Summary
Os neurônios nociceptores e as células NK interagem ativamente em um contexto inflamatório. Uma abordagem de co-cultura permite estudar essa interação.
Abstract
Os neurônios somatossensoriais evoluíram para detectar estímulos nocivos e ativar reflexos defensivos. Ao compartilhar meios de comunicação, os neurônios nociceptores também ajustam as defesas do hospedeiro, controlando a atividade do sistema imunológico. A comunicação entre esses sistemas é principalmente adaptativa, ajudando a proteger a homeostase, também pode levar a, ou promover, o aparecimento de doenças crônicas. Ambos os sistemas co-evoluíram para permitir essa interação local, como encontrado nos tecidos linfoides primários e secundários e na mucosa. Estudos recentes demonstraram que os nociceptores detectam e respondem diretamente a antígenos estranhos, citocinas derivadas de células imunes e micróbios.
A ativação do nociceptor não só resulta em hipersensibilidade à dor e coceira, mas reduz o limiar de disparo do nociceptor, levando à liberação local de neuropeptídeos. Os peptídeos que são produzidos e liberados a partir dos terminais periféricos dos nociceptores podem bloquear a quimiotaxia e a polarização dos linfócitos, controlando a localização, a duração e o tipo de inflamação. Evidências recentes mostram que os neurônios sensoriais interagem com células imunes inatas através do contato célula-célula, por exemplo, envolvendo receptores de grupo 2D (NKG2D) em células natural killer (NK).
Dado que as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores, é concebível que os nociceptores usem neuropeptídeos para controlar a atividade das células NK. Aqui, elaboramos um método de co-cultura para estudar as interações entre o neurônio nociceptor e as células NK em um prato. Usando essa abordagem, descobrimos que os neurônios nociceptores lombares diminuem a expressão de citocinas de células NK. No geral, esse método reducionista poderia ser útil para estudar como os neurônios inervantes de tumores controlam a função anticancerígena das células NK e como as células NK controlam a eliminação de neurônios lesionados.
Introduction
Os corpos celulares dos neurônios sensoriais se originam nos gânglios da raiz dorsal (DRG). Os DRG estão localizados no sistema nervoso periférico (SNP), entre o corno dorsal da medula espinhal e os terminais nervosos periféricos. A natureza pseudo-unipolar dos neurônios DRG permite a transferência de informações do ramo periférico, que inerva o tecido alvo, para o ramo central, que transporta a informação somatossensorial para a medula espinhal1. Usando receptores de canais iônicos especializados, os neurônios de primeira ordem detectam ameaças representadas por patógenos, alérgenos e poluentes2, levando ao influxo de cátions (Na+, Ca2+) e à geração de um potencial de ação 3,4,5.
Esses neurônios também enviam potencial de ação antidrômica para a periferia, onde ocorreu a detecção inicial de perigo, o que leva à liberação local de neuropeptídeos 1,4. Portanto, os neurônios nociceptores servem como mecanismo de proteção, alertando o hospedeiro para o perigo ambiental 4,5,6,7.
Para se comunicar com neurônios de segunda ordem, os nociceptores liberam vários neurotransmissores (por exemplo, glutamato) e neuropeptídeos (por exemplo, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), substância P (SP) e peptídeo intestinal vasoativo (VIP)))6,7. Esses peptídeos atuam sobre os capilares e promovem extravasamento plasmático, edema e influxo e modulação locais de células imunes 2,4,7.
Os sistemas somatossensorial e imunológico utilizam um sistema de comunicação compartilhado composto por citocinas e neuropeptídeos, e seus respectivos receptores cognatos4. Embora essa comunicação bidirecional ajude a proteger do perigo e preservar a homeostase, também pode contribuir para a fisiopatologia da doença4.
As células NK são classificadas como células linfoides inatas e são especializadas para eliminar células infectadas por vírus. A função das células NK é governada por um equilíbrio de receptores estimulatórios e inibitórios, incluindo o receptor ativador NKG2D8. O ligante endógeno do NKG2D, ácido retinóico induzível precoce1 (RAE1), é expresso por células submetidas a estresse, como tumorigênese e infecção 8,9.
Investigações recentes mostraram que a lesão do nervo periférico leva os neurônios sensoriais a expressar moléculas desadaptativas, como a estatina 2 (STMN2) e a RAE1. Assim, através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram ativadas pela interação com neurônios que expressam RAE1. Por sua vez, as células NK foram capazes de eliminar neurônios nociceptores lesados e hipersensibilidade à dor contusa normalmente associada à lesão nervosa10. Além do eixo NKG2D-RAE1, as células NK expressam os receptores cognatos para vários mediadores produzidos por nociceptores. Portanto, é possível que esses mediadores modulem a atividade das células NK. Este trabalho apresenta um método de co-cultura para investigar a biologia da interação nociceptor neurônio-célula NK. Essa abordagem ajudará a avançar a compreensão de como os neurônios nociceptores modulam as respostas inatas das células imunes a lesões, infecções ou malignidades.
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Protocol
Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Université de Montréal (#22053, #22054) aprovaram todos os procedimentos para animais. Consulte a Tabela 1 para uma lista de soluções e sua composição e a Tabela de Materiais para uma lista de materiais, equipamentos e reagentes usados neste protocolo.
1. Isolamento, cultura e estimulação de células NK
- Gerar neurônio nociceptor intacto (controle de companheiro de ninhada; TRPV1wt::D TA fl/wt) e camundongos ablados (TRPV1 cre::D TA fl/wt) cruzando camundongos com toxina lox-stop-lox-diphtheria (DTA fl/fl) com camundongos TRPV1cre/wt.
- Usando a inalação de CO2, eutanasie um rato ingênuo de controle de companheiro de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt).
- Recolher o baço num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 500 μL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
- Homogeneize o baço usando um pilão.
- Diluir as células com 1 mL de PBS estéril.
- Filtrar a mistura através de um filtro de células de 50 μm para um tubo cónico de 15 ml.
- Aumente o volume (10 mL) com PBS estéril.
- Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
- Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células a uma concentração de 108 células/ml em meio RPMI 1640 suplementado.
- Siga as instruções do fabricante para purificar magneticamente as células NK do baço usando um kit de isolamento de células NK de camundongo. Confirmar a pureza das células NK usando citometria de fluxo11.
- Colete 10 μL e conte as células usando um hemocitômetro.
- Centrifugar as células (500 × g, 5 min) e remover o sobrenadante.
- Ressuspender as células NK em meio de cultura RPMI 1640 suplementado (contendo IL-2 e IL-15).
- Cultura 2 × 106 células NK/mL em uma placa de fundo U de 96 poços por 48 h.
2. Isolamento e cultura de neurônios DRG
- Às 24 h antes do final da estimulação com células NK (etapa 1.15), revestir uma placa de 96 poços com 100 μL/poço de laminina (1 ng/mL) e incubar por 45 min (37 °C).
- Após a incubação, remova a solução e deixe os poços secarem ao ar em um armário de biossegurança.
- Usando a inalação de CO2, eutanasiar o neurônio nociceptor intacto (controle do companheiro de ninhada; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt).
NOTA: A inalação de CO2 é preferível à luxação cervical, pois evita interromper os nervos espinhais conectados ao DRG. - Prenda o rato na prancha em posição prona, levante a pele e incite a pele ao longo da coluna dorsal. Consulte Perner et al. para um vídeo detalhado12.
- Corte a articulação lombossacra e separe o sacro da coluna lombar com uma tesoura.
- Separe a coluna cortando os músculos e costelas em ambos os lados da coluna vertebral na direção craniana até que a base do crânio seja atingida.
- Usando uma tesoura, corte a coluna vertebral na articulação atlanto-occipital.
- Remova o músculo e o tecido adiposo da coluna vertebral.
- Prenda e abra a coluna vertebral para remover a medula espinhal e obter acesso ao DRG. Procure o DRG nos forames intervertebrais conectados à medula espinhal através da raiz dorsal, mas separados das meninges.
- Colha os DRGs em um tubo cônico de 15 mL preenchido com 10 mL de DMEM suplementado gelado.
- Centrifugar a preparação (200 × g, 5 min, temperatura ambiente) e remover o sobrenadante.
- Adicionar 250 μL de PBS contendo colagenase IV (1 mg/mL) e Dispase II (2,4 U/mL).
- Incubar o DRG com solução de colagenase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, agitação ligeira). Ao agrupar gânglios de vários camundongos, mantenha uma proporção de 125 μL de solução C/D por gânglio.
- Para inativar as enzimas, adicione 5 mL de meio DMEM suplementado.
- Centrifugar a solução (200 × g, 5 min) e remover suavemente o sobrenadante utilizando uma pipeta.
- Para evitar a perda de células indesejadas, deixe ~ 100 μL do sobrenadante.
- Adicione 1 mL de meio DMEM suplementado.
- Usando uma pistola de pipeta e três pipetas Pasteur de vidro de tamanhos decrescentes, triturate suavemente (~ 10 para cima / para baixo por tamanho de pipeta Pasteur) o DRG em uma preparação de célula única.
- Em um gabinete de biossegurança, diluir a albumina sérica bovina (BSA) em PBS estéril até uma concentração final de 15%. Armazenar alíquotas de 1 ml a -20 °C.
- Crie um gradiente de BSA em um tubo cônico de 15 mL adicionando 2 mL de PBS estéril e dispensando lentamente 1 mL de solução de BSA a 15% na parte inferior do tubo. Evite interromper o gradiente removendo suavemente a pipeta.
- Usando uma pipeta P200, pipete lentamente a suspensão triturada dos gânglios (que contém os neurônios) para o lado do tubo no gradiente.
- Centrifugar o gradiente de BSA contendo neurônios (200 × g, 12 min, temperatura ambiente). Ajuste a aceleração e a desaceleração da centrífuga para a velocidade mínima.
NOTA: Após a centrifugação, os neurônios estarão na parte inferior do tubo, enquanto os detritos celulares ficarão presos no gradiente BSA. - Remova suavemente todo o sobrenadante usando uma pipeta.
- Ressuspender as células em 500 μL de Neurobasal.
- Placa 104 neurônios por poço (200 μL de neurobasal/poço) em uma placa de 96 poços revestida de laminina e fundo plano.
NOTA: Em média, um investigador será capaz de preencher ~ 8 poços por mouse. - Cultura dos neurônios (37 °C, durante a noite) para permitir a fixação.
3. Co-cultura e citometria de fluxo
- Remova lentamente o neurobasal da cultura de neurônios.
- Após 48 h de estimulação com IL-2 e IL-15 (ver passos 1.14-1.15), ressussuscite as células NK e adicione 105 células NK/poço à cultura de neurónios (placa inferior plana de 96 poços).
NOTA: Em média, o investigador será capaz de preencher ~ 6 poços por mouse. - Co-cultura das células em MX neurobasal suplementado (37 °C, 48 h).
- Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Descarte o sobrenadante e manche as células com o Corante de Viabilidade eFlour-780 (1:1.000, 15 min, 4 °C).
- Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Bloquear locais inespecíficos nas células com CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).
- Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Coloração (15 min, 4 °C) das células com BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-NKp46 (1:100) e ficoeritrina (PE) anti-GM-CSF (1:100).
- Recolher as células, lavar com PBS (3x) e centrifugar (500 × g, 5 min, 4 °C).
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em tampão FACS (500 μL) e imunofenótipo as células NK por citometria de fluxo11. Consulte a Figura 1A para ver a estratégia de bloqueio.
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Representative Results
As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou ratos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu veículo. Após 24 h de cocultura, as células NK foram purificadas por FACS e seus níveis de ativação foram imunofenotipados por citometria de fluxo (Figura 1A).
Quando cultivadas isoladamente, as células NK expressaram níveis basais de GM-CSF e NKp46. Quando co-cultivado com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptor intacto (TRPV1 wt::D TAfl/wt), a estimulação com capsaicina diminuiu a expressão das células NK do GM-CSF. A capsaicina não teve impacto na ativação das células NK quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptores ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt) (Figura 1A,B). Vale ressaltar que a ablação celular mediada por TRPV1cre utilizando a toxina diftérica A (DTA) eliminará todos os neurônios TRPV1+, peptidérgicos e não peptidérgicos (células MrgD+)13,14.
Figura 1: Os neurônios TRPV1+ controlam a ativação das células NK. As células NK foram purificadas magneticamente a partir de esplenócitos de camundongos controle de ninhada (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e estimuladas (48 h) com IL-2 e IL-15. As células NK foram então cultivadas isoladamente ou co-cultivadas com neurônios DRG colhidos do neurônio nociceptor intacto (controle littermate; TRPV1wt: :D TA fl/wt) ou camundongos ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt). As células foram então expostas ao agonista TRPV1 capsaicina (1 μM) ou seu veículo. Após 24 h de cocultura, as células NK foram purificadas por FACS e seus níveis de ativação foram imunofenotipados por citometria de fluxo (A). Quando cultivadas isoladamente, as células NK expressaram níveis basais de GM-CSF e NKp46. A expressão de GM-CSF diminuiu quando as células NK foram co-cultivadas com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptores intactos (TRPV1 wt::D TAfl/wt) e estimulados com capsaicina (A,B). Os níveis de NKp46 não foram afetados (A,B). A capsaicina não teve impacto na ativação das células NK quando co-cultivada com neurônios DRG colhidos de camundongos nociceptores ablados (TRPV1cre::D TAfl/wt) (A,B). O gráfico FACS representativo é mostrado (A). Os dados são apresentados como média ± S.E.M (B). O experimento foi repetido três vezes e conclusões semelhantes foram obtidas. O número de animais testados é indicado; n = 5 replicações biológicas/grupo (B). Os valores de p são mostrados na figura e determinados por ANOVA one-way post-hoc Bonferroni (B). Abreviaturas: TRPV1 = receptor receptor potencial do canal catiônico subfamília V membro 1; NK = assassino natural; DTA = toxina diftérica A; DRG = gânglio da raiz dorsal; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; GM-CSF = fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos; Veh = veículo; Cap = capsaicina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Solução | Composição | ||
| Colagenase/Dispase (C/D) | PBS estéril suplementado com colagenase (1 mg/mL) e Dispase II (2,4 U/mL) | ||
| DMEM | DMEM estéril suplementado com FBS (10%), penicilina (100 UI) e estreptomicina (100 μg/mL) | ||
| RPMI 1640 suplementado | RMPI 1640 estéril suplementado com penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/mL), soro fetal bovino (10%), L-glutamina (300 ng/mL), IL-2 recombinante de camundongo (200 U/mL) e IL-15 recombinante de camundongo (10 ng/mL) | ||
| Neurobasal | Neurobasal estéril suplementado com penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/mL) e GDNF (2 ng/mL) | ||
| Neurobasal MX | Neurobasal estéril suplementado com penicilina (100 UI), estreptomicina (100 μg/mL), L-glutamina (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng/mL), GDNF (2 ng/mL), IL-2 recombinante de camundongo (200 U/mL) e IL-15 recombinante de camundongo (10 ng/mL) | ||
| Buffer de classificação FACS | PBS estéril suplementado com FBS (2%) e EDTA (1 mM) | ||
Tabela 1: Lista de soluções e mídias utilizadas neste protocolo. Abreviaturas: NGF = fator de crescimento nervoso; GDNF = fator neurotrófico derivado de células gliais; FBS = soro fetal bovino; PBS = solução salina tamponada com fosfato.
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Discussion
Davies et al.11 encontraram que os neurônios lesados regulam positivamente a RAE1. Através do contato célula-célula, as células NK que expressam NKG2D foram então capazes de identificar e eliminar neurônios RAE1+ , que por sua vez limitam a dor crônica11. Dado que as células NK também expressam vários receptores neuropeptídicos, e que esses neuropeptídeos são conhecidos por suas capacidades imunomoduladoras, parece cada vez mais importante estudar a interação entre as células NK e os neurônios nociceptores in vitro. Aqui, desenvolvemos um protocolo simples de co-cultura que permite aos investigadores estudar como os neurônios controlam a função das células NK e, reciprocamente, como as células NK podem modular a função dos neurônios DRG. A citometria de fluxo foi usada para imunofenótipo como os neurônios modulam a ativação das células NK. Alternativamente, os pesquisadores poderiam usar qPCR ou sequenciamento de RNA para medir as alterações do transcrito em células purificadas por FACS ou analisar a secreção de fatores secretados, como citocinas ou neuropeptídeos, usando ELISAs. Os dados brutos são depositados e disponibilizados gratuitamente em www.talbotlab.com.
Aqui descobrimos que os neurônios nociceptores TRPV1+ , secundários à ação da capsaicina, bloqueiam a ativação das células NK (expressão GM-CSF). Embora a capsaicina usada em alta concentração possa prejudicar as funções das células NK14, descartamos essa possibilidade experimentalmente, pois a atividade das células NK não foi afetada pela exposição à capsaicina (1 μM) na ausência de neurônios peptidérgicos (TRPV1cre::D TAfl/wt). Como a capsaicina leva ao influxo de cálcio e sua subsequente liberação em neuropeptídeos, esses dados sugerem que a ativação das células NK é, portanto, provavelmente secundária à ação de fatores solúveis sendo liberados pelos neurônios. Portanto, tal abordagem de co-cultura foi útil para estudar como a liberação de neuropeptídeos pode modular a função das células NK. Além dos fatores solúveis, as interações célula-célula local entre os dois tipos de células também tendem a modular suas funções, algo que deve ser testado experimentalmente (por exemplo, comparando o impacto do meio condicionado com o da cocultura).
No geral, tal interação sugere que, dentro do microambiente tecidual, a função das células NK é provavelmente sintonizada pelos terminais dos neurônios nociceptores. Esses dados enfatizam a importância de avaliar as respostas inflamatórias de forma holística, estudando simultaneamente o papel dos neurônios e das células imunes inatas (ou seja, as células NK). Por exemplo, o crosstalk célula-neurônio NK provavelmente desempenha um papel biológico importante em contextos que vão desde lesão nervosa, lesão tecidual, infecção bacteriana ou viral até malignidades. Trabalhos futuros, incluindo o uso deste método de cocultura, são necessários para avaliar o impacto da interação neurônio-célula NK na saúde e na doença.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo The New Frontiers in Research Fund (NFRFE201901326), pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (162211, 461274, 461275), pela Fundação Canadense para a Inovação (37439), pelo programa Canada Research Chair (950-231859), pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (RGPIN-2019-06824) e pelo Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
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