Esaminare l'effetto dei pesticidi sui neuroni caenorhabditis elegans

Summary

I nematodi caenorhabditis elegans giovani adulti sono esposti a diverse concentrazioni di pesticidi commerciali o altre sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, diversi neuroni possono essere visualizzati utilizzando ceppi che esprimono fluorescenza. Questo documento dimostra come esporre i nematodi ai pesticidi e valutare il danno ai neuroni.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un potente organismo modello utilizzato in molti laboratori di ricerca per comprendere le conseguenze dell'esposizione a inquinanti chimici, pesticidi e un'ampia varietà di sostanze tossiche. Questi nematodi sono facili da lavorare e possono essere utilizzati per generare nuovi risultati di ricerca, anche nel laboratorio di biologia universitaria. Una serie di laboratori di più settimane di progetti di ricerca autentici e guidati dagli studenti forma gli studenti in un toolkit di tecniche e approcci in misurazioni comportamentali, biologia cellulare e microscopia che poi applicano ai loro progetti. Una tecnica in quel toolkit è quantificare la percentuale di neuroni che mostrano danni neurodegenerativi a seguito dell'esposizione a un tossico chimico come un pesticida. I nematodi C. elegans giovani adulti possono essere esposti a diverse concentrazioni di pesticidi disponibili in commercio o altri tipi di sostanze tossiche per 2-24 ore. Quindi, gli studenti universitari possono visualizzare diversi sottotipi di neuroni utilizzando ceppi fluorescenti di C. elegans. Queste tecniche non richiedono sofisticati software di elaborazione delle immagini e sono efficaci anche a bassi ingrandimenti, rendendo superflua la necessità di costose microscopie confocali. Questo documento dimostra come trattare i nematodi con pesticidi e come visualizzare e segnare i neuroni. Fornisce inoltre un protocollo semplice per la microscopia e l'analisi della morfologia dei neuroni. I materiali utilizzati per questa tecnica sono economici e prontamente disponibili nella maggior parte dei dipartimenti di biologia universitari. Questa tecnica può essere combinata con misure comportamentali come la locomozione, il rallentamento basale o la deposizione delle uova per condurre una serie di esperimenti potenzialmente pubblicabili e offrire agli studenti universitari un'autentica esperienza di ricerca a un costo molto basso.

Introduction

Caenorhabditis elegans è un eccellente organismo modello per la formazione di corsi di laboratorio in corsi di scienze biologiche per studenti di livello introduttivo e intermedio. Questa procedura di laboratorio può essere utilizzata come parte di un modulo di più settimane che esplora vari effetti dei pesticidi comunemente usati sul comportamento di C. elegans e sulla biologia cellulare. Gli studenti possono imparare come progettare e realizzare progetti indipendenti che insegnano loro l'analisi dei dati e le capacità di presentazione. Questo documento si concentra sui protocolli per esporre C. elegans a miscele di pesticidi e quindi osservare e analizzare gli effetti sulla morfologia dei neuroni.

Le miscele di pesticidi chimici per prato sono ampiamente utilizzate per uso residenziale e agricolo e possono essere acquistate in qualsiasi negozio di giardinaggio locale. C'è una crescente preoccupazione per la sicurezza di queste sostanze chimiche per^l'uomo e la fauna selvatica ^1,2,3. Gli studenti possono leggere la letteratura scientifica e selezionare un pesticida per la valutazione sperimentale e, così facendo, possono conoscere la biologia e la neurobiologia di base, nonché importanti abilità di laboratorio come la progettazione e l'analisi sperimentale e le abilità generali di laboratorio come pipettaggio e diluizioni seriali, microscopia sezionante, microscopia fluorescente, fotografia digitale e produzione di figure.

I protocolli descritti in questo articolo possono stare da soli in un corso di livello intermedio in biologia o neuroscienze o far parte di un modulo di più settimane che potrebbe anche includere misurazioni di comportamenti governati da particolari gruppi di neuroni. Ad esempio, descritta in questo protocollo è una valutazione della morfologia dei neuroni colinergici che governano la locomozione utilizzando un ceppo di nematode che esprime GFP (LX 929) nei neuroni colinergici⁴. Questi ceppi possono essere ottenuti a prezzi molto bassi dal Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). I ceppi che esprimono GFP nei neuroni dopaminergici (OH 7457), nei neuroni colinergici (LX 929) o mCherry espressi in tutti i neuroni (PVX4) sono tutte buone scelte. Gli studenti potrebbero anche misurare la locomozione e ottenere dati per accompagnare la valutazione della morfologia. Una descrizione completa di un progetto di gruppo di studenti di più settimane può essere trovata in Susman⁵.

Questo progetto di gruppo di studenti è abbastanza economico e facile da configurare per gruppi di quattro studenti. I materiali necessari includono un microscopio di dissezione, l'accesso a un microscopio composto a fluorescenza che può avere una fotocamera digitale collegata, piastre di Petri e accesso all'agar di crescita dei nematodi, batteri con crescita limitata (ceppo OP50, dal CGC), un bruciatore Bunsen a fiamma di gas o una lampada ad alcool, un'autoclave, filo di platino e forniture di laboratorio generali come micropipetteri, vetrini per microscopi, coverslips e pipette Pasteur in vetro. A seconda del tossico chimico esaminato dai gruppi di studenti, le fasi del protocollo potrebbero dover verificarsi sotto un cappuccio di fumo o con i guanti. Questo protocollo utilizza miscele chimiche solubili in acqua (non volatili) e vengono seguite tutte le procedure di manipolazione sicura raccomandate dal produttore.

Protocol

Tutto l'uso di animali invertebrati era conforme alle linee guida per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione.

1. Preparazione di piastre di Petri rivestite di pesticidi

1. Preparare le piastre di Petri di agar (6 cm di diametro funzionano meglio) utilizzando le procedure standard⁶.
   NOTA: Questi possono essere fatti con mesi di anticipo e conservati in frigorifero fino all'uso. Portare le piastre a temperatura ambiente (RT) sul banco. Nella maggior parte dei casi, i gruppi di studenti dovrebbero essere dotati di una piastra per ogni diluizione della miscela di pesticidi, incluso un controllo dell'acqua.
2. Preparare 1 mL di ogni diluizione del pesticida scelto in tubi di microfuga da 1,5 mL etichettati. Per una manipolazione sicura, assicurarsi di leggere le istruzioni e fornire guanti, o lavorare in una cappa aspirante, se suggerito.
   NOTA: Diluizioni suggerite per testare: 1 mL di pesticida a piena resistenza, diluizione 1:10 in acqua (100 μL di pesticida, 900 μL di acqua distillata), diluizione 1:100 (10 μL di pesticida, 990 μL di acqua), diluizione 1:1000 (10 μL della diluizione 1:10, 990 μL di acqua), ecc.
3. Fare uno spandiluvitore di soluzioni piegando con cura una pipetta pasteur di vetro (dimensione 9 ml) in una fiamma del bruciatore Bunsen. Utilizzare la fiamma per chiudere l'apertura della pipetta. Quindi sterilizzare l'etanolo dello spargitore prima di ogni diffusione sulla piastra di Petri.
4. Utilizzando un micropipettero, posizionare 100 μL della diluizione (o controllo dell'acqua) sul centro dell'agar e distribuire delicatamente sulla superficie con lo spargitore sterilizzato. Risterilizzare lo spanditore prima di ogni utilizzo.
5. Mettere da parte le piastre di Petri coperte e lasciare che la soluzione si impregni in superficie fino a "asciugare".
   NOTA: a seconda dei livelli di pesticidi e umidità in laboratorio, potrebbe essere necessario del tempo. Gli studenti potrebbero aver bisogno di preparare i loro piatti il giorno prima del periodo di esposizione.
6. Per periodi di esposizione superiori a 12 ore, aggiungere 50 μL di una coltura notturna di Escherichia coli alle piastre prima di aggiungere i nematodi. Per gli esperimenti acuti (12 ore o meno), non è necessario avere E. coli sulle piastre.

2. Aggiunta di nematodi a piastre rivestite di pesticidi

NOTA: Gli studenti dovranno avere una piastra di nematodi adulti (le colture di 5 giorni sono le migliori) del ceppo fluorescente LX929, che è disponibile presso il Caenorhabditis elegans Genetics Center. Ci sono due possibili procedure per questo. Se gli studenti hanno avuto precedenti esperienze di lavoro con i nematodi (ad esempio, se questa procedura fa parte di un esercizio di più settimane e hanno già imparato a raccogliere i nematodi con un worm pick), utilizzare il passaggio 2.1. In caso contrario, utilizzare il passaggio 2.2.

1. Scegli i nematodi con un plettro a verme. Crea un worm pick da un pezzo di filo di platino da 1 in che viene fuso in una pipetta Pasteur usando una fiamma del bruciatore Bunsen. Raccogli un piccolo blob di E. coli appiccicoso sul plettro e poi raccogli i nematodi adulti usando il blob appiccicoso. Per una dimensione del campione decente, scegliere 10 nematodi per ogni piastra di trattamento.
   NOTA: gli studenti senza molta esperienza possono seguire i passaggi 2.2-2.3.
2. Utilizzare una micropipetta per posizionare 1 mL di acqua sterile sulla piastra dei nematodi. Spostare l'acqua per sollevare i nematodi, quindi rimuovere il liquido con i nematodi in un tubo di microfuga da 1,5 ml.
3. Lasciare che i nematodi si depositino per gravità per circa 10 minuti, quindi rimuovere con cura almeno 500 μL di acqua e scartare. Risospese i nematodi e, utilizzando una punta della pipetta gialla tagliata, rimuovere 50-100 μL di vermi sospesi in ciascuna piastra di trattamento. Assicurati che ogni piatto abbia almeno 10 vermi adulti.
4. Impostare un timer, o annotare l'ora, ed esporre i nematodi a RT per il periodo di tempo scelto. Durante il tempo di esposizione scelto, preparare i vetrini del microscopio per i supporti bagnati. Le diapositive devono essere fatte lo stesso giorno della microscopia.
   NOTA: I gruppi di studenti avranno scelto il loro tempo di esposizione durante la pianificazione per il loro studio indipendente.

3. Preparazione di vetrini per microscopi per supporti a umido

NOTA: i passaggi 3.1-3.3 possono essere eseguiti da ciascun gruppo di studenti. Prepara tre diapositive ciascuna.

1. Preparare due diapositive posizionando un pezzo di nastro adesivo su un solo lato della diapositiva (Figura 1, pannello di sinistra). Il nastro viene utilizzato per creare lo spessore corretto per l'agarosio per formare un tampone di spessore uniforme. Quindi posizionare una diapositiva pulita e inutilizzata tra di loro sul piano di lavoro, come illustrato nella figura.
2. Utilizzare un micropipettero per posizionare una goccia di 10 μL di agarosio fuso (3% in ddH₂O, riscaldato con un riscaldatore a blocchi a secco a 65 °C) sul centro della diapositiva che si trova nel mezzo.
3. Appiattire la goccia posizionando un'altra diapositiva pulita in alto, perpendicolare alla diapositiva con la goccia, come mostrato nella figura (Figura 1, pannello di destra). Appiattire applicando pressione, in modo che la goccia di agarosio formi lo spessore del nastro adesivo.
4. L'agarosio si solidificherà entro circa 1 minuto. Quindi, applicare una pressione costante per separare le due diapositive. Il cerchio di agar aderirà a una delle diapositive. Appoggiare questo vetrino, lato agar verso l'alto, sul piano di lavoro, e lasciarlo asciugare per 1-2 minuti prima dell'uso.

4. Montaggio di nematodi vivi su vetrini per microscopi

1. Per aggiungere nematodi al vetrino preparato con il tampone di agarosio, aggiungere una goccia di acqua da 5 μL contenente 1 M di azide di sodio (NaN₃) al tampone di agar. Questa soluzione anestetizza i vermi e li immobilizza.
   ATTENZIONE: La soluzione madre di azide di sodio può causare malattie se ingerita.
2. Quindi trasferire i nematodi (almeno 10 per vetrino di trattamento) alla goccia usando un plettro a verme. Sterilizzare il plettro prima e dopo averlo usato per trasferire i nematodi.
3. Usa una pinza per aggiungere una coverlip posizionandola ad angolo e abbassandola lentamente. Evitare che il coverslip scivoli o si abbassi troppo rapidamente utilizzando una matita o una sonda metallica.
4. Posizionare il supporto a umido preparato su un microscopio fluorescente per osservare i vermi, prima sotto ingrandimento 10x e contrasto di fase, poi sotto ingrandimento 40x con contrasto di fase e illuminazione fluorescente.

5. Microscopia fluorescente

NOTA: I gruppi di studenti dovrebbero fare un montaggio a umido di diversi vermi di ogni tipo su vetrini per microscopio separati, che dovrebbero etichettare in modo appropriato. Le istruzioni che seguono sono suggerimenti generali sull'uso di un microscopio composto a fluorescenza standard che può avere una configurazione trinoculare collegata, una fotocamera digitale e un sistema informatico. La configurazione utilizzata per questo manoscritto è illustrata nella Figura 2. Gli studenti dovrebbero avere familiarità con le impostazioni del microscopio, inclusi gli obiettivi, i tipi di filtri luminosi, la capacità di passare tra campo luminoso e luce fluorescente, come inviare il segnale luminoso alla fotocamera digitale, ecc.

1. Posizionare un supporto a umido preparato alla volta sul palco del microscopio e fissarlo in posizione utilizzando le clip da palcoscenico del microscopio.
2. Inizia a visualizzare i supporti bagnati visualizzando prima con l'obiettivo di ingrandimento più basso, che in genere è 10x, e usa il campo luminoso o il contrasto di fase per visualizzare e concentrarti sui nematodi.
3. Una volta che un nematode si trova nel campo visivo, concentrati su di esso usando la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio. Impostare l'illuminazione sulla fluorescenza ruotando il quadrante. Quindi dirigere la luce verso la fotocamera per acquisire le immagini digitali. Regolare l'illuminazione utilizzando il software di imaging in modo che i neuroni siano illuminati in modo luminoso ma non sovrasaturi.
4. Ad un certo punto, ottenere un'immagine separata di un righello allo stesso ingrandimento delle immagini delle celle per fornire una scala di ingrandimento per la loro figura. Posizionare una breve sezione di un righello trasparente, o un vetrino micrometrico, sul palco del microscopio, concentrarsi su di esso utilizzando la manopola di messa a fuoco fine e ottenere un'immagine utilizzando il software di imaging.
5. Ottenere immagini aggiuntive (da almeno 10 nematodi separati) a ingrandimenti più elevati, se possibile. La luce intensa probabilmente sbiancherà l'area da cui viene ripresa, quindi monitora attentamente l'immagine e non permettere alla luce di rimanere sulla stessa area della diapositiva per lunghi periodi di tempo. Assicurati di nominare le immagini acquisite per tenere traccia del nematode e della regione, nonché del trattamento e dell'ingrandimento.
6. Crea una cartella sul computer e sposta le immagini nella cartella per utilizzarle nell'analisi e nella preparazione delle figure.

6. Scala di valutazione dell'integrità morfologica

NOTA: Una caratteristica citologica chiave del danno neurodegenerativo nei neuroni è un cambiamento nella morfologia del soma. Ci sono tre morfologie che possono essere facilmente visualizzate e contate.

1. Contare i neuroni con processi fluidi e uniformemente fluorescenti e corpi cellulari non rotondi come di consueto, come mostrato nella Figura 3.
2. Spesso il soma diventa arrotondato e dall'aspetto gonfio rispetto ai neuroni sani e giovani. Conta i neuroni che assomigliano a questo come "arrotondati".
3. I neuroni con lunghi processi neurali possono esibire blebbing, dove ci sono puncta arrotondati o addirittura lacune nei processi. Conta i neuroni che mostrano queste caratteristiche come "blebbed".

7. Analisi dei dati e preparazione delle figure

1. Se sono state conteggiate la percentuale di salute (nessun arrotondamento, nessun blebbing) e la percentuale di compromissione (arrotondamento e/o blebbing) per almeno dieci nematodi per ciascun trattamento (Figura 3), eseguire analisi statistiche utilizzando il software statistico disponibile.
2. Conta tutti i neuroni che sono etichettati in modo fluorescente, mantenendo un conteggio di quelli che presentano morfologia normale, morfologia blebbing o morfologia arrotondata, quindi calcola la percentuale di ciascuna morfologia dal conteggio totale per ciascun nematode analizzato.
3. Per preparare le figure, importare le immagini in un software appropriato come Powerpoint e quindi aggiungere etichette e una barra di scala in base all'immagine del righello o del micrometro acquisita.

Representative Results

I metodi e i protocolli descritti in questo documento forniscono importanti competenze di laboratorio per studenti universitari di livello intermedio in biologia o neuroscienze. Gli studenti possono acquisire un'esperienza importante nello sviluppo di un progetto indipendente e condurre un esperimento del proprio design che potrebbe fornire nuovi risultati. La Figura 3 mostra un risultato ottimale di un progetto studentesco che alla fine è diventato parte di un documento pubblicato³. Mentre la maggior parte dei progetti degli studenti non si traduce in risultati pubblicabili, la maggior parte degli studenti è in grado di creare una figura sofisticata e una legenda di figure, e la maggior parte è anche in grado di ottenere conteggi di celle, condurre analisi statistiche e creare una figura o una tabella di dati. Particolari neuroni governano comportamenti specifici. Pertanto, quando questa procedura fa parte di un progetto indipendente di più settimane che include altre misurazioni come saggi di locomozione o chemiotassi, il progetto risultante produce più figure e una presentazione di classe di cui gli studenti possono essere orgogliosi.

I gruppi di studenti possono scegliere il tipo di pesticida che desiderano esplorare. A seconda della loro ricerca bibliografica sul principio attivo del pesticida che hanno selezionato, gli studenti potrebbero valutare diversi neuroni. Poiché tutti i neuroni in C. elegans sono noti e le loro funzioni ben descritte, gli studenti possono scegliere specifici tipi neuronali, come i neuroni della dopamina o i neuroni colinergici, da studiare in un esperimento progettato in modo indipendente. Nell'esempio fornito in questo manoscritto, gli studenti hanno esaminato un pesticida neonicotinoide e si sono concentrati sui neuroni colinergici utilizzando un ceppo fluorescente di nematode che esprime GFP nei neuroni colinergici. Un altro esempio, mostrato nella Figura 4, mostra un risultato più tipico di un gruppo di studenti che ha esaminato gli effetti di un pesticida contenente manganese sui neuroni dopaminergici usando un ceppo in cui i neuroni della dopamina esprimono GFP (OH7457). Questo particolare ceppo mostra un segnale luminoso nei neuroni della dopamina e i neuroni sono stati prontamente visualizzati dagli studenti. Tuttavia, nel tempo, il segnale fluorescente si sbianca se i neuroni sono esposti alla luce per lunghi periodi di tempo, come è accaduto con questo gruppo di studenti.

Se gli studenti del corso hanno avuto pochissima esperienza con la microscopia fluorescente, è una buona idea costruire in una settimana in più per dare agli studenti la possibilità di ripetere il loro esperimento poiché le loro abilità miglioreranno notevolmente con la pratica.

Un aspetto impegnativo per l'istruttore di laboratorio è se ci sono più piccoli gruppi, ognuno dei quali valuta la morfologia di diversi tipi di neuroni. I diversi ceppi fluorescenti non sono costosi da ottenere o mantenere, ma è necessario uno sforzo maggiore per avere a portata di mano numerosi ceppi fluorescenti diversi. Tuttavia, è possibile limitare i tipi di progetti alle tensioni e alle risorse disponibili. I ceppi che funzionano molto bene con gli studenti universitari includono i ceppi LX929 e OH7547. PVX4, che è un mCherry che esprime pan-neuronale, è anche un ceppo molto facile da lavorare con ^7,8.

Figura 1: Diagramma di come preparare i vetrini del microscopio per i supporti a umido di C. elegans. Il pannello di sinistra mostra il posizionamento del nastro adesivo e la goccia di agarosio al 2% -3% (10 μL). Quindi, nel pannello di destra, una seconda diapositiva viene posizionata sopra con un angolo di 90 ° per appiattire la goccia di agarosio allo spessore del nastro. Una volta che l'agarosio si è solidificato, le diapositive vengono accuratamente separate. Il tampone di agarosio aderirà a una delle diapositive. Per evitare l'essiccazione, i nematodi vengono posti in una goccia di tampone contenente azide di sodio (che paralizza i nematodi) entro un'ora dalla produzione del vetrino con tampone. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Il microscopio a fluorescenza con una fotocamera digitale utilizzato in questo studio. Il microscopio si trova a un tavolo che può ospitare piccoli gruppi (da tre a quattro) di studenti. Il microscopio ha una fotocamera digitale collegata da un cavo USB a un computer con un software di acquisizione di immagini digitali appropriato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Valutazione degli effetti di un pesticida contenente neonicotinoidi sulla morfologia dei neuroni. (A) Neuroni colinergici non trattati dal ceppo fluorescente LX929. (B) Neuroni colinergici esposti a pesticidi (T + S). (C) Percentuale di neuroni che mostrano blebbing nelle due condizioni. Le barre di errore sono l'errore standard della media. indica p < 0,001 da un ANOVA unidirezionale. Sono stati analizzati un totale di 113 neuroni di 12 singoli nematodi. Questa cifra è stata modificata da Bradford, et ^al.3. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Effetti di un pesticida contenente manganese sulla morfologia dei neuroni della dopamina. Il gruppo di studenti non ha fornito una barra di scala per la loro figura, ma ha preso l'immagine con un ingrandimento 40x. (A) Soma neuronale putativo CEPDL e CEPVL (etichettato) nei vermi di controllo. Il neurone testa intatto somata e i loro processi indicano una mancanza di degenerazione. (B) Processi putativi CEPD L&R (asterisco) e SOMA neuronale CEPV L&R (etichettato) in vermi acuti esposti. Il soma e i processi esprimevano GFP, ma sembra esserci uno smorzamento dell'espressione GFP nei processi dorsali. (C) Soma neuronale putativo CEPDL e CEPVL (etichettato) in vermi esposti cronici. Il soma non esprimeva GFP e i processi non erano visibili, indicando una degenerazione significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

I protocolli descritti in questo manoscritto funzionano con successo da soli o come parte di un progetto di gruppo di studenti indipendenti di più settimane. I protocolli sono anche suscettibili di esperienze esplorative autonome di una settimana. I ceppi di nematodi sono economici e facili da mantenere nel laboratorio di ricerca. Gli studenti possono facilmente imparare come raccogliere i vermi con un piccone o come spostarli lavando le piastre con acqua e permettendo loro di stabilirsi per gravità. Gli esperimenti possono essere eseguiti nel corso di un singolo periodo di laboratorio o per più settimane. Gli studenti possono progettare autonomamente i loro esperimenti, oppure può essere fornita loro una procedura. I microscopi di dissezione non devono essere costosi. L'oggetto più costoso è il microscopio fluorescente con una fotocamera digitale. Questa è una limitazione per i laboratori didattici che non hanno accesso a un microscopio fluorescente o a una fotocamera digitale.

Se un microscopio fluorescente e una fotocamera digitale e un sistema di imaging computerizzato non sono disponibili per l'uso in laboratorio, gli studenti potrebbero misurare specifici comportamenti semplici che sono governati da particolari neuroni. Molti test comportamentali sono disponibili e possono essere trovati in Wormbook⁹. I comportamenti possono essere valutati utilizzando il microscopio di dissezione.

Un passo fondamentale in questo protocollo è la preparazione dei vetrini del microscopio per i supporti bagnati dei nematodi. Un altro passo critico è l'aggiunta dei nematodi alla goccia. Un ultimo passo critico nel protocollo è assicurarsi di non esporre i nematodi all'illuminazione fluorescente per così tanto tempo da sbiancare il segnale. Sarebbe importante che l'istruttore indicasse questi passaggi critici in modo che i gruppi di studenti si esercitino e prestino attenzione alle istruzioni che vengono date.

L'aspetto più eccitante di questa metodologia è che gli studenti possono progettare e realizzare esperimenti nuovi e autentici che potrebbero produrre risultati pubblicabili o diventare la base per una ricerca più avanzata, come un progetto di ricerca senior. Le procedure possono essere utilizzate per studiare una varietà di pesticidi, miscele di pesticidi e molte altre diverse sostanze chimiche ambientali¹⁰, che fornisce agli studenti un'esperienza di ricerca e una formazione veramente rilevanti nella progettazione sperimentale, nell'analisi dei dati, nella preparazione delle figure e nella presentazione dei risultati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250