Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kjemisk triphosforylering av oligonukleotider

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Oligonukleotid 5′-trifosfater er allestedsnærværende komponenter i essensielle biologiske veier og har sett økende bruk i bioteknologiske applikasjoner. Her beskriver vi teknikker for rutinemessig syntese og rensing av oligonukleotid 5′-trifosfater, med utgangspunkt i oligonukleotider fremstilt ved standard automatiserte synteseteknikker.

Abstract

5′-trifosfatet er en essensiell nukleinsyremodifisering som finnes gjennom hele livet og i økende grad brukes som en funksjonell modifikasjon av oligonukleotider i bioteknologi og syntetisk biologi. Oligonukleotid 5′-trifosfater har historisk blitt fremstilt in vitro ved enzymatiske metoder. Imidlertid er disse metodene begrenset til naturlige RNA oligonukleotider, har sterke sekvenspreferanser, og har en tendens til å produsere heterogene produkter. Nye metoder for kjemisk triphosforylering utfyller både den reduserte kostnaden for automatisert oligonukleotidsyntese ved fosforamidittkjemi og det mangfoldige spekteret av nukleotidmodifikasjoner som nå er tilgjengelige. Således er syntesen av oligonukleotidtrifosfater av vilkårlig sekvens og lengde, og eventuelt inneholder forskjellige ikke-essensielle modifikasjoner, nå tilgjengelig.

Dette papiret presenterer passende metoder og teknikker for kjemisk triposforylering av oligonukleotider ved bruk av salicylfosforokloriditt og pyrofosfat. Denne metoden bruker kommersielt tilgjengelige reagenser, er kompatibel med de fleste oligonukleotider fremstilt ved standard solidfasesyntesemetoder, og kan fullføres i 2 timer etter oligonukleotidsyntese, før debeskyttelse og rensing. To anvendelser av kjemisk triphosforylerte oligonukleotider som substrater for katalytiske RNA-enzymer er demonstrert, inkludert syntese av en speilbildeversjon av hammerhead ribozym fra ikke-biologiske L-RNA-trifosfater.

Introduction

Den 5'-triphosphorylated form av RNA er allestedsnærværende i biologi som det er generert av RNA transkripsjon i alle domener av livet og ved RNA replikasjon i løpet av livssyklusen til mange RNA virus. Disse trifosfatene tjener som substrat for dannelsen av 7-metylguanylat-kappet mRNA i eukaryoter og spiller derfor en viktig rolle i proteinuttrykk1. I motsetning til dette beholdes trifosfatet i bakterier og virus; dermed gjenkjennes RNA 5′-trifosfater av medfødte immunitetsresponsregulatorer i eukaryoter 2,3,4,5,6,7. Utenfor biologi har en rekke RNA ligase ribozymer blitt utviklet for å bruke 5′-trifosfat in vitro8 og modifisert for bruk i diagnostiske analyser 9,10,11,12,13,14,15. Et slikt ribozym kan brukes til malavhengig syntese av L-RNA, den ikke-biologiske "speilbilde" enantiomeren av naturlig D-RNA, fra små L-RNA oligonukleotid 5′-trifosfater 16,17,18. Rutinemessig forberedelse av triphosforylerte oligonukleotider av varierende sekvens og ryggradssammensetning er avgjørende for å undersøke disse systemene.

Den vanligste og mest tilgjengelige metoden for fremstilling av RNA 5′-trifosfater i laboratoriet er ved in vitro transkripsjon. Imidlertid er RNA produsert ved denne metoden begrenset i rekkefølge og størrelse av promotor- og substratkrav til RNA-polymeraseenzymet. T7 RNA-polymerase og spesialiserte derivater er de vanligste polymerasene som brukes til dette formålet 19,20,21,22. In vitro transkribert RNA fremstilt med disse enzymene må initieres med en 5′-terminal purin og er sterkt forspent mot puriner i de første 10 nukleotidene23,24. Videre er enzymatisk inkorporering av base- eller ryggradsmodifiserte nukleotider i beste fall ineffektiv og oftere umulig med naturlige polymeraser, noe som begrenser muligheten til å produsere oligonukleotid 5′-trifosfater sammensatt av alt annet enn naturlig D-RNA. En annen begrensende faktor er at RNA generert av in vitro transkripsjon kan inneholde betydelig 5 '- og 3'- heterogenitet og produseres som ekstremt heterogene produkter når de er kortere enn 20 nt 23,24,25,26,27.

I motsetning til dette kan kjemisk triphosforylering av oligonukleotider fremstilt ved fastfase fosforamidittsyntese 28,29,30,31,32,33,34,35 brukes til å fremstille oligonukleotid 5′-trifosfater 3-50 nt lange, av hvilken som helst sekvens. I tillegg kan et stort utvalg av nukleinsyremodifikasjoner tilgjengelig for fosforamidittsyntese tilsettes oligonukleotider før 5′-triposforylering 14,15,16,17,18,29,36. Mange av disse metodene bruker fosfitetsreagenset salicylfosforokloriditt, som ble utviklet av Ludwig og Eckstein for løsningsfasen trifosforylering av mononukleosider37. Trifosforylering av oligonukleotider med dette reagens oppnås på den faste fase ved fosfatitylasjon av oligonukleotid 5′-hydroksyl, omdannelse til trifosfat ved reaksjon med pyrofosfat og oksidasjon, etterfulgt av standardprosedyrer for spaltning av oligonukleotidet fra fast støtte, debeskyttelse og rensing (figur 1)28.

Figure 1
Figur 1: Skjema for trifosforylering av syntetiske oligonukleotider. I det første trinnet blir oligonukleotid 5ʹ-hydroksyl fosforitetert med SalPCl. I neste trinn reageres 5ʹ-salicylfosfitt med TBAP for å danne den sykliske metafosfitten, deretter i det tredje trinnet oksidert for å generere det sykliske 5ʹ-trimetafosfatet i DNA / RNA synthesizer oksidasjonsløsning (0,1 M jod / pyridin / H2O / THF), som raskt hydrolyseres for å gi det lineære 5ʹ-trifosfatet i samme løsning28,33, 37. Påfølgende alkalisk spaltning fra den faste CPG-støtten og debeskyttelse av oligonukleotidet i vandig MeNH2 / ammoniakk vil hydrolysere ethvert gjenværende syklisk trimetafosfat til lineær form. Forkortelser: SalPCl = salicylfosforokloriditt; TBAP = tributylammoniumpyrofosfat; THF = tetrahydrofuran; CPG = kontrollert pore glass; MeNH2 = metylamin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Selv om tidlige publiserte rapporter som brukte denne metoden ofte led av dårlige utbytter og uønskede sideprodukter 28,37,38, er forsiktig vedlikehold av vannfrie forhold alt som er nødvendig for rutinemessig å oppnå høye utbytter. Dette kan oppnås ved forsiktig fremstilling av reagenser og bruk av en enkel reaksjonsanordning montert fra standard plastkomponenter. Her demonstrerer vi de riktige trinnene for kjemisk triposforylering av oligonukleotider, inkludert fremstilling av reagenser, montering av reaksjonskammeret, triposforyleringsreaksjonen og påfølgende avbeskyttelse og rensing av triposforylerte oligonukleotider. Også inkludert er den representative bruken av 5′-triphosforylerte oligonukleotider som substrater for ligase ribozymer for syntese av større nukleinsyreprodukter med naturlig D-RNA og abiotiske L-RNA-ryggrader.

Protocol

1. Automatisert fastfasesyntese av 5′-hydroksyl oligonukleotider på en solid støtte

  1. Forbered den automatiserte DNA / RNA-synthesizeren med reagenser og fosforamiditter i henhold til mål oligonukleotidsammensetningen og instrumentinstruksjonene.
  2. Legg en syntesekolonne som inneholder solid støtte på synthesizeren og syntetiser oligonukleotider i henhold til synthesizerinstrumentprotokollene.
    MERK: Triposforyleringsprosedyren er optimalisert for oligonukleotider fremstilt på 1 μmole-skalaen.
  3. Fjern 5′-dimetoksytritylbeskyttelsesgruppen for å gi det solidstøttede oligonukleotid 5′-hydroksylet som en del av oligonukleotidsyntesen i forrige trinn, eller ved å utføre et terminalt detrityleringstrinn i henhold til synthesizerinstrumentprotokollene.
  4. Fjern kolonnen som inneholder 5′-hydroksyl oligonukleotid på fast støtte fra synthesizeren, tørk under et husvakuum i 10 minutter for å fjerne gjenværende løsningsmiddel, og fortsett til trifosforylering (avsnitt 3 og 4) når materialer for triposforylering er fremstilt (avsnitt 2).
    MERK: Hvis den ikke brukes umiddelbart, kan den tørkede kolonnen lagres under en normal atmosfære i en forseglet plastbeholder med tørkemiddel ved -20 °C. Ytterligere tørking er ikke nødvendig på dette stadiet, da kolonnen tørkes grundig før trifosforylering i avsnitt 3.

2. Forberedelse av materialer for triposforylering

  1. Fest en tørr argonkilde med justerbart trykk til en gassmanifold med minst to linjer og koble til en bobler. Sørg for at linjene avsluttes i 1 ml plastsprøyter for å lette tilkoblingen til reaksjonsapparatet.
  2. Samle utstyr som skal brukes under trifosforylering, inkludert 1 ml plastsprøyter, en treveis polypropylen stoppekran, noncoring nåler, 1,5 ml polypropylenrør og en liten metallspatel. Oppbevar dem i en forseglet beholder eller tørkemiddel med tørkemiddel ved romtemperatur i minst 1 dag før bruk.
  3. Klargjør 30 ml hver vannfri 1,4-dioksan, 3:1 dioksan:pyridin i volum, N,N-dimetylformamid (DMF) og acetonitril (ACN) i tørkede 30 ml glassflasker med tørkefeller (4 Å molekylsikter i forseglede membranpakker) minst 1 dag før bruk. Forsegl med gummisepta, og oppbevar i en tørkemiddel med tørkemiddel.
  4. Oppbevar fast 2-klor-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one (salicylfosforokloriditt, SalPCl) i sin opprinnelige beholder inne i en forseglet krukke med tørkemiddel ved 4 ° C. Skyll alltid beholderen med argon mellom bruk.
  5. Klargjør en oppløsning av tributylammoniumpyrofosfat (TBAP) minst 5 dager før triposforyleringsreaksjonen:
    1. Vei 1-5 g fast TBAP i en tørket 30 ml glassflaske og løs opp i 1 ml DMF og 0,5 ml tributylamin per g TBAP.
    2. Tilsett tre tørkefeller, forsegl flasken med et gummiseptum under argon, og boble med argon i 30 minutter til degas.
    3. Oppbevares i en forseglet krukke med tørkemiddel ved 4 °C i 5 dager slik at molekylsiktene absorberer alt sporvann. Oppbevar krukken ved -20 °C og tilbered fersk etter 6 måneder.

3. Montering og bruk av triposforyleringsapparatet

  1. La syntesekolonnen varmes opp til romtemperatur hvis den hentes ut fra lagring ved -20 °C.
  2. Monter reaksjonskammeret vist i figur 2:
    1. Forbered forkammeret: Fjern stempelet fra en tørr 1 ml sprøyte, klipp av toppen av sprøyten med saks eller et barberblad, og fest sprøyten til syntesekolonnen. Fest den treveis stoppekranen til toppen av sprøyten og fest sideinnløpet til stoppekranen til den tørre argonkilden med bobleren, slik at det øverste innløpet til stoppekranen er reagensinjeksjonsporten.
    2. Fest dette apparatet til et stativ med klemmer og forsegl alle oppstrømsfuger med voksforseglingsfilm. Juster stoppekranen slik at injeksjonsporten er lukket, og apparatet er åpent for argonkilden. Lukk bobleren, og la argon ved lavt trykk (<10 psi) strømme gjennom reaksjonskammeret i 5 minutter.
      MERK: Flere reaksjonskamre kan settes parallelt med trifosforyllat 2-4 oligonukleotider. Imidlertid bør en linje fra manifolden reserveres for tilførsel av argon til reagensflaskene.
    3. Åpne bobleren på nytt og fest en sprøyte til bunnen av syntesekolonnen, som vil være avfallssprøyten. Trekk argon gjennom kolonnen gjentatte ganger ved hjelp av avfallssprøyten; Fest deretter sprøyten igjen med stempelet presset helt inn.
      MERK: Med mindre det legges i reagenser, skal stoppekranen stilles inn slik at injeksjonsporten lukkes og apparatet åpnes mot argonkilden, som vist i figur 2A. På samme måte skal avfallssprøyten festes og skjøten til syntesekolonnen forsegles med voksforseglingsfilm, med mindre reagenser fjernes aktivt.
  3. Slik tilsetter du et reagens eller oppløsningsmiddel:
    1. Fest en nål til den tørre argonkilden og stikk den inn i reagenset eller oppløsningsvæskeflaskeseptumet, pass på at du ikke senker nålen ned i flaskeinnholdet.
    2. Sett sammen en tørr sprøyte med en nål og stikk den inn i reagenset eller oppløsningsflaskeseptumet uten å senke den ned i flaskeinnholdet. Fyll sprøyten med argon, trekk nålen ut av septum og fjern argonet. Fyll sprøyten med argon og utdriv igjen; Fyll deretter sprøyten med det nødvendige volumet av oppløsningsvæske eller reagens under argontrykk.
    3. Juster stoppekranen på apparatet slik at argonkilden er lukket og injeksjonsporten er åpen (figur 2B). Fjern raskt den fylte sprøyten og kanylen fra kildeflasken, tørk bort oppløsningsvæsken som sitter fast på siden eller spissen av nålen, og stikk kanylen inn i injeksjonsporten. Fjern reagenset i apparatets forkammer, fjern nålen og lukk injeksjonsporten, åpne apparatet på nytt for argonkilden.
    4. Trekk forsiktig væsken fra forkammeret hele veien gjennom syntesekolonnen ved hjelp av avfallssprøyten slik at all væske nå holdes i avfallssprøyten. Nå skyver du løsningen sakte opp igjen i syntesekolonnen, slik at ingen gassbobler er i kolonnen. For å blande eller omrøre, trekk oppløsningen forsiktig opp og ned over kolonnen med avfallssprøyten.
      MERK: Beveg alltid væske sakte og forsiktig gjennom reaksjonskammeret for å sikre at ingen tetninger brytes, noe som gjør at luft kan komme inn i apparatet.
  4. Slik fjerner du et reagens eller løsningsmiddel fra kolonnen:
    1. Trekk oppløsningen sakte inn i avfallssprøyten. Etter at mesteparten av oppløsningen har passert inn i avfallssprøyten, trekk argon gjennom for å skylle den gjenværende oppløsningsvæsken ut av kolonnen.
    2. Fjern voksforseglingsfilmen rundt avfallssprøyteleddet, fjern deretter sprøyten og kast avfallsoppløsningen. Bytt ut avfallssprøyten med en ny, tørr sprøyte, og lukk skjøten på nytt med voksforseglingsfilm.

Figure 2
Figur 2: Triphosforyleringsapparat. Under blanding eller reaksjoner er enheten (A) åpen for argonkilden (i) og lukket for luften ved å justere treveis stoppekran (ii). Reagenser trekkes fra forkammeret (iii) inn i syntesekolonnen (iv) ved hjelp av avfallssprøyten (v). Reagenser fjernes ved å trekke all væske inn i avfallssprøyten (v) og kaste den. Ved lasting av reagenser (B) er den treveis stoppekranen (ii) åpen for atmosfæren, og reagenset lastes inn i forkammeret (iii) ved hjelp av en sprøyte og nål (vi). (C) Et fotografi av det monterte apparatet satt som i (A) for reagensblanding og reaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. On-kolonne triphosphorylation av syntetisk 5'-hydroksyl oligonukleotid

  1. Fjern SalPCl- og TBAP-oppløsningen fra oppbevaring ved -20 °C og la den varmes opp til romtemperatur før bruk.
  2. Tilsett 200 μL pyridin/dioksan i forkammeret, i henhold til trinn 3.3.1-3.3.3. Du må imidlertid ikke legge oppløsningsvæsken på syntesekolonnen før i trinn 4.4.
  3. Bruk en tørr metallspatel til å veie 6-12 mg SalPCl i et tørt mikroscentrifugerør på 1,5 ml, og løs opp i 100 μL dioksan ved å forsiktig sprøyte løsningsmidlet opp og ned i mikrosentrifugerrøret.
  4. Tilsett den oppløste SalPCl i forkammeret og last den inn i syntesekolonnen, etter trinn 3.3. La den reagere i 15 minutter, og omrør løsningen hvert 5. minutt. Fjern og kast SalPCl-oppløsningen i henhold til trinn 3.4.
    MERK: SalPCl tilsettes i stort overskudd og vil scavenge alt vann som absorberes under forberedelse og lasting i reaksjonskammeret. Innføring av fuktighet under trinn 4.5 og 4.6 vil imidlertid kompromittere det endelige oligonukleotid 5′-trifosfatutbyttet.
  5. Tilsett 250 μL TBAP-løsning til forkammeret og last det på syntesekolonnen, etter trinn 3.3. La den reagere i 20 minutter, og agiter hver 5. Fjern og kast TBAP-oppløsningen i henhold til trinn 3.4.
  6. Vask kolonnen med 0,5 ml DMF, deretter 0,5 ml ACN, og fjern oppløsningsvæsken etter hver tilsetning i henhold til trinn 3.3 og 3.4.
  7. Tilsett 250 μL oksidasjonsmiddeloppløsning (0,1 M jod i tetrahydrofuran (THF) / pyridin / vann, 88: 10: 2) til forkammeret og last det på syntesekolonnen, etter trinn 3.3. La den reagere i 30 minutter, og rør hver 10. Fjern og kast oksidasjonsmiddeloppløsningen i henhold til trinn 3.4.
  8. Vask kolonnen med 0,5 ml ACN og fjern den i henhold til trinn 3.3 og 3.4.
  9. Demonter reaksjonsapparatet. Vask syntesekolonnen med 5 ml ACN og tørk kolonnen.

5. Spaltning fra solid støtte, avbeskyttelse og rensing

  1. Fjern den tørkede faste støtteharpiksen fra syntesekolonnen og overfør den til et 1,5 ml polypropylen skrukork forseglbart rør med en silikon o-ring.
  2. Suspender harpiksen i 1 ml av en 1: 1 blanding av 28% -30% vandig ammoniakk og 40% vandig metylamin (AMA) og forsegle røret tett. Inkuber ved 65 °C i 10 minutter med intermitterende blanding ved skånsom inversjon39. Bruk en mildere behandling ved romtemperatur i 2 timer for oligonukleotider lengre enn 40 nt.
    FORSIKTIG: Oppvarming av AMA-løsningen vil sette røret under høyt trykk. Hvis røret ikke er tett forseglet eller ikke bruker en ammoniakkkompatibel (silikon) o-ring, kan røret ventilere gass eller lekke løsemiddel, noe som potensielt kan kompromittere sikkerheten eller sluttproduktets utbytte. Åpne aldri røret mens det er over omgivelsestemperaturen, da varm AMA-løsning kan utvikle gass voldsomt.
  3. Avkjøl røret på is og sentrifuger det kort (6.000-12.000 × g i 10 s). Fjern supernatanten fra harpiksen, filtrer gjennom en sprøyte utstyrt med et 0,2 μm filter, og overfør til et nytt, sterilt polypropylenrør. Fordamp løsningen til tørrhet ved hjelp av en vakuumentrifuge utstyrt med en ammoniakknøytraliserende kjemisk felle.
    MERK: Hvis det syntetiske oligonukleotidet ikke inneholder noen RNA-nukleotider med 2′-silylbeskyttende grupper, hopp til trinn 5.8.
  4. Fjern silylbeskyttende grupper ved å oppløse det tørkede materialet i 1 ml 1 M tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) i THF, varme opp til 55 °C, riste om nødvendig for å oppløse oligonukleotidet fullstendig og inkubere ved romtemperatur i 16-24 timer40,41.
  5. Slukk TBAF-løsningen med 1 ml 1 M Tris-buffer, pH 7,5, og fjern THF ved hjelp av en vakuumsentrifuge.
  6. Fjern TBAF-salter ved hjelp av en kolonne for utelukkelse av engangsstørrelse, i henhold til produsentens instruksjoner. For oligonukleotider kortere enn 15 nt, bekreft eluering av produktet ved å samle eluatet i fraksjoner og identifisere hovedproduktfraksjonene ved absorbans ved 260 nm på et UV-Vis-spektrofotometer.
  7. Konsentrer det beskyttede RNA-oligonukleotidet ved lyofilisering eller vakuumentrifuge hvis mindre enn 15 nt, eller ved etanolutfelling hvis større enn 15 nt.
  8. Forbered en preparativ skala 10% -20% polyakrylamid / 8 M urea / 1x TBE gel ved bruk av 19: 1 mono: bis akrylamid lager, i henhold til passende protokoller for oligonukleotidstørrelse, gelplate og stativ. Monter gelplaten i gelstativet med 1x TBE i reservoarer og kjør på 35 W (eller eventuelt for gelplateformat) i minst 30 minutter.
  9. Løs opp det faste oligonukleotidet i ureagelbelastningsbuffer (8 M urea, 10% sukrose, 50 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA med bromfenol og xylen cyanol løpende fargestoffer) og varme til 80 ° C. Last på polyakrylamidgelen og kjør i 1-2 timer ved 25-35 W (eller som passer for gelplateformatet og oligonukleotidstørrelsen).
    MERK: Bromfenolblått eller xylen cyanol bør utelukkes fra gelbelastningsbufferen for oligonukleotider kortere enn 15 nt hvis en av dem migrerer sammen med produktet, da det er vanskelig å fjerne disse fargestoffene fra det eluerte oligonukleotidet uten etanolutfelling.
  10. Når gelelektroforese er fullført, fjern gelplaten fra gelstativet, demonter gelplaten og pakk gelen i polyvinylkloridfilm. Identifiser produktbåndene ved bakgrunnsskygging med 254 nm UV-lys, og fjern hovedproduktbåndet ved hjelp av et barberblad.
  11. Trekk ut oligonukleotidet fra den utskårne gelen ved knusing og bløtleggingsmetode42.
    1. Knus den utskårne gelen ved å ekstrudere den gjennom en plastsprøyte eller mekanisk.
    2. For oligonukleotider lengre enn 15 nt:
      1. Eluer i 3x volumer knuse- og bløtbuffer (300 mM NaCl; 10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) i minst 12 timer med omrøring eller risting.
      2. Fjern faste gelstykker ved å føre løsningen gjennom en sprøyte utstyrt med et 0,2 μm filter og konsentrer oligonukleotidet ved etanolutfelling.
    3. For oligonukleotid kortere enn 15 nt:
      1. Eluer i 3x volumer nukleasefritt vann i minst 12 timer med omrøring eller risting.
      2. Fjern faste gelstykker ved å føre løsningen gjennom en sprøyte utstyrt med et 0,2 μm filter og konsentrat ved lyofilisering.
      3. Fjern restsalter og løsemidler ved hjelp av en eksklusjonskolonne for engangsstørrelse som i trinn 5.6. Konsentrat ved lyofilisering.
  12. Oppbevar rensede trifosforylerte oligonukleotider ved -20 °C i TE-buffer (10 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA) eller i en lignende oligonukleotidlagringsbuffer.
    1. Bestem konsentrasjonen av oligonukleotidet ved å måle absorbansen ved 260 nm ved hjelp av et UV-Vis-spektrofotometer.
      MERK: Den estimerte utryddelseskoeffisienten til oligonukleotidet bør ikke påvirkes av dens 5′-fosforyleringstilstand, og kan beregnes ut fra sekvensen ved hjelp av en oligonukleotidutryddelseskoeffisientkalkulator.
    2. Verifiser triphosforylering ved massespektrometri. Se etter en forventet masse på +239,94 Da i forhold til 5′-hydroksyl oligonukleotid.
      MERK: Enten matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering eller elektrosprayioniseringsmassespektrometri (henholdsvis MALDI-MS eller ESI-MS) er egnet for å identifisere trifosforyleringstilstanden til oligonukleotidet ved bruk av protokoller optimalisert for nukleinsyrer. ESI-MS gir imidlertid mer konsistente resultater på grunn av lavere ionfragmenteringshastigheter; en representativ kommersiell tjeneste er gitt i materialtabellen.

6. Triphosforylerte oligonukleotider som substrater for ribozym selvreplikasjon

FORSIKTIG: 32P er en radioaktiv isotop, og følgende trinn bør utføres ved bruk av standard sikkerhetsprotokoller for arbeid med radioaktive materialer i et laboratorium og av en forsker sertifisert for bruk av radioaktive materialer av de relevante miljøhelse- og sikkerhetsavdelingene. Som et alternativ kan selvreplikerende ribozymsubstrat A fremstilles syntetisk med en 5′-fluoresceinetikett14 og avbildes fluorescerende, som i trinn 7.9.

  1. Forbered løsning A som en blanding av selvreplikator ribozym E og 5′-32P-merket RNA-substrat A14 til konsentrasjoner på henholdsvis 0,30 μM og 30 μM. Klargjør løsninger B-transkribert og B-syntetisk med 15 μM triposforylert RNA-substrat B, fremstilt ved in vitro transkripsjon14 eller kjemisk triposforylering som ovenfor, henholdsvis i 75 mM EPPS-buffer, pH 8,5 og 37,5 MgCl2. Bring begge løsningene til 42 °C.
    MERK: Alle RNA-komponenter er oppført i materialtabellen.
  2. For å starte selvreplikasjon blandes raskt 5 μL løsning A med 10 μL løsning B-transkribert eller B-syntetisk til en endelig konsentrasjon på 0,1 μM E, 10 μM A, 10 μM B, 25 mM MgCl2 og 50 mM EPPS-buffer, pH 8,5. Inkuber reaksjonsblandingen ved 42 °C.
  3. Med jevne mellomrom, ta 0,5 μL aliquots og slukk i 9,5 μL formamid gel lasting buffer (95% formamid; 10 mM EDTA, pH 8).
  4. Klargjør et analytisk polyakrylamid/8 M urea/1x TBE gel, i henhold til passende protokoller for gelplaten og stativet. Monter støpt gel og plate i et gelstativ, fyll reservoarene med 1x TBE, og kjør på 40 W (eller etter behov for forskjellige gelplater og stativer) i 30 minutter.
  5. Varm opp de slukkede reaksjonsprøvene til 80 °C, last 5 μL av prøven i hver brønn, og kjør gelen ved 40 W i ca. 40 minutter (eller eventuelt for forskjellige gelplater og stativer).
  6. Fjern gelplaten fra gelstativet, demonter og pakk gelen i polyvinylkloridfilm. Dekk gelen med en fosforskjerm og utsett i 1 time (eller som passer for 32P cpm); skann skjermen ved hjelp av en fluorescerende / fosforescerende gelskanner.
  7. Kvantifiser reaksjonsutbyttet ved hjelp av gelbildekvantifiseringsprogramvare.
    1. Åpne gelbildet ved hjelp av Analyseverktøykassen, velg Analyse | Form Definisjon, velg Områder | rektangelformen, og tegn rektangler av samme størrelse rundt bånd som tilsvarer uomsatt A og produkt E for hver gang og begge reaksjonene.
    2. Velg analyse | Subtraksjon i bakgrunnen, velg Områder | rektangelformen, og tegn et rektangel av samme størrelse i en tom del av gelbildet. Endre bakgrunns subtraksjonsmetoden for alle rektangler til Bilde rektangel.
    3. Velg Vindu | 2 Områdevindu, og deretter Rediger | Eksporter til Excel for å eksportere de kvantifiserte båndpikselvolumene til en regnearkfil.
  8. Plott konsentrasjonen av produkt E versus tid, og tilpass dataene til den logistiske veksten Eq (1) ved hjelp av statistisk datatilpasningsprogramvare:
    [E] = Equation 1 (1)
    Hvor a er reaksjonens maksimale utstrekning, er b grad av sigmoidisitet, og c er eksponentiell vekstrate.
    1. I det eksporterte regnearket deler du produkt E-volumet med summen av substrat A og produkt E-volumer for å bestemme brøkdelen av produktet for hver gang og begge reaksjonene. Multipliser med den opprinnelige konsentrasjonen av substrat A (10 μM) for å bestemme utbyttet av produkt E som en funksjon av tiden.
    2. I programvare for statistisk datatilpasning velger du Fil | Nye | Ny prosjektfil, velg XY under Ny tabelldiagram, og klikk på Opprett. Angi reaksjonstidene og produkt E-utbyttene for begge reaksjonene i tilstøtende kolonner, og merk kolonnene tilsvarende (f.eks. "tid", "transkribert B", "syntetisk B").
    3. Velg Sett inn | Ny analyse, velg XY-analyser | Ikke-lineær regresjon (kurvetilpasning) og klikk deretter OK. Velg Vekstkurver | Logistisk vekst og klikk OK; Ikke juster andre parametere. Observer tilpasningsparametrene og konfidensintervallene under Resultater og plottet av datapunkter og monterte kurver under Grafer.

7. Kryss-kiral kopiering av L-RNA

  1. Forbered 10 μL RNA-løsning inneholdende 20 μM D-RNA 27.3t krysskiral polymerase, 2 μM 5′-fluorescein-merket L-RNA primer, 4 μM biotinylert L-RNA hammerhead mal og 20 μM hver av L-RNA pppCUG, pppAUG, pppAGG og pppCGC, i 10 μL av 50 mM Tris, pH 8.3. Glød RNA ved å varme det opp til 90 °C i 1 min og avkjøl til 23 °C ved 0,2 °C/s i en PCR termosykler. Se materialtabellen for detaljer om polymerase, primer og mal.
  2. Inkuber RNA-løsningen ved 17 °C og start reaksjonen ved å tilsette 10 μL 2x startbuffer (400 mM MgCl2, 500 mM NaCl og 50 mM Tris, pH 8,3). Sørg for at de endelige konsentrasjonene av alle komponentene i reaksjonen er 10 μM polymerase, 1 μM primer, 2 μM mal, 10 μM hvert trinukleotid 5′-trifosfat, 200 mM MgCl2, 250 mM NaCl og 50 mM Tris, pH 8,3.
  3. Når reaksjonen fortsetter, ta 10 μL aliquots og slukk med 5 μL av 0,5 M EDTA, pH 8.
  4. Til hver slukket reaksjonsprøve tilsettes 0,1 mg streptavidinbelagte magnetiske perler (20 pmol biotin-oligonukleotid bindingskapasitet) suspendert i 10 μL 1 M NaCl i TE-buffer med 0,05% nøytralt vaskemiddel for å fange trimer-utvidede primere via den biotinylerte malen og inkubere i 30 minutter ved romtemperatur med risting.
  5. Fang perlene på en dråpefangende magnet, fjern og kast væske, og tilsett 50 μL vaskeoppløsning (250 mM NaCl i TE med 0,05% nøytralt vaskemiddel). Bland perlene, fang dem igjen og fjern vaskeoppløsningen. Gjenta en gang til.
  6. For å eluere utvidede primere fra perler, tilsett 50 μL elueringsløsning (25 mM NaOH med 0,05% nøytralt vaskemiddel) og bland perlene. Ta opp perlene igjen, fjern elueringsløsningen, slukk med 100 mM Tris (pH 7,5) og utfell med etanol.
  7. Forbered en analytisk polyakrylamid / 8 M urea / 1x TBE gel, i henhold til passende protokoller for gelplaten og stativet. Monter støpt gel og plate i et gelstativ, fyll reservoarene med 1x TBE, og kjør på 40 W (eller etter behov for forskjellige gelplater og stativer) i 30 minutter.
  8. Løs opp det utfelte RNA i 10 μL formamidgelbelastningsbuffer, og lag uomsatt sluttmerket primer ved 0,5 μM i formamidgelbelastningsbuffer. Varm opp prøvene til 80 °C, last 5 μL av prøven i hver brønn, og kjør gelen ved 40 W i ca. 40 minutter (eller eventuelt for forskjellige gelplater og stativer).
  9. Fjern gelplaten fra stativet, og skann med en fluorescerende / fosforescerende gelskanner for å visualisere krysskirale L-RNA-forlengelsesprodukter.

Representative Results

Oligonukleotider skal syntetiseres ved hjelp av standardprotokoller som passer til fosforamidittene og automatisert DNA / RNA-synthesizer, slik at produktet oligonukleotid er urent fra den faste støtten i den opprinnelige plastsyntesekolonnen, med den 5ʹ-terminale dimetoksytritylgruppen fjernet for å gi den frie 5ʹ-hydroksylen (avsnitt 1). Alle oligonukleotider som ble brukt i denne demonstrasjonen ble fremstilt ved bruk av 1000 Å-kontrollert poreglass (CPG) harpiks som fast støtte og utført på 0,2 eller 1 μmol skala. Representative eksempler på synthesizerkolonner, harpikser, reagenser og fosforamiditter er gitt i materialtabellen. For større reaksjoner kan det være nødvendig å justere volumer og tider som brukes i påfølgende trinn.

Triposforyleringsreaksjonen utføres i kolonne i et spesialbygd reaksjonskammer (figur 2, avsnitt 3) ved bruk av standard, kommersielt tilgjengelige komponenter oppført i materialtabellen og følger skjemaet illustrert i figur 1 (avsnitt 4) 28. Det er viktig at forholdene holdes strengt vannfrie under triposforylering, og at alle løsningsmidler og reagenser fremstilles over molekylsikter på forhånd og får tørke helt ut før bruk (avsnitt 2). Det tar vanligvis 2 timer før trifosforylering skjer, og etterpå kan den vaskede og tørkede kolonnen behandles i henhold til standard oligonukleotiddeproteksjons- og renseprosedyrer (avsnitt 5).

Etter debeskyttelse renses oligonukleotidtrifosfater ved denaturering av polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), som viser et enkelt hovedproduktbånd ved UV-bakskygging som kan skåret ut og elueres fra gelen. 5′-trifosfatproduktet separeres lett fra reaksjonssideprodukter for korte oligonukleotider, som vist for DNA-trinukleotid 5ʹ-trifosfater, pppAAA og pppCCC, og L-RNA-trinukleotid 5ʹ-trifosfatpppGAA i figur 3A,B. Både 5′-hydroksyl- og 5-trifosfatproduktene for AAA- og CCC DNA-trimere ble skåret ut og identifisert ved massespektrometri og tilsvarende merket i figur 3A. Ytterligere bånd, som synlige for AAA DNA-trimeren, inneholder vanligvis ikke nok materiale til å gjenopprette og identifisere. Tilstedeværelsen av disse båndene korrelerer imidlertid med ytterligere produktmasser i de urensede reaksjonsproduktene (figur 3C), som vanligvis representerer sideprodukter av 5′-difosfat, monofosfat og H-fosfonat, som diskutert nedenfor.

Etter PAGE-rensing kan større oligonukleotider elueres ved hjelp av knusings- og bløtleggingsmetoden42 og påfølgende etanolutfelling. Oligonukleotider mindre enn 15 nt kan imidlertid ikke utfelles effektivt og krever derfor en modifisert prosedyre for gele-elusjon (trinn 5.11.3). Kolonnen for utelukkelse av engangsstørrelse som er oppført i materialtabellen , er kun vurdert for bruk med oligonukleotider som er lengre enn 10 nt. Vi har imidlertid funnet ut at oligonukleotider så korte som trimere effektivt kan avsaltes ved hjelp av produsentens anbefalte protokoll. Ved avsalting av korte oligonukleotider (som i trinn 5.6 og 5.11.3) anbefales det likevel at kolonneelusatet samles i fraksjoner, og produktfraksjoner identifiseres ved absorbans ved 260 nm ved bruk av et UV-Vis-spektrofotometer. En størrelsesekskluderingskolonne optimalisert for kortere oligonukleotider er gitt i materialtabellen som et alternativt valg. Det endelige utbyttet fra 1 μmole skala oligonukleotidsyntese etter rensing er 50-300 nmol.

Trifosforylering kan bekreftes ved massespektrometri, hvor det trifosforylerte produktet har en masse +239,94 Da større enn 5′-hydroksyl oligonukleotid, selv om tilstedeværelsen av materialer som tilsvarer henholdsvis 5′-di- og monofosfat (+159,96 og +79,98 Da) ofte observeres. Et 5′-H-fosfonat sideprodukt med en masse +63,98 Da fra 5′-OH massen kan også observeres, og høye nivåer av dette produktet indikerer at forholdene under trifosforylering ikke var tilstrekkelig vannfrie. Før rensing vil debeskyttede oligonukleotider typisk vise alle disse produktene (figur 3C), mens renset materiale vil vise en topp som tilsvarer 5′-trifosfatproduktet sammen med 5′-di- og monofosfater (figur 3D,E).

Massespektrometri alene vil vanligvis ikke gi et strengt mål på 5′-trifosfatrenhet på grunn av differensielle ioniseringshastigheter og fragmentering av trifosfatet under ionisering. For å måle sluttproduktets renhet anbefales væskekromatografi med omvendt fase og tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS), spesielt for lengre oligonukleotider. Analyse av D-RNA 5ʹ-trifosfatene pppACGAGG og pppGAGACCGCAACUUA ved RP-LC/ESI-MS (henholdsvis figur 4A,B) viser typisk sluttproduktrenhet, som inneholder 20 % 5ʹ-difosfat, da disse to artene er vanskelige å skille fra hverandre når de er til stede på lengre oligonukleotider.

Syntetiske 5′-trifosfat oligonukleotider fungerer vanligvis like godt eller bedre enn materialer fremstilt enzymatisk i biokjemiske studier. I avsnitt 6, som et eksempel, ble 5′-trifosfat 14 nt RNA-substrater fremstilt enten syntetisk eller ved in vitro transkripsjon sammenlignet i en RNA-katalysert selvreplikasjonsreaksjon 14,15,43,44,45. Ribozyme E katalyserer sammenføyningen av substratene A og B for å gi en ny kopi av E i en autokatalytisk reaksjon som er i stand til eksponentiell vekst (figur 5A). E- og 32P-merkede A-komponenter ble fremstilt ved in vitro-transkripsjon, og trifosforylert substrat B ble fremstilt enten syntetisk, som beskrevet ovenfor, eller ved in vitro-transkripsjon 14. Selvreplikasjonsreaksjonsfremgangen ble overvåket ved å ta periodiske prøver som ble analysert ved denaturering av PAGE og kvantifisert via en fluorescerende / fosforescerende gelskanner. De resulterende dataene, tilpasset en logistisk vekstfunksjon, viste at enten transkribert eller syntetisk B-substrat støtter eksponentiell vekst, men syntetisk B gir en litt større mengde produkt (figur 5B). Dette resultatet kan gjenspeile kompositorisk heterogenitet ved 5′-enden av RNA fremstilt ved in vitro transkripsjon23,24.

Kjemisk triposforylering muliggjør også syntese av oligonukleotidtrifosfater som ikke kan fremstilles biologisk, verken in vitro eller i celler. I avsnitt 7 ble ikke-biologiske oligonukleotidtrifosfater sammensatt av L-RNA, enantiomeren av naturlig D-RNA, fremstilt som i seksjon 1-5, brukt som substrater for D-RNA "cross-chiral" polymerase ribozym 27.3t (figur 6A), som katalyserer malstyrt polymerisering av et lengre L-RNA-produkt fra kort L-RNA oligonukleotid 5′-trifosfater på en sekvens-generell måte. Som et eksempel kan ribozym syntetisere en L-RNA-versjon av hammerhodets selvspaltemotiv (figur 6B)18. Rensede L-RNA-trinukleotidtrifosfater ble kombinert med en fluoresceinmerket L-RNA-primer og L-RNA-mal (figur 6C) og reagerte med den krysskirale ligasen. Prøver i løpet av reaksjonen ble analysert av PAGE og avbildet ved hjelp av en fluorescerende / fosforescerende gelskanner for å demonstrere syntese av en L-RNA-versjon av hammerhead ribozym kodet av malen (figur 6D).

Figure 3
Figur 3: Rensing av trinukleotid 5ʹ-trifosfater. (A) SIDEanalyse (visualisert ved UV-back-shadowing) av trihosphorylation av DNA-trinukleotider tri-deoxyadenosin (AAA, blå) og tri-deoksycytidin (CCC, rød), med vilje overbelastet for å visualisere mindre sideprodukter. Både startmaterialet for 5ʹ-trifosfat (ppp) og 5ʹ-hydroksyl (OH) ble skåret ut og identifisert av MALDI-MS. (B) Preparativ SIDE av trifosforylering av L-RNA trinukleotid GAA, med hovedproduktbånd skåret ut og identifisert som 5ʹ-trifosfat (ppp) av ESI-MS. (C) MALDI-MS av råreaksjonsprodukter etter debeskyttelse og (D) rensede produkter fra (A). 5ʹ-trifosfat (ppp; pppAAA forventet 1,119 Da, observert 1,118 Da; pppCCC forventet 1,047 Da, observert 1,046); 5ʹ-difosfat (pp), 5ʹ-monofosfat (p), 5ʹ-hydroksyl (OH) og 5ʹ-H-fosfonat (Hp) er merket. (E) Dekonvolutert massespektrum fra direkte injeksjon ESI-MS av isolert 5ʹ-trifosfatprodukt fra (B), med identifiserte topper merket (forventet 1,181.6 Da, observert 1,181.0 Da). Det observeres også 5ʹ-difosfat (pp)-produkter, det samme gjelder natriumiontopper for både tri- og difosfatproduktene (+22 Da). Vanlige forurensningstopper er merket med en stjerne. For enkel sammenligning ble massespektra normalisert til den høyeste intensiteten målt i hvert spektrum og rapporteres som en prosentandel i forhold til den verdien. Forkortelser: PAGE = polyakrylamidgelelektroforese; MALDI-MS = matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering; ESI-MS = elektrosprayionisering massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Analytisk RP-LC på 6 nt og 14 nt D-RNA oligonukleotidtrifosfater. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ og (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS identifiserte den viktigste toppen av begge (~ 70%) som 5ʹ-trifosfat (ppp), med mindre mengder av 5ʹ-difosfat (pp). Forkortelser: RP-LC = væskekromatografi i omvendt fase; nt = nukleotider; ESI-MS = elektrosprayionisering massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av oligonukleotid 5ʹ-trifosfatsubstrater fremstilt ved kjemisk syntese eller in vitro transkripsjon. (A) De selvreplikerende ribozym E-ligatene RNA A og 5′-triphosforylert RNA B. (B) Sammenligning av selvreplikasjonsreaksjoner ved bruk av 10 μM A og 10 μM B, enten syntetiske (åpne sirkler) eller in vitro transkriberte (fylte sirkler). (B) Data var tilpasset den logistiske vekstligningen: [E] = a / (1 + b e-ct), hvor a er det endelige utbyttet, b er graden av sigmoidicitet, og c er den eksponentielle vekstraten. Vekstratene for de to reaksjonene var identiske, ved 1,14 h-1, mens den endelige utstrekningen var 10 % høyere for reaksjoner med syntetisk B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Kryss-kiral L-RNA-polymerisasjon med ribozym. (A) D-RNA 27.3t polymerase ribozym, som katalyserer malavhengig ligering av L-RNA. (B) L-RNA-produktet syntetisert av 27.3t inngår i et hammerhode endonukleasemotiv. (C) L-RNA-polymerisasjon katalysert ved 27,3t ved bruk av en biotinylert L-RNA-mal (brun), en endemerket L-RNA-primer (magenta) og fire L-RNA-trinukleotidtrifosfater (cyan), fremstilt syntetisk. (D) SIDEanalyse av forlengelsesprodukter av (B) ved 4 timer og 24 timer, som viser hver trinukleotid-inkorporering opp til full lengde produkt (svart prikk). Uomsatt L-RNA-primer er inkludert som referansemarkør. Forkortelser: PAGE = polyakrylamidgelelektroforese; M = referansemarkør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Triposforyleringsprosedyren beskrevet her er bredt kompatibel med oligonukleotidsyntese ved bruk av standard fosforamidittkjemi. Nukleosidfosforamiditter bør ha baselabile beskyttelsesgrupper som er kompatible med rask deproteksjon i AMA39, inkludert standard β-cyanoetyl på fosfitt og isobutyryl, dimetylformamidyl, acetyl, fenoksyacetyl eller 4-isopropylfenoksyacetylgrupper på nukleosobasenes eksocykliske aminer. Ribose 2'-hydroksylgrupper bør beskyttes av silylbeskyttende grupper, enten t-butyldimetylsilyl (TBDMS) eller tri-iso-propylsilyloksymetyl (TOM)40,41. Den baselabile pivaloyloksymetylgruppen (PivOM) er også rapportert å være kompatibel med kjemisk triposforylering30.

Det er beskrevet flere metoder for kjemisk triposforylering av syntetiske oligonukleotider 28,29,30,31,32,33,34,35. Vi har funnet triphosforylering ved hjelp av Ludwig-Eckstein-reagenset37 for å være en av de mest tilgjengelige, krever ingen spesialisert syntese av reagenser og ikke noe spesialutstyr. Oligonukleotid 5′-trifosfater fremstilt ved denne metoden har blitt brukt rutinemessig som substrater for RNA-ligase ribozymer, inkludert bruk av enzymatisk utilgjengelige L-RNA oligonukleotidtrifosfater for å oppnå malavhengig syntese og replikasjon av denne "speilbilde" nukleinsyre 14,16,17,18 . Metoden er også egnet for fremstilling av små 5′-triphosphorylated stem-loop RNAer som er potente aktivatorer av den medfødte immunresponsen hos vertebrater 6,7.

Ludwig-Eckstein-reagenset, salicylfosforokloliditt37, er svært reaktivt mot vann, og fjerner effektivt alt vann som introduseres når reagenset oppløses før det lastes på oligonukleotidkolonnen. Etter dette punktet vil imidlertid 5′-fosfitetert oligonukleotid fortrinnsvis reagere med noe vann som innføres i systemet over pyrofosfat, og danner et 5′-H-fosfonat sideprodukt etter opparbeidelse 28,37,38. Forsiktig fremstilling av trifosforyleringsreagenser og trifosforyleringsreaksjonskammeret sikrer at dette sideproduktet ikke dannes. For tørking av løsemidler selges molekylsikter av type 4 Å ferdigpakket i teflonposer som er kompatible med de fleste organiske løsningsmidler under forskjellige merkenavn av de fleste oligonukleotidsyntesereagensfirmaer. Ytterligere forholdsregler, som å utføre trifosforylering i et hanskerom under en vannfri atmosfære, er vanligvis ikke nødvendig.

Reaksjon av 5′-fosfitetert oligonukleotid med TBAP danner et syklisk 5′-trimetafosfitt-mellomprodukt, som deretter oksyderes til det sykliske 5′-trimetafosfatet ved bruk av oligonukleotidsynteseoksiderende løsning (jod i vann / pyridin / THF). Det skal bemerkes at kommersielle oksidasjonsløsninger bruker varierende mengder jod, og det er viktig å bruke den høye jodkonsentrasjonen på 0,1 M for å sikre fullstendig oksidasjon til trifosfatet. Det sykliske produktet hydrolyseres til det endelige lineære 5′-trifosfatet i samme løsning37, og alternativt må vannfrie oksidasjonsløsninger brukes hvis linearisering med andre nukleofiler enn vann er ønsket (se nedenfor for anvendelser)33. Eventuelt gjenværende syklisk trimetafosfat vil imidlertid bli linearisert under påfølgende alkalisk deproteksjon av oligonukleotidet. Hydrolyse av syklisk 5′-trimetafosfat gir bare den lineære, snarere enn forgrenet trifosfat37,46.

Oligonukleotid deprotection vanligvis ikke trenger å bli endret for å imøtekomme 5'-triphosphorylation, men noen forholdsregler bør tas. Trifosfatet er relativt stabilt til kortvarig eksponering for alkaliske forhold, men det bør utvises forsiktighet for ikke å eksponere trifosfatet for AMA lenger enn nødvendig. Beskyttelse av grupper som trenger mer langvarig behandling i ammoniakk eller AMA i mer enn 10 minutter ved 65 °C bør unngås. Mer skånsomme behandlinger, som 2 timer i ammoniakk ved romtemperatur, er akseptable når de er kompatible med andre fosforamidittbeskyttende grupper. En vanlig, rask debeskyttelsesmetode for silylbeskyttede syntetiske RNA-oligonukleotider bruker trietylamintrihydrofluorid og høy temperatur47; Dette bør imidlertid unngås ved fremstilling av RNA 5′-trifosfater, da de langvarige sure forholdene er funnet å akselerere trifosfathydrolyse31,32.

Preparativ PAGE har vist seg å være den enkleste og mest pålitelige metoden for postdeprotection rensing av 5′-triphosphorylated oligonukleotider (figur 3 og figur 4). Imidlertid kan forberedende omvendt fase HPLC også brukes til å rense triphosforylerte produkter. Tilstedeværelsen av 5′-difosfat og i mindre grad 5′-monofosfatprodukter observeres rutinemessig ved verifisering av triposforylering ved massespektrometri. Vi har observert 5′-trifosfatfragmentering under massespektrometri fra svært rent materiale fremstilt ved kjemisk syntese eller transkripsjon, spesielt hvis instrumentet ikke er optimalisert for analyse av oligonukleotider. Likevel viser RP-LC-analyse ofte at 10% -20% av 5′-difosfatsideproduktet er tilstede i lengre 5′-triphosforylerte oligonukleotider (figur 4). Kommersielle preparater av tributylammoniumpyrofosfat kan forurenses med så mye som 20% monofosfat, noe som vil gi 5′-difosfat som et sideprodukt under trifosforylering30,31. Forsiktig forberedelse av dette reagenset internt kan gi mye mer rene TBAP-aksjer31. Imidlertid har vi funnet oligonukleotider triphosphorylated ved bruk av kommersielle kilder til TBAP fortsatt viser sammenlignbar eller større reaktivitet når de brukes som substrater i enzymatiske reaksjoner (figur 5B), sammenlignet med materiale fremstilt ved in vitro transkripsjon.

En bemerkelsesverdig videre bruk av oligonukleotidtriosforylering med Ludwig-Eckstein-reagenset utnytter det sykliske trimetafosfitt-mellomproduktet33. Hvis det etterfølgende oksidasjonstrinnet utføres med 1 M t-butylperoksid i heksaner, som ofte brukes til oligonukleotidoksydoksydasjon under vannfrie forhold, oppstår oksidasjon av fosfittet uten ringåpningshydrolyse, noe som gir det sykliske trimetafosfatet. Dette mellomproduktet kan deretter reageres med primære amin- eller alkoholnukleofiler for å gi 5′-trifosfater med modifikasjoner ved γ-fosfat. Disse modifikasjonene inkluderer tilsetning av en lipofil tag forbundet med en fosforamidatbinding, noe som letter rask trifosfatspesifikk rensing ved RP-LC, etterfulgt av sur hydrolyse av taggen fra trifosfat33. Fluorescerende modifikasjoner ved γ-fosfatposisjon kan også introduseres for bruk som sanntids fluorescerende reportere for ribozym-katalyserte ligeringsreaksjoner15,33.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Forfatterne er takknemlige for Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski og Katrina Tjhung for nyttige diskusjoner om beste praksis for kjemiske triposforyleringsreaksjoner og til Gerald Joyce for nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av grant MCB 2114588 fra National Science Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Tags

Bioteknologi utgave 184
Kjemisk triphosforylering av oligonukleotider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter