано на рисунке 1C, на котором показано, что до 41 пН может быть применено к FRET-паре, меченой i-мотивом, со скоростью сдвига 77 796 с−1. На рисунке 2B оценивали связывание лиганда (L2H2-4OTD) с молекулами i-мотива ДНК, подвергшимися сдвиговому потоку, что показало, что приращение интенсивности флуоресценции стало менее очевидным с увеличением концентрации L2H2-4OTD (0-60 мкМ). Из кривой связывания (т.е. графика связанных фракций лиганда против концентрации свободного лиганда) на фиг.2С была определена константа диссоциации (Kd) 36 мкМ для взаимодействия между лигандом L2H2-4OTD и i-мотивом11. В качестве практического применения силы сдвига для химических реакций на рисунке 3 показана механо-щелкающая реакция, которая может быть вызвана потоком сдвига. На рисунке 3B хелатный i-мотив Cu(I) разворачивали со скоростью сдвига 63 209 с−1 , и высвобождаемая медь (I) вызывала флуорогенную реакцию щелчка, показанную на рисунке 3A, что приводило к увеличению интенсивности флуоресценции с течением времени (рисунок 3C).
Рисунок 1: Раскрытие структуры ДНК i-мотива сдвиговым потоком в EFS. (A) Схема развертывания структуры ДНК i-мотива, помеченной парой FRET (Cy5 и quencher) потоком сдвига, генерируемым в настольном гомогенизаторе. Левая вставка: светло-коричневый указывает на статор, а темно-коричневый указывает на ротор. Правая вставка: пунктирная голубая окружность между ротором и статором указывает на буферный поток в условиях сдвига. Темно-коричневая круглая стрелка указывает направление ротора. Голубые стрелки в увеличенном представлении правой вставки указывают на буферный поток при сдвиге. Длина каждой стрелки отображает скорость конкретного потока потока (более длинные стрелки указывают на более высокие скорости). (B) Процентное изменение интенсивности флуоресценции при зондировании в реальном времени обусловлено развертыванием i-мотива при различных скоростях сдвига от 9 724 с−1 до 97 245 с−1. Сплошные кривые указывают на экспоненциальную подгонку. Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. (C) Диаграмма скорости сдвига по сравнению с силой сдвига для i-мотива, показанная в (A). Красной линией изображена линейная подгонка (R2 = 1,00). Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Разворачивание i-мотивов, связанных лигандами. (A) Схема i-мотива, помеченного парой FRET (Cy5 и quencher), связанной с лигандом L2H2-4OTD13. (B) Снижение интенсивности флуоресценции i-мотива с увеличением концентрации лиганда L2H2-4OTD (розовый: 0 мкМ, зеленый: 6 мкМ, голубой: 30 мкМ, серый: 36 мкМ, черный: 45 мкМ и светло-коричневый: 60 мкМ). Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. (C) Кривая связывания i-мотива при различных концентрациях свободного L2H2-4OTD. Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Реакции механо-щелчка. (А) Фторогенная реакция щелчка между Calfluor 488 и HPG. Соединение, показанное зеленым цветом, является продуктом флуоресцентной реакции. (B) Структуру ДНК i-мотива, хелатированную медью (I) при рН 7,4, фильтровали для удаления несвязанной меди (I) в растворе. Хелатный i-мотив меди (I) был развернут сдвиговым потоком в EFS. Высвобождаемая медь (I) катализировала фторогенную реакцию щелчка, которая была показана в капиллярных трубках (внизу справа). (C) Процентное увеличение интенсивности флуоресценции реакции щелчка при скорости сдвига 63 209 с−1 в течение 20 мин. Темная кривая указывает на соответствие интенсивности флуоресценции от контрольной щелчковой реакции без ДНК. Зеленая кривая представляет экспоненциальную подгонку. Интенсивность флуоресценции нормализуется относительно максимального значения, наблюдаемого в эксперименте. Эта цифра была изменена по сравнению с Hu et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный в этой рукописи, позволяет в режиме реального времени исследовать разворачивание ансамблевого набора биомолекулярных структур силой сдвига. Представленные здесь результаты подчеркивают, что структуры ДНК i-motif могут быть развернуты силой сдвига. Развертывание лиганд-связанного i-мотива и реакции щелчка с силой сдвига были доказательством концепции для этого метода ансамблевой силовой спектроскопии.
На рисунке 1 показана настройка прибора. Наконечник генератора гомогенизатора и реакционная камера не должны контактировать друг с другом, что имеет решающее значение для обеспечения стабильного сдвигового потока между ротором и статором без образования пузырьков. Для коммерческого наконечника гомогенизатора лучше выбрать наконечник с воздушным отверстием, чтобы уменьшить образование пузырьков. Кроме того, размер реакционной камеры не должен быть слишком большим, так как большая камера требует большего количества пробного раствора. Напротив, для покрытия основного корпуса наконечника гомогенизатора требуется определенная высота камеры сдвига. Чтобы уменьшить систематическую ошибку, предлагается поддерживать такое же выравнивание в установке для проведения всех соответствующих экспериментов. Важно отметить, что ДНК сохраняет целостность, о чем свидетельствует гель-электрофорез после сдвига11.
С рисунка 1B насыщенная флуоресценция увеличивалась со скоростью сдвига в диапазоне от 9724 с−1 до 97245 с−1. После построения диаграммы интенсивности флуоресценции плато по сравнению со скоростью сдвига интенсивность флуоресценции больше не увеличивалась при скорости сдвига выше 97245 с−1, предполагая, что связанная сила сдвига, обеспечиваемая скоростью сдвига (97245 с−1), уже была выше, чем требуемая сила для развертывания i-мотива. Поэтому интенсивность флуоресценции плато при 97245 с−1 была взята за точку отсчета (т. е. соответствующую 100% разворачиванию) для расчета процента развернутого i-мотива при любой скорости сдвига11. На рисунке 1С показана сила сдвига, создаваемая на теломерном i-мотиве при определенной скорости сдвига. Чтобы установить связь между силой сдвига и скоростью сдвига, в оптических пинцетах выполнили механическое развертывание той же теломерной структуры i-мотива, а на основе гистограммы разворачивающейся силы i-мотива в экспериментах11 оптических пинцетов был построен кумулятивный график разворачивающегося процента i-мотива . Для различных структур ДНК рекомендуется силовая калибровка с использованием оптического пинцета. Основываясь на предположении, что проценты развернутого i-мотива эквивалентны между механическим развертыванием на основе лазерного пинцета и разворачиванием на основе силы сдвига при определенной силе (т. Е. Учитывая, что направление силы, испытываемой i-мотивом, аналогично в этих двух методах, которое находится вдоль растянутой оси двух ручек ДНК [свесов]), мы откалибровали силу сдвига против скорости сдвига.
Хотя инструменты гомогенизатора легко доступны в любой лаборатории, есть несколько ключевых шагов, которые следует выполнять с осторожностью. Во-первых, чтобы обнаружить точные значения флуоресценции, следует установить путь света между ротором и статором. Во-вторых, при выполнении экспериментов по стрижке по шагам этого протокола важно проверить флуоресценцию перед экспериментом. Необходимо снизить высокую интенсивность фоновой флуоресценции, хорошо очистив всю установку, особенно наконечник гомогенизатора и реакционную камеру. Эксперимент следует проводить в темном помещении, чтобы еще больше уменьшить рассеянный свет.
Одним из наиболее значительных преимуществ метода EFS является его гибкость и универсальность для механического развертывания ансамблевого набора биомолекулярных структур, включая структуры белка, РНК и ДНК. Традиционно ансамблевые механические эксперименты по развертыванию требуют сложных экспериментальных установок. Преимущество EFS заключается в том, что она снижает сложность конструкции прибора при значительном снижении стоимости. Хотя EFS может выполнять эксперименты с высокой пропускной способностью за более короткое время по сравнению с методами с одной молекулой, существуют некоторые ограничения, которые включают в себя тот факт, что величина силы определяется размером молекулярной структуры. Кроме того, требуется флуоресцентная маркировка обнаруженной молекулы. Для достижения больших сил сдвига может потребоваться прикрепление ручек сдвига к интересующей молекуле. Для будущих применений EFS на основе сдвиговой силы может быть потенциально использована для изучения различных механохимических явлений, в которых химические реакции, такие как распознавание аналитов15 и полимеризация синтетических полимеров, находятся под влиянием механических сил.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта исследовательская работа была поддержана Национальным научным фондом [CBET-1904921] и Национальными институтами здравоохранения [NIH R01CA236350] для H. M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
References
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V.
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026 (2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H.
