Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden farklılaşan genetik olarak eşleşen epitel ve vasküler endotel hücrelerini entegre ederek böbrek glomerüler filtrasyon bariyerinin yapısını ve işlevini özetleyen kişiselleştirilmiş bir çip üzerinde organ sistemi tasarlamak için bir protokol sunulmaktadır. Bu biyomühendislik sistemi, böbrek hassas tıbbını ve ilgili uygulamaları ilerletebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Üretilen İzojenik Böbrek Glomerulus Çipi
Bu makalede
Özet
Özet
Kronik böbrek hastalığı (KBH), ABD yetişkin nüfusunun% 15'ini etkilemektedir, ancak hedefe yönelik tedavilerin kurulması, insan biyolojik yanıtlarını ve nefrotoksisiteyi doğru bir şekilde tahmin edebilen fonksiyonel modellerin eksikliği ile sınırlandırılmıştır. Böbrek hassas tıbbındaki gelişmeler bu sınırlamaların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, daha önce kurulmuş olan insan böbrek glomerulusunun in vitro modelleri - kan filtrasyonu için birincil bölge ve birçok hastalık ve ilaç toksisitesinin kilit bir hedefi - tipik olarak sınırlı fonksiyonel özelliklere ve eşsiz genetik geçmişlere sahip heterojen hücre popülasyonlarını kullanır. Bu özellikler, hastaya özgü hastalık modellemesi ve terapötik keşif için uygulamalarını önemli ölçüde sınırlar.
Bu yazıda, izojenik ve vaskülarize mikroakışkan böbrek glomerulus çipi mühendisliği için tek bir hastadan insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücre kaynaklı glomerüler epitel (podositler) ve vasküler endoteli entegre eden bir protokol sunulmaktadır. Ortaya çıkan glomerulus çipi, soya özgü belirteçleri eksprese eden, bazal membran proteinleri üreten ve böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerine benzeyen bir doku-doku arayüzü oluşturan kök hücre kaynaklı endotel ve epitel hücre katmanlarından oluşur. Tasarlanmış glomerulus çipi, molekülleri seçici olarak filtreler ve ilaca bağlı böbrek hasarını özetler. İzojenik hücre tiplerini kullanarak böbrek glomerulusunun yapısını ve işlevini yeniden oluşturma yeteneği, böbrek hastalığını hastaya özgüllükle modelleme ve böbrek hassas tıbbı ve ilgili uygulamalar için çip üzerindeki organların faydasını geliştirme fırsatı yaratır.
Giriş
Çip üzerinde organ cihazları, belirli organların yapısını ve işlevini modelleyen doku-doku arayüzleri oluşturmak için moleküler ve mekanik stimülasyonun yanı sıra vaskülarizasyon kullanan dinamik 3D in vitro modellerdir. Böbreğin glomerulusunu (glomerulus çipleri) özetlemeyi amaçlayan daha önce kurulmuş çip üzerinde organ cihazları, hayvan hücre hatları1 veya heterojen kaynakların insan birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından oluşuyordu 2,3. Genetik olarak heterojen hücre kaynaklarının kullanımı, hastaya özgü yanıtlar ve hastalığın genetiği veya mekanizmaları üzerine y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bodrum membran matris çözeltileri ve kaplamalı substratlar hazırlayın
- Bodrum membran matrisi 1'i 4 °C'de buz üzerinde gece boyunca çözün. Aliquot, seyreltme oranı için üreticinin önerisine göre. 50 mL'lik bir konik tüp ve pipet kullanarak, tamamen çözülene ve çözülene kadar uygun miktarda bazal membran matrisi 1'i 25 mL soğuk DMEM/F12'ye iyice karıştırın.
- Dondurulmuş bir aliquot'u çözmek için, 25 mL'lik soğuk DMEM / F12'den ~ 200 μL alın ve dondurulmuş aliquot tüpüne aktarın. Matris iyice çözülene ve çözülene kadar pipeti yukarı ve aşağı doğru çekin. Bodrum membranı matrisi 1'in tüm tüp içeriğini soğuk DMEM/F12'nin geri kalanına a....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, glomerulusun fonksiyonel bir 3D in vitro modelinin, izojenik bir insan iPS hücresi kaynağından vaskülarize edilebileceğini ve epitelize edilebileceğini gösteriyoruz. Spesifik olarak, bu protokol, insan iPS hücre teknolojisinin, özellikle de özel hücre tiplerine farklılaşma yeteneklerinin, insan böbreğinin yapısını ve işlevini hastaya özgü düzeyde modellemek için mikroakışkan cihazlarla entegre edilebilen böbrek glomerüler epiteli (podositler) ve vasküler endotel (viECs) üretmek için nasıl uygulanacağına .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu yazıda, izojenik bir insan iPS hücre hattından vasküler endotel ve glomerüler epitel (podositler) elde etmek için bir protokol ve bu hücrelerin böbrek glomerulusunun yapısını, doku-doku arayüzünü ve moleküler filtrasyon fonksiyonunu taklit eden bir çip üzerinde 3D organ sistemi oluşturmak için kullanımını özetlemekteyiz. Bu glomerulus çipi, birlikte seçici filtre moleküllerine bir bariyer sağlayan endotel ve glomerüler epitel ile donatılmıştır.
Bu protokolü uyarlamak isteyen araştırmacılar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
SM, insan iPS hücrelerinden podosit farklılaşması ile ilgili bir patent üzerinde mucittir. Diğer yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Duke Üniversitesi'ndeki Pratt Mühendislik Okulu, Duke Tıp Bölümü'ndeki Nefroloji Bölümü, Biyomedikal Araştırmalarda Whitehead Bursu ve S. Musah için Genentech Araştırma Ödülü tarafından desteklenmiştir. Y. Roye, Duke Üniversitesi-Alfred P. Sloan Vakfı Bursu ve Duke Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nden William M. "Monty" Reichert Yüksek Lisans Bursu'na sahiptir. DU11 (Duke Üniversitesi klon #11) iPS hücre hattı, Duke iPSC Çekirdek Tesisi'nde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Yazarlar N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya ve Y. Zhou'ya teknik yardım ve yararlı tartışmalar için teşekkür eder. Yaza....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Antikorlar< / güçlü > | |||
| Alexa Fluor 488- ve Alexa Fluor 594 konjuge ikincil antikorlar | Thermo / Life Technologies | A32744; A32754; A-11076; A32790; A21203; A11015 | |
| Kollajen IV | Termo / Yaşam Teknolojileri | 14-9871-82 | |
| Nefrin | Progen | GP-N2 | |
| PECAM-1 | R& D Sistemleri | AF806 | |
| Podocin | Abcam | ab50339 | |
| VE-Cadherin | Santa Cruz | sc-9989 | |
| bazal membran matrisleri | |||
| Corning Fibronektin, İnsan | Corning | 356008 | Bazal membran (3) |
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) parçası | Iwai Kuzey Amerika | N8922012 | Bazal membran matrisi (2) |
| Matrigel hESC onaylı matris, 5 mL'lik flakon | BD Biosciences | 354277 | Bazal membran matrisi (1); partiden partiye varyasyon gösterebilir |
| Hücreler | |||
| DU11 insan iPS hücreleri | DU11 (Duke Üniversitesi klonu # 11) iPS hücre hattı, Duke iPSC Çekirdek Tesisinde üretildi ve bize Duke Üniversitesi'ndeki Bursac Laboratuvarı tarafından sağlandı. Hat test edildi ve mikoplazma (Kasım 2021'deki son test) ve karyotip anormallikleri (Temmuz 2019) | ||
| Kültür ortamı büyüme faktörleri ve ortam takviyeleri | |||
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrojen | 15575020 | |
| 2-Merkaptoetanol | Termo/Yaşam Teknolojileri | 21985023 | |
| Sığır serumundan Albümin, Texas Red konjuge | Thermo / Life Technologies | A23017 | |
| All-trans retinoik asit (500 mg) | Kök Hücre Teknolojileri | 72262 | |
| B27 serumsuz takviye | Thermo / Life Technologies | 17504044 | |
| A Vitamini içermeyen B-27 takviyesi (50x) | Thermo / Life Technologies | 12587010 | |
| Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Partiden partiye değişiklik gösterebilir |
| CultureBoost-R | Hücre Sistemleri | 4Z0-500-R | Podosit bakım ortamı |
| DMEM/F12 | Termo/Yaşam Teknolojileri | 12634028 | |
| GlutaMAX takviyeli DMEM/F12 | Termo/Yaşam Teknolojileri | 10565042 | Glutaminli |
| DMEM/F12Forskolin (Adenilil siklaz aktivatörü) | Abcam | ab120058 | |
| GlutaMAX takviyesi | Thermo/Life Technologies | 35050061 | glutamin takviyesi |
| Isı ile inaktive edilmiş FBS | Thermo/Life Technologies | 10082147 | |
| Heparin solüsyonu | Kök Hücre Teknolojileri | 7980 | |
| İnsan Aktivin A | Termo/Yaşam Teknolojileri | PHC9544 | |
| İnsan BMP4 | Preprotech | 120-05ET | |
| İnsan BMP7 | Termo/Yaşam Teknolojileri | PHC9544 | |
| İnsan VEGF | Termo/Yaşam Teknolojileri | PHC9394 | |
| Inulin-FITC | Sigma-Aldrich | F3272 | |
| mTeSR1 orta | Kök Hücre Teknolojileri | 05850 | İnsan iPS hücre kültürü ortamı (CCM). Üreticiye göre 5x takviye ekleyin. İnsan iPS CCM, -20 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir. |
| N-2 Takviyesi (100x) | Termo/Yaşam Teknolojileri | 17502048 | |
| Nörobazal ortam | Termo/Yaşam Teknolojileri | 21103049 | Lateral mezoderm bazal ortam |
| PBS (Fosfat tamponlu salin) | Thermo/Life Technologies | 14190-250 | |
| Penisilin-streptomisin, sıvı (100x) | Thermo/Life Technologies | 15140-163 | |
| KAYA inhibitör (Y27632) | Tocris | 1254 | |
| StemPro-34 SFM | Thermo/Life Technologies | 10639011 | Endotel hücre kültürü ortamı (CCM). Üreticiye göre ek ekleyin. Endotelyal CCM, 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir; C veya -20 derece & derece; 6 aya kadar C. |
| TGF-Beta inhibitörü (SB431542) | Kök Hücre Teknolojileri | 72234 | |
| Enzimler ve diğer reaktifler | |||
| Accutase | Thermo/Life Technologies | A1110501 | Hücre ayırma tamponu |
| Dimetil Sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Etanol çözeltisi, %70 (hacim/hacim), biyoteknoloji sınıfı | VWR | 97065-058 | |
| Paraformaldehit (PFA) | Termo/Yaşam Teknolojileri | 28906 | |
| Steril damıtılmış su | Termo/Yaşam Teknolojileri | 15230162 | |
| Triton X-100 | VWR | 97062-208 | |
| Ekipman | |||
| Tripsin EDTA, %0.05Termo | /Yaşam Teknolojileri | 25300-120 | |
| (Orb) Hub modülü | ORB-HM1'i | taklit et | |
| 100 mm x 15 mm yuvarlak petri kabı | Fisherbrand | FB087579B | |
| 120 x 120 mm kare hücre kültürü kabı | VWR | 688161 | |
| Accuri C6 | BD Biosciences | ||
| Aspirasyonlu pipetler, ayrı ayrı sarılmış | Corning | 29442-462 | |
| Aspirasyon Ünitesi | SP Bel-Art | F19917-0150 | |
| Avanti J-15R Santrifüj | Beckman Coulter | B99516 | |
| Konik santrifüj tüpü, 15 mL | Corning | 352097 | |
| Konik santrifüj tüpü, 50 mL | Corning | 352098 | |
| EVOS M7000 | Thermo/Life Technologies | AMF7000 | Sabit ve lekeli görüntülerin alınması için floresan mikroskop Hücre. |
| Hemositometre | VWR | 100503-092 | |
| Heracell VIOS 160i CO2 inkübatörü | Thermo/Life Technologies | 51030403 | |
| AxioCam 503 kamera ile donatılmış Ters Zeiss Axio | Gözlemcisi Carl Zeiss Mikroskopi | 491916-0001-000 (mikroskop) ; 426558-0000-000(kamera) | |
| Kimberly-Clark nitril eldiven | VWR | 40101-346 | |
| Kimwipes, büyük | VWR | 21905-049 | |
| Leoca SP8 Dik Konfokal Mikroskop | |||
| Medya rezervuarı (POD Taşınabilir Modül) | POD-1'i | edin | |
| Mikroplaka çalkalayıcı | VWR | 12620-926 | |
| Organ çipi | Taklit | S-1 Çip | |
| Organ çipi tutucu | AK-CCR | ||
| P10'u taklit edin hassas bariyerli pipet uçları | Denville Scientific | P1096-FR | |
| P100 bariyerli pipet uçları | Denville Scientific | P1125 | |
| P1000 bariyerli pipet uçları | Denville Scientific | P1121 | |
| P20 bariyerli pipet uçları | Denville Scientific | P1122 | |
| P200 bariyerli pipet uçları | Denville Scientific | P1122 | |
| Plazma Asher | Quorum teknolojisi | K1050X RF | Bu Plazma Aşındırıcı/Asher/Temizleyici, Duke Üniversitesi'nin Paylaşılan Malzeme Enstrümantasyon Tesisi'nin (SMiF) bir parçası olarak kullanıldı. |
| Hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü | Corning | 352235 | |
| Serolojik pipet, 10 mL, ayrı ayrı sarılmış | Corning | 356551 | |
| Serolojik pipet, 25 mL, ayrı ayrı sarılmış | Corning | 356525 | |
| Serolojik pipet, 5 mL, ayrı ayrı sarılmış | Corning | 356543 | |
| Steriflip, 0.22 & mikro; m, PES | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Steril Mikrosantrifüj tüpleri | Thomas Scientific | 1138W14 | |
| T75cm2 havalandırma kapaklı hücre kültürü | şişesi Corning | 430641U | |
| Doku kültürü ile tedavi edilmiş 12 oyuklu plakalar | Corning | 353043 | |
| Vakum modülatörü ve perstaltik pompa (Zoe Kültür Modülü) | ZOE-CM1 | Organ Çipi Biyoreaktörünü | Taklit Edin |
| VE-Cadherin CD144 anti-insan antikoru - APC konjuge | Miltenyi Biotec | 130-126-010 | |
| Geniş eğimli hücre kaldırıcı | Corning | 3008 | |
| MACS | |||
| CD144 MicroBeads, insan | Miltenyi Biotec | 130-097-857 | |
| CD31 Mikro Boncuk Kiti, insan | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| LS sütunları | Miltenyi Biotec | 130-042-401 |
Kaynaklar
- Wang, L., et al. A disease model of diabetic nephropathy in a glomerulus-on-a-chip microdevice. Lab on a Chip. 17 (10), 1749-1760 (2017).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripot....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
