Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En multiplexed screening med høj kapacitet for type 1-diabetes, cøliaki og COVID-19

Published: July 5, 2022 doi: 10.3791/63787
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1, 1
1Barbara Davis Center for Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine, South China University of Technology
* These authors contributed equally

Summary

I tråd med det presserende behov for screening for type 1-diabetes, cøliaki og coronavirus sygdom 2019 udviklede vi et 6-Plex elektrokemiluminescensassay med høj gennemstrømning for samtidig at detektere alle fire ø-autoantistoffer, vævstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mod receptorbindingsdomænet for alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2.

Abstract

Et igangværende klinisk forsøg, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningsundersøgelse i den generelle befolkning for type 1-diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er epidemiologien af COVID-19 i den generelle befolkning og viden om sammenhængen mellem COVID-19-infektion og T1D-udvikling presserende. Den nuværende standardscreeningsmetode for radiobindingsassay (RBA) har mødt to store udfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sygdomsspecificitet med en stor andel af antistoffer med lav affinitet genereret ved screening. Med platformen for multiplex elektrokemiluminescens (ECL) assay, vi etablerede tidligere, blev der udviklet et nyt 6-Plex ECL-assay, der kombinerer i en enkelt brønd alle fire ø-autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyre decarboxylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og zinktransportør 8 (ZnT8) til T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) til cøliaki og alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindende domæne (RBD) antistoffer til COVID-19. Analysen blev valideret i blinde ved hjælp af 880 prøver fra ASK-undersøgelsen, herunder 325 positive prøver og 555 alle antistofnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA'erne og et enkelt ECL-assay. Med fordelene ved høj effektivitet, lave omkostninger og lav serumvolumen er dette assay blevet accepteret som det primære screeningsværktøj til ASK-undersøgelsen.

Introduction

Store epidemiologiske undersøgelser over hele verden viser, at forekomsten af type 1-diabetes (T1D) har været hurtigt stigende med 3%-5% årligt, og forekomsten af T1D er fordoblet i de sidste 20 år, især hos små børn 1,2. Ø autoantistoffer (IAbs) forekommer normalt år før kliniske symptomer og er i øjeblikket de mest pålidelige prædiktive og diagnostiske biomarkører for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identificere personer med risiko for at komme videre til klinisk T1D, uddanne offentligheden, stort set reducere den livstruende komplikation af ketoacidose og gavne kliniske forsøg med forebyggelsesterapier. Verdensomspændende forebyggelsesindsats for T1D er i gang, og flere interventionelle forsøg udføres blandt forsøgspersoner med IAbs-positive for at forsinke progressionen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lancerede det første amerikanske kliniske forsøg med screening i den generelle befolkning i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunitetsscreening for børnene (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sygdom relateret til immun- og genetiske faktorer. Forekomsten af CD hos børn med T1D kan nå op til 24,5%5. Mere end halvdelen af personer med CD kan ikke have typiske symptomer ved præsentation6, så serologisk screening for cøliaki er helt nødvendig.

Siden pandemien med coronavirussygdom 2019 (COVID-19) startede, er der rapporteret over 200 millioner tilfælde globalt, og børn tegner sig for op til 16% af laboratoriebekræftede tilfælde7. Mange undersøgelser har vist virkningen af eksisterende T1D på sværhedsgraden og dødeligheden af COVID-19-infektion8, mens virkningen af COVID-19-infektion på T1D-udvikling ikke er klar. Undersøgelsen af den samlede COVID-19-infektion i den generelle befolkning ved bestemmelse af alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og undersøgelsen af sammenhængen mellem COVID-19-infektion og udløsning af T1D-autoimmunitet eller accelererende T1D-progression er presserende nødvendige og meget vigtige, mens den igangværende ASG-undersøgelse er en glimrende platform for dette. På grund af enkeltassayformatet og genereringen af en stor andel af antistofpositivitet med lav affinitet har standard radiobindingsassay (RBA) mødt en flaskehals med lav effektivitet og lav sygdomsspecificitet9. I dette papir præsenterer vi et nyt 6-Plexed elektrokemiluminescens (ECL) assay bygget på vores tidligere multiplex ECL-analyseplatform ved hjælp af en multiple-Plex-plade, der kombinerer seks autoantistofassays i en enkelt brønd, herunder alle fire store IAb'er til insulin (IAA), glutaminsyre decarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer til transglutaminase (TGA) til cøliaki, og SARS-CoV-2 receptorbindende domæne (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er det første multiplex-assay, der rekrutterede et komplet panel af fire store IAb'er og yderligere kombinerede dette med TGA og COVID-19A. Det er blevet valideret og formelt accepteret som det primære screeningsværktøj, der erstatter standard RBA i ASK-undersøgelsen.

Protocol

Forskningsprotokollen blev godkendt af Colorado Multiple Institutional Review Board.

1. Forberedelse af buffer

  1. Forbered mærkningsbufferen (2x PBS, pH 7,9): Tilsæt 100 ml 10x PBS til 400 ml destilleret vand, og juster pH ved hjælp af NaOH til 7,9.
  2. Lav 3 mM biotin og Ru Sulfo-NHS: Opløs 1 mg biotin i 588 μL mærkningsbuffer og opløs 150 nmol Ru Sulfo-NHS i 50 μL mærkningsbuffer.
  3. Antigenbufferen (1% BSA): 5 g bovint serumalbumin (BSA) opløses i 500 ml 1x PBS.
  4. Forbered belægningsbufferen (3% blokker A): Opløs 15 g blokker A i 500 ml 1x PBS.
  5. Forbered den første vaskebuffer (0,05 % Tween 20, PBST): Bland 2,5 ml Tween 20 i 5.000 ml 1x PBS.
  6. Forbered den anden vaskebuffer (0,4 M NaCl): Bland 50 ml 5 M NaCl i 575 ml destilleret vand for at fremstille 0,4 M NaCl-opløsningen.
    BEMÆRK: For effektiv mærkning skal du altid bruge frisklavede biotin- og Ru Sulfo-NHS-opløsninger og ikke opbevarede dem, der er fremstillet tidligere.

2. Antigenproteinmærkning med biotin og Ru Sulfo-NHS separat

BEMÆRK: En højere koncentration af antigenprotein ≥0,5 mg / ml anbefales til højere mærkningseffektivitet.

  1. Forbered seks målrettede antigenproteinopløsninger, herunder proinsulin, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG og receptorbindende domæne (RBD) af spike-proteinet af SARS-CoV-2. Beregn mol af hvert antigenprotein i henhold til dets molekylvægt og lav passende molære forhold mellem biotin eller Ru Sulfo-NHS. Forholdet mellem antigen og summen af biotin eller Ru Sulfo-NHS vil være 1: 5 for små molekylære antigener (molekylvægt ≤10 kd), såsom proinsulinprotein. For mellemmolekylære antigener (molekylvægt 10-50 kd), såsom ZnT8, justeres forholdet til 1:10. For antigener med stor molekylvægt (molekylvægt >50 kd), såsom GAD, vil molforholdet være 1:20.
  2. Andel antigenproteinet i to lige store dele og bland det separat med biotin og Ru Sulfo-NHS ved hjælp af det beregnede molære forhold i trin 2.1. Inkuber blandingen ved stuetemperatur (RT) i 1,5 timer, undgå lys.
    BEMÆRK: Alle reducerende kemikalier som Tris eller glycin i bufferen af antigenprotein skal fjernes ved hjælp af en størrelsesspinkolonne grundet med en buffer på 2x PBS (pH 7,9).
  3. Prime spinkolonnerne med 2x PBS (størrelsen på spinkolonnen, 2 ml eller 5 ml, afhænger af volumenet af mærkningsantigenproteinet): Tilsæt 1 ml 2x PBS-buffer til spinkolonnen, centrifuger den ved 1.000 x g i 2 minutter, og gentag trinnet 2x mere.
  4. Lad antigenprotein-biotin- eller -Ru Sulfo-NHS-blandingen gå gennem den grundede spinkolonne 1x (centrifuge søjlen ved 1.000 x g i 2 minutter) til oprensning og stoppe mærkningsreaktionen.
  5. Mål det endelige volumen af det mærkede antigenprotein elueret fra spinkolonnerne, og beregn koncentrationerne af biotin- eller Ru Sulfo-NHS-mærket antigenprotein. Lav mindre alikvoter af mærket antigenprotein (50 μL / rør) og opbevar dem ved -80 ° C til langvarig brug.
    BEMÆRK: Dækningen af protein efter hver spinkolonne vil være en ca. 90% -95% retentionsrate.

3. Definer den bedste koncentration og forhold for biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærkede antigener til 6-Plex ECL-assay (skakbrætassay)

BEMÆRK: Skakbrætassayet for hvert antigen er nødvendigt før integration i det multipleksede assay.

  1. Påfør skakbrætassayet for hvert antigen separat.
    BEMÆRK: Trin 3.2.-3.7. vil bruge TGA som et kort eksempel. TGA-skakbrætanalyseprocessen er at simulere analyseprocessen, men med kun en slags antigen.
  2. Lav seriel fortynding af den biotinylerede tTG og Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG. De anbefalede arbejdskoncentrationer af den første blandingsopløsning starter fra 240 ng/ml for både biotinyleret og Ru Sulfo-NHS-mærket tTG. Antag, at koncentrationerne af både original biotinyleret og Ru Sulfo-NHS-mærket tTG er 1,0 μg / μL. Lav en 10x fortynding af den oprindelige Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG og en 5x fortynding af den oprindelige biotinylerede tTG med 5% BSA.
  3. Bland 4 μL biotinyleret tTG-protein med 156 μL 5% BSA (antigenbuffer) og 240 μL af den streptavidinkonjugerede linker i et rør, og opløsningen inkuberes ved RT i 30 min. Tilsæt derefter 160 μL stopopløsning, og inkuber ved RT i yderligere 30 minutter. Tag 400 μL af blandingen og bland med 2 ml stopopløsning. Koncentrationen af det biotinylerede tTG i blandingen er 240 ng/ml.
  4. For at fremstille en seriel fortynding for biotinmærket ZnT8-antigen skal du forberede yderligere fem nye rør, tage 1 ml af en aliquot fra blandingen i trin 3.3. og bland med 1 ml stopopløsning i et nyt rør, og få blandingen med en koncentration på 120 ng/ml. Gentag dette trin, lav serielle 1: 1 fortyndinger, og få den biotinmærkede tTG ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml og 7,5 ng / ml.
  5. Tilsæt 4 μL Ru Sulfo-NHS-mærket tTG med 1,6 ml stopopløsning, og få en blanding af Ru Sulfo-NHS-mærket tTG i en koncentration på 240 ng / ml. Med de samme trin på 3.4. foretages serielle 1: 1 fortyndinger og får Ru Sulfo-NHS-mærket ZnT8-antigen ved 60 ng / ml, 30 ng / ml, 15 ng / ml, 7,5 ng / ml og 3,75 ng / ml. Den sidste koncentration er 0 ng/ml, med kun stopopløsning og intet Ru Sulfo-NHS-mærket antigen.
  6. Forbered tTG-positive kontrol- og negative kontrolserumprøver (prækvalificeret og standardiseret ved et enkelt ECL tTG-assay) og en 96-brønds PCR-plade. Aliquot de positive og negative kontrolserumprøver til henholdsvis venstre halvdel og højre halvdel af pladen med 7 μL i hver brønd. Tilsæt 1x PBS til pladen med 33 μL pr. Brønd.
  7. På venstre halvdel af PCR-pladen tilsættes 24 μL af den serielle fortyndede biotinmærkede tTG-linkeropløsning til hver brønd, en kolonne med en koncentration i rækkefølge fra højeste til laveste. På samme måde tilsættes 16 μL af det serielle fortyndede Ru Sulfo-NHS-mærkede tTG-antigen til hver brønd, en række med en koncentration, og blandes derefter grundigt. Gentag trinnet på højre halvdel af PCR-pladen.
  8. Fortsæt resten af analysetrinnene beskrevet i trin 5.3.-9.1. indtil de rå tælledata er opnået.
  9. Beregn forholdet mellem positive styresignaler og tilsvarende negative styresignaler. Bestem den bedste koncentration for det biotinmærkede antigen og det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen med højere forholdsværdier og lavere baggrund for den negative kontrolprøve. De optimale arbejdskoncentrationer af biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærket antigenprotein er vist nedenfor: 16,0 ng/ml og 8,0 ng/ml for GAD65, 18,8 ng/ml og 9,4 ng/ml for SARS-CoV-2 RBD, 42,0 ng/ml og 42,0 ng/ml for IA-2, 60,0 ng/ml og 60,0 ng/ml for tTG, 4,2 ng/ml og 4,2 ng/ml for ZnT8, og 31,3 ng/ml og 31,3 ng/ml for proinsulin.

4. Opret linkerkoblet antigenopløsning

  1. Fortynd de biotin- og Ru Sulfo-NHS-mærkede antigener med 5% BSA til de optimale arbejdskoncentrationer i henhold til trin 3.9.
  2. Bind forudvalgte linkere til hvert biotinyleret antigenprotein. For et 96-brønds pladeassay tilsættes 4 μL biotinyleret GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigenprotein i et separat rør indeholdende 156 μL 1% BSA og blandes med 240 μL af tilsvarende streptavidinkonjugerede linkere 1, 2, 3, 8, 9 og 10 (figur 1). Inkuber blandingen i 30 minutter ved RT.
  3. Aliquot 160 μL stopopløsning i hvert rør og inkuberes blandingen ved RT i 30 min. Tag 400 μL af blandingsopløsningen ud af hvert rør og kombiner dem sammen.
  4. Tilsæt 4 μL Ru Sulfo-NHS mærket GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 og proinsulinantigen til blandingen ovenfor, og tilsæt derefter 1,6 ml stopopløsning og 3,2 ml 1x PBS og bland. Nu er antigenopløsningen klar til brug i analysen.

5. Inkuber serumprøver med det mærkede antigen

  1. Aliquot 7 μL serum pr. brønd til en 96-brønds PCR-plade og dæksel med tætningsfilm. Forvarm seraen ved 56 °C i 30 minutter på en PCR-maskine. Centrifuger pladen kortvarigt ved 100 x g i 1 min.
  2. Der tilsættes 63 μL antigenopløsning (fremstillet i trin 4.4) pr. boring, og blandes med seraen. Dæk PCR-pladen med tætningsfolie for at undgå lys.
  3. Ryst pladen på en ryster ved 450 o / min ved RT i 2 timer, og inkuber derefter pladen ved 4 ° C i 18-24 timer.

6. Forbered 6-Plex-pladen

  1. Tag en 6-Plex plade fra 4 °C køleskabet, så pladen kan komme til RT. Tilsæt 150 μL 3% Blocker A til hver brønd af 6-Plex pladen.
  2. Sæt pladen tilbage i 4 °C køleskab, dæk pladen med folie for at undgå lys, og inkuber natten over.
    BEMÆRK: Analysetrin i dag 1 omfatter afsnit 4.-6.

7. Overfør serum/antigen inkuberer til 6-Plex-pladen

  1. Den næste dag skal du tage den inkuberende 6-Plex-plade fra køleskabet og dumpe al bufferen ud af pladen. Klap tallerkenen på køkkenrulle for at tørre ud.
  2. Vask 6-Plex pladen 3x med 150 μL vaskebuffer pr. brønd hver gang. Tallerkenen tørres på køkkenrulle, og aliquotserum/antigen inkuberes fra hver brønd i den natlige inkuberende PCR-plade i to brønde på 6-Plex-pladen (30 μL pr. brønd for dubletter).
  3. Dæk pladen med folie, sæt derefter pladen på en pladeryster, og ryst med en hastighed på 450 o / min ved RT i 1 time.

8. Vask 6-Plex-pladen, og tilføj læsebuffer

  1. Opløsningen dumpes i 6-Plex-pladen, og pladen vaskes 3x med 150 μL 0,4 M NaCl-vaskebuffer pr. brønd hver gang.
  2. Når den tredje vask er færdig, tørres pladen mod køkkenrullen, og der tilsættes 150 μL læsebuffer i hver brønd.
    BEMÆRK: Luftbobler i brønden påvirker nøjagtigheden af pladelæsermaskinen og bør undgås for enhver pris.

9. Læs pladen og analyser dataene

  1. Tæl pladen på en elektrokemiluminescensanalysator. Læseresultaterne vil blive præsenteret med værdierne i tællinger pr. sekund (CPS). Beregn det relative antistofindeks for hver prøve ved hjælp af den rå CPS opnået fra læsemaskinen mod CPS for de interne standard positive og negative kontroller af hvert specifikt antistof (indeksværdi = [CPS (prøve) - CPS (negativ standard)] / [CPS (positiv standard) - CPS (negativ standard)]).
  2. Bestem negative eller positive antistofresultater ved hjælp af de afskæringsværdier, der er etableret ved 99,5til 99,8procent af 555 negative kontrolprøver fra ASK-undersøgelsen (alle antistoffer negative prøver uden historie eller familiehistorie af diabetes eller nogen anden form for autoimmun sygdom).
    BEMÆRK: Analysetrin i dag 2 omfatter afsnit 7-9.

Representative Results

Tabel 1, tabel 2 og tabel 3 viser de repræsentative resultater. Den rå CPS fra læsemaskinen er illustreret i tabel 1. I tabel 2 blev rå CPS arrangeret og sorteret efter de seks linkere og tilsvarende antistoffer. Tabel 3 viser de beregnede indeksværdier med CPS som beskrevet i analyseprotokollen. Alle rå tælleværdier skal kontrolleres for at undgå forkerte endelige indeksresultater forårsaget af dårlige dubletter. I tabel 1 er der givet eksempler på dårlige dubletter, hvilket resulterede i en fejl i den endelige indeksberegning i tabel 3.

Dette assay blev valideret blindt ved hjælp af 880 udvalgte prøver fra ASK-undersøgelsen med 325 IAbs-positive prøver og 555 alle Abs-negative prøver. Niveauerne af autoantistoffer fra 6-Plex ECL-assay for de 880 prøver blev sammenlignet punkt for punkt med niveauerne af tilsvarende enkelt ECL-assays (figur 2) og med tilsvarende enkelt standard RBA (figur 3). Afskæringen, følsomheden og specificiteten for hvert antistof er angivet i tabel 4. Følsomheden og specificiteten af dette ECL-COVID-19A-assay er blevet identificeret som henholdsvis 100% og 99.9%10.

Figure 1
Figur 1: Illustration af 6-Plex ECL-analysen. Serumautoantistoffer skaber forbindelsen mellem det Ru Sulfo-NHS-mærkede antigen til det biotinylerede antigen, som er kombineret med en specifik linker og danner et kompleks af antigen-antistof-antigen-linker. Komplekserne fanges gennem hver specifik linker på de specifikke pletter i 6-Plex-pladen. For hvert antigen blev de specifikke linkernumre tildelt: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9 og Proinslulin-linker-10. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af seks antistofniveauer i 880 prøver fra ASK-undersøgelsen mellem det enkelte ECL-assay og 6-Plex ECL-assayet. Panelerne viser sammenligninger af antistofniveauer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA og COVID-19A (indeks for COVID-19A blev præsenteret som (100 x beregnet indeksværdi)). De stiplede linjer repræsenterer assayafskæringerne for hvert antistofassay. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning af fem antistofniveauer i 880 prøver fra ASK-undersøgelsen mellem RBA og 6-Plex ECL-analysen. Panelerne viser sammenligninger af antistofniveauer for henholdsvis GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A og TGA. De stiplede linjer repræsenterer assayafskæringerne for hvert antistofassay. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra He et al.11. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Rå CPS-tal (venstre halvdel af pladen). Rå CPS-tællinger erhvervet fra venstre halvdel af en analyseplade. Hver prøve udføres i to eksemplarer. Hvert CPS-tal inden for samme kolonne (A1, A2, A3 osv.) repræsenterer læsedataene fra de 10 pletter i samme brønd (tilsvarende linkernumre er markeret). Eksempler på dårlige dubletter er fremhævet med gråt, som det ses i række D-linker 3 kolonne 5 og kolonne 6. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Opstilling af tabel 1-data, sorteret med seks linkere. CPS-værdier fra tabel 1 blev omarrangeret, idet middelværdierne for duplikataflæsninger af CPS blev beregnet, og ubrugte værdier for linkere 4-7 blev slettet. Værdierne af den interne standard høj positiv, lav positiv og negativ kontrol af hvert autoantistofassay er markeret med mørk fed. PC, positiv kontrol. NC, negativ kontrol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Resultater af indeksværdier. Indeksværdierne for hver prøve for alle seks antistoffer blev beregnet i forhold til de tilsvarende positive og negative kontroller. En indeksværdi, der var større end afskæringsværdien, blev defineret som positiv, markeret med fed skrift. De dårlige duplikerede CPS-værdier i tabel 1, række D-linker 3-kolonne 5 og 6, førte til en positiv IA-2A-indeksværdi for prøve 11 (fremhævet med gråt), hvilket sandsynligvis var et falsk-positivt resultat. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 4: Assay cutoff, følsomhed og specificitet for GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA og TGA blandt 880 ASK-prøver, herunder 325 IAbs-positive prøver og 555 alle antistoffer negative prøver. Den optimale cutoff-indeksværdi for GADA-, IA-2A-, ZnT8A-, IAA- og TGA-assay blev sat til mindst den 99. percentil af de 555 normale kontrolprøver. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Interventionen for T1D er gået ind i præ-T1D-æraen, med igangværende nationale og internationale store screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske forsøg, der anvendes i fase 1 T1D for at ophæve eller bremse progressionen til klinisk T1D12,13. Målinger af fire IAbs ved hjælp af den nuværende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er besværligt og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende efterspørgsel efter et multiplekset IAbs-assay med høj kapacitet er multiplekset ECL-assay, 3-Screen ICA ELISA og antistofdetektion ved agglutinations-PCR (ADAP) opstået som aktuelt konkurrencedygtige teknologier. I Fr1da-undersøgelsen af screening for T1D i en population af små børn i Tyskland blev 3-Screen ICA ELISA, der kombinerede 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) anvendt som hovedtest14. En stor begrænsning af 3-skærms ICA ELISA er manglen på IAA, som for det meste er den første IAb, der vises med en høj forekomst hos små børn med T1D. Desuden er analysen ikke i stand til at skelne mellem, hvilken af de tre IAbs der er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve skal gentages med tre enkeltassays til bekræftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerede høj analysefølsomhed og specificitet i IASP-workshoppen, men mangler data om, hvor forudsigelig den er i populationsbaseret screening for T1D-undersøgelser, som IASP-værkstedet ikke er i stand til at bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne undersøgelse er bygget på platformen for et enkelt ECL-assay, der er valideret mod den nuværende standard RBA i flere kliniske forsøg som TrailNet9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Det foreliggende assay er blevet valideret mod både RBA og enkelt ECL-assay ved hjælp af 880 serumprøver fra deltagere i ASK-undersøgelsen. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistofniveauer mellem 6-Plex og enkelt ECL eller mellem 6-Plex og RBA for det meste kongruente med hinanden for antistoffernes positivitet. Sammenfaldsraterne for IAbs testet af RBA og 6-Plex var 91,7%-97,8%, og sammenfaldsraterne for IAbs testet med enkelt ECL og 6-Plex var 95,3%-99,2%. Uoverensstemmelse mellem ECL-analysen og RBA var hovedsageligt fra dem med enkelt IAb. Niveauerne af IAbs testet af 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korreleret. TGA testet ved 6-Plex-assay var stærkt korreleret med resultaterne af både RBA (99,4%) og enkelt ECL-assay (99,4%). Derudover nåede COVID-19A testet af 6-Plex 99.8% overholdelse af resultaterne af det enkelte ECL-assay.

Som følge heraf er 6-Plex ECL-analysen formelt blevet accepteret som den primære screeningsmetode for den igangværende ASK-undersøgelse og erstattet standard RBA22. Dette assay demonstrerede dets fremragende følsomhed og specificitet med højere gennemstrømning, lavere omkostninger og mindre volumen serum sammenlignet med standard RBA.

Det er dokumenteret, at i T1D-screeningsstudiet var enkelt IAb påvist af RBA, som optog en stor del af IAb-positiviteterne, af lav affinitet, med lav sygdomsrisiko og resulterede i en samlet lav prædiktiv værdi 19,21,23,24,25,26. En sådan forudsigelse med lav risiko medførte enorme ekstraomkostninger ved opfølgende besøg og resulterede i vanskeligheder for forebyggende T1D-undersøgelser. Den etablerede ECL-analyseplatform er blevet demonstreret i flere kliniske forsøg for at diskriminere IAb'er med høj affinitet fra IAb'er med lav affinitet genereret af RBA og signifikant forbedre de forudsigelige værdier for alle fire IAb'er, især med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien blev bygget på platformen for det enkelte ECL-assay med denne tydelige fordel ved påvisning af abs-abs med høj affinitet. I denne undersøgelse illustrerede 6-Plex ECL-analysen sin lighed med de tilsvarende enkelte ECL-assays i følsomhed og specificitet.

Nogle begrænsninger og de tekniske problemer ved multiplex ECL-analysen ved hjælp af flere Plex-plader er allerede blevet dækket i tidligere publikationer27,28. Med seks mærkede antigener i en brønd kan der være nogle påvirkninger mellem forskellige antigener, og analysebaggrunden kan øges, når der tilføjes hvert antistofassay til multiplexing i samme brønd. En stor mængde analyseoptimeringsarbejde er nødvendigt for at justere analysebetingelserne, især for at justere de endelige koncentrationer af hvert mærket antigenprotein baseret på skakbrætassayet for hvert antigen for at opretholde følsomheden og specificiteten for hvert antistofassay. Som nævnt i tidligere undersøgelser27,28 resulterer et lille antal prøver (<1%) i falsk positivitet på multipel Plex-pladen uden en klar underliggende årsag. Alle positive resultater bør gentages og bekræftes ved et enkelt ECL-assay som rutinemæssig kvalitetssikring af laboratorier; Normalt fjernes de falske positiver. Falsk-negative resultater forårsaget af "prozoneeffekten" observeret i det tidligere 7-Plex ECL-assay27,28 blev ikke observeret i denne undersøgelse. I analysen beskrevet her fjernede vi trinnet med syrebehandling af serumprøver fra den tidligere protokol; I stedet forvarmede vi serumprøverne ved 56 °C i 30 minutter (trin 5.1.). På den anden dag med pladevask brugte vi en vaskebuffer indeholdende 0,4 M NaCl (trin 8.1.) i stedet for almindelig vaskebuffer til at vaske pladen strengere. Disse ændringer gjorde multiplex ECL-analysen enklere og lavere baggrund uden at miste analysefølsomheden.

Afslutningsvis har dette assay fremragende ydeevne til påvisning af fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidigt. Multiplexing-funktionen såvel som det høje gennemløb, lave omkostninger og små serumvolumenkrav gør storskala screening for T1D og samtidige sygdomme meget mere gennemførlig i den generelle befolkning. Patienter med T1D eller autoimmune sygdomme har en meget højere risiko for andre autoimmune sygdomme. Multiplex ECL-analysen giver en fremragende platform til at screene for T1D og flere autoimmune sygdomme samtidigt.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Undersøgelsen blev støttet af JDRF-tilskud 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-tilskud DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) tilskud P30 DK116073.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mM NaCl ThermoFisher 1070832
96-well Plate Shaker VWR 12620-926
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Biotin ThermoFisher PI21329
Blocker A MSD R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units Fisher 0974064A
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
GAD65 protein Diamyd Medical 10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979) Creative BioMart 283309
MESO QuickPlex SQ120 MSD R31QQ-3 Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x ThermoFisher 70011044
PBS 1x ThermoFisher 10010023
Proinsulin protein AmideBio 20160118B3
Read buffer B MSD Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein Creative Biomart Spike-190V
Stop Solution MSD Y0090019
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
tTG protein Diarect AG 15201
Tween 20 Sigma P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate MSD Z00U0142E 6-plex plate
U-PLEX Linker 1 MSD L0010022
U-PLEX Linker 10 MSD L0100020
U-PLEX Linker 2 MSD L0020015
U-PLEX Linker 3 MSD L0030018
U-PLEX Linker 8 MSD L0080018
U-PLEX Linker 9 MSD L0090014
ZeBa Column ThermoFisher 89892 Spin columns
ZnT8 protein Research Laboratory n/a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. Jaime, G., Deville, E. S., Ouellette, C. P. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021).
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, Supplement 1 158 (2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).

Tags

Immunologi og infektion udgave 185 Elektrokemiluminescensassay multiplex autoantistofassay type 1-diabetes autoimmun sygdom COVID-19 screening forudsigelse
En multiplexed screening med høj kapacitet for type 1-diabetes, cøliaki og COVID-19
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang,… More

Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang, C., Rewers, M., Yu, L. A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19. J. Vis. Exp. (185), e63787, doi:10.3791/63787 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter