Summary
여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
포유류 미토콘드리아 (mt) DNA는 전자 수송 사슬의 13 개 서브 유닛을 암호화하는 작고 원형의 이중 가닥 미토콘드리아 내 DNA 분자입니다. 이배체 핵 게놈과 달리 대부분의 세포에는 세포 유형에 따라 100개 미만에서 200,000개 이상의 사본에 이르는 mtDNA 사본이 더 많이 포함되어 있습니다. MtDNA 복제 수는 여러 연령 관련 퇴행성 질환 및 질병에 대한 바이오마커로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 따라서 mtDNA 복제 수의 정확한 측정은 연구 및 진단 환경 모두에서 핵심 도구가 되고 있습니다. 종종 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 또는 결실로 발생하는 mtDNA의 돌연변이는 세포 내 mtDNA의 모든 사본 (동형 플라즘이라고 함) 또는 돌연변이 및 WT mtDNA 사본의 혼합물 (이종 플라스미라고 함)로 존재할 수 있습니다. 이종질 mtDNA 돌연변이는 희귀 질환 또는 파킨슨병과 같은 점점 더 많은 일반적인 후기 발병 질환에서 임상 미토콘드리아 병리의 주요 원인입니다. 세포에 존재하는 이형질의 수준을 결정하는 것은 희귀 미토콘드리아 질환의 진단과 미토콘드리아가 역할을 할 수있는 일반적인 후기 발병 장애를 이해하기위한 연구에서 중요한 단계입니다. MtDNA 복제 수 및 이형질은 전통적으로 정량적 (q) PCR 기반 분석 또는 심층 시퀀싱에 의해 측정되었습니다. 그러나 최근 도입된 ddPCR 기술은 두 파라미터를 모두 측정하기 위한 대체 방법을 제공했습니다. 절대 mtDNA 복제 수를 측정할 수 있는 기능과 낮은 복제 수에서도 단일 세포에서 정확한 측정을 수행할 수 있는 충분한 감도를 포함하여 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 ddPCR을 사용하여 단일 세포에서 mtDNA 복제 수의 측정을 설명하는 자세한 프로토콜이며, 이후 액적 생성 PCR이라고 하며, mtDNA가 결실된 세포에서 이형질을 동시에 측정하는 옵션이 있습니다. mtDNA SNP를 가진 세포에서 이형질을 측정하기 위해이 방법을 확장 할 가능성도 논의된다.
Introduction
포유류 미토콘드리아(mt)DNA는 2개의 rRNA, 22개의 tRNA 및 13개의 단백질 코딩 유전자로 구성된 37개의 유전자를 암호화하는 미토콘드리아 매트릭스에 상주하는 작은(약 16.5Kb) 원형 DNA게놈입니다. 세포당 각 유전자의 사본이 하나(반수체) 또는 두 개(이배체) 복제를 포함하는 핵 게놈과 달리 mtDNA는 각 세포의 미토콘드리아에 수십 개의 사본(예: 성숙한 정자세포)에서 수십만 개의 사본(예: 난모세포)에 이르기까지 여러 사본으로 존재합니다2,3. 이러한 다중 복제 특성의 결과는 단일 염기 다형성(SNP), 결실 또는 복제로 존재할 수 있는 mtDNA 게놈의 돌연변이가 주어진 세포에서 다양한 수준으로 존재할 수 있으며 세포의 전체 mtDNA 집단의 0%에서 100%까지 구성할 수 있다는 것입니다. 동일한 세포에 야생형 및 돌연변이 mtDNA 게놈이 존재하는 것을 이형질이라고 하며, 병원성 이형질 mtDNA 돌연변이는 미토콘드리아 질환의 주요 원인이며, 몇 가지 일반적인 신경 증후군이 근본적인 이형질 mtDNA 돌연변이와관련이 있습니다4.
임상 질환을 유발하는 이형질 mtDNA 돌연변이의 가능성에 기여하는 두 가지 주요 매개 변수는 이형질 수준과 mtDNA 복제 수입니다. 많은 이형질 돌연변이는 역치 효과를 나타내며, 생화학 적 및 임상 적 표현형은 특정 이형질 수준 (일반적으로 약 80 % 5) 이상에서만 분명 해지고 이형질이 더 증가함에 따라 악화됩니다4. 그러나 세포에 존재하는 mtDNA의 사본 수를 고려하는 것도 중요한데, 이는 주어진 이형질 수준에 존재하는 야생형(즉, '건강한') mtDNA 게놈의 수에 영향을 미치기 때문입니다. 미토콘드리아 질환 환자에 대한 연구는 이형질과 복제 번호5,6 사이의 이러한 상호 작용의 중요성을 강조했으며, Filograna et al.은 최근 미토콘드리아 질환7의 마우스 모델에서 변하지 않은 이형질에도 불구하고 증상을 완화시키는 mtDNA 복제 수의 증가를보고했습니다.
최근 몇 년 동안 mtDNA 이종질로 인한 질병의 발병 기전 및 전염에 대한 이해를 향상시키기 위해 많은 작업이 수행되었지만, 이 작업의 대부분은 세포가 아닌 조직 수준에서 수행되어 평균 조직 이형질 수준과 대량 조직 생검 및 혈액 샘플에서 얻은 복제 수 측정을 비교합니다. 레이저 포획 미세 해부와 같은 일부 잘 정립 된 기술은 세포 수준 8,9에서 이러한 측정을 허용합니다. 그러나 최근 고처리량 단일 세포 분석 방법 또는 소위 "단일 세포 오믹스"10의 폭발적인 증가로 인해 단일 세포 수준에서 이러한 중요한 mtDNA 파라미터를 정확하게 측정할 수 있는 방법에 대한 요구가 생겼습니다.
액적 생성 PCR 방법은 샘플DNA 11에서 특정 표적 앰플리콘의 PCR 증폭을 통해 알려지지 않은 DNA 농도를 정량하는 기존 방법을 개선하기 위해 미세 유체 기술의 최근 발전을 이용합니다. 샘플 DNA가 단일 반응으로 증폭되는 qPCR과 달리 PCR 산물의 상대적 축적 속도가 판독값으로 작용하여 이 방법은 초기 샘플을 수천 개의 개별 방울로 분할하여 샘플 DNA 분자를 공간적으로 분리된 반응으로 구획화합니다12. 후속 PCR 반응은 각 개별 액적에서 진행되며 PCR 산물은 표적 DNA를 포함하는 액적에만 축적됩니다. 이 반응의 결과는 표적 DNA 및 증폭 된 PCR 산물의 사본을 포함하거나 표적 DNA를 포함하지 않는 물방울 풀 형태의 디지털 출력입니다. 형광 DNA 프로브 또는 이중 가닥(ds)DNA 결합 염료를 사용하여 증폭된 산물을 포함하는 액적을 계수할 수 있으며 '양성' 대 '음성' 방울의 비율을 사용하여 초기 샘플에 존재했던 DNA 사본의 절대 수를 계산할 수 있습니다. qPCR 반응에서 얻은 상대적 측정과 반대되는 이 절대 측정은 이 방법론을 단일 세포에서 mtDNA 복제 수 및 이형질의 정확한 측정에 사용할 수 있게 하는 핵심 요소이며11, 최근의 여러 연구에서 이미 이러한 목적으로 액적 생성 PCR 기술을 활용했습니다.13,14 . 이 기사는 인간과 마우스 조직 모두에서 단일 세포에서 mtDNA 복제 수와 결실 이형질을 측정하는 방법을 제시합니다.
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Protocol
모든 실험은 REACH 지침을 따랐으며 캠브리지 대학 동물 복지 윤리 검토 기관 (AWERB)의 승인을 받았습니다.
알림: 액적 생성 전 모든 샘플 준비 단계는 깨끗한 사전 PCR 작업 영역, 가능하면 UV 멸균 캐비닛에서 수행해야 합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 특정 액적 생성 PCR 장비( 재료 표 참조)를 사용하며, 일반적인 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있어야 하지만 프라이머/프로브 농도, PCR 사이클링 조건 등에 관한 제조업체의 지침을 참조하는 것이 좋습니다. 본 연구에 사용된 세포주/일차 세포는 다음과 같았다: 인간 HeLa 세포 (상업적으로 입수), 인간 HEK 293T 세포 (상업적으로 입수), 일차 인간 진피 섬유아세포 세포 (뉴캐슬 바이오뱅크로부터 입수), 인간 사이브리드 (WT &ΔH2.1 결실15, C. Moraes, University of Miami로부터 입수), 마우스 배아 섬유아세포 (불멸화, C57Bl/6 마우스로부터, J. Stewart로부터 입수, 뉴캐슬 대학교), 마우스 원시 생식 세포 (C57Bl/6 마우스 배아에서 얻음) 및 마우스 MII 난모세포 (성인 암컷 C57Bl/6 마우스에서 얻음). 모든 배양된 세포는 5%CO2로 37°C에서 10% 소 태아 혈청이 보충된 고포도당(4.5g/L) DMEM에서 유지되었습니다. 본 연구에 사용된 1차 마우스 세포는 내무부 프로젝트 라이센스 P6C97520A에 따라 1986년 동물(과학적 절차)법에 따라 사육된 동물로부터 분리되었다.
1. 관심 DNA 서열을 표적으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 설계 및 합성
참고: 액적 생성 PCR은 앰플리콘 특이적 프로브 대신 dsDNA 결합 염료를 사용하여 수행할 수도 있습니다.
- 프라이머 및 프로브 서열은 시스템 제조업체가 제공한 지침에 따라 설계합니다. 인간16,17 및 마우스18 세포 모두에서 단일 세포 mtDNA 복제 수/결실 이종질을 측정하기에 적합한 검증된 프라이머 및 프로브 서열이 표 1에 제공된다. 대체 표적 서열을 선택할 때 다음 사항을 고려하십시오.
- 단일 PCR 분석에서 두 개의 프라이머/프로브 세트를 다중화하되 두 분석이 하나의 FAM 표지 프로브와 하나의 HEX 표지 프로브를 사용하는지 확인하여 표적 앰플리콘을 액적 판독기로 구별할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜은 이중 프로브 분석을 제시합니다. 신중한 실험 설계를 통해 멀티플렉싱을 최대 4 개의 대상까지 늘릴 수 있으며 대체 플랫폼은 고차원 멀티플렉싱을 달성 할 수 있습니다.
- 별도의 mtDNA 서열을 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트를 멀티플렉싱할 때 두 프라이머 세트에서 생성된 앰플리콘이 겹치지 않도록 하십시오.
- mtDNA 결실을 운반하는 샘플에서 이형질을 측정할 때 하나의 표적 앰플리콘이 예상되는 결실 영역 내에 있고 다른 앰플리콘이 예상되는 결실 영역 밖에 있는지 확인하십시오.
참고: 대체 분석을 위한 최적의 PCR 사이클링 조건은 단계 5.1에 인용된 것과 다를 수 있습니다. 분석 최적화에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.
2. 단일 세포에서 DNA 분리
참고: 이 방법은 최대 100개 셀의 작은 벌크 샘플에도 사용할 수 있습니다.
- 형광 활성화 세포 분류(FACS)19 또는 레이저 포획 미세 해부(20)와 같은 적절한 방법을 사용하여 가능한 한 작은 부피로 적절한 용기(예: 96웰 플레이트)에 단일 세포를 수집합니다. 단일 세포 분리 전 또는 도중에 세포 생존율 염료를 사용하면 죽은 세포를 분리 할 가능성을 최소화 할 수 있습니다. 원하는 경우 단일 세포를 용해 완충액으로 직접 분류하고 분석 전에 -80°C(최대 6개월)에서 보관하십시오.
- 세포를 적합한 용해 완충액(이 연구에 사용된 완충액은 단계 2.2.1에 기재되어 있다)의 작은 부피(<10 μL)로 용해시킨다.
참고: 이 연구의 세포에서 얻은 모든 데이터는 단일 세포 용해물 또는 20개 세포 풀에서 얻은 것입니다(샘플 크기는 그림 범례에 규정되어 있음). 액적 생성 PCR 프로토콜의 액적 생성 단계 동안 오일/액적 에멀젼의 효율적인 형성은 샘플 내의 세제의 존재에 의해 크게 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 실험 샘플을 진행하고 가장 작은 실제 부피의 용해 완충액을 사용하기 전에 의도한 입력 농도에서 액적 생성과 모든 세포 용해 완충액의 호환성을 검증하는 것이 좋습니다. 다음 용해 프로토콜은 액적 생성 효율에 미치는 영향을 최소화합니다.- 50 mM Tris-HCl pH 8.3, 1 % TWEEN-20 및 200 μg / mL 단백질 분해 효소 K를 함유하는 용해 완충액을 준비한다.
- 각 샘플에 2.5μL의 용해 버퍼를 추가하고 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉한 다음 샘플을 1,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 플레이트 커버에 액체가 응축되는 것을 방지하기 위해 가열된 뚜껑을 105°C로 설정한 상태에서 thermocycler에서 37°C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다.
- 각 샘플에 7.5μL의 뉴클레아제 자유수를 추가하여 10μL의 최종 샘플 부피를 얻고 플레이트를 다시 밀봉한 다음 샘플을 1,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리합니다.
- 80 ° C의 열 순환기에서 15 분 동안 배양하여 (가열 된 뚜껑을 105 ° C로 설정) Proteinase K를 비활성화합니다.
- 샘플을 1,000 x g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리한 다음 얼음 위에 유지합니다.
- 아래의 3단계로 진행합니다.
참고: 세포 용해물은 단계 3을 계속하기 전에 -20°C에서 보관할 수 있습니다. 그러나 가능한 경우 새로 용출된 DNA를 사용하여 DNA 분해를 초래하는 동결-해동 주기의 위험을 제거하십시오.
3. 시료 준비
참고: 결과의 정확성을 보장하기 위해 샘플 및 비템플릿 대조군(NTC)의 기술 복제가 각 분석 플레이트에 포함되어 있는지 확인합니다. 액적 생성 PCR 분석의 동적 범위는 반응당 표적 앰플리콘의 최대 120,000 카피입니다. 단일 세포 또는 소형 벌크 세포 샘플 용해물의 경우 희석이 필요하지 않을 수 있으며 용해물 혼합물을 mtDNA 복제 수 측정을 위해 반응에 직접 입력할 수 있습니다(예: 10μL의 용해물 샘플을 분할하여 각 분석에 직접 3μL를 입력하여 삼중으로 실행할 수 있음). 그러나, 매우 높은 카피 mtDNA 수를 갖는 세포 (예를 들어, 난 모세포) 또는 더 많은 수의 세포 (예를 들어, 50-100)를 함유하는 세포로부터의 희석되지 않은 용해물을 사용하는 것은이 동적 범위를 초과 할 수있다. 이러한 경우, 특정 세포 유형/세포 수에 대한 분석의 포화를 피하는 적절한 희석 인자를 식별하기 위해 초기 연속 희석이 필요합니다(자세한 내용은 대표 결과 참조).
- 얼음, 소용돌이 위에서 모든 시약을 해동하고 사용하기 전에 잠시 스핀다운하십시오.
- (표 2)에 설명된 대로 얼음 위에 마스터 믹스(샘플 DNA 제외)를 준비합니다.
참고: 하나의 표적 앰플리콘만 측정하는 경우 샘플당 뉴클레아제가 없는 물 2.55μL를 추가하여 최종 부피 22μL를 달성합니다. 분석할 샘플 및 NTC 수에 맞는 충분한 마스터 믹스와 액적 생성 PCR 플레이트에 필요한 '블랭크' 웰을 설명하기에 충분한 마스터 믹스를 준비합니다(다음 단계 참조). - 준비된 마스터 믹스를 간단히 와동시켜 필요한 부피(22μL - 입력 DNA 부피)를 액적 생성 PCR 96-웰 플레이트의 각 웰에 혼합하고 분취합니다. 샘플을 96웰 플레이트의 전체 컬럼에 배열합니다. 불완전한 컬럼의 빈 우물을 마스터 믹스로 채우고 NTC로 사용하십시오.
- 각 샘플 웰에 입력 DNA를 추가하고 NTC 웰에 뉴클레아제가 없는 물/용리 버퍼를 추가하여 각각의 총 부피를 최대 22μL로 만듭니다.
- 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 셰이커에 2,000rpm으로 1분 동안 놓은 다음 4°C에서 1분 동안 1,000 x g 로 원심분리합니다.
- 접시를 얼음 위에 놓고 4단계로 진행합니다.
알림: 준비된 플레이트는 액적 생성을 진행하기 전에 얼음 위에 보관하고 짧은 시간 (예 : 1-2 시간) 동안 빛으로부터 보호 할 수 있습니다.
4. 물방울 생성
알림: 이 섹션에서 참조하는 액적 발생기 계기 데크의 회로도는 그림 1A 를 참조하십시오.
- 액적 발생기의 전원을 켭니다.
- 액적 생성 오일 병이 계기판 E의 위치에 로드되었는지 확인하십시오. 메시지가 표시되면 화면의 지시에 따라 병을 교체하십시오.
- 터치 스크린에서 샘플 플레이트 구성을 클릭합니다. 샘플/블랭크가 포함된 샘플 플레이트의 모든 열을 선택합니다.
참고: 이 단계에서 플레이트 이름 및 실험 세부 정보 입력은 선택 사항이며 실험 설정을 계속할 필요가 없습니다. - 확인을 클릭하여 플레이트 구성을 확인합니다. 계기판 갑판에 주황색 표시등이 켜져 소모품을 적재해야 하는 위치를 나타냅니다.
- 액적 발생기 카트리지를 계기판의 B 위치에 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌도록 합니다.
- 빈 팁 폐기물통을 계기판 데크의 C 위치에 놓습니다.
- 필터 팁 상자에서 뚜껑을 제거하고 모든 표시등이 녹색으로 바뀌도록 계기 스테이지의 D 위치에 로드합니다.
- 샘플 플레이트에서 접착 플레이트 씰을 제거하고 표시등이 녹색으로 바뀌도록 계기 데크의 F 위치에 로드합니다.
- 빈 액적 수집 96웰 플레이트를 냉각 블록(-20°C에서 사전 냉각)에 놓고 표시등이 녹색으로 바뀌도록 기기 데크의 G 위치에 로드합니다.
- 기기 터치 스크린에서 액적 생성 시작을 클릭합니다.
- 계측기 터치 스크린에서 실행 시작을 클릭합니다. 기기 뚜껑이 자동으로 닫힙니다. 초기화 후 액적 생성이 완료될 때까지 남은 시간이 기기 터치 스크린에 표시됩니다.
- 액적 생성이 완료되면 샘플 수집 플레이트를 육안으로 확인하여 각 웰의 오일 상 위에 액적 에멀젼 층이 존재하는지 확인합니다(그림 1B).
알림: 액적 에멀젼 층이 보이지 않으면 실험을 더 진행하지 말고 프로토콜의 이전 단계에서 발생할 수 있는 오류를 확인하십시오. - 계기판 데크에서 사용한 소모품을 치우고 팁 폐기물 통을 비우십시오.
- 플레이트 실러의 전원을 켜고 온도를 180°C로, 밀봉 시간을 5초로 설정하고 기계가 작동 온도에 도달하도록 합니다.
- 샘플 수집 플레이트를 플레이트 실러 플레이트 홀더에 넣고 빨간색 선이 위쪽을 향하도록 플레이트 위에 새 호일 씰을 놓습니다. 호일 씰의 밑면을 만지지 않도록 주의하십시오.
알림: 플레이트 홀더는 실온(RT)에서 보관해야 하며 샘플 수집 플레이트로의 열 전달을 방지하기 위해 호일 씰을 적용할 때만 플레이트 실러 서랍에 넣어야 합니다. - 플레이트 실러가 작동 온도에 도달하면 기기 터치스크린에서 꺼내기를 누릅니다. 서랍이 자동으로 열립니다.
- 플레이트 홀더를 플레이트 실러 서랍에 넣고 씰을 누릅니다. 서랍이 자동으로 닫히고 밀봉이 완료되면 다시 열립니다.
- 콜드 블록의 밀봉된 플레이트를 교체하고 플레이트 실러를 끈 다음 즉시 5단계로 진행합니다.
알림: 이 단계에서는 액적이 불안정하므로 액적 생성 완료 후 1시간 이내에 PCR 단계가 시작되었는지 확인하십시오.
5. PCR
- 밀봉된 액적 수집 플레이트를 96-딥웰 블록이 장착된 PCR 사이클러에 놓고 표 3에 설명된 열 사이클링 프로토콜을 실행합니다.
알림: 가열된 뚜껑 온도를 105°C로 설정하고 시료량을 40μL로 설정합니다. 변성 및 어닐링/확장 단계에는 오일이 올바른 온도와 평형을 이룰 수 있는 시간이 있도록 2°C/s의 온도 램프 속도가 포함되어야 합니다. - 단계 6으로 이동합니다.
알림: 열 순환 프로토콜이 완료되면 액적이 더 안정적이며 플레이트는 다음 단계를 진행하기 전에 4°C에서 최대 4일 동안 보관할 수 있습니다.
6. 물방울 읽기
- 액적 판독기와 연결된 컴퓨터의 전원을 켭니다.
- 액적 판독기 오일 및 액적 판독기 폐기물 병의 유체 수준을 확인하고 필요한 경우 각각 채우거나 비우십시오.
- PCR 후 샘플이 포함된 플레이트를 액적 판독기 플레이트 홀더에 넣고 덮개를 홀더 위에 놓고 검은색 잠금 클립으로 제자리에 고정합니다. 샘플 플레이트에서 호일 뚜껑을 제거하지 마십시오.
- 액적 판독기의 뚜껑에 있는 열기/닫기 버튼을 눌러 엽니다.
- 샘플 플레이트가 들어 있는 액적 판독기 플레이트 홀더를 판독기 챔버에 로드하고 마그네틱 베이스에 단단히 배치합니다.
- 액적 판독기의 덮개에 있는 열기/닫기 버튼을 눌러 닫습니다.
- 분석 소프트웨어 인터페이스를 열고 플레이트 추가 탭을 선택하고 다음과 같이 새 샘플 플레이트 를 준비합니다.
- 플레이트 추가를 클릭하고 플레이트 구성을 클릭합니다.
- 플레이트 정보 탭에서 플레이트 이름을 입력하고 Supermix 드롭다운 메뉴에서 프로브용 Supermix(dUTP 없음)를 선택한 다음 다른 이름으로 데이터 파일 저장 아래에 파일 이름을 입력합니다.
- 웰 선택 탭에서 분석할 웰을 강조 표시하고 선택한 웰 포함을 클릭합니다.
참고: 6.7.4 – 6.7.7단계는 선택 사항입니다. - 웰 정보 탭에서 주석을 달 웰을 선택합니다.
참고: Well Information 탭 인터페이스의 예는 그림 1D를 참조하십시오. - 실험 유형 드롭다운 메뉴에서 직접 정량화(DQ)를 선택하고 샘플 설명, 샘플 유형 및 대상 이름 상자를 채우고 필요에 따라 웰 노트 및/또는 플레이트 노트를 추가합니다.
- 적용을 클릭합니다. 필드의 정보는 선택한 웰에 적용됩니다.
- 모든 샘플 웰에 주석이 추가될 때까지 6.7.4–6.7.6단계를 반복합니다.
- 플레이트 구성이 완료되면 실행 시작을 클릭합니다.
- 실행이 완료되면 빈 샘플 플레이트를 폐기하고 필요한 경우 액적 판독기 폐기물 병을 비우십시오.
- 단계 7로 이동합니다.
7. 결과 분석
참고: 액적 판독기는 샘플의 각 액적에 대한 FAM 및 HEX 채널의 형광 강도를 측정합니다. 성공적인 분석에서 액적은 각 프로브에 대해 음성(표적이 액적에 존재하지 않았음을 의미) 또는 양성(표적이 액적에 존재했음을 의미)의 두 가지 범주 중 하나에 속합니다. 샘플을 분석하기 전에 각 웰에 >10,000개의 액적이 포함되어 있고 각 채널에 저형광(음성) 및 고형광(양성) 액적의 두 개의 명확하게 분리된 집단이 있는지 확인하십시오(그림 2A).
- 데이터 분석 탭을 선택하고 내 데이터 파일 메뉴에서 분석할 파일을 엽니다.
- 단색 실험의 경우 1D 진폭 탭을 클릭하고 2색 실험의 경우 2D 진폭 탭을 클릭합니다.
- 각 채널에 형광 임계값을 적용하여 양성 및 음성 액적을 구별합니다. 분석 소프트웨어는 샘플별 및 채널별로 자동 임계값을 적용하려고 시도하지만, 이것이 실패한 것으로 보이거나 부정확해 보이는 경우 다음과 같이 임계값을 수동으로 적용합니다.
- 임계 설정이 필요한 우물을 선택하십시오.
- 임계값 선 모드 도구를 사용하여 진폭 플롯에서 양수 모집단과 음수 집단 사이의 빈 공간에 임계값을 수동으로 적용합니다. 2D 뷰에서 수동 임계값을 설정할 때 4개의 액적 집단(이중 음성, 단일 양성 FAM, 단일 양성 HEX 및 이중 양성)이 명확하게 분리되도록 십자선을 배치해야 합니다.
알림: 임계값은 잘 수행하거나 한 번에 여러 웰에 적용할 수 있습니다.
- 모든 샘플에 임계값이 적용되면 데이터 테이블 탭을 클릭하고 가져오기/내보내기를 클릭한 다음 표시되는 데이터를 CSV로 내보내기를 선택하여 추가 분석을 위해 결과를 .csv 파일로 내보냅니다. 적절한 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다.
- 다음과 같이 초기 샘플의 mtDNA 복제 수를 계산합니다.
복제 수 = mtDNA 목표 농도 × 22 × 총 용해물 입력의 1/분율
참고: 두 개의 미토콘드리아 프로브를 사용하는 경우 계산하기 전에 두 대상의 농도를 평균화합니다. 둘 이상의 세포를 포함하는 샘플의 경우 셀당 복제 수는 샘플의 셀 수로 나누어 계산됩니다. .csv 파일에서 계산된 '20μL당 카피' 값보다는 '농도' 값(즉, 마이크로리터당 카피 수)에 22μL의 초기 샘플 부피를 곱한 값을 사용하는 것이 중요한데, 이는 액적 발생기에 필요한 2μL 초과분에 남아 있는 mtDNA 카피를 초기 샘플의 절대 카피 수를 계산할 때 고려해야 하기 때문입니다. - 이종질 mtDNA 결실을 운반하는 세포의 경우, 결실된 영역 외부의 mtDNA 표적(즉, 결실된 표적 및 WT mtDNA 분자 모두에 존재하는 표적)으로부터의 결과를 사용하여 복제 수를 계산한다. 결실 이종질은 다음과 같이 결실된 영역 내부의 표적과 결실된 영역 외부의 표적의 농도를 사용하여 계산된다.
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Representative Results
액적 생성 후 불투명한 액적의 투명한 층이 각 웰의 오일 상 위에 떠 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B). 액적 형성은 단일 세포에 대한 실험을 수행할 때 투입 용해물에 세제가 존재함으로써 악영향을 받을 수 있습니다. 2.1.2.에 설명된 용해 프로토콜을 사용하면 최종 샘플에 소량의 TWEEN-20이 존재함에도 불구하고 권장 수준인 10,000 이상의 액적 수율이 일상적으로 달성됩니다(그림 1C). 그러나 버퍼 RLT Plus와 같은 다른 용해 버퍼를 사용하면 형성된 액적 수가 크게 감소하며(그림 1C), 이는 복제 수 측정의 정확도에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
PCR 및 액적 판독 후, 각 샘플 웰에 사용된 각 채널에서 양성 및 음성 액적의 명확하게 분리된 집단이 볼 수 있으며(그림 2A), NTC 웰에는 음성 액적만 포함됩니다. 결과를 분석할 때 발생할 수 있는 잠재적인 문제는 다음과 같습니다.
양성 개체군과 음성 개체군 사이에 명확한 구분이 없고 두 개체군 사이의 간격에 물방울이 존재하는 것을 '비'라고 합니다(그림 2B). 이는 최적이 아닌 어닐링/확장 온도를 사용하는 경우, 특히 양성 액적과 음성 액적 사이의 형광 차이가 상대적으로 작은 분석에서 발생할 수 있습니다. 어닐링/확장 온도의 기울기를 실행하면 사용할 최적의 온도를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또는 분석 성능을 개선하기 위해 프라이머/프로브를 재설계해야 할 수도 있습니다.
'1D 진폭'보기를 사용할 때 음수 집단에서 물방울의 '이중 밴드'. 일부 경우에, 음의 액적의 이중 밴드가 HEX 채널에서 보일 수 있다 (도 2Bii); 이는 (그림 2Biii)에서 볼 수 있듯이 이중 음성 및 단일 음성(즉, FAM 양성, HEX 음성) 액적 집단 간의 배경 형광 수준이 상이한 결과이며, 이는 이중 음성 집단(왼쪽 아래 사분면)보다 HEX 채널에서 평균 형광이 낮은 FAM 단일 양성 집단(왼쪽 상단 사분면)을 보여줍니다. 이 형광 인공물은 분석 결과에 영향을 미치지 않으며 '2D 진폭'을 사용하면 4개의 액적 집단을 명확하게 식별할 수 있습니다.
양성 방울의 부재 (그림 2C). 검증된 분석의 경우 이는 샘플 준비 중 오류(예: 불완전한 세포 용해, 마스터 믹스에 추가된 잘못된 프라이머/프로브, 단일 세포 분류 실패 등)로 인한 것일 가능성이 큽니다.
음의 물방울이 없습니다 (그림 2D). 이는 분석이 높은 표적 DNA 입력으로 포화되어 모든 액적에 하나 이상의 표적 서열이 포함될 때 발생합니다. 이는 높은 카피 수 샘플 (예 : 난 모세포)을 측정 할 때 가장 많이 나타나며 3.5 단계 이전에 용해물을 희석하여 해결할 수 있습니다. 입력 DNA의 연속 희석(그림 2D)은 이 문제가 발생할 때 적절한 희석 계수를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
두 개의 독립적인 mtDNA 프로브를 사용할 때 '2D 진폭' 보기를 선택하여 샘플 DNA의 무결성을 평가할 수 있습니다. 따라서 완전한 mtDNA 게놈을 포함하는 액적은 두 채널 모두에서 양성입니다(그림 3A). mtDNA 결실을 운반하는 샘플을 분석할 때, 분해되지 않은 샘플에서도 이중 양성 방울과 결실되지 않은 표적 서열에 대해서만 양성인 액적의 혼합물이 존재할 것입니다(그림 3B). mtDNA가 분해되면 일부 표적 서열이 별도의 DNA 단편에 존재할 가능성이 높으므로 물방울은 하나의 프로브에 대해 양성일 가능성이 더 높고 두 프로브에 대해 더 적은 수의 액적이 양성일 것입니다(그림 3C). 농도는 항상 해당 형광 채널에서 모든 양성 방울의 총 집단을 사용하여 각 표적에 대해 독립적으로 추정된 다음 복제 수를 추정하기 위해 평균화되거나 이형질을 계산하는 데 사용되기 때문에 이러한 차이는 데이터 분석 중에 설명됩니다(단계 7.3.-7.4 참조).
이 방법은 HeLa, HEK 293T와 같은 실험실 세포주, 불멸화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 및 1차 세포, 예를 들어 인간 진피 섬유아세포 및 마우스 원시 생식 세포(PGC)를 포함한 마우스 및 인간 조직 모두의 다양한 세포 유형에서 복제 수를 측정하는 데 사용할 수 있습니다(그림 4A). 테스트 된 체세포 유형에서 복제 수의 범위는 수백 (예 : 진피 섬유 아세포)에서 수천 (예 : HeLa 세포)까지 보입니다. 분석 정밀도를 정량화하기 위해 매우 높은 복제 수(세포당 >150,000 카피)2를 갖는 성숙한 마우스 난모세포를 용해시키고 생성된 용해물을 세포당 22개의 개별 반응에 균등하게 분할했습니다. 액적 생성 PCR 프로토콜을 실행한 후, 두 개의 대표적인 세포(그림 4B)가 총 229,647개의 카피(웰당 평균 10,439개, 표준 편차 380개) 및 난모세포당 330,121개(웰당 평균 15,006개, 표준 편차 340)를 산출하여 각 반응에서 검출된 복제 수에 거의 차이가 없었습니다. 이 두 셀의 변동 계수 (CV)는 각각 3.64 %와 2.26 %였습니다. 생물학적 표본에 걸친 재현성을 테스트하기 위해 PGC를 구상 후 13.5일에 4마리의 배아 마우스의 생식선에서 수확하고 이러한 세포 집단의 결과 단일 세포 복제 수를 다른 배아에 걸쳐 비교했습니다(그림 4C). 약간의 생물학적 변이가 예상되지만, 평균 복제 수와 표준 편차는 시험된 4개의 배아에서 비교 가능한 상태로 유지되었으며, 이러한 결과는 배아 발달의 유사한 단계에서 이 세포 유형에서 이전에 보고된 복제 수 데이터와 일치했습니다21.
복제 수를 측정하는 것 외에도, 이 방법은 또한 이종질 mtDNA 결실을 운반하는 사이브리드 세포에서 이종질 수준을 측정하는 데 활용될 수 있다. 이를 위해서는 두 개의 mtDNA 프로브를 사용해야 하며, 하나는 mtDNA의 삭제된 영역 내부에 있고 다른 하나는 외부로 떨어집니다(그림 5A). 분석 후, 이종질의 수준은 단계 7.4에 기재된 바와 같이 두 표적 (즉, WT mtDNA 게놈) 및 결실된 영역 외부에 속하는 프로브만을 함유하는 비율(즉, 결실된 mtDNA 게놈)을 모두 포함하는 카피의 비율을 계산하기 위해 각 프로브의 농도를 비교함으로써 확인할 수 있다. 결실된 영역 외부에 위치한 표적이 모든 mtDNA 사본에 존재하기 때문에, 이것은 또한 세포의 전체 복제 수를 계산하는데 사용될 수 있다. 결실이 높은 이종질을 갖는 세포에서는 결실 영역 내에서 프로브의 비교적 적은 사본이 검출되는 반면(도 5Bi), 결실이 낮은 이종질을 갖는 세포에서는 두 프로브의 농도가 훨씬 더 유사하다(도 5Bii). 대량 추출 DNA 샘플에서 액적 생성 PCR에 의한 결실 이형질을 측정하기 위해 'in-out' 프로브 분석을 사용하면 qPCR 기반 방법에 비해 정밀도가 향상되었지만 매우 낮은 이질질 수준(<5%)22을 처리할 때 민감도가 부족하므로 결실 부담이 매우 작은 세포에서는 권장되지 않습니다. 표 1에 기재된 마우스 및 인간 mtDNA 둘 다에 대한 프라이머/프로브 세트는 mtDNA 주요 호 내의 하나의 표적 및 외부의 하나의 표적을 포함하고, 따라서 가장 일반적인 mtDNA 결실(23,24)에 적합하다.
| 종 | 과녁 | 프라이머/프로브 이름 | 순서 | 5' 프로브 | 3' 담금질 | ||
| 사람의 | ND4 | huND4_F 프라이머 | AGTGCGATGAGTAGGGGAAGG | ||||
| huND4_R 프라이머 | ACCTTGGCTATCATCACCGAT | ||||||
| huND4_FAM 프로브 | CAACCAGCCAGAACGCCTGAACGCA | 팸 | 비에이치큐 2 | ||||
| ND1 | huND1_F 프라이머 | GGGTTCATAGTAGAGCGATGG | |||||
| huND1_R 프라이머 | ACGCCATAAAACTCTTCACCAAG | ||||||
| huND1_HEX 프로브 | 증권 시세 표시기 | 16 진수 | 비에이치큐 1 | ||||
| 마우스 | ND1 | musND1_F 프라이머 | GAGCCTCAAACTCCAAATACTCACT | ||||
| musND1_R 프라이머 | 가악가타아아아아아 GCTATGGTTACTTCA |
||||||
| musND1_FAM 프로브 | CCGTAGCCCAAACAAT | 팸 | 비에이치큐 1 | ||||
| 콕스3 | musCOX3_F 프라이머 | CCTCGTACCAACACATGATCTAGG | |||||
| musCOX3_R 프라이머 | AGTGGGACTTCTAGAGGGTTAAGTG | ||||||
| musCOX3_HEX 프로브 | ACCTCCAACAGGAATTTCA | 16 진수 | 비에이치큐 1 | ||||
표 1: 인간 및 마우스 세포에 사용하기 위해 검증된 액적 생성 PCR 프라이머 및 프로브 세트. 인간16,17 및 마우스 세포 18에 대한 두 개의 독립적인 mtDNA 표적을 증폭하는 이전에 검증된 분석을 위한 프라이머 및 프로브 세트.
| 구성 요소 | 샘플당 부피 | 최종 농도 |
| 프로브용 2X ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음) | 11 μl | 1배 |
| 타겟 1 프라이머 F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| 타겟 1 프라이머 R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| 타겟 2 프라이머 F (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| 타겟 2 프라이머 R (20 μM) | 1 μl | 900 nM |
| 타겟 1 프로브 (FAM, 10 μM) | 0.55 μl | 250 nM |
| 타겟 2 프로브 (HEX, 10 μM) | 0.55 μl | 250 nM |
| 샘플 DNA(3.4단계에서 추가됨) | 변수 | 변수 |
| 뉴클레아제가 없는 물 | 변수 | |
| 총 볼륨 | 22 μl |
표 2: 액적 생성 PCR 반응 혼합 레시피. 단일 웰 액적 생성 PCR 분석에 필요한 반응 혼합. 권장 프라이머/프로브 서열은 표 1에서 확인할 수 있습니다. 레시피는 여러 샘플을 실행할 때 확장할 수 있습니다.
| 걸음 | 온도 (°C) | 시간 | 아니요. 사이클 |
| 효소 활성화 | 95 | 10 분 | 1 |
| 변성 | 94 | 30초 | 40 |
| 어닐링/확장 | 58 | 1 분 | |
| 효소 비활성화 | 98 | 10 분 | 1 |
| 들다 | 4 | 무한 | 1 |
표 3: 액적 생성 PCR 열 사이클링 프로토콜. 액적 생성 후 표적 DNA의 증폭을 위한 사이클링 프로토콜.
그림 1: 액적 생성. (A) 액적 생성 PCR 액적 발생기 기기 데크의 개략적인 레이아웃, 위치는 다음과 같습니다: A = 자동 액체 처리 모듈, B = 액적 발생기 카트리지(x3), C = 팁 폐기물 버킷, D = 필터 팁 상자(x2), E = 액적 발생기 오일 홀더, F = 샘플 플레이트, G = 수집 플레이트(냉각 블록에 보관됨). (B) 액적 생성 직후 유상 위에 떠 있는 액적 에멀젼의 대표 이미지. (C) 액적 수에 대한 상이한 용해 완충액의 영향; 1% TWEEN-20의 경우 액적 수가 약간 감소하는 반면, RLT Plus 버퍼는 액적 수가 거의 3배 감소하여 권장 수인 10,000개보다 훨씬 낮습니다(결과는 표준 편차가 있는 조건당 3회 기술 반복의 평균으로 표시됨). (D) 96-웰 템플릿의 웰 A1에 적용된 완성된 샘플 정보를 보여주는 소프트웨어 웰 정보 탭의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 예상 결과와 일반적인 문제를 보여주는 대표적인 액적 생성 PCR 분석 분석. (A) (i) FAM 채널, (ii) HEX 채널 및 (iii) 결합 된 2D 진폭 뷰에서 명확하게 분리 된 양성 및 음성 액적 집단을 보여주는 3 개의 HeLa 단일 세포 용해물의 이중 mtDNA 프로브 분석 결과. (B) (i) FAM 채널에서 양성 및 음성 집단 사이의 '비', (ii) HEX 채널에서 양성 및 음성 액적 사이의 불량한 분리, 및 (iii) HEX 채널의 음성 액적에서 이중 액적 밴드를 보여주는 4개의 벌크 HeLa 20-셀 샘플로부터의 분석 결과, (ii) HEX 음성 집단의 상이한 배경 형광 수준으로 인해, 2D 진폭 보기에서 볼 수 있습니다. (c) 비교를 위해 동일한 실험 (ii)의 성공적인 WT 사이브리드 분석과 함께 양쪽 형광 채널에 양성 방울이 없는 WT 사이브리드 단일 세포 용해물의 예. (D) 알려진 농도의 PCR-증폭된 인간 ND1 표적 앰플리콘의 10배 연속 희석으로부터의 대표적인 결과로서, 분석 상한인 120,000 카피를 초과하는 액적 생성 PCR의 포화도를 나타낸다. RFU = 상대 형광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: '2D 진폭' 보기를 사용한 mtDNA 무결성 평가 . (A) 대표적인 액적 생성 PCR 결과는 주로 FAM 및 HEX 이중 양성 액적의 존재로 표시되는 대부분 손상되지 않은 mtDNA 게놈을 함유하는 WT 사이브리드 단일 세포 용해물입니다. (B) 액적 생성 PCR 결과는 HEX 단일 양성 액적 (HEX 표적만을 운반하는 결실된 mtDNA 분자 함유)과 FAM 및 HEX 이중 양성 액적(두 표적을 모두 운반하는 완전한 mtDNA 분자 함유)의 혼합물을 보여주는 이종질 결실 사이브리드 단일 세포 용해물로부터 결과하며, FAM 단일 양성 액적은 거의 없으며, 이는 주요 mtDNA 분해를 나타내지 않는다. (C) FAM 단일 양성, HEX 단일 양성, FAM 및 HEX 이중 양성 방울의 혼합물을 함유하는 마우스 난모세포 단일 세포 용해물로부터의 액적 생성 PCR 결과, 이는 일부 mtDNA 분해가 본 샘플에서 발생했을 가능성이 있음을 나타낸다. RFU = 상대 형광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 단일 세포 복제 수 측정은 세포 유형 간의 변화를 나타내지만 강력한 실험 내 및 실험 간 반복성을 보여줍니다. (A) 인간 (사각형) 및 마우스 (삼각형) 조직 모두로부터의 다양한 세포주로부터의 대표적인 단일 세포 복제 수 측정 (n = 조직 당 12 세포). (b) 2개의 개별 마우스 난모세포로부터의 용해물 중의 카피 수의 연속 측정; 총 용해물 부피는 22개의 개별 액적 생성 PCR 반응에 걸쳐 분할되었고; 상자 및 휘스커 플롯의 각 점은 단일 웰에서 측정된 복사 수를 나타냅니다. 평균, 표준 편차 (SD) 및 변동 계수 (CV)가 각 난 모세포에 대해보고됩니다. (C) 수정 후 13.5일에 4개의 개별 배아로부터 수집된 1차 마우스 원시 생식 세포의 단일 세포 복제 수(배아당 n=94개의 단일 세포). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 결실 사이브리드 라인에서 단일 세포 이종질 측정. (A) 이 연구에 사용된 사이브리드 라인에서 결실된 mtDNA 영역과 ND1 및 ND4 mtDNA 프로브의 위치를 보여주는 개략도. (B) (i) 높은 이종질 단일 세포 용해물 및 (ii) ND4:ND1 프로브의 상이한 비율과 결과 복제 수 및 이종질 측정을 보여주는 낮은 이종질 단일 세포 용해물로부터의 대표적인 결과. RFU = 상대 형광 단위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 위에서 논의한 것 외에도 광범위한 세포 유형 및 종에 적용할 수 있지만, 이전에 검증된 프라이머/프로브 조합에서 벗어날 때 분석법의 정확성과 반복성이 유지되도록 하려면 새로운 분석 설계의 신중한 최적화가 중요합니다. 단일 세포로 작업할 때 샘플 수집이 가능한 한 정확하게 수행되도록 하고(예: FACS로 세포를 분류할 때 엄격한 단일 세포 파라미터 사용) 얻은 결과가 개별 세포의 결과를 진정으로 반영하는지 확인하고 오염 발생 위험을 줄이기 위해 모든 준비 작업이 깨끗한 사전 PCR 영역에서 수행되도록 하는 것이 중요합니다. 효율적인 세포 용해는 mtDNA 사본이 별도의 액적으로 성공적으로 구획화될 수 있도록 하는 데에도 중요합니다. 그러나 이것은 더 높은 농도의 세제를 사용할 때 물방울 형성을 방해할 위험과 균형을 이루어야 합니다.
분석 설계 및 용해 단계가 프로토콜에서 가장 중요하기 때문에 문제 해결이 필요할 가능성이 가장 높은 단계이기도 합니다. 초기에 잘 분리된 양성 및 음성 액적 집단을 생성하지 않는 프라이머/프로브 세트는 PCR 프로토콜의 어닐링/확장 온도가 최적화되면 성능이 향상될 수 있습니다. 단계 5.1에서 주어진 58°C의 제안된 온도. (표 1)의 프라이머/프로브 세트에 대해 검증되었습니다. 그러나 최적 온도는 55-65 °C까지 다양할 수 있으며 이 범위에 걸친 그래디언트 PCR을 실행하여 새로운 프라이머/프로브 세트에 가장 적합한 온도를 찾을 수 있습니다. 이것이 실패하면 분석 설계에 대한 제조업체 지침을 참조하여 성능을 향상시키기 위해 프라이머 및/또는 프로브를 재설계해야 할 수 있습니다( 재료 표 참조).
용해 조건이 단계 2.1.2에 기재된 것과 상이한 경우. 필요한 경우 대체 용해 완충액이 액적 생성에 미치는 영향을 평가해야 합니다. 용해 완충액 내의 세제 농도를 줄이거나 더 많은 양의 뉴클레아제가 없는 물에 용해물을 희석함으로써 액적 생성을 개선할 수 있지만, 일부 완충액(예: RLT Plus 완충액)은 매우 낮은 농도에서도 액적 형성에 여전히 상당한 영향을 미친다는 것을 발견했습니다. 이 문제에 대한 한 가지 가능한 해결책은 예를 들어 SPRI 비드를 사용하여 DNA를 결합하고 세제를 씻어내는 것과 같이 DNA의 용해 후 정화를 수행하는 것입니다. SPRI 비드는 단일 세포 용해물로부터 게놈 DNA25 및 mtDNA26 을 모두 정제하는 데 사용되지만, 이 과정에서 mtDNA 게놈의 손실은 후속 복제 수 측정에 영향을 미치며, 현재 단일 세포 용해물에 상업적으로 이용 가능한 SPRI 비드 제품을 사용할 때 이러한 잠재적 오류 원인을 정량화하는 데이터는 없습니다.
전통적으로, mtDNA 복제 수 및 결실 이종형질은 qPCR 분석27을 사용하여 측정되었다. qPCR 접근법의 기본 개념은 여기에 설명된 액적 생성 PCR 기술과 매우 유사하지만 qPCR 사용의 한 가지 주요 단점은 절대 복제 수11을 직접 측정할 수 없다는 것입니다. 각 샘플에 대해 qPCR은 초기 입력 DNA에서 일정량의 산물에 도달하는 데 필요한 PCR 주기 수인 주기 역치(ct)값을 측정합니다. 이 임계값은 임의적이기 때문에 절대 복제 수를 샘플에 할당하기 전에 알려진 목표 농도 범위를 포함하는 입력에서 표준 곡선을 생성해야 합니다. 벌크 DNA 수준에서 이 프로세스는 mtDNA 복제 수를 측정하는 능력에서 액적 생성 PCR과 매우 정확하고 유사합니다. 그러나, 단일 세포에서 전형적으로 발견되는 것과 같은 매우 낮은 복제 수에서, qPCR에 대한 표준 곡선을 정확하게 생성하는 것이 점점 더 어려워지고, 따라서 절대 복제 수11의 정확한 측정을 얻는 것이 점점 더 어려워진다. 액적 생성 PCR은 현재 qPCR보다 수행 비용이 더 많이 들며, 소모품 및 시약은 초기 장비 비용이 더 높을 뿐만 아니라 샘플당 기준으로 약 2.5배 더 비쌉니다. 이는 액적 생성 PCR의 비용이 특정 고처리량 애플리케이션에 대해 엄청날 수 있음을 의미하며, 이 경우 qPCR은 여전히 실행 가능한 대안입니다.
액적 생성 PCR은 샘플에 존재하는 주어진 표적의 사본 수를 직접 측정하기 때문에, 절대 복제 수를 측정할 때 표준 곡선에 대한 요구가 없으며, 따라서 액적 생성 PCR 방법은 매우 적은 양의 입력 DNA11,12로도 매우 민감하다. 미토콘드리아 생물학 분야에서 단일 세포 기술의 중요성이 대두됨에 따라 이 액적 생성 PCR 기반 접근 방식은 이전 방법론에 비해 중요한 발전을 나타내며 단일 세포 설정에서 주요 미토콘드리아 매개변수를 지속적으로 측정할 수 있습니다. 또한 액적 생성 PCR을 사용하여 벌크 조직 샘플에서 추출한 DNA의 mtDNA 복제 수를 측정할 수도 있습니다. 이를 위해서는 세포 번호의 정규화를 허용하기 위해 mtDNA 복제 수 외에 핵 DNA 복제 수를 측정해야 합니다. 따라서 mtDNA를 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트와 함께 핵 유전자를 표적으로 하는 프라이머/프로브 세트를 포함해야 합니다. 상기 나타낸 바와 같이, 벌크 조직 수준에서, 액적 생성 PCR 및 표준 qPCR 방법은 유사한 정확도를 가지며, 따라서, 액적 생성 PCR은 이러한 설정에서 현존하는 기술에 비해 상당한 이점을 제공하지 않는다.
여기에 제시된 방법의 한 가지 주요 한계는 mtDNA 결실이 아닌 이종질 SNP를 운반하는 세포에서 이형질 수준을 측정할 수 없기 때문에 단일 세포에서 복제 수와 이형질을 모두 측정하기 위해 추가 분석(예: 파이로시퀀싱 또는 qPCR)이 필요하다는 것입니다. 이 플랫폼을 사용하여 대립 유전자 특이 적 발현 (ASE)을 입증하는 SNP의 성공적인 검출이보고되었으며28, 최근 보고서는이 방법을 사용하여 일반적인 m.3243A >G MELAS 돌연변이29의 이종 형질을 측정하는 방법을 설명했습니다. 따라서 신중하게 설계된 프로브 쌍을 사용하여 이러한 한계를 극복할 수 있는 것으로 보이지만 각 개별 SNP에 대해 설계/검증할 별도의 프라이머/프로브 세트가 필요하며 설계 매개변수는 프로브가 mtDNA 서열의 특정 염기를 표적으로 해야 하기 때문에 훨씬 더 제한됩니다. 이와 같이, SNP 검출을 여기에 기술된 액적 생성 PCR 프로토콜에 통합하는 것은 아직 시도되지 않았다.
본 연구에서 사용된 유형과 같은 액적 기반 디지털 PCR 플랫폼이 DNA 표적의 절대 정량화가 가능한 유일한 기술은 아니며, 웰 플레이트 기반 분할과 같은 대체 방법을 활용하는 상용 제품도 이용 가능하다는 점에 유의하는 것이 중요하다(30). 또한 루프 매개 등온 증폭(LAMP)31 및 재조합 중합효소 증폭(RPA)32와 같은 PCR에 대한 대안을 사용하는 기술은 임상 환경에서 사용하기에 액적 생성 PCR보다 더 적합한 것으로 입증될 수 있습니다.
전반적으로, 이 프로토콜은 단일 세포에서 mtDNA 복제 수 및 결실 이형질을 측정하기 위한 매우 민감한 방법을 제시하며, 이는 광범위한 다양한 세포 유형 및 종에 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
액적 생성 PCR 데이터의 통계 분석에 대한 조언을 해주신 L Bozhilova 박사에게 감사드립니다. 그림 3C 및 그림 4B에서 데이터를 생성하는 데 사용되는 난모세포를 제공한 H Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 캠브리지 대학의 의학 연구위원회 미토콘드리아 생물학 단위 (MC_UU_00015 / 9)의 SPB에 의해 수행되었으며 PFC (212219 / Z / 18 / Z)가 보유한 Wellcome Trust Principal Research Fellowship의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G |
References
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D'Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
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