Summary
Jongvolwassen Caenorhabditis elegans-nematoden worden gedurende 2-24 uur blootgesteld aan verschillende concentraties commerciële pesticiden of andere toxische stoffen. Vervolgens kunnen verschillende neuronen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende spanningen. Dit artikel laat zien hoe nematoden kunnen worden blootgesteld aan pesticiden en neuronschade kan worden beoordeeld.
Abstract
Caenorhabditis elegans is een krachtig modelorganisme dat in veel onderzoekslaboratoria wordt gebruikt om de gevolgen van blootstelling aan chemische verontreinigende stoffen, pesticiden en een breed scala aan giftige stoffen te begrijpen. Deze nematoden zijn gemakkelijk om mee te werken en kunnen worden gebruikt om nieuwe onderzoeksresultaten te genereren, zelfs in het niet-gegradueerde biologielaboratorium. Een meerweekse laboratoriumreeks van authentieke, studentgestuurde onderzoeksprojecten traint studenten in een toolkit van technieken en benaderingen in gedragsmetingen, celbiologie en microscopie die ze vervolgens toepassen op hun projecten. Een techniek in die toolkit is het kwantificeren van het percentage neuronen dat neurodegeneratieve schade vertoont na blootstelling aan een chemisch toxisch middel zoals een pesticide. Jongvolwassen C. elegans-nematoden kunnen gedurende 2-24 uur worden blootgesteld aan verschillende concentraties van in de handel verkrijgbare pesticiden of andere soorten toxische stoffen. Vervolgens kunnen niet-gegradueerde studenten verschillende neuronsubtypen visualiseren met behulp van fluorescerende stammen van C. elegans. Deze technieken vereisen geen geavanceerde beeldverwerkingssoftware en zijn effectief bij zelfs lage vergrotingen, waardoor de noodzaak van dure confocale microscopie overbodig is. Dit artikel laat zien hoe de nematoden met pesticiden kunnen worden behandeld en hoe de neuronen in beeld kunnen worden gebracht en gescoord. Het biedt ook een eenvoudig protocol voor de microscopie en analyse van neuronmorfologie. De materialen die voor deze techniek worden gebruikt, zijn goedkoop en gemakkelijk beschikbaar in de meeste niet-gegradueerde biologieafdelingen. Deze techniek kan worden gecombineerd met gedragsmaatregelen zoals voortbeweging, basale vertraging of het leggen van eieren om een potentieel publiceerbare reeks experimenten uit te voeren en niet-gegradueerde studenten een authentieke onderzoekservaring te bieden tegen zeer lage kosten.
Introduction
Caenorhabditis elegans is een uitstekend modelorganisme voor laboratoriumcursussen in biologische wetenschappencursussen voor studenten op inleidend en middelhoog niveau. Deze laboratoriumprocedure kan worden gebruikt als onderdeel van een module van meerdere weken die verschillende effecten van veelgebruikte pesticiden op het gedrag van C. elegans en celbiologie onderzoekt. Studenten kunnen leren hoe ze onafhankelijke projecten kunnen ontwerpen en uitvoeren die hen data-analyse en presentatievaardigheden leren. Dit artikel richt zich op de protocollen voor het blootstellen van C. elegans aan pesticidenmengsels en vervolgens het observeren en analyseren van de effecten op de morfologie van neuronen.
Gazon chemische pesticide mengsels worden veel gebruikt voor residentieel en agrarisch gebruik en kunnen worden gekocht bij elke lokale tuinwinkel. Er is toenemende bezorgdheid over de veiligheid van deze chemicaliën voor mens en dier 1,2,3. Studenten kunnen de wetenschappelijke literatuur lezen en een pesticide selecteren voor experimentele evaluatie en zo meer te weten komen over basisbiologie en neurobiologie, evenals belangrijke laboratoriumvaardigheden zoals experimenteel ontwerp en analyse, en algemene laboratoriumvaardigheden zoals pipetteren en seriële verdunningen, ontleden van microscopie, fluorescerende microscopie, digitale fotografie en figuurproductie.
De protocollen die in dit artikel worden beschreven, kunnen op zichzelf staan in een cursus op gemiddeld niveau in biologie of neurowetenschappen of deel uitmaken van een module van meerdere weken die ook metingen van gedrag kan omvatten dat wordt bestuurd door bepaalde groepen neuronen. In dit protocol wordt bijvoorbeeld een beoordeling beschreven van de morfologie van cholinerge neuronen die de voortbeweging regelen met behulp van een stam van nematode die GFP (LX 929) tot expressie brengt in cholinerge neuronen4. Deze stammen zijn voor zeer lage prijzen verkrijgbaar bij het Caenorhabditis elegans Genetics Center (https://cgc.umn.edu/). Stammen die GFP tot expressie brengen in dopaminerge neuronen (OH 7457), cholinerge neuronen (LX 929) of mCherry uitgedrukt in alle neuronen (PVX4) zijn allemaal goede keuzes. Studenten konden ook de voortbeweging meten en gegevens verkrijgen om de beoordeling van morfologie te begeleiden. Een volledige beschrijving van een meerweeks studentengroepproject is te vinden in Susman5.
Dit studentengroepproject is vrij goedkoop en eenvoudig op te zetten voor groepen van vier studenten. De benodigde materialen omvatten een ontleedmicroscoop, toegang tot een fluorescentie samengestelde microscoop met een aangesloten digitale camera, petriplaten en toegang tot nematodegroeiagar, groeibeperkte bacteriën (stam OP50, van de CGC), een gasvlam Bunsen-brander of een alcohollamp, een autoclaaf, platinadraad en algemene laboratoriumbenodigdheden zoals micropipetters, microscoopglaasjes, coverslips en glazen Pasteur pipetten. Afhankelijk van de chemische stof die door de studentengroepen wordt onderzocht, moeten de stappen in het protocol mogelijk onder een zuurkast of met handschoenen worden uitgevoerd. Dit protocol maakt gebruik van chemische mengsels die in water oplosbaar (niet vluchtig) zijn en alle veilige hanteringsprocedures die door de fabrikant worden aanbevolen, worden gevolgd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het gebruik van ongewervelde dieren was in overeenstemming met de richtlijnen voor dierverzorging en gebruik van de instelling.
1. Bereiding van petriplaten met een pesticidecoating
- Bereid agar petrischalen (6 cm diameter werken het beste) met behulp van standaardprocedures6.
OPMERKING: Deze kunnen maanden van tevoren worden gemaakt en tot gebruik in de koelkast worden bewaard. Breng borden op kamertemperatuur (RT) op het tafelblad. In de meeste gevallen moeten de studentengroepen worden voorzien van een plaat voor elke verdunning van het pesticidenmengsel, inclusief een watercontrole. - Bereid 1 ml van elke verdunning van het gekozen bestrijdingsmiddel in gelabelde 1,5 ml microfugebuizen. Voor een veilige hantering moet u de instructies lezen en handschoenen verstrekken, of in een zuurkast werken, indien aanbevolen.
OPMERKING: Voorgestelde verdunningen om te testen: 1 ml pesticide op volle sterkte, 1:10 verdunning in water (100 μl pesticide, 900 μl gedestilleerd water), 1:100 verdunning (10 μl pesticide, 990 μl water), 1:1000 verdunning (10 μl van de 1:10 verdunning, 990 μl water), enz. - Maak een oplossingsstrooier door een glazen Pasteur pipet (9 ml grootte) voorzichtig te buigen in een Bunsen brandervlam. Gebruik de vlam om de opening van de pipet te sluiten. Vervolgens ethanol-steriliseer de strooier voordat elke spread op de petriplaat wordt uitgesmeerd.
- Plaats met behulp van een micropipetter 100 μL van de verdunning (of waterregeling) op het midden van de agar en verspreid deze voorzichtig over het oppervlak met de gesteriliseerde spreader. Steriliseer de spreader opnieuw voor elk gebruik.
- Zet de afgedekte petrischaaltjes opzij en laat de oplossing in het oppervlak weken totdat deze "droog" is.
OPMERKING: Afhankelijk van het bestrijdingsmiddel en de vochtigheidsgraad in het laboratorium, kan dit enige tijd duren. Studenten moeten mogelijk hun borden de dag voor de blootstellingsperiode voorbereiden. - Voeg voor blootstellingsperioden langer dan 12 uur 50 μL van een nachtkweek van Escherichia coli toe aan de platen voordat u de nematoden toevoegt. Voor acute experimenten (12 uur of minder) is het niet nodig om E. coli op de platen te hebben.
2. Nematoden toevoegen aan met pesticiden bedekte platen
OPMERKING: Studenten moeten een plaat met volwassen nematoden hebben (5-daagse culturen zijn het beste) van de fluorescerende stam LX929, die verkrijgbaar is bij het Caenorhabditis elegans Genetics Center. Daar zijn twee mogelijke procedures voor. Als studenten eerdere ervaring hebben met het werken met nematoden (bijvoorbeeld als deze procedure deel uitmaakt van een oefening van meerdere weken en ze al hebben geleerd hoe ze nematoden kunnen plukken met een wormprikker), gebruikt u stap 2.1. Als dit niet het geval is, gebruikt u stap 2.2.
- Pluk aaltjes met een wormenprikker. Maak een wormenprik van een 1 in stuk platinadraad dat met behulp van een Bunsen-brandervlam tot een Pasteur-pipet wordt gesmolten. Pak een kleine klodder kleverige E. coli op de pik en pak vervolgens volwassen nematoden op met behulp van de kleverige klodder. Kies voor een fatsoenlijke steekproefgrootte 10 nematoden voor elke behandelingsplaat.
OPMERKING: Studenten zonder veel ervaring kunnen stappen 2.2-2.3 volgen. - Gebruik een micropipette om 1 ml steriel water op de plaat met nematoden te plaatsen. Draai het water rond om de nematoden op te tillen en verwijder vervolgens de vloeistof met de nematoden naar een microfugebuis van 1,5 ml.
- Laat de nematoden ongeveer 10 minuten door de zwaartekracht bezinken, verwijder dan voorzichtig ten minste 500 μL van het water en gooi het weg. Resuspend de nematoden en verwijder met behulp van een afgesneden gele pipetpunt 50-100 μL gesuspendeerde wormen op elke behandelingsplaat. Zorg ervoor dat elke plaat minstens 10 volwassen wormen bevat.
- Stel een timer in, of noteer de tijd, en stel de nematoden bij RT bloot voor de gekozen periode. Bereid tijdens de gekozen belichtingstijd microscoopglaasjes voor op natte vattingen. De dia's moeten dezelfde dag als de microscopie worden gemaakt.
OPMERKING: Studentengroepen hebben hun tijd van blootstelling gekozen tijdens de planning voor hun onafhankelijke studie.
3. Microscoopglaasjes voorbereiden voor natte mounts
OPMERKING: Stappen 3.1-3.3 kunnen door elke studentengroep worden uitgevoerd. Bereid elk drie dia's voor.
- Bereid twee dia's voor door een stuk labeltape aan slechts één kant van de dia te plaatsen (figuur 1, linkerdeelvenster). De tape wordt gebruikt om de juiste dikte voor de agarose te creëren om een pad van uniforme dikte te vormen. Plaats vervolgens een schone, ongebruikte dia ertussen op het bankje, zoals geïllustreerd in de afbeelding.
- Gebruik een micropipetter om een druppel gesmolten agarose van 10 μL (3% in ddH2O, verwarmd met een droge blokverwarmer van 65 °C) op het midden van de dia in het midden te plaatsen.
- Vlak de druppel af door er nog een schone dia bovenop te plaatsen, loodrecht op de dia met de druppel, zoals weergegeven in de afbeelding (figuur 1, rechterdeelvenster). Vlak af door druk uit te oefenen, zodat de agarose-druppel de dikte van de etiketteerband vormt.
- De agarose zal binnen ongeveer 1 minuut stollen. Oefen vervolgens constante druk uit om de twee dia's te scheiden. De agarcirkel zal zich hechten aan een van de dia's. Laat deze glijbaan, agar met de zijkant naar boven, op het bankje rusten en laat hem 1-2 minuten drogen voor gebruik.
4. Montage van levende nematoden op microscoopglaasjes
- Om nematoden toe te voegen aan de voorbereide dia met de agarose pad, voeg een 5 μL druppel water met 1 M natriumazide (NaN3) toe aan de agar pad. Deze oplossing verdooft de wormen en immobiliseert ze.
LET OP: Natriumazide stockoplossing kan ziekte veroorzaken als het wordt ingenomen. - Breng vervolgens nematoden (minstens 10 per behandelingsdia) over op de druppel met behulp van een wormenprikker. Steriliseer de beitelaar voor en na gebruik om nematoden over te brengen.
- Gebruik een tang om een coverslip toe te voegen door deze onder een hoek te plaatsen en langzaam te laten zakken. Voorkom dat de coverslip te snel wegglijdt of daalt door een potlood of metalen sonde te gebruiken.
- Plaats de voorbereide natte houder op een fluorescerende microscoop om de wormen te observeren, eerst onder 10x vergroting en fasecontrast, vervolgens onder 40x vergroting met fasecontrast en fluorescerende verlichting.
5. Fluorescerende microscopie
OPMERKING: Studentengroepen moeten een natte mount maken van verschillende wormen van elk type op afzonderlijke microscoopglaasjes, die ze op de juiste manier moeten labelen. De volgende instructies zijn algemene tips over het gebruik van een standaard fluorescentie samengestelde microscoop die een aangesloten trinoculaire opstelling, digitale camera en computersysteem kan hebben. De opstelling die voor dit manuscript is gebruikt, is te zien in figuur 2. Studenten moeten bekend zijn met de instellingen van de microscoop, inclusief de doelstellingen, soorten lichtfilters, de mogelijkheid om te schakelen tussen helder veld- en fluorescentielicht, hoe het lichtsignaal naar de digitale camera te sturen, enz.
- Plaats één voorbereide natte houder tegelijk op het microscoopstadium en zet deze op zijn plaats met behulp van de microscooptrapclips.
- Begin met het bekijken van de natte mounts door eerst te bekijken met het laagste vergrotingsobjectief, dat meestal 10x is, en gebruik helder veld- of fasecontrast om de nematoden te visualiseren en erop te focussen.
- Zodra een nematode zich in het gezichtsveld bevindt, richt u zich erop met behulp van de fijne scherpstelknop op de microscoop. Schakel de verlichting naar de fluorescentie door aan de draaiknop te draaien. Richt vervolgens het licht op de camera om de digitale beelden vast te leggen. Pas de verlichting aan met behulp van de beeldvormingssoftware, zodat de neuronen helder verlicht zijn, maar niet oververzadigd.
- Verkrijg op een gegeven moment een afzonderlijke afbeelding van een liniaal met dezelfde vergroting als de celafbeeldingen om een vergrotingsschaal voor hun figuur te bieden. Plaats een kort gedeelte van een transparante liniaal, of een micrometerschuif, op het microscooppodium, concentreer erop met behulp van de fijne scherpstelknop en verkrijg een beeld met behulp van de beeldvormingssoftware.
- Verkrijg indien mogelijk extra afbeeldingen (van ten minste 10 afzonderlijke nematoden) bij hogere vergrotingen. Het intense licht zal waarschijnlijk het gebied bleken van waaruit het wordt afgebeeld, dus houd de beeldvorming zorgvuldig in de gaten en laat het licht niet lang op hetzelfde gebied van de dia blijven. Zorg ervoor dat u de verkregen beelden een naam geeft om de nematode en regio bij te houden, evenals de behandeling en vergroting.
- Maak een map op de computer en verplaats de afbeeldingen naar de map voor gebruik bij analyse en figuurvoorbereiding.
6. Morfologische integriteitsbeoordelingsschaal
OPMERKING: Een belangrijk cytologisch kenmerk van neurodegeneratieve schade in neuronen is een verandering in de somamorfologie. Er zijn drie morfologieën die gemakkelijk kunnen worden bekeken en geteld.
- Tel de neuronen met gladde, gelijkmatig fluorescerende processen en niet-ronde cellichamen als normaal, zoals weergegeven in figuur 3.
- Vaak wordt de soma afgerond en gezwollen ogend in vergelijking met gezonde, jonge neuronen. Tel de neuronen die er zo uitzien als 'afgerond'.
- Neuronen met lange neurale processen kunnen blebbing vertonen, waarbij er afgeronde puncta of zelfs gaten in de processen zijn. Tel de neuronen die deze kenmerken vertonen als 'geblaat'.
7. Data-analyse en figuurvoorbereiding
- Als het percentage gezond (geen afronding, geen blebbing) en het percentage aangetast (afronding en/of blebbing) voor ten minste tien nematoden voor elke behandeling zijn geteld (figuur 3), voer dan statistische analyse uit met behulp van beschikbare statistische software.
- Tel alle neuronen die fluorescerend zijn getagd, houd een telling bij van die met normale morfologie, blebbing morfologie of afrondingsmorfologie en bereken vervolgens het percentage van elke morfologie uit de totale telling voor elke geanalyseerde nematode.
- Om cijfers voor te bereiden, importeert u de afbeeldingen in een geschikte software zoals Powerpoint en voegt u vervolgens labels en een schaalbalk toe op basis van de verkregen liniaal of micrometerafbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De methoden en protocollen die in dit artikel worden beschreven, bieden belangrijke laboratoriumvaardigheden voor niet-gegradueerde studenten op gemiddeld niveau in de biologie of neurowetenschappen. Studenten kunnen belangrijke ervaring opdoen bij het ontwikkelen van een onafhankelijk project en het uitvoeren van een eigen ontwerpexperiment dat nieuwe resultaten kan opleveren. Figuur 3 toont een optimaal resultaat van een studentenproject dat uiteindelijk onderdeel is geworden van een gepubliceerd artikel3. Hoewel de meeste studentenprojecten niet resulteren in publiceerbare resultaten, kunnen de meeste studenten een geavanceerde figuur en figuurlegende maken, en de meeste zijn ook in staat om celtellingen te verkrijgen, statistische analyse uit te voeren en een figuur of gegevenstabel te maken. Bepaalde neuronen regelen specifiek gedrag. Dus wanneer deze procedure deel uitmaakt van een onafhankelijk project van meerdere weken dat andere metingen omvat, zoals testen van voortbeweging of chemotaxis, levert het resulterende project meerdere cijfers en een klaspresentatie op waar studenten trots op kunnen zijn.
Studentengroepen kunnen het type pesticide kiezen dat ze willen verkennen. Afhankelijk van hun literatuuronderzoek naar het actieve ingrediënt van het pesticide dat ze hebben geselecteerd, kunnen de studenten verschillende neuronen evalueren. Omdat alle neuronen in C. elegans bekend zijn en hun functies goed worden beschreven, kunnen studenten specifieke neuronale typen kiezen, zoals dopamineneuronen of cholinerge neuronen, om te bestuderen in een onafhankelijk ontworpen experiment. In het voorbeeld in dit manuscript onderzochten de studenten een neonicotinoïde pesticide en concentreerden ze zich op cholinerge neuronen met behulp van een fluorescerende stam van nematoden die GFP tot expressie brengen in cholinerge neuronen. Een ander voorbeeld, weergegeven in figuur 4, toont een meer typisch resultaat van een studentengroep die de effecten van een mangaanbevattend bestrijdingsmiddel op dopaminerge neuronen onderzocht met behulp van een stam waarin dopamineneuronen GFP (OH7457) tot expressie brengen. Deze specifieke stam vertoont een helder signaal in dopamine-neuronen en de neuronen werden gemakkelijk gevisualiseerd door studenten. Na verloop van tijd bleekt het fluorescerende signaal echter als de neuronen gedurende lange tijd aan het licht worden blootgesteld, zoals bij deze studentengroep gebeurde.
Als de studenten in de cursus heel weinig ervaring hebben met fluorescerende microscopie, is het een goed idee om een extra week in te bouwen om de studenten de kans te geven hun experiment te herhalen, omdat hun vaardigheden dramatisch zullen verbeteren met oefenen.
Een uitdagend aspect voor de laboratoriuminstructeur is als er meerdere kleine groepen zijn, die elk de morfologie van verschillende neurontypen beoordelen. De verschillende fluorescerende stammen zijn niet duur om te verkrijgen of te onderhouden, maar er is meer inspanning nodig om tal van verschillende fluorescerende stammen bij de hand te hebben. Het is echter mogelijk om de soorten projecten te beperken tot de beschikbare spanningen en middelen. Soorten die heel goed werken met niet-gegradueerde studenten zijn de LX929- en OH7547-soorten. PVX4, een pan-neuronale expressiemCherry, is ook een zeer gemakkelijke soort om mee te werken 7,8.
Figuur 1: Diagram van het voorbereiden van microscoopglaasjes voor natte vattingen van C. elegans. Het linkerpaneel toont de plaatsing van labeltape en de druppel van 2%-3% agarose (10 μL). Vervolgens wordt in het rechterpaneel een tweede dia bovenop geplaatst in een hoek van 90 ° om de druppel agarose af te vlakken tot de dikte van de tape. Zodra de agarose is gestold, worden de dia's zorgvuldig gescheiden. De agarose pad hecht zich aan een van de dia's. Om uitdroging te voorkomen, worden de nematoden binnen een uur na de productie van de dia met pad in een druppel buffer met natriumazide (die de nematoden verlamt) geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De fluorescentiemicroscoop met een digitale camera die in dit onderzoek is gebruikt. De microscoop zit aan een tafel die plaats biedt aan kleine groepen (drie tot vier) studenten. De microscoop heeft een digitale camera aangesloten door een USB-kabel op een computer met de juiste software voor het vastleggen van digitale beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Evaluatie van de effecten van een neonicotinoïde-bevattend bestrijdingsmiddel op de neuronmorfologie. (A) Onbehandelde cholinerge neuronen van de fluorescerende stam LX929. (B) Aan pesticiden blootgestelde (T + S) cholinerge neuronen. (C) Percentage neuronen dat blebbing vertoont in de twee omstandigheden. Foutbalken zijn de standaardfout van het gemiddelde. geeft p < 0,001 aan vanaf een eenrichtings-ANOVA. Een totaal van 113 neuronen van 12 individuele nematoden werden geanalyseerd. Dit cijfer is aangepast van Bradford, et al.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van een mangaanhoudend bestrijdingsmiddel op de morfologie van dopamineneuronen. De studentengroep gaf geen schaalbalk voor hun figuur, maar nam het beeld met 40x vergroting. (A) Vermeende CEPDL en CEPVL neuronale soma (gelabeld) in bestrijdingswormen. Het intacte hoofdneuron somata en hun processen wijzen op een gebrek aan degeneratie. (B) Vermeende CEPD L&R processen (asterisk) en CEPV L&R neuronale soma (gelabeld) in acuut blootgestelde wormen. De soma en processen drukten GFP uit, maar er lijkt een demping van GFP-expressie te zijn in dorsale processen. (C) Vermeende CEPDL en CEPVL neuronale soma (gelabeld) in chronische blootgestelde wormen. De soma drukte geen GFP uit en de processen waren niet zichtbaar, wat wijst op significante degeneratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De protocollen die in dit manuscript worden beschreven, werken met succes alleen of als onderdeel van een meerweeks onafhankelijk studentengroepproject. De protocollen zijn ook vatbaar voor stand-alone, een week verkennende ervaringen. De aaltjestammen zijn goedkoop en gemakkelijk te onderhouden in het onderzoekslaboratorium. Studenten kunnen gemakkelijk leren hoe ze wormen kunnen plukken met een wormenpluk of hoe ze ze kunnen verplaatsen door platen met water te spoelen en ze door de zwaartekracht te laten bezinken. De experimenten kunnen worden uitgevoerd in de loop van een enkele laboratoriumperiode of gedurende meerdere weken. Studenten kunnen zelfstandig hun experimenten ontwerpen, of een procedure kan aan hen worden verstrekt. Het ontleden van microscopen hoeft niet duur te zijn. Het duurste item is de fluorescerende microscoop met een digitale camera. Dit is een beperking voor onderwijslaboratoria die geen toegang hebben tot een fluorescerende microscoop of digitale camera.
Als een fluorescerende microscoop en digitale camera en computerbeeldvormingssysteem niet beschikbaar zijn voor gebruik in het laboratorium, kunnen de studenten specifiek eenvoudig gedrag meten dat wordt bestuurd door bepaalde neuronen. Veel gedragstesten zijn beschikbaar en zijn te vinden in Wormboek9. Het gedrag kan worden beoordeeld met behulp van de ontleedmicroscoop.
Een cruciale stap in dit protocol is het voorbereiden van de microscoopglaasjes op de natte mounts van de aaltjes. Een andere cruciale stap is het toevoegen van de nematoden aan de druppel. Een laatste cruciale stap in het protocol is ervoor te zorgen dat de nematoden niet zo lang worden blootgesteld aan de fluorescerende verlichting dat het signaal wordt gebleekt. Het zou belangrijk zijn voor de instructeur om op deze kritieke stappen te wijzen, zodat studentengroepen oefenen en goed letten op de instructies die ze krijgen.
Het meest opwindende aspect van deze methodologie is dat studenten nieuwe en authentieke experimenten kunnen ontwerpen en uitvoeren die publiceerbare resultaten kunnen opleveren of de basis kunnen vormen voor meer geavanceerd onderzoek, zoals een senior onderzoeksproject. De procedures kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan pesticiden, mengsels van pesticiden en vele andere verschillende milieuchemicaliënte bestuderen 10, wat studenten een echt relevante onderzoekservaring en training biedt in experimenteel ontwerp, gegevensanalyse, figuurvoorbereiding en presentatie van resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Het werk dat in dit manuscript wordt beschreven, is gedaan voor een klas op gemiddeld niveau in de neurowetenschappen. Fondsen voor de reagentia en benodigdheden werden verstrekt door de afdeling Biologie aan het Vassar College. De microscopen en het digitale beeldvormingssysteem werden ook geleverd door de afdeling Biologie van het Vassar College. De auteur bedankt alle vele studenten die deze cursus hebben gevolgd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fisher Scientific | BP97445 | |
| Agarose | Fisher Scientific | MP1AGAH0250 | |
| Alcohol lamp | Fisher Scientific | 17012826 | |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 17-012-820 | |
| C. elegans strains | C. elegans Genetics Center | ||
| CaCl | Fisher Scientific | 10035-04-8 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | AAA1147030 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-AP | |
| Digital camera | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| E. coli strain (OP50) | C. elegans Genetics Center | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | |
| Fluorescent scope | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Imaging software | Nikon | These can vary depending on the requirement | |
| Inoculation loop | Fisher Scientific | 131045 | |
| LB Broth Base | Fisher Scientific | BP9723-500 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 05408129 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 22-265446 | |
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 94060316 | |
| Pipetters | Fisher Scientific | 14-386-319 | |
| Platinum wire | Genesee Scientific | 59-1M30P | |
| Potassium Phosphate buffer | Fisher Scientific | AAJ61413AP | |
| Sodium azide | Fisher Scientific | AC447810250 |
References
- Duzguner, V., Erdogan, S. Chronic exposure to imidacloprid induces inflammation and oxidative stress in the liver & central nervous system of rats. Pesticide Biochemistry and Physiology. 104 (1), 58-64 (2012).
- Catae, A. F., et al. Exposure to a sublethal concentration of imidacloprid and the side effects on target and nontarget organs of Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Ecotoxicology. 27 (2), 109-121 (2018).
- Bradford, B. R., Whidden, E., Gervasio, E. D., Checchi, P. M., Raley-Susman, K. M. Neonicotinoid-containing insecticide disruption of growth, locomotion, and fertility in Caenorhabditis elegans. PLOS One. 15 (9), 0238637 (2020).
- Jospin, M., et al. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 7 (12), 1000265 (2009).
- Susman, K. Discovery-Based Learning in the Life Sciences. , Wiley Blackwell. Hoboken, New Jersey. (2015).
- Stiernagle, T.
- Brody, H. A., Chou, E., Gray, J. M., Pokyrwka, N. J., Raley-Susman, K. M. Mancozeb-induced behavioral deficits precede structural neural degeneration. NeuroToxicology. 34, 74-81 (2013).
- Chen, P., Martinez-Finley, E. J., Bornhorst, J., Chakraborty, S., Aschner, M.
- Hart, A.
- Harlow, P. H., et al. The nematode Caenorhabditis elegans as a tool to predict chemical activity on mammalian development and identify mechanisms influencing toxicological outcome. Scientific Reports. 6 (1), 22965 (2016).
