Summary
本プロトコルは、シミュレートされた廃用環境への曝露後のラットの歩行運動変化を描写するための3次元運動追跡/評価を記載する。
Abstract
廃用が神経系に影響を及ぼし、関節の動きが変化することはよく知られています。しかし、どのアウトカムがこれらの特性を適切に示すかはまだ不明である。本研究では,映像キャプチャからの3次元(3D)再構成を利用した動作解析手法について述べる.この技術を用いて、模擬微小重力環境にさらされたげっ歯類において、後肢を尾で降ろすことによって、不使用誘発の歩行性能の変化が観察されました。2週間の荷降ろしの後、ラットはトレッドミルの上を歩き、歩行運動を4台の電荷結合素子(CCD)カメラでキャプチャしました。3Dモーションプロファイルを再構築し、画像処理ソフトウェアを使用して対照被験者のモーションプロファイルと比較しました。再構築されたアウトカム指標は、歪んだ歩行運動の明確な側面をうまく描写しました:膝と足首の関節の過伸展と立脚期中の股関節のより高い位置。モーション解析は、いくつかの理由で役立ちます。まず、主観的な観察(特定のタスクでの合格/不合格など)の代わりに定量的な行動評価が可能になります。次に、基本的なデータセットを取得したら、特定のニーズに合わせて複数のパラメーターを抽出できます。より広範な適用のハードルにもかかわらず、労働集約度およびコストを含むこの方法の欠点は、包括的な測定および実験手順を決定することによって軽減され得る。
Introduction
身体活動の欠如または廃用は、筋萎縮および骨量減少1および全身のコンディショニング解除2などの自発運動エフェクターの劣化をもたらす。さらに、最近、不活動が筋骨格成分の構造的側面だけでなく、運動の質的側面にも影響を与えることが注目されています。例えば、模擬微小重力環境にさらされたラットの四肢位置は、介入終了後1ヶ月でも無傷の動物のそれとは異なっていた3,4。それにもかかわらず、非活動によって引き起こされる運動障害についてはほとんど報告されていません。また、劣化の包括的な運動特性は完全には決定されていません。
現在のプロトコルは、後肢の除荷を受けたラットの廃用によって誘発される歩行運動障害を参照することにより、運動変化を視覚化するための運動学的評価の適用を実証し、議論しています。
模擬微小重力環境後の歩行における四肢の過伸展は、ヒト5と動物4,6,7,8の両方で観察されることが示されています。そこで普遍性のために、本研究では一般的なパラメータである膝関節と足首関節の角度と、立脚期の中間点(中脚)における中足指節関節と股関節の垂直距離(股関節の高さにほぼ相当)に着目した。さらに、ビデオ運動学的評価の潜在的な応用が議論で示唆されています。
一連の運動学的分析は、神経制御の機能的側面を評価するための効果的な尺度であり得る。しかし、モーション解析は、フットプリント観察またはキャプチャされたビデオ9,10の単純な測定から複数のカメラシステム11,12まで開発されているが、普遍的な方法およびパラメータはまだ確立されていない。本研究の方法は、この関節運動解析に包括的なパラメータを提供することを目的としています。
前研究13では、神経病変モデルラットの歩行変化を網羅的な映像解析を用いて図解することを試みた。ただし、一般に、モーション解析の潜在的な結果は、解析フレームワークで提供される所定の変数に制限されることがよくあります。このため、本研究では、広く適用可能なユーザー定義パラメータを組み込む方法をさらに詳しく説明しました。ビデオ解析を使用した運動学的評価は、適切なパラメータが実装されている場合、さらに役立つ可能性があります。
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Protocol
本研究は、京都大学動物実験委員会(医学会14033)の承認を受け、国立衛生研究所のガイドライン(実験動物の管理と使用に関するガイド、第8版)に準拠して実施されました。7週齢の雄のWistarラットを本研究に使用した。手順のシーケンスを表す概略図は、 補足ファイル 1 に記載されています。
1.ラットにトレッドミルウォーキングに慣れる
注:手順の詳細については、以前に公開されたレポート13 を参照してください。
- げっ歯類用に設計されたトレッドミルにラットを置きます( 材料の表を参照)。最初のセッションでは、動物がトレッドミルを探索して環境に慣れるようにします。
注: このプロセスには約 5 分かかります。 - ベルトの速度を希望のレベル(20 cm / s)まで徐々に上げ、ラットを歩きます。必要に応じて、トレッドミルの端に感電を使用してください14。
注:1回のウォーキングセッションは約10〜20分続きます。 - このプロセスを1日おきに1週間以上繰り返します必要に応じて15,16,17。
注意: 手順1の2週間前に習熟期間を開始します。 - ラットをケージ(各ケージに2〜3匹のラット)のグループで12時間の明暗サイクルで保ちます。.食料と水を 自由に提供します。
2. 後肢除荷のラットへの適用と関節マーカーの設置
注:以前の報告18、19、20に記載されているように、尾に取り付けられた糸と粘着テープを使用してラットの後肢を持ち上げます。尾の皮が滑らないように、糸とテープが尾の付け根に取り付けられていることを確認してください。動物を徹底的に監視し、必要に応じてテープの荷降ろし高さまたは気密性を調整します。
- 麻酔マスクによる2〜5%イソフルラン吸入下で、ラットの尾の近位部分に長さ30cmの粘着テープのストリップの前半を巻き付ける。
- 長さ1mの綿糸(綿の台所撚り糸、直径約1mm)を半分に折ります。折りたたまれた50 cmの中間点で結び目を結ぶことによってループを作ります。結び目は、5 cmの円周ループを残すために、先端から約10 cmである必要があります。
- 粘着テープの残りの15 cmをスレッドループに一度通してテープを固定します。残りのテープを尾の遠位部分に巻き付けます。
- スレッドのもう一方の先端をケージのオーバーヘッドプラットフォームに固定します。動物を尾で後肢を持ち上げるのに十分な高さのケージに入れてください。荷降ろし以外は、Ctrlグループと同じ環境(食料、水、床敷きなど)を提供します。
- 以下の手順に従って、ジョイントマーカーとソフトウェア( 材料表を参照)を設定します。
注:この手順の詳細については、Wangら13を参照してください。- 2〜5%イソフルラン吸入下で、骨のランドマークに対応する剃毛された皮膚に着色された半球マーカー(直径3mm)を取り付けます。非常に深い麻酔を防ぐために、イソフルランレベルをできるだけ低く保ってください。
- ランドマークが前上腸骨棘(ASIS)、大転子(股関節)、膝関節(膝)、外側くるぶし(足首)、および第5中足指節関節(MTP)であることを確認します21。
注意: つま先の角度が必要な場合は、つま先の先端をペイントします。油性塗料マーカーを使用します( 材料表を参照)。液体の形態はより速く乾燥するので、液体の接着剤は接着剤にとって好ましい。
3.キャプチャしたビデオを使用したマーカー追跡
- モーションレコーダーアプリ(材料表を参照)を開き、トレッドミルをオンにします。ラットをトレッドミルベルトに置きます。
注意: ビデオキャプチャ用の4台のカメラ( 資料表を参照)は、トレッドミルの長いエッジに沿って配置されています:各エッジに約50 cm x 50 cm間隔で、トレッドミルベルト領域の中央に面した2台のカメラ。 - ベルト速度を最大20 cm / sまで上げます。ラットが希望の速度で正常に歩き始めたら、 録画 ビデオキャプチャを開始するアイコン。十分なステップ(5つの連続したステップ、できれば10ステップ)が得られたら、 記録 アイコンをもう一度クリックしてキャプチャを停止します。
注:1回の実験で複数の動物のデータをキャプチャします。ラットごとに最大5回試してください。ラットが歩かない場合は、別のラットを捕獲し、後で最初のラットを試してください。カメラのキャプチャレートは120フレーム/秒でした。 - 3DCalculatorアプリ(材料表を参照)と分析するビデオファイルを開きます。
- 上部の水平スライダーバーを調整して、十分な数の連続したステップを含むようにビデオをトリミングします。キャプチャされた画像は、黄色のスライドバーの端の先端アイコンをドラッグすると変化します。
- マーカーをキャプチャするには、スティックピクチャーモデルのマーカーの凡例をクリックし、キャプチャしたビデオの対応するマーカーにドラッグしてボタンを離して、マーカーの 凡例 を選択します。このプロセスにより、マーカーの色がスティック画像のマーカーの凡例に割り当てられます。追跡するすべてのマーカーについて、このプロセスを繰り返します。
- 自動トレースアイコンをクリックします。システムがマーカーを正確に追跡しない場合、またはマーカーの損失により追跡プロセスが停止した場合は、手動モードに切り替えます。
注: この自動プロセスは、マーカーが見落とされない限り停止しません。停止が数フレームごとよりも頻繁に発生する場合は、失われたマーカーを再配置することを検討してください。 - 手動モードが必要な場合は、[ 手動 ]アイコンをクリックして切り替えます。スティック画像上の 欠落マーカーの凡例 とビデオ上の対応するマーカーをクリックします。ビデオは、手動モードでクリックするたびに1フレーム進行します。
注:マーカーを追跡(デジタル化)する人の疲労を防ぐために、自動クリックを可能にする無料で利用可能なアプリを利用してください( 材料表を参照)。
4. 所望のパラメータの計算
- KineAnalyzer アプリ (マテリアルの表を参照) を開き、ファイルを読み込みます。
- マーカーマスターの表示>編集メニューに移動します。「マーカーマスター編集」ウィンドウが開きます。
注: キャプチャされたマーカーには、ラベルが付けられるまで単純な番号が付けられます。 - マーカータブで目的のラベル(ランドマーク)をクリックしてから、目的の色をクリックします。このプロセスでは、各マーカーを特定のランドマークに指定します。
- リンクタブに移動します。2つのマーカーを連続してクリックして線を作成します。このプロセスでは、ラベル付きマーカーを使用して、各手足に対応する線を作成します。
- 作成した線に色を割り当てるには、[色]列から目的の 色 を選択します。
- 参照/移動線と角度の方向を割り当てることにより、角度を定義します。[角度]タブに移動します。角度に名前を付けた後、各ランドマークに対応するマーカーをクリックして、ベクトルA(基準線)とベクトルB(移動線)を割り当てます。次に、同じタブの操作セクションの値を使用して角度の方向を定義します。
注:本研究では、主に立脚期の中間(中盤)に焦点を当てたパラメータ:KSt(膝の角度)、ASt(足首の角度)、MHD(中足骨の股関節の距離:股関節の高さに相当、次のセクションを参照)。膝の角度と足首の角度は、それぞれ大腿骨と脛骨、脛骨と第5中足骨の間の角度として定義されました。0°の角度は、ジョイントが完全に曲がっていることを意味します。 - [距離] タブで、距離パラメーター (MHD) を定義します。[距離設定]セクションで対応する2つのマーカーを選択します。正規化されたステップサイクルの関数としての関節軌道も利用可能になります。
注: 角度/パラメータの定義は、1 回だけ実行する必要があります。パラメータの設定は、この定義プロセスが完了すると、後で評価できるようになります。
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Representative Results
12匹の動物を、荷降ろし群(UL、n = 6)または対照群(Ctrl、n = 6)の2つのグループのうちの1つにランダムに割り当てた。UL群では、動物の後肢を尾部から2週間(UL期間)降ろしたが、Ctrl群では自由のままとした。荷降ろしの2週間後、UL群はCtrl群と比較して明確な歩行パターンを示した。図1は、代表的な被験者の正規化された関節軌跡を示す。立脚期には、UL群は「つま先歩行」と呼ばれるCtrl群よりも膝と足首のさらなる伸展(すなわち足首の足底屈曲)を示した3,16。本研究の目的は,これらの運動劣化の総合的特徴を明らかにすることである。これらの全体的な結果から定量的測定値を解明するために、上記のように3つのパラメーターが実装されました:KSt、中間の膝の角度。A足首の角度;MHD、中足骨股関節距離(第5中足指節関節と股関節との間の垂直距離)は、中部における股関節の高さと実質的に同等である。
2週間後(除荷後2週間)の時点で、UL群のKStとAStの両方がCtrl群のKStとAStの両方よりも有意に大きかった(図2A、B、対応のないt検定:p < 0.01)。さらに、MHDはUL群でかなり高かった(図3、対応のないt検定:p < 0.01)。中弯期の足の位置を補足図1に示します。
荷降ろしによる活動の低下は、神経変化を引き起こす可能性があります22,23,24,25。これらの変化は、自発運動系の機能的特徴3,4および筋骨格系の特徴の悪化につながる可能性があります。上記のパラメータの有意な変化は、それらの神経変化に起因し得る。
図1:代表的な被験者の正規化された関節軌道。 縦軸は、ダイアグラムの軌道がほぼ中央に表示されるように調整されます。(A)除荷群の膝関節と(B)足首関節は、立脚期に対照群よりもさらに伸展(足首に対する足底屈曲)を示した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:中盤の膝と足首の関節角度。 除荷群は、対照群よりも(A)KSt(膝)と(B)Ast(足首)の両方で有意に大きな角度を示しました(対応のないt検定: p < 0.01)。エラーバーは95%信頼区間を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:中央での股関節の高さ。 除荷群の中足骨股関節距離は対照群よりも有意に高かった(対応のないt検定: p < 0.01)。エラーバーは95%信頼区間を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:手順のシーケンスを表す概略図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図1:中弓期におけるラットの足の位置。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ビデオ1:下からの足音の追跡。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足動画2:到達動作の評価。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
環境の変化は、自発運動系の機能的側面および筋骨格的構成要素の変動をもたらす26,27。収縮構造または環境の異常は機能的能力に影響を与える可能性があり、機械的/環境的歪みを解決した後でも持続します19。客観的な動作解析は、これらの機能的能力を定量的に測定するのに役立ちます。上記のように、ビデオ分析はそのようなパラメータを取得するための強力な方法論です。
ビデオ分析のために共同ランドマークを追跡するために、赤外線マーカーとカメラを使用することが一般的ですが、手動追跡も一般的です10,28。色付きの半球形のマーカーを自動キャプチャプロセスと組み合わせると、この追跡プロセスがよりシンプルで費用効果が高くなります。この追跡方法は、皮膚の滑りによる結果の潜在的な変動にもかかわらず、本研究に組み込まれました。この皮膚の滑りに対処するために、Bojadosらは、皮膚の下の骨に直接マーカーを埋め込んだX線撮影アプローチも試みました17。
モーション解析のもう一つの利点は、基礎データセットが得られたら、複数の機能的側面を抽出することです。特徴的な動きは影響を受ける関数の点で異なるため、データ収集後でも異なるパラメータへのデータ変換は大きなメリットとなります。歩行プラットフォームの下に45度傾斜したミラーを配置することで、足音の追跡も実現できます。さらに、映像解析の応用は歩行動作にとどまらない(補足動画1、 補足動画2)。
これらの利点にもかかわらず、モーション解析、特に3D解析アプローチには限界があります。まず、この方法論はデバイスのコンステレーション(つまり、動物用のトレッドミル、複数のカメラ、アプリ)として機能するため、デバイスのセットアップ全体が高価になる可能性があります。第二に、実験手順は労働集約的であり、オペレーターは手順に完全に慣れる必要があります。
ただし、歩行分析と関節角度の両方に適用できることを考慮すると、広く利用可能になると、その利点は欠点を上回ります。将来の研究では、この分析シリーズを提供するために、より幅広い機能評価でビデオ分析を利用する可能性があります。
3Dモーショントラッキング/評価は、動きの機能的変化を定量的に評価するための強力なツールです。この方法論の実施に対する障害は、さらなる研究によって解決される可能性があります。
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Disclosures
著者は、利益相反はないと宣言しています。
Acknowledgments
本研究の一部は、日本学術振興会科研費(番号18H03129, 21K19709, 21H03302, 15K10441)および国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED)(番号15bk0104037H0002)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive Tape | NICHIBAN CO.,LTD. | SEHA25F | Adhesive tape to secure thread on tails of rats for hindlimb unloading |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Auto clicker | N.A. | N.A. | free software available to download to PC (https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=auto+clicker) |
| CCD Camera | Teledyne FLIR LLC | GRAS-03K2C-C | CCD (Charge-Coupled Device) cameras for video capture |
| Cotton Thread | N.A. | N.A. | Thread to hang tails of rats from the ceiling of cage |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| Joint marker | TOKYO MARUI Co., Ltd | 0.12g BB | 6 mm airsoft pellets that were used as semispherical markers with modification |
| Kine Analyzer | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for analysis |
| Konishi Aron Alpha | TOAGOSEI CO.,LTD. | #31204 | Super glue to attach spherical markers on randmarks of rats |
| Motion Recorder | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software for video recording |
| Paint Marker | MITSUBISHI PENCIL CO., LTD | PX-21.13 | Oil based paint marker to mark toes of animals |
| Three-dimensional motion capture apparatus (KinemaTracer for small animals) | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | 3D motion analysis system that consists of four cameras (https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ or https://micekc.com/en/) |
| Three-dimensional(3D) Calculator | KISSEI COMTEC CO.,LTD. | N.A. | Software fo marker tracking |
| Treadmill | MUROMACHI KIKAI CO.,LTD | MK-685 | Treadmill equipped with transparent housing, electrical shocker, and speed control unit |
| Wistar Rats (male, 7-week old) | N.A. | N.A. | Commercially available at experimental animal sources |
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