Изучение влияния пестицидов на нейроны Caenorhabditis elegans

Summary

Молодые взрослые нематоды Caenorhabditis elegans подвергаются воздействию различных концентраций коммерческих пестицидов или других токсикантов в течение 2-24 ч. Затем различные нейроны могут быть визуализированы с использованием флуоресцентно-экспрессирующих штаммов. В этой статье показано, как подвергать нематод воздействию пестицидов и оценивать повреждение нейронов.

Abstract

Caenorhabditis elegans является мощным модельным организмом, используемым во многих исследовательских лабораториях для понимания последствий воздействия химических загрязнителей, пестицидов и широкого спектра токсичных веществ. С этими нематодами легко работать, и их можно использовать для получения новых результатов исследований, даже в лаборатории биологии бакалавриата. Многонедельная лабораторная серия аутентичных, управляемых студентами исследовательских проектов обучает студентов инструментарию методов и подходов в поведенческих измерениях, клеточной биологии и микроскопии, которые они затем применяют в своих проектах. Одним из методов в этом инструментарии является количественная оценка процента нейронов, проявляющих нейродегенеративное повреждение после воздействия химического токсиканта, такого как пестицид. Молодые взрослые нематоды C. elegans могут подвергаться воздействию различных концентраций коммерчески доступных пестицидов или других типов токсикантов в течение 2-24 ч. Затем студенты бакалавриата могут визуализировать различные подтипы нейронов, используя флуоресцентно-экспрессирующие штаммы C. elegans. Эти методы не требуют сложного программного обеспечения для обработки изображений и эффективны даже при низком увеличении, что делает необходимость в дорогостоящей конфокальной микроскопии ненужной. В этой статье показано, как лечить нематод пестицидами и как изображать и оценивать нейроны. Он также предоставляет простой протокол для микроскопии и анализа морфологии нейронов. Материалы, используемые для этой техники, недороги и легко доступны на большинстве факультетов биологии бакалавриата. Этот метод может быть объединен с поведенческими показателями, такими как локомоция, базальное замедление или яйцекладка, чтобы провести потенциально публикуемую серию экспериментов и дать студентам бакалавриата подлинный исследовательский опыт по очень низкой цене.

Introduction

Caenorhabditis elegans является отличным модельным организмом для лабораторного курса обучения на курсах биологических наук для студентов вводного и среднего уровня. Эта лабораторная процедура может быть использована как часть многонедельного модуля, который исследует различные эффекты обычно используемых пестицидов на поведение C. elegans и клеточную биологию. Студенты могут научиться разрабатывать и выполнять независимые проекты, которые учат их навыкам анализа данных и презентации. В этой статье основное внимание уделяется протоколам воздействия C. elegans на пестицидные смеси, а затем наблюдению и анализу влияния на морфологию нейронов.

Газонные химические пестицидные смеси широко используются для бытового и сельскохозяйственного использования и могут быть приобретены в любом местном садовом магазине. Растет обеспокоенность по поводу безопасности этих химических веществ для человека и дикой природы ^1,2,3. Студенты могут читать научную литературу и выбирать пестицид для экспериментальной оценки и, таким образом, могут узнать о базовой биологии и нейробиологии, а также о важных лабораторных навыках, таких как экспериментальное проектирование и анализ, и общих лабораторных навыках, таких как пипетка и серийные разведения, рассекающая микроскопия, флуоресцентная микроскопия, цифровая фотография и производство фигур.

Протоколы, описанные в этой статье, могут стоять отдельно в курсе среднего уровня по биологии или неврологии или быть частью многонедельного модуля, который также может включать измерения поведения, управляемого определенными группами нейронов. Например, в этом протоколе описана оценка морфологии холинергических нейронов, управляющих локомоцией, с помощью штамма нематоды, экспрессирующего GFP (LX 929) в холинергических нейронах⁴. Эти штаммы можно получить по очень низким ценам в Центре генетики Caenorhabditis elegans (https://cgc.umn.edu/). Штаммы, экспрессирующие GFP в дофаминергических нейронах (OH 7457), холинергических нейронах (LX 929) или mCherry, экспрессируемые во всех нейронах (PVX4), являются хорошим выбором. Студенты также могут измерять локомоцию и получать данные для сопровождения оценки морфологии. Полное описание многонедельного проекта студенческой группы можно найти в Susman⁵.

Этот студенческий групповой проект довольно недорогой и простой в настройке для групп из четырех студентов. Необходимые материалы включают рассекающий микроскоп, доступ к флуоресцентному составному микроскопу, который может иметь прикрепленную цифровую камеру, пластины Петри и доступ к агару роста нематод, бактериям с ограничением роста (штамм OP50, из CGC), горелке Бунзена газового пламени или спиртовой лампе, автоклаву, платиновой проволоке и общим лабораторным материалам, таким как микропипеттеры, слайды микроскопа, чехлы и стеклянные пипетки Пастера. В зависимости от химического токсиканта, исследуемого студенческими группами, шаги в протоколе могут быть выполнены под вытяжным капюшоном или в перчатках. В этом протоколе используются химические смеси, которые являются водорастворимыми (не летучими), и соблюдаются все процедуры безопасного обращения, рекомендованные производителем.

Protocol

Все виды использования беспозвоночных животных осуществлялись в соответствии с руководящими принципами учреждения по уходу за животными и их использованию.

1. Приготовление пластин Петри с пестицидным покрытием

1. Приготовьте чашку из агара Петри (диаметром 6 см лучше всего работать), используя стандартные процедуры⁶.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Они могут быть изготовлены за несколько месяцев и храниться в холодильнике до использования. Доведите тарелки до комнатной температуры (RT) на столешнице. В большинстве случаев студенческие группы должны быть обеспечены табличкой для каждого разведения пестицидной смеси, включая контроль воды.
2. Готовят 1 мл каждого разведения выбранного пестицида в маркированных микрофьюжных пробирках объемом 1,5 мл. Для безопасного обращения обязательно прочитайте инструкцию и предоставьте перчатки или поработайте в вытяжном шкафу, если это предлагается.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемые для испытания разбавления: 1 мл пестицида полной силы, разбавление 1:10 в воде (100 мкл пестицида, 900 мкл дистиллированной воды), разбавление 1:100 (10 мкл пестицида, 990 мкл воды), разбавление 1:1000 (10 мкл разбавления 1:10, 990 мкл воды) и т.д.
3. Сделайте разбрасыватель раствора, аккуратно согнув стеклянную пипетку Пастера (размером 9 мл) в пламя горелки Бунзена. Используйте пламя, чтобы закрыть отверстие пипетки. Затем этанол -стерилизуйте разбрасыватель перед каждым разбрасыванием на пластине Петри.
4. Используя микропипеттер, поместите 100 мкл разбавления (или контроля воды) на центр агара и аккуратно распределите по поверхности стерилизованным разбрасывателем. Повторно стерилизуйте распределитель перед каждым использованием.
5. Отложите в сторону чашки Петри, покрытые крышкой, и дайте раствору впитаться в поверхность до «высыхания».
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от пестицидов и уровня влажности в лаборатории, это может занять некоторое время. Студентам может потребоваться подготовить свои тарелки за день до периода воздействия.
6. Для периодов воздействия более 12 ч добавляют 50 мкл ночной культуры кишечной палочки к пластинам перед добавлением нематод. Для острых экспериментов (12 ч и менее) нет необходимости иметь кишечную палочку на пластинах.

2. Добавление нематод в пластины, покрытые пестицидами

ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты должны будут иметь тарелку взрослых нематод (лучше всего 5-дневные культуры) флуоресцентного штамма LX929, который доступен в Центре генетики Caenorhabditis elegans . Для этого возможны две процедуры. Если у студентов был предыдущий опыт работы с нематодами (например, если эта процедура является частью многонедельного упражнения и они уже научились собирать нематод с помощью червячного отбора), используйте Шаг 2.1. Если они этого не сделали, используйте шаг 2.2.

1. Собирайте нематод с помощью червячной кирки. Создайте червячную кирку из 1 куска платиновой проволоки, которая расплавляется до пипетки Пастера с помощью пламени горелки Бунзена. Возьмите небольшой шарик липкой кишечной палочки на кирку, а затем подберите взрослых нематод, используя липкую каплю. Для приличного размера выборки выберите 10 нематод для каждой лечебной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Студенты без большого опыта могут следовать Шагам 2.2-2.3.
2. Используйте микропипетку, чтобы поместить 1 мл стерильной воды на пластину нематод. Разбрызгивайте воду, чтобы поднять нематод, затем удалите жидкость с нематодами в микрофьюжную трубку объемом 1,5 мл.
3. Дайте нематодам отстояться под действием силы тяжести около 10 минут, затем осторожно удалите не менее 500 мкл воды и выбросьте. Повторно суспендируют нематод и, используя отрезанный желтый кончик пипетки, удаляют 50-100 мкл взвешенных червей на каждую лечебную пластину. Убедитесь, что в каждой тарелке не менее 10 взрослых червей.
4. Установите таймер или запишите время и выставьте нематод на RT за выбранный период времени. В течение выбранного времени экспозиции подготовьте предметные стекла микроскопа для мокрых креплений. Слайды должны быть сделаны в тот же день, что и микроскопия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Студенческие группы будут выбирать свое время экспозиции во время планирования своего независимого обучения.

3. Подготовка слайдов микроскопа для мокрых креплений

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 3.1-3.3 могут быть выполнены каждой студенческой группой. Подготовьте по три слайда.

1. Подготовьте два слайда, поместив кусок ленты меток только на одну сторону слайда (рисунок 1, левая панель). Лента используется для создания правильной толщины для агарозы, чтобы сформировать прокладку равномерной толщины. Затем поместите чистый, неиспользуемый слайд между ними на столешнице, как показано на рисунке.
2. Используйте микропипеттер, чтобы поместить 10 мкл капли расплавленной агарозы (3% в ddH_2O, нагретой с помощью сухого блочного нагревателя 65 ° C) в центр слайда, который находится посередине.
3. Сгладите каплю, поместив сверху еще один чистый слайд, перпендикулярный слайду с каплей, как показано на рисунке (рисунок 1, правая панель). Сплющивают, применяя давление, поэтому капля агарозы образует толщину этикетировочной ленты.
4. Агароза затвердевает в течение примерно 1 мин. Затем приложите постоянное давление, чтобы разделить два слайда. Круг агара будет прилипать к одному из слайдов. Положите эту горку, агар стороной вверх, на столешницу и дайте ему высохнуть в течение 1-2 минут перед использованием.

4. Установка живых нематод на предметные стекла микроскопа

1. Чтобы добавить нематод к подготовленному слайду с агароновой прокладкой, добавьте в агаровую прокладку каплю воды объемом 5 мкл, содержащую 1 М азида натрия (NaN₃). Этот раствор обезболивает червей и обездвиживает их.
   ВНИМАНИЕ: Раствор азида натрия может вызвать заболевание при приеме внутрь.
2. Затем переложите нематод (не менее 10 на один лечебный слайд) в каплю с помощью червячной кирки. Стерилизуйте кирку до и после ее использования для переноса нематод.
3. Используйте щипцы, чтобы добавить крышку, поместив ее под углом и медленно опуская. Предотвратите слишком быстрое скольжение или опускание обшивки с помощью карандаша или металлического зонда.
4. Поместите подготовленное мокрое крепление на флуоресцентный микроскоп для наблюдения за червями, сначала под 10-кратным увеличением и фазовым контрастом, затем под 40-кратным увеличением с фазовым контрастом и флуоресцентным освещением.

5. Флуоресцентная микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Студенческие группы должны сделать мокрое крепление из нескольких червей каждого типа на отдельных предметных стеклах микроскопа, которые они должны соответствующим образом маркировать. Приведенные ниже инструкции являются общими советами по использованию стандартного флуоресцентного составного микроскопа, который может иметь прикрепленную тринокулярную установку, цифровую камеру и компьютерную систему. Установка, используемая для этой рукописи, показана на рисунке 2. Студенты должны быть знакомы с настройками микроскопа, включая цели, типы световых фильтров, возможность переключения между ярким полем и флуоресцентным светом, как отправить световой сигнал на цифровую камеру и т. Д.

1. Поместите одно подготовленное мокрое крепление за раз на ступень микроскопа и закрепите его на месте с помощью зажимов сцены микроскопа.
2. Начните просмотр мокрых креплений с первого просмотра с наименьшим объективом увеличения, которое обычно составляет 10x, и используйте яркое поле или фазовый контраст для визуализации и фокусировки на нематодах.
3. Как только нематода окажется в поле зрения, сосредоточьтесь на ней с помощью тонкой ручки фокусировки на микроскопе. Переключите подсветку на флуоресценцию, повернув циферблат. Затем направьте свет на камеру, чтобы захватить цифровые изображения. Отрегулируйте освещение с помощью программного обеспечения для визуализации, чтобы нейроны были ярко освещены, но не перенасыщены.
4. В какой-то момент получите отдельное изображение линейки с тем же увеличением, что и изображения ячеек, чтобы обеспечить шкалу увеличения для их фигуры. Поместите короткий участок прозрачной линейки или микрометрового слайда на сцену микроскопа, сосредоточьтесь на нем с помощью ручки тонкой фокусировки и получите изображение с помощью программного обеспечения для визуализации.
5. Получите дополнительные изображения (по крайней мере, от 10 отдельных нематод) при более высоких увеличениях, если это возможно. Интенсивный свет, скорее всего, отбеливает область, из которой он изображается, поэтому тщательно следите за изображением и не позволяйте свету оставаться на одной и той же области слайда в течение длительных периодов времени. Обязательно назовите полученные изображения, чтобы отслеживать нематоду и область, а также обработку и увеличение.
6. Создайте папку на компьютере и переместите изображения в папку для использования в анализе и подготовке рисунков.

6. Шкала оценки морфологической целостности

ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевой цитологической характеристикой нейродегенеративного повреждения нейронов является изменение морфологии сомы. Есть три морфологии, которые можно легко просмотреть и подсчитать.

1. Подсчитайте нейроны с гладкими, равномерно флуоресцентными процессами и некруглыми клеточными телами как обычно, как показано на рисунке 3.
2. Часто сома становится округлой и опухшей по сравнению со здоровыми, молодыми нейронами. Считайте нейроны, которые выглядят так, как «округлые».
3. Нейроны с длинными нейронными процессами могут проявлять блеббинг, где есть округлые пункты или даже промежутки в процессах. Подсчитайте нейроны, которые показывают эти особенности, как «блеббированные».

7. Анализ данных и подготовка рисунков

1. Если был подсчитан процент здоровых (без округления, без блеббинга) и процент нарушений (округление и/или блеббинг) по крайней мере для десяти нематод для каждого лечения (рисунок 3), выполните статистический анализ с использованием доступного статистического программного обеспечения.
2. Подсчитайте все нейроны, которые флуоресцентно помечены, сохраняя подсчет тех, которые демонстрируют нормальную морфологию, морфологию блеббинга или округляющую морфологию, а затем рассчитайте процент каждой морфологии от общего количества для каждой анализируемой нематоды.
3. Чтобы подготовить рисунки, импортируйте изображения в соответствующее программное обеспечение, такое как Powerpoint, а затем добавьте метки и шкалу на основе полученного изображения линейки или микрометра.

Representative Results

Методы и протоколы, описанные в этой статье, обеспечивают важные лабораторные навыки для студентов среднего уровня бакалавриата в области биологии или неврологии. Студенты могут получить важный опыт в разработке независимого проекта и проведении эксперимента собственного дизайна, который может дать новые результаты. На рисунке 3 показан оптимальный результат студенческого проекта, который в конечном итоге стал частью опубликованной статьи³. В то время как большинство студенческих проектов не приводят к публикуемым результатам, большинство студентов могут создать сложную фигуру и легенду фигуры, а большинство также могут получить количество клеток, провести статистический анализ и создать рисунок или таблицу данных. Определенные нейроны управляют специфическим поведением. Таким образом, когда эта процедура является частью многонедельного независимого проекта, который включает в себя другие измерения, такие как анализы локомоции или хемотаксиса, полученный проект дает несколько цифр и презентацию класса, которой студенты могут гордиться.

Студенческие группы могут выбрать тип пестицида, который они хотят исследовать. В зависимости от их литературных исследований активного ингредиента пестицида, который они выбрали, студенты могут оценить различные нейроны. Поскольку все нейроны у C. elegans известны и их функции хорошо описаны, студенты могут выбрать конкретные типы нейронов, такие как дофаминовые нейроны или холинергические нейроны, для изучения в независимом эксперименте. В примере, приведенном в этой рукописи, студенты исследовали неоникотиноидный пестицид и сосредоточились на холинергических нейронах с использованием флуоресцентного штамма нематоды, экспрессирующего GFP в холинергических нейронах. Другой пример, показанный на рисунке 4, показывает более типичный результат от студенческой группы, которая изучила влияние содержащего марганец пестицида на дофаминергические нейроны с использованием штамма, в котором дофаминовые нейроны экспрессируют GFP (OH7457). Этот конкретный штамм показывает яркий сигнал в дофаминовых нейронах, и нейроны были легко визуализированы студентами. Однако со временем флуоресцентный сигнал отбеливается, если нейроны подвергаются воздействию света в течение длительных периодов времени, как это произошло с этой студенческой группой.

Если у студентов курса было очень мало опыта работы с флуоресцентной микроскопией, рекомендуется построить дополнительную неделю, чтобы дать студентам возможность повторить свой эксперимент, поскольку их навыки значительно улучшатся с практикой.

Сложным аспектом для лабораторного инструктора является наличие нескольких небольших групп, каждая из которых оценивает морфологию различных типов нейронов. Различные флуоресцентные штаммы не дороги в получении или обслуживании, но требуется больше усилий, чтобы иметь под рукой множество различных флуоресцентных штаммов. Тем не менее, можно ограничить типы проектов доступными напряжениями и ресурсами. Штаммы, которые очень хорошо работают со студентами бакалавриата, включают штаммы LX929 и OH7547. PVX4, который является паннейрональным экспрессирующим mCherry, также является очень простым штаммом для работы с ^7,8.

Рисунок 1: Схема подготовки слайдов микроскопа для мокрых креплений C. elegans. На левой панели показано размещение этикеточной ленты и капли 2%-3% агарозы (10 мкл). Затем в правой панели сверху помещается второй слайд под углом 90°, чтобы сгладить каплю агарозы до толщины ленты. Как только агароза затвердевает, горки тщательно отделяются. Агарозная подушка будет прилипать к одному из слайдов. Чтобы предотвратить высыхание, нематод помещают в каплю буфера, содержащую азид натрия (который парализует нематод) в течение часа после производства слайда с прокладкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой, используемый в этом исследовании. Микроскоп сидит за столом, который может вместить небольшие группы (от трех до четырех) студентов. Микроскоп имеет цифровую камеру, подключенную USB-кабелем к компьютеру с соответствующим программным обеспечением для захвата цифрового изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Оценка влияния неоникотиноидового пестицида на морфологию нейронов. (А) Необработанные холинергические нейроны флуоресцентного штамма LX929. (B) Холинергические нейроны, подвергающиеся воздействию пестицидов (T+S). (C) Процент нейронов, демонстрирующих блеббинг в этих двух условиях. Полосы ошибок являются стандартной погрешностью среднего значения. обозначает p < 0,001 от одностороннего ANOVA. В общей сложности было проанализировано 113 нейронов от 12 отдельных нематод. Эта цифра была изменена по сравнению с Брэдфордом и ^др.3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Влияние марганцевосодержащего пестицида на морфологию дофаминовых нейронов. Студенческая группа не предоставила шкалу для своей фигуры, но сделала изображение с 40-кратным увеличением. (A) Предполагаемая CEPDL и CEPVL нейрональная сома (меченая) у контрольных червей. Неповрежденные головные нейроны соматы и их отростки свидетельствуют об отсутствии дегенерации. (B) Предполагаемые процессы CEPD L & R (звездочка) и CEPV L & R нейронная сома (меченая) у червей с острым воздействием. Сома и процессы экспрессируют GFP, но, по-видимому, наблюдается ослабление экспрессии GFP в дорсальных процессах. (C) Предполагаемая CEPDL и CEPVL нейрональная сома (меченая) у хронических подверженных воздействию червей. Сома не выражала GFP, и процессы не были видны, что указывает на значительную дегенерацию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протоколы, описанные в этой рукописи, успешно работают в одиночку или в рамках многонедельного независимого проекта студенческой группы. Протоколы также поддаются автономному, недельному исследовательскому опыту. Штаммы нематод дешевы и просты в обслуживании в исследовательской лаборатории. Студенты могут легко узнать, как собирать червей с помощью червячного кирка или как перемещать их, промывая пластины водой и позволяя им оседать под действием силы тяжести. Эксперименты могут проводиться в течение одного лабораторного периода или в течение нескольких недель. Студенты могут самостоятельно разрабатывать свои эксперименты, или им может быть предоставлена процедура. Рассекающие микроскопы не должны быть дорогими. Самым дорогим изделием является флуоресцентный микроскоп с цифровой камерой. Это ограничение для учебных лабораторий, которые не имеют доступа к флуоресцентному микроскопу или цифровой камере.

Если флуоресцентный микроскоп, цифровая камера и компьютерная система визуализации недоступны для использования в лаборатории, студенты могут измерить конкретное простое поведение, которое управляется конкретными нейронами. Многие поведенческие анализы доступны и могут быть найдены в Wormbook⁹. Поведение может быть оценено с помощью рассекающего микроскопа.

Критическим шагом в этом протоколе является подготовка слайдов микроскопа для влажных креплений нематод. Другим важным шагом является добавление нематод в каплю. Последним критическим шагом в протоколе является обеспечение того, чтобы не подвергать нематод флуоресцентному освещению так долго, что оно отбеливает сигнал. Для преподавателя было бы важно указать на эти критические шаги, чтобы студенческие группы практиковались и внимательно следили за инструкциями, которые им дают.

Наиболее захватывающим аспектом этой методологии является то, что студенты могут разрабатывать и проводить новые и аутентичные эксперименты, которые могут дать публикуемые результаты или стать основой для более продвинутых исследований, таких как старший исследовательский проект. Процедуры могут быть использованы для изучения различных пестицидов, смесей пестицидов и многих других различных химических веществ окружающей среды¹⁰, что предоставляет студентам действительно актуальный исследовательский опыт и обучение экспериментальному проектированию, анализу данных, подготовке рисунков и представлению результатов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Fisher Scientific	BP97445
Agarose	Fisher Scientific	MP1AGAH0250
Alcohol lamp	Fisher Scientific	17012826
Bunsen burner	Fisher Scientific	17-012-820
C. elegans strains	C. elegans Genetics Center
CaCl	Fisher Scientific	10035-04-8
Cholesterol	Fisher Scientific	AAA1147030
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-AP
Digital camera	Nikon		These can vary depending on the requirement
Dissecting scope	Nikon	SMZ745
E. coli strain (OP50)	C. elegans Genetics Center
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Fluorescent scope	Nikon		These can vary depending on the requirement
Imaging software	Nikon		These can vary depending on the requirement
Inoculation loop	Fisher Scientific	131045
LB Broth Base	Fisher Scientific	BP9723-500
MgSO4	Fisher Scientific	10034-99-8
Microfuge tubes	Fisher Scientific	05408129
Microscope slides	Fisher Scientific	22-265446
Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Petri dishes	Fisher Scientific	AS4050
Pipette tips	Fisher Scientific	94060316
Pipetters	Fisher Scientific	14-386-319
Platinum wire	Genesee Scientific	59-1M30P
Potassium Phosphate buffer	Fisher Scientific	AAJ61413AP
Sodium azide	Fisher Scientific	AC447810250