Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Химическое трифосфорилирование олигонуклеотидов

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63877
Automatic Translation
1, 1
1The Salk Institute

Summary

Олигонуклеотид 5'-трифосфаты являются вездесущими компонентами в основных биологических путях и все чаще используются в биотехнологических приложениях. Здесь мы описываем методы рутинного синтеза и очистки олигонуклеотидных 5'-трифосфатов, начиная с олигонуклеотидов, полученных стандартными методами автоматизированного синтеза.

Abstract

5'-трифосфат является важной модификацией нуклеиновых кислот, встречающейся на протяжении всей жизни и все чаще используемой в качестве функциональной модификации олигонуклеотидов в биотехнологии и синтетической биологии. Олигонуклеотидные 5'-трифосфаты исторически получали in vitro ферментативными методами. Однако эти методы ограничены природными олигонуклеотидами РНК, имеют сильные предпочтения последовательности и, как правило, производят гетерогенные продукты. Новые методы химического трифосфорилирования дополняют как снижение стоимости автоматизированного синтеза олигонуклеотидов химией фосфорамидитов, так и широкий спектр доступных в настоящее время модификаций нуклеотидов. Таким образом, синтез олигонуклеотидных трифосфатов произвольной последовательности и длины, и необязательно содержащих различные неестественные модификации, теперь доступен.

В данной работе представлены соответствующие методы и приемы химического трифосфорилирования олигонуклеотидов с использованием салицилфосфорохлоридита и пирофосфата. Этот способ использует коммерчески доступные реагенты, совместим с большинством олигонуклеотидов, полученных стандартными твердофазными методами синтеза, и может быть завершен через 2 ч после синтеза олигонуклеотидов, до депротекции и очистки. Продемонстрировано два использования химически трифосфорилированных олигонуклеотидов в качестве субстратов для каталитических ферментов РНК, включая синтез зеркальной версии рибозима молотоголового из небиологических трифосфатов L-РНК.

Introduction

5'-трифосфорилированная форма РНК повсеместно распространена в биологии, поскольку она генерируется транскрипцией РНК во всех областях жизни и репликацией РНК в течение жизненного цикла многих РНК-вирусов. Эти трифосфаты служат субстратом для образования 7-метилгуанилат-закрытой мРНК у эукариот и, следовательно, играют существенную роль в экспрессии белка1. Напротив, трифосфат сохраняется в бактериях и вирусах; таким образом, РНК 5'-трифосфаты распознаются регуляторами ответа врожденного иммунитета у эукариот 2,3,4,5,6,7. Вне биологии множество рибозимов РНК-лигазы были разработаны для использования 5'-трифосфата in vitro8 и модифицированы для использования в диагностических анализах 9,10,11,12,13,14,15. Один из таких рибозимов может быть использован для шаблон-зависимого синтеза L-РНК, небиологического «зеркального» энантиомера естественной D-РНК, из малых L-РНК олигонуклеотида 5′-трифосфатов 16,17,18. Рутинное получение трифосфорилированных олигонуклеотидов различной последовательности и основного состава имеет важное значение для исследования этих систем.

Наиболее распространенным и доступным методом получения РНК 5'-трифосфатов в лаборатории является транскрипция in vitro. Однако РНК, продуцируемая этим методом, ограничена в последовательности и размере промоторными и субстратными требованиями фермента РНК-полимеразы. Т7 РНК-полимераза и специализированные производные являются наиболее распространенными полимеразами, используемыми для этой цели 19,20,21,22. In vitro транскрибированная РНК, приготовленная с этими ферментами, должна быть инициирована 5'-концевым пурином и сильно смещена в сторону пуринов в первых 10 нуклеотидах23,24. Более того, ферментативное включение баз- или магистральных модифицированных нуклеотидов в лучшем случае неэффективно и чаще невозможно с природными полимеразами, ограничивая возможность получения олигонуклеотидных 5'-трифосфатов, состоящих из чего угодно, кроме естественной D-РНК. Другим ограничивающим фактором является то, что РНК, генерируемая транскрипцией in vitro, может содержать существенную 5'- и 3'-гетерогенность и образуется как чрезвычайно гетерогенные продукты, когда короче20 nt 23,24,25,26,27.

Напротив, химическое трифосфорилирование олигонуклеотидов, полученных твердофазным синтезом фосфорамидитов 28,29,30,31,32,33,34,35, может быть использовано для получения олигонуклеотидов 5'-трифосфатов длиной 3-50 нт, любой последовательности. Кроме того, широкий спектр модификаций нуклеиновых кислот, доступных для синтеза фосфорамидитов, может быть добавлен к олигонуклеотидам до 5'-трифосфорилирования 14,15,16,17,18,29,36. Многие из этих способов используют реагент фосфитилирования салицилфосфорохлоридит, который был разработан Людвигом и Экштейном для растворно-фазного трифосфорилирования мононуклеозидов37. Трифосфорилирование олигонуклеотидов этим реагентом достигается на твердой фазе фосфитилированием олигонуклеотида 5'-гидроксила, превращением в трифосфат реакцией с пирофосфатом и окислением с последующими стандартными процедурами расщепления олигонуклеотида от твердой опоры, депротекции и очистки (фиг.1)28.

Figure 1
Рисунок 1: Схема трифосфорилирования синтетических олигонуклеотидов. На первом этапе олигонуклеотид 5ʹ-гидроксил фосфитилируется SalPCl. На следующей стадии 5ʹ-салицилфосфит реагируют с TBAP с образованием циклического метафосфита, затем на третьей стадии окисляют с образованием циклического 5ʹ-триметафосфата в растворе окисления синтезатора ДНК/РНК (0,1 М йода/пиридина/H2O/THF), который быстро гидролизуется с получением линейного 5ʹ-трифосфата в том же растворе28,33, 37. Последующее щелочное расщепление от твердой поддержки CPG и депротекция олигонуклеотида в водном Растворе MeNH2/аммиак гидролизует любой остаточный циклический триметафосфат в линейную форму. Сокращения: SalPCl = салицилфосфорохлорид; TBAP = пирофосфат трибутиламмония; ТГФ = тетрагидрофуран; CPG = контролируемое поровое стекло; MeNH2 = метиламин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Хотя ранее опубликованные отчеты с использованием этого метода часто страдали от плохих урожаев и нежелательных побочных продуктов 28,37,38, тщательное поддержание безводных условий - это все, что необходимо для регулярного получения высоких урожаев. Это может быть достигнуто путем тщательной подготовки реагентов и использования простого реакционного устройства, собранного из стандартных пластиковых компонентов. Здесь мы демонстрируем соответствующие этапы химического трифосфорилирования олигонуклеотидов, включая получение реагентов, сборку реакционной камеры, реакцию трифосфорилирования и последующую депротекцию и очистку трифосфорилированных олигонуклеотидов. Также включено репрезентативное использование 5'-трифосфорилированных олигонуклеотидов в качестве субстратов для рибозимов лигазы для синтеза более крупных продуктов нуклеиновых кислот с естественной D-РНК и абиотической L-РНК-основой.

Protocol

1. Автоматизированный твердофазный синтез 5'-гидроксильных олигонуклеотидов на твердой подложке

  1. Подготовьте автоматизированный синтезатор ДНК/РНК с реагентами и фосфорамидитами в соответствии с целевым олигонуклеотидным составом и инструкцией прибора.
  2. Загрузите на синтезатор колонку синтеза, содержащую твердую опору, и синтезируйте олигонуклеотиды в соответствии с протоколами синтезаторного прибора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура трифосфорилирования оптимизирована для олигонуклеотидов, полученных в масштабе 1 мкмоль.
  3. Удалите 5'-диметокситритильную защитную группу с получением твердо поддерживаемого олигонуклеотида 5'-гидроксила как часть синтеза олигонуклеотидов на предыдущей стадии или путем выполнения стадии терминальной детритилирования в соответствии с протоколами синтезатора.
  4. Извлекают колонну, содержащую 5'-гидроксильный олигонуклеотид на твердой опоре, из синтезатора, сушат под домашним вакуумом в течение 10 мин для удаления остаточного растворителя и приступают к трифосфорилированию (разделы 3 и 4) после приготовления материалов для трифосфорилирования (раздел 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать немедленно, высушенный столб можно хранить в нормальной атмосфере в герметичном пластиковом контейнере с осушителем при -20 °C. Дальнейшая сушка на этом этапе не требуется, так как колонна тщательно высушивается перед трифосфорилированием в разделе 3.

2. Подготовка материалов для трифосфорилирования

  1. Прикрепите сухой источник аргона с регулируемым давлением к газовому коллектору, имеющему по меньшей мере две линии, и подключите к барботеру. Убедитесь, что линии заканчиваются пластиковыми шприцами объемом 1 мл для облегчения подключения к реакционному устройству.
  2. Соберите оборудование для использования во время трифосфорилирования, включая пластиковые шприцы 1 мл, трехсторонний полипропиленовый запорный кран, некоринговые иглы, полипропиленовые трубки 1,5 мл и небольшой металлический шпатель. Храните их в герметичном контейнере или осушителе с осушителем при комнатной температуре не менее 1 дня перед использованием.
  3. Приготовьте по 30 мл безводного 1,4-диоксана, 3:1 диоксана:пиридина по объему, N,N-диметилформамида (DMF) и ацетонитрила (ACN) в высушенных стеклянных бутылках по 30 мл с сушильными ловушками (4 молекулярных сита Å в герметичных мембранных пакетах) по меньшей мере за 1 день до использования. Уплотнить резиновыми перегородками и хранить в осушителе с осушителем.
  4. Хранить твердый 2-хлор-4Н-1,3,2-бензодиоксафосфорин-4-он (салицилфосфорохлорид, SalPCl) в оригинальной таре внутри герметичной банки с осушителем при 4 °C. Всегда промывайте контейнер аргоном между использованием.
  5. Приготовьте раствор пирофосфата трибутиламмония (ТБАП) не менее чем за 5 дней до начала реакции трифосфорилирования:
    1. Взвесьте 1-5 г твердого ТБАП в высушенном стеклянном флаконе объемом 30 мл и растворите в 1 мл ДМФ и 0,5 мл трибутиламина на г ТБАП.
    2. Добавьте три сушильные ловушки, запечатайте бутылку резиновой перегородкой под аргоном и пузырите с аргоном в течение 30 минут до дегазации.
    3. Хранить внутри запечатанной банки с осушителем при 4 °C в течение 5 дней, чтобы молекулярные сита впитали всю следовую воду. Хранить банку при -20 °C и готовить свежей через 6 месяцев.

3. Сборка и использование аппарата трифосфорилирования

  1. Дайте синтезирующей колонне нагреться до комнатной температуры при извлечении из хранилища при -20 °C.
  2. Соберите реакционную камеру, показанную на рисунке 2:
    1. Подготовьте прихожую: извлеките поршень из сухого шприца объемом 1 мл, отрежьте верхнюю часть шприца ножницами или лезвием бритвы и прикрепите шприц к колонне синтеза. Прикрепите трехсторонний запорный кран к верхней части шприца и прикрепите боковое входное отверстие запорного крана к источнику сухого аргона с помощью барботера, так что верхним входным отверстием запорного крана является отверстие для впрыска реагента.
    2. Закрепите этот аппарат на подставке с помощью зажимов и запечатайте все восходящие стыки восковой уплотнительной пленкой. Отрегулируйте запорный кран так, чтобы порт впрыска был закрыт, а аппарат был открыт для источника аргона. Закройте барботер и дайте аргону при низком давлении (<10 фунтов на кв. дюйм) течь через реакционную камеру в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько реакционных камер могут быть установлены параллельно трифосфорилатам 2-4 олигонуклеотидам. Тем не менее, одна линия от коллектора должна быть зарезервирована для подачи аргона в бутылки с реагентами.
    3. Снова откройте барботер и прикрепите шприц к нижней части колонны синтеза, который будет являться отработанным шприцем. Протягивайте аргон через колонну многократно с помощью отработанного шприца; затем снова прикрепите шприц с полностью вставленным плунжером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением случаев загрузки реагентов, запорный кран должен быть установлен таким образом, чтобы порт впрыска был закрыт, а устройство открыто для источника аргона, как показано на рисунке 2А. Аналогичным образом, шприц отходов должен быть прикреплен, а соединение с колонной синтеза запечатано восковой герметизирующей пленкой, если только активно не удаляются реагенты.
  3. Чтобы добавить реагент или растворитель:
    1. Прикрепите иглу к сухому источнику аргона и вставьте ее в перегородку бутылки с реагентом или растворителем, следя за тем, чтобы не погрузить иглу в содержимое бутылки.
    2. Соберите сухой шприц с помощью иглы и вставьте его в перегородку реагента или бутылки с растворителем, не погружая в содержимое бутылки. Наполните шприц аргоном, выньте иглу из перегородки и изгоните аргон. Наполните шприц аргоном и снова изгоните; затем заполните шприц необходимым объемом растворителя или реагента под давлением аргона.
    3. Отрегулируйте запорный кран на аппарате так, чтобы источник аргона был закрыт, а порт впрыска открыт (рисунок 2B). Быстро извлеките наполненный шприц и иглу из исходного флакона, протрите любой растворитель, прилипший к боку или кончику иглы, и вставьте иглу в инъекционный порт. Выталкните реагент в прихожую аппарата, извлеките иглу и закройте инъекционный порт, вновь открыв аппарат к источнику аргона.
    4. Осторожно вытяните жидкость из прихожей через колонну синтеза с помощью шприца отходов, чтобы вся жидкость теперь удерживалась в шприце отходов. Теперь медленно протолкните раствор обратно в колонну синтеза, гарантируя, что в колонне нет пузырьков газа. Чтобы перемешать или перемешать, осторожно потяните раствор вверх и вниз над колонкой со шприцем отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда медленно и осторожно перемещайте жидкость через реакционную камеру, чтобы убедиться, что уплотнения не повреждены, что позволяет воздуху проникать в аппарат.
  4. Для удаления реагента или растворителя из колонки:
    1. Медленно втяните раствор в шприц отходов. После того, как основная часть раствора попала в шприц отходов, протяните аргон, чтобы смыть оставшийся растворитель из колонны.
    2. Снимите восковую уплотнительную пленку вокруг соединения шприца отходов, затем извлеките шприц и выбросьте раствор отходов. Замените отработанный шприц новым, сухим шприцем и повторно запечатайте стык восковой герметизирующей пленкой.

Figure 2
Рисунок 2: Аппарат трифосфорилирования. Во время перемешивания или реакций устройство (А) открыто для источника аргона (i) и закрыто для воздуха путем регулировки трехстороннего запорного крана (ii). Реагенты извлекаются из прихожей (iii) в колонку синтеза (iv) с помощью отработанного шприца (v). Реагенты удаляются путем втягивания всей жидкости в шприц отходов (v) и ее выброса. При загрузке реагентов (В) трехсторонний запорный кран (ii) открыт для атмосферы, а реагент загружается в прихожую (iii) с помощью шприца и иглы (vi). (C) Фотография собранного устройства, установленного в соответствии с пунктом (А) для смешивания и взаимодействия реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Онколонное трифосфорилирование синтетического 5'-гидроксильного олигонуклеотида

  1. Извлеките раствор SalPCl и TBAP из хранилища при температуре -20 °C и дайте им нагреться до комнатной температуры перед использованием.
  2. Добавьте 200 мкл пиридина/диоксана в прихожую в соответствии с этапами 3.3.1-3.3.3. Однако не нагружайте растворитель в колонну синтеза до стадии 4.4.
  3. Используйте сухой металлический шпатель, чтобы взвесить 6-12 мг SalPCl в сухую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и растворить в 100 мкл диоксана, осторожно спрессовывая растворитель вверх и вниз в трубке микроцентрифуги.
  4. Добавьте растворенный SalPCl в прихожую и загрузите его в колонну синтеза, следуя шагу 3.3. Дайте ему вступить в реакцию в течение 15 мин, перемешивая раствор каждые 5 мин. Удалите и выбросьте раствор SalPCl в соответствии с шагом 3.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SalPCl добавляется в большом избытке и удаляет любую воду, поглощенную во время приготовления и загрузки в реакционную камеру. Однако введение любой влаги на этапах 4.5 и 4.6 поставит под угрозу конечный выход олигонуклеотида 5'-трифосфата.
  5. Добавьте 250 мкл раствора TBAP в прихожую и загрузите его в колонну синтеза, следуя шагу 3.3. Дайте ему вступить в реакцию в течение 20 минут, перемешивая каждые 5 минут. Удалите и выбросьте раствор TBAP в соответствии с шагом 3.4.
  6. Промыть колонну 0,5 мл DMF, затем 0,5 мл ACN, удаляя растворитель после каждого добавления согласно этапам 3.3 и 3.4.
  7. Добавьте 250 мкл раствора окислителя (0,1 М йода в тетрагидрофуране (ТГФ)/пиридине/воде, 88:10:2) в прихожую и загрузите его в колонну синтеза, следуя шагу 3.3. Дайте ему вступить в реакцию в течение 30 минут, перемешивая каждые 10 минут. Удалите и выбросьте раствор окислителя в соответствии с этапом 3.4.
  8. Вымойте колонку с 0,5 мл ACN и удалите в соответствии с шагами 3.3 и 3.4.
  9. Разберите реакционный аппарат. Промойте колонну синтеза 5 мл ACN и высушите колонну.

5. Расщепление от твердой опоры, депротекция и очистка

  1. Извлеките высушенную твердую опорную смолу из колонны синтеза и переложите ее в уплотнительную трубку с силиконовым уплотнительным кольцом объемом 1,5 мл полипропилена.
  2. Суспендировать смолу в 1 мл смеси 1:1 из 28%-30% водного аммиака и 40% водного метиламина (АМА) и плотно запечатать трубку. Инкубировать при 65 °C в течение 10 мин с прерывистым перемешиванием путем мягкой инверсии39. Используйте более мягкую обработку при комнатной температуре в течение 2 ч для олигонуклеотидов длиной более 40 нт.
    ВНИМАНИЕ: Нагревание раствора AMA поставит трубку под высокое давление. Если трубка не герметично закрыта или не использует аммиачно-совместимое (силиконовое) уплотнительное кольцо, трубка может выпустить газ или растворитель, что может поставить под угрозу безопасность или выход конечного продукта. Никогда не открывайте трубку, когда она находится выше температуры окружающей среды, так как горячий раствор АМА может сильно выделять газ.
  3. Охладите трубку на льду и ненадолго центрифугируйте ее (6000-12000 × г в течение 10 с). Извлеките супернатант из смолы, отфильтруйте через шприц, оснащенный фильтром 0,2 мкм, и переложите в новую, стерильную полипропиленовую трубку. Испарите раствор до сухости с помощью вакуумной центрифуги, оснащенной химической ловушкой, нейтрализующей аммиак.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если синтетический олигонуклеотид не содержит нуклеотидов РНК с 2'-силильными защитными группами, перейдите к шагу 5.8.
  4. Удаляют силильные защитные группы путем растворения высушенного материала в 1 мл 1 М тетрабутиламмония фторида (TBAF) в ТГФ, нагревания до 55 °C, встряхивания при необходимости полного растворения олигонуклеотида и инкубации при комнатной температуре в течение 16-24 ч40,41.
  5. Гасите раствор TBAF 1 мл буфера 1 M Tris, рН 7,5 и удалите ТГФ с помощью вакуумной центрифуги.
  6. Удалите соли TBAF с помощью одноразовой колонки исключения размера, следуя инструкциям производителя. Для олигонуклеотидов короче 15 нт подтверждают элюирование продукта путем сбора элюата во фракции и идентификации фракций основного продукта по поглощению при 260 нм на спектрофотометре UV-Vis.
  7. Концентрируют незащищенный олигонуклеотид РНК путем лиофилизации или вакуумной центрифуги, если менее 15 нт, или путем осаждения этанола, если более 15 нт.
  8. Готовят препаративную шкалу 10%-20% полиакриламида/8 М мочевины/1x TBE геля с использованием 19:бис акриламида 19:бис в соответствии с соответствующими протоколами для размера олигонуклеотида, гелевой пластины и подставки. Соберите гелевую пластину в подставке для геля с 1x TBE в резервуарах и предварительно запустите при 35 Вт (или в зависимости от формата гелевой пластины) в течение не менее 30 минут.
  9. Растворить твердый олигонуклеотид в буфере загрузки геля мочевины (8 М мочевины, 10% сахарозы, 50 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА с бромфенолом и ксилолцианоловыми ходовыми красителями) и нагреть до 80 °C. Нагрузите полиакриламидный гель и проведите в течение 1-2 ч при 25-35 Вт (или в зависимости от формата гелевой пластины и размера олигонуклеотида).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бромфенол синий или ксилол цианол должны быть исключены из буфера нагрузки на гель для олигонуклеотидов менее 15 нт, если любой из них мигрирует вместе с продуктом, поскольку трудно удалить эти красители из элюированного олигонуклеотида без осаждения этанола.
  10. Когда гель-электрофорез будет завершен, снимите гелевую пластину с гелевой подставки, разберите гелевую пластину и оберните гель в поливинилхлоридную пленку. Определите полосы продукта путем обратного затенения ультрафиолетовым светом 254 нм и вырежьте основную полосу продукта с помощью лезвия бритвы.
  11. Экстрагируйте олигонуклеотид из иссеченного геля методом дробления и замачивания42.
    1. Измельчите иссеченный гель, выдавливая его через пластиковый шприц или механически.
    2. Для олигонуклеотидов длиной более 15 нт:
      1. Элюют в 3-кратных объемах буфера дробления и замачивания (300 мМ NaCl; 10 мМ Трис, рН 8; 1 мМ ЭДТА) в течение не менее 12 ч с перемешиванием или встряхиванием.
      2. Удалите твердые кусочки геля, проведя раствор через шприц, оснащенный фильтром 0,2 мкм, и сконцентрируйте олигонуклеотид путем осаждения этанола.
    3. Для олигонуклеотида короче 15 нт:
      1. Элюют в 3х объемах безнуклеазной воды в течение не менее 12 ч с перемешиванием или встряхиванием.
      2. Удалите твердые кусочки геля, пропустив раствор через шприц, оснащенный фильтром 0,2 мкм, и сконцентрируйте путем лиофилизации.
      3. Удалите остаточные соли и растворенные вещества с помощью колонки для исключения одноразовых размеров, как показано на этапе 5.6. Концентрат путем лиофилизации.
  12. Хранить очищенные трифосфорилированные олигонуклеотиды при -20 °C в буфере TE (10 мМ Tris, рН 8; 1 мМ ЭДТА) или в аналогичном буфере хранения олигонуклеотидов.
    1. Определяют концентрацию олигонуклеотида путем измерения абсорбции при 260 нм с помощью спектрофотометра UV-Vis.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетный коэффициент вымирания олигонуклеотида не должен зависеть от его 5'-фосфорилирования и может быть рассчитан на основе его последовательности с использованием калькулятора коэффициента вымирания олигонуклеотидов.
    2. Проверка трифосфорилирования с помощью масс-спектрометрии. Ищите ожидаемую массу +239,94 Da относительно массы 5'-гидроксильного олигонуклеотида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Либо матричная лазерная десорбция/ионизация, либо масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией (MALDI-MS или ESI-MS, соответственно) подходят для идентификации состояния трифосфорилирования олигонуклеотида при использовании протоколов, оптимизированных для нуклеиновых кислот. ESI-MS обеспечивает более последовательные результаты, однако, из-за более низких скоростей фрагментации ионов; представительская коммерческая услуга предоставляется в Таблице материалов.

6. Трифосфорилированные олигонуклеотиды как субстраты для саморепликации рибозима

ВНИМАНИЕ: 32P является радиоактивным изотопом, и следующие шаги должны выполняться с использованием стандартных протоколов безопасности для работы с радиоактивными материалами в лаборатории и исследователем, сертифицированным для использования радиоактивных материалов соответствующими отделами гигиены и безопасности окружающей среды. В качестве альтернативы самовоспроизводящаяся рибозимная подложка А может быть получена синтетически с 5'-флуоресцеиновой меткой14 и изображена флуоресцентно, как на этапе 7.9.

  1. Готовят раствор А в виде смеси саморепликатора рибозима Е и 5'-32Р-меченого РНК-субстратаА14 до концентраций 0,30 мкМ и 30 мкМ соответственно. Готовят растворы В-транскрибированного и В-синтетического с 15 мкМ трифосфорилированной РНК-субстрата В, приготовленные путем транскрипции in vitro 14 или химического трифосфорилирования, как указано выше, соответственно, в буфере EPPS 75 мМ, рН 8,5 и 37,5 МгCl2. Доведите оба раствора до 42 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты РНК перечислены в Таблице материалов.
  2. Чтобы инициировать саморепликацию, быстро смешайте 5 мкл раствора А с 10 мкл раствора В-транскрибированного или В-синтетического до конечной концентрации 0,1 мкМ Е, 10 мкМ А, 10 мкМ В, 25 мМMgCl2 и 50 мМ буфера EPPS, рН 8,5. Инкубировать реакционную смесь при 42 °C.
  3. Через равные промежутки времени берут 0,5 мкл аликвоты и гасят в 9,5 мкл формамидного гелевого нагрузочного буфера (95% формамида; 10 мМ ЭДТА, рН 8).
  4. Приготовьте аналитический полиакриламид/8 М мочевины/1x TBE гель в соответствии с соответствующими протоколами для гелевой пластины и подставки. Соберите литый гель и пластину в подставку для геля, заполните резервуары 1x TBE и предварительно запустите на 40 Вт (или в зависимости от обстоятельств для разных гелевых пластин и подставок) в течение 30 минут.
  5. Нагрейте закаленные реакционные образцы до 80 °C, загрузите 5 мкл образца в каждую скважину и запустите гель при 40 Вт в течение приблизительно 40 минут (или в зависимости от обстоятельств для различных гелевых пластин и стендов).
  6. Снимите гелевую пластину с гелевой подставки, разберите и заверните гель в поливинилхлоридную пленку. Накройте гель люминофорным экраном и выставьте на 1 ч (или по мере необходимости на 32P cpm); сканировать экран с помощью флуоресцентного/фосфоресцентного гелевого сканера.
  7. Количественно оцените выход реакции с помощью программного обеспечения для количественного определения изображения геля.
    1. Откройте изображение геля с помощью панели инструментов анализа, выберите Анализ | Определение фигуры, выберите Области | форму прямоугольника и нарисуйте прямоугольники одинакового размера вокруг полос, соответствующих непрореагировавшим A и продукту E для каждого времени и обеих реакций.
    2. Выберите | анализа Вычитание фона, выберите «Области» | фигуре прямоугольника и нарисуйте прямоугольник того же размера в пустой части изображения геля. Измените метод вычитания фона для всех прямоугольников на Image Rectangle.
    3. Выберите «Окно» | «Окно области 2», затем «Редактировать | Экспорт в Excel для экспорта количественных томов пикселов полосы в файл электронной таблицы.
  8. Постройте график концентрации продукта E по отношению ко времени и приведите данные в соответствие с ростом логистики Eq (1) с помощью программного обеспечения для статистической подгонки данных:
    [Э] = Equation 1 (1)
    Где a — максимальная степень реакции, b — степень сигмоидности, а c — экспоненциальная скорость роста.
    1. В экспортируемой электронной таблице разделите объем продукта E на сумму объемов субстрата A и продукта E, чтобы определить дробный выход продукта для каждого раза и обеих реакций. Умножьте на начальную концентрацию субстрата А (10 мкМ), чтобы определить выход продукта Е в зависимости от времени.
    2. В программном обеспечении для подгонки статистических данных выберите Файл | Новые | Новый файл проекта, выберите XY в разделе Новая таблица и график и нажмите кнопку Создать. Введите время реакции и выход продукта E для обеих реакций в соседних столбцах и соответственно обозначьте столбцы (например, «время», «транскрибированный B», «синтетический B»).
    3. Выберите Вставить | Новый анализ, выберите анализ XY | Нелинейная регрессия (подгонка кривой), затем нажмите кнопку «ОК». Выберите кривые роста | Логистический рост и нажмите OK; не корректируйте никаких других параметров. Соблюдайте параметры соответствия и доверительные интервалы в разделе Результаты , а также график точек данных и встроенных кривых в разделе Графики.

7. Кросс-хиральное копирование L-РНК

  1. Приготовьте 10 мкл раствора РНК, содержащего 20 мкМ D-РНК 27,3 т кросс-хиральной полимеразы, 2 мкМ 5'-флуоресцеин-меченого L-РНК праймера, 4 мкМ биотинилированного L-РНК-молотого шаблона и по 20 мкм каждого из L-РНК pppCUG, pppAUG, pppAGG и pppCGC, в 10 мкл 50 мМ Tris, рН 8,3. Отжиг РНК путем нагревания ее до 90 °C в течение 1 мин и охлаждения до 23 °C при 0,2 °C/с в термоциклере PCR. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о полимеразе, грунтовке и шаблоне.
  2. Инкубируют раствор РНК при 17 °C и начинают реакцию, добавляя 10 мкл 2-кратного стартового буфера (400 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl и 50 мМ Tris, рН 8,3). Убедитесь, что конечные концентрации всех компонентов реакции составляют 10 мкМ полимеразы, 1 мкМ праймера, 2 мкМ шаблона, 10 мкМ каждого тринуклеотида 5'-трифосфата, 200 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl и 50 мМ Tris, рН 8,3.
  3. По мере протекания реакции берут 10 мкл аликвот и гасят 5 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8.
  4. К каждому закаленному реакционному образцу добавляют 0,1 мг магнитных шариков с покрытием стрептавидином (связывающая способность биотин-олигонуклеотида 20 пмоль), суспендированных в 10 мкл 1 М NaCl в буфере TE с 0,05% нейтральным моющим средством для захвата расширенных тримером праймеров через биотинилированный шаблон и инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре с встряхиванием.
  5. Захватите шарики на магните для захвата бусин, удалите и выбросьте жидкость и добавьте 50 мкл моющего раствора (250 мМ NaCl в TE с 0,05% нейтральным моющим средством). Смешайте бусины, снова захватите их и удалите раствор для мытья. Повторите еще раз.
  6. Для элюирования расширенных грунтовок из бисера добавляют 50 мкл элюционного раствора (25 мМ NaOH с 0,05% нейтральным моющим средством) и смешивают бусины. Снова отловите шарики, удалите раствор элюирования, затушите 100 мМ Трис (рН 7,5) и осадите этанолом.
  7. Приготовьте аналитический полиакриламид/8 М мочевины/1x TBE гель в соответствии с соответствующими протоколами для гелевой пластины и подставки. Соберите литый гель и пластину в подставку для геля, заполните резервуары 1x TBE и предварительно запустите на 40 Вт (или в зависимости от обстоятельств для разных гелевых пластин и подставок) в течение 30 минут.
  8. Растворите осажденную РНК в 10 мкл нагрузочного буфера формамидного геля и приготовьте непрореагировавшую концевую маркировку праймера при 0,5 мкМ в буфере нагрузки формамидного геля. Нагревайте образцы до 80 °C, загружайте 5 мкл образца в каждую скважину и запускайте гель при 40 Вт в течение приблизительно 40 минут (или в зависимости от обстоятельств для различных гелевых пластин и подставок).
  9. Снимите гелевую пластину с подставки и просканируйте с помощью флуоресцентного /фосфоресцентного гелевого сканера для визуализации кросс-хиральных продуктов для расширения L-РНК.

Representative Results

Олигонуклеотиды следует синтезировать с использованием стандартных протоколов, соответствующих фосфорамидитам и автоматизированному синтезатору ДНК/РНК, оставляя продукт олигонуклеотид неочищенным от твердой опоры в исходной пластиковой колонке синтеза, с удалением 5-концевой диметокситритильной группы с получением свободного 5ʹ-гидроксила (раздел 1). Все олигонуклеотиды, использованные в этой демонстрации, были получены с использованием смолы 1000 Å-контролируемого порового стекла (CPG) в качестве твердой опоры и проводились по шкале 0,2 или 1 мкмоль. Репрезентативные примеры колонок синтезатора, смол, реагентов и фосфорамидитов приведены в Таблице материалов. Для более масштабных реакций объемы и время, используемые на последующих этапах, возможно, потребуется скорректировать.

Реакцию трифосфорилирования проводят на колонне в специально изготовленной реакционной камере (фиг.2, раздел 3) с использованием стандартных, коммерчески доступных компонентов, перечисленных в Таблице материалов , и следуют схеме, проиллюстрированной на Фиг.1 (раздел 4)28. Важно, чтобы условия были строго безводными во время трифосфорилирования и чтобы все растворители и реагенты были заранее приготовлены на молекулярных ситах и полностью высохли перед использованием (раздел 2). Трифосфорилирование обычно занимает 2 ч, после чего промытая и высушенная колонна может быть обработана в соответствии со стандартными процедурами депротекции и очистки олигонуклеотидов (раздел 5).

После депротекции олигонуклеотидные трифосфаты очищают денатурирующим электрофорезом полиакриламидного геля (PAGE), показывая одну основную полосу продукта путем ультрафиолетового обратного затенения, которое может быть иссечено и элюировано из геля. 5'-трифосфатный продукт легко отделяется от побочных продуктов реакции для коротких олигонуклеотидов, как показано для ДНК-тринуклеотида 5ʹ-трифосфатов, pppAAA и pppCCC, и L-РНК тринуклеотида 5ʹ-трифосфата pppGAA на рисунке 3A, B. Как 5'-гидроксильные, так и 5'-трифосфатные продукты для тримеров ДНК AAA и CCC были вырезаны и идентифицированы масс-спектрометрией и соответственно помечены на рисунке 3A. Дополнительные полосы, видимые для тримера ДНК ААА, как правило, не содержат достаточного количества материала для восстановления и идентификации. Присутствие этих полос, однако, коррелирует с дополнительными массами продукта в неочищенных продуктах реакции (рисунок 3C), обычно представляющих 5'-дифосфатные, монофосфатные и Н-фосфонатные побочные продукты, как обсуждается ниже.

После очистки PAGE более крупные олигонуклеотиды могут быть элюированы с использованием метода дробления и замачивания42 и последующего осаждения этанола. Однако олигонуклеотиды менее 15 nt не могут эффективно осаждаться этанолом и, таким образом, требуют модифицированной процедуры элюирования геля (этап 5.11.3). Столбец исключения одноразовых размеров, указанный в Таблице материалов, рассчитан только на использование с олигонуклеотидами длиной более 10 нт. Тем не менее, мы обнаружили, что олигонуклеотиды, такие короткие, как тримеры, могут быть эффективно обессолены с использованием рекомендованного производителем протокола. Тем не менее, при обессоливании коротких олигонуклеотидов (как на этапах 5.6 и 5.11.3) рекомендуется, чтобы элюат колонки собирался во фракциях, а фракции продукта были идентифицированы по абсорбции при 260 нм с использованием спектрофотометра UV-Vis. Столбец исключения размера, оптимизированный для более коротких олигонуклеотидов, приведен в Таблице материалов в качестве альтернативного выбора. Конечный выход из 1 мкмольной шкалы синтеза олигонуклеотидов после очистки составляет 50-300 нмоль.

Трифосфорилирование может быть подтверждено масс-спектрометрией, где трифосфорилированный продукт имеет массу +239,94 Да больше, чем 5'-гидроксильный олигонуклеотид, хотя часто наблюдается наличие материалов, соответствующих 5'-ди- и монофосфату (+159,96 и +79,98 Да соответственно). Также может наблюдаться побочный продукт 5'-Н-фосфонат с массой +63,98 Да от массы 5'-ОН, и высокие уровни этого продукта указывают на то, что условия во время трифосфорилирования были недостаточно безводными. Перед очисткой незащищенные олигонуклеотиды обычно показывают все эти продукты (рисунок 3C), в то время как очищенный материал покажет пик, соответствующий 5'-трифосфатному продукту вместе с 5'-ди- и монофосфатами (рисунок 3D, E).

Масс-спектрометрия сама по себе, как правило, не дает строгой меры чистоты 5'-трифосфата из-за дифференциальных скоростей ионизации и фрагментации трифосфата во время ионизации. Для измерения чистоты конечного продукта рекомендуется обратная фазовая жидкостная хроматография и тандем ESI-MS (RP-LC / ESI-MS), особенно для более длинных олигонуклеотидов. Анализ D-РНК 5ʹ-трифосфатов pppACGAGG и pppGACCGCAACUUA с помощью RP-LC/ESI-MS (Рисунок 4A,B, соответственно) показывает типичную чистоту конечного продукта, содержащего 20% 5ʹ-дифосфата, поскольку эти два вида трудно разделить при наличии на более длинных олигонуклеотидах.

Синтетические 5'-трифосфатные олигонуклеотиды обычно функционируют так же хорошо или лучше, чем материалы, полученные ферментативно в биохимических исследованиях. В разделе 6, в качестве примера, 5'-трифосфатные 14 nt субстраты РНК, полученные либо синтетически, либо путем транскрипции in vitro, сравнивали в катализируемой РНК реакции саморепликации 14,15,43,44,45. Рибозим E катализирует соединение субстратов A и B с получением новой копии E в автокаталитической реакции, способной к экспоненциальному росту (рисунок 5A). E и 32P-меченые A компоненты получали путем транскрипции in vitro, а трифосфорилированный субстрат B получали либо синтетически, как описано выше, либо транскрипцией in vitro 14. Прогресс реакции саморепликации контролировался путем взятия периодических образцов, которые анализировались путем денатурации PAGE и количественно оценивались с помощью флуоресцентного / фосфоресцентного гелевого сканера. Полученные данные, соответствующие функции логистического роста, показали, что либо транскрибированная, либо синтетическая субстрата B поддерживает экспоненциальный рост, но синтетический B дает несколько большее количество продукта (рисунок 5B). Этот результат может отражать композиционную неоднородность на 5'-конце РНК, полученной транскрипцией in vitro 23,24.

Химическое трифосфорилирование также позволяет синтезировать олигонуклеотидные трифосфаты, которые не могут быть получены биологически, ни in vitro , ни в клетках. В разделе 7 небиологические олигонуклеотидные трифосфаты, состоящие из L-РНК, энантиомера природной D-РНК, приготовленные как в разделах 1-5, использовали в качестве субстратов для D-РНК «кросс-хирального» полимеразы рибозима 27,3t (Рисунок 6A), который катализирует шаблонно-направленную полимеризацию более длинного продукта L-РНК из коротких L-РНК олигонуклеотид 5'-трифосфатов последовательностью. Например, рибозим может синтезировать L-РНК-версию мотива саморасщепления головки молота (рисунок 6B)18. Очищенные тринуклеотидные трифосфаты L-РНК комбинировали с флуоресцеин-меченым L-РНК праймером и шаблоном L-РНК (рисунок 6C) и реагировали с кросс-хиральной лигазой. Образцы в ходе реакции были проанализированы PAGE и сфотографированы с использованием флуоресцентного/фосфоресцентного гелевого сканера для демонстрации синтеза L-РНК-версии рибозима-молота, закодированного шаблоном (рисунок 6D).

Figure 3
Рисунок 3: Очистка тринуклеотидов 5ʹ-трифосфатов. (A) PAGE-анализ (визуализированный УФ-обратной тенью) трифосфорилирования ДНК-тринуклеотидов три-дезоксиаденозина (AAA, синий) и три-дезоксицитидина (CCC, красный), намеренно перегруженных для визуализации второстепенных побочных продуктов. Как исходный материал 5ʹ-трифосфата (ppp), так и исходный материал 5ʹ-гидроксила (OH) были иссечены MALDI-MS. (B) Препаративный PAGE трифосфорилирования L-РНК тринуклеотида GAA, при этом основной полоса продукта иссекается и идентифицируется как 5ʹ-трифосфат (ppp) ESI-MS. (C) MALDI-MS сырых продуктов реакции после депротекции и (D) очищенных продуктов из (A). 5ʹ-трифосфат (ppp; pppAAA ожидается 1 119 Da, наблюдается 1 118 Da; pppCCC ожидается 1 047 Da, наблюдается 1 046); Маркировка 5ʹ-дифосфат (pp), 5ʹ-монофосфат (p), 5ʹ-гидроксил (OH) и 5ʹ-H-фосфонат (Hp). (E) Деконволютированный массовый спектр от прямого впрыска ESI-MS выделенного 5ʹ-трифосфатного продукта из (B) с идентифицированными пиками маркировки (ожидается 1 181,6 Да, наблюдается 1 181,0 Да). Также наблюдаются продукты 5ʹ-дифосфата (pp), а также пики ионов натрия как для три-, так и для дифосфатных продуктов (+22 Da). Распространенные пики загрязняющих веществ помечены звездочкой. Для удобства сравнения масс-спектры были нормализованы до самой высокой интенсивности, измеренной в каждом спектре, и представлены в процентах относительно этого значения. Сокращения: PAGE = электрофорез полиакриламидного геля; MALDI-MS = матричная лазерная десорбция/ионизация; ESI-MS = масс-спектрометрия электрораспылительной ионизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Аналитический RP-LC из 6 nt и 14 nt D-РНК олигонуклеотид трифосфатов. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ и (B) 5ʹ-pppGACCGCAACUUA-3ʹ. Тандем ESI-MS определил основной пик обоих (~ 70%) как 5ʹ-трифосфат (ppp), с меньшим количеством 5ʹ-дифосфата (pp). Сокращения: RP-LC = обратная фазовая жидкостная хроматография; nt = нуклеотиды; ESI-MS = масс-спектрометрия электрораспылительной ионизации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Сравнение олигонуклеотидных 5ʹ-трифосфатных субстратов, полученных путем химического синтеза или транскрипции in vitro. (A) Самовоспроизводящийся рибозим E торгует РНК А и 5'-трифосфорилированную РНК B. (B) Сравнение реакций саморепликации с использованием 10 мкМ А и 10 мкМ В, либо синтетических (открытые круги), либо транскрибированных in vitro (заполненные круги). (B) Данные соответствовали уравнению логистического роста: [E] = a / (1 + b e-ct), где a - конечная доходность, b - степень сигмоидности, а c - экспоненциальный темп роста. Темпы роста для двух реакций были идентичными, при 1,14 ч-1, в то время как конечная степень была на 10% выше для реакций с синтетическим B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Кросс-хиральная L-РНК-полимеризация с рибозимом. (A) D-РНК 27.3t полимеразного рибозима, который катализирует шаблон-зависимое лигирование L-РНК. (B) Продукт L-РНК, синтезируемый 27,3 т, является частью мотива эндонуклеазы молота. (C) Полимеризация L-РНК катализируется 27,3 т с использованием биотинилированного шаблона L-РНК (коричневого цвета), концевой маркировки L-РНК праймера (пурпурный) и четырех L-РНК тринуклеотидтрифосфатов (голубой), полученных синтетически. (D) СТРАНИЧНЫЙ анализ продуктов расширения (B) через 4 ч и 24 ч, показывающий каждое включение тринуклеотида до полноразмерного продукта (черная точка). Нереагированный букварь L-РНК включен в качестве эталонного маркера. Сокращения: PAGE = электрофорез полиакриламидного геля; M = ссылочный маркер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Описанная здесь процедура трифосфорилирования в целом совместима с синтезом олигонуклеотидов с использованием стандартной химии фосфорамидитов. Нуклеозидфосфорамидиты должны иметь базово-лабильные защитные группы, совместимые с быстрой депротекцией в АМА39, включая стандартные β-цианоэтил на фосфите и изобутириловые, диметилформамидиловые, ацетиловые, феноксиацетильные или 4-изопропилфеноксиацетильные группы на экзоциклических аминах нуклеотидов. Рибозные 2'-гидроксильные группы должны быть защищены силил-защитными группами, либо t-бутилдиметилсилил (TBDMS), либо три-изо-пропилсилоксиметил (TOM)40,41. Также сообщалось, что группа пивалоилоксиметила (PivOM) также совместима с химическим трифосфорилированием30.

Описаны многочисленные способы химического трифосфорилирования синтетических олигонуклеотидов 28,29,30,31,32,33,34,35. Мы обнаружили, что трифосфорилирование с использованием реагента Людвига-Экштейна37 является одним из самых доступных, не требующих специализированного синтеза реагентов и специализированного оборудования. Олигонуклеотидные 5'-трифосфаты, полученные этим методом, обычно использовались в качестве субстратов для рибозимов РНК-лигазы, включая использование ферментативно недоступных L-РНК олигонуклеотидных трифосфатов для достижения шаблон-зависимого синтеза и репликации этой «зеркальной» нуклеиновой кислоты 14,16,17,18 . Метод также подходит для получения малых 5'-трифосфорилированных стволовых петлевых РНК, которые являются мощными активаторами врожденного иммунного ответа у позвоночных 6,7.

Реагент Людвига-Экштейна, салицилфосфорохлоридит37, обладает высокой реакционной способностью к воде и эффективно удаляет любую воду, введенную при растворении реагента перед загрузкой на олигонуклеотидную колонну. После этого момента, однако, 5'-фосфитилированный олигонуклеотид будет предпочтительно реагировать с любой водой, введенной в систему через пирофосфат, образуя побочный продукт 5'-H-фосфоната после обработки 28,37,38. Тщательное приготовление трифосфорилирующих реагентов и реакционной камеры трифосфорилирования гарантирует, что этот побочный продукт не образуется. Для сушки растворителем молекулярные сита типа 4 Å продаются предварительно упакованными в тефлоновые мешки, совместимые с большинством органических растворителей под различными торговыми марками большинства компаний по производству реагентов для синтеза олигонуклеотидов. Дополнительные меры предосторожности, такие как выполнение трифосфорилирования в бардачке в безводной атмосфере, как правило, не требуются.

Реакция 5'-фосфитилированного олигонуклеотида с TBAP образует циклический промежуточный продукт 5'-триметафосфита, который затем окисляется до циклического 5'-триметафосфата с использованием раствора окислителя синтеза олигонуклеотидов (йод в воде/пиридин/ТГФ). Следует отметить, что в коммерческих растворах окислителей используются различные количества йода, и для обеспечения полного окисления до трифосфата необходимо использовать высокую концентрацию йода 0,1 М. Циклический продукт гидролизуют до конечного линейного 5'-трифосфата в том же растворе37, и альтернативные, безводные растворы окислителя должны использоваться, если желательна линеаризация нуклеофилами, отличными от воды (см. Ниже для применения)33. Однако любой остаточный циклический триметафосфат будет линеаризирован во время последующей щелочной депротекции олигонуклеотида. Гидролиз циклического 5'-триметафосфата дает только линейный, а не разветвленный трифосфат37,46.

Олигонуклеотидная депротекция обычно не нуждается в модификации для размещения 5'-трифосфорилирования, но следует принять несколько мер предосторожности. Трифосфат относительно стабилен к кратковременному воздействию щелочных условий, но следует соблюдать осторожность, чтобы не подвергать трифосфат ВОЗДЕЙСТВИЮ АМА дольше, чем это необходимо. Следует избегать защиты групп, которые требуют более длительной обработки аммиаком или АМА в течение более 10 мин при 65 °C. Более щадящие обработки, такие как 2 ч в аммиаке при комнатной температуре, приемлемы при совместимости с другими группами защиты фосфорамидитов. Распространенный, быстрый метод депротекции для силил-защищенных синтетических олигонуклеотидов РНК использует триэтиламин тригидрофторид и высокую температуру47; однако этого следует избегать при получении РНК-5'-трифосфатов, поскольку длительные кислые условия ускоряют гидролиз трифосфата 31,32.

Препаративный PAGE зарекомендовал себя как самый простой и надежный метод постдепротекторной очистки 5'-трифосфорилированных олигонуклеотидов (Фиг.3 и Фиг.4). Однако препаративная обратная фаза ВЭЖХ также может быть использована для очистки трифосфорилированных продуктов. Присутствие 5'-дифосфатных и, в меньшей степени, 5'-монофосфатных продуктов обычно наблюдается при проверке трифосфорилирования масс-спектрометрией. Мы наблюдали фрагментацию 5'-трифосфатов во время масс-спектрометрии из высокочистого материала, полученного путем химического синтеза или транскрипции, особенно если прибор не оптимизирован для анализа олигонуклеотидов. Тем не менее, анализ RP-LC часто показывает, что 10%-20% 5'-дифосфатного побочного продукта присутствует в более длинных 5'-трифосфорилированных олигонуклеотидах (рисунок 4). Коммерческие препараты пирофосфата трибутиламмония могут быть загрязнены до 20% монофосфата, который даст 5'-дифосфат в качестве побочного продукта при трифосфорилировании30,31. Тщательная подготовка этого реагента собственными силами может дать гораздо более чистые запасы TBAP31. Тем не менее, мы обнаружили, что трифосфорилированные олигонуклеотиды с использованием коммерческих источников TBAP по-прежнему демонстрируют сопоставимую или большую реакционную способность при использовании в качестве субстратов в ферментативных реакциях (рисунок 5B) по сравнению с материалом, полученным путем транскрипции in vitro.

Одним из примечательных дальнейших применений олигонуклеотидного трифосфорилирования с реагентом Людвига-Экштейна используется циклический триметафосфитный промежуточный продукт33. Если последующую стадию окисления проводят 1 М т-бутилпероксидом в гексанах, который часто используется для олигонуклеотидного окисления в безводных условиях, окисление фосфита происходит без гидролиза открытия кольца, в результате чего образуется циклический триметафосфат. Затем этот промежуточный продукт может быть отреагирован с первичными аминовыми или спиртовыми нуклеофилами с получением 5'-трифосфатов с модификациями в γ-фосфата. Эти модификации включают добавление липофильной метки, связанной фосфорамидатной связью, которая облегчает быструю трифосфат-специфическую очистку RP-LC с последующим кислотным гидролизом метки из трифосфата33. Флуоресцентные модификации в положении γ-фосфата также могут быть введены для использования в качестве флуоресцентных репортеров в реальном времени для реакций лигирования, катализируемых рибозимом15,33.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарны Грегу Спрингстину, Наташе Пол, Чарльзу Олеа-младшему, Джонатану Щепански и Катрине Тьхунг за полезные дискуссии о лучших практиках химических реакций трифосфорилирования и Джеральду Джойсу за полезные комментарии. Эта работа была поддержана грантом MCB 2114588 от Национального научного фонда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm polyethersulfone syringe filter MilliporeSigma SLMP025SS Syringe filter for removing crushed polyacrylamide gel particles (Section 5)
0.22 µm PTFE syringe filter MilliporeSigma SLLG013SL Syringe filter for removing CPG resin (Section 5)
1 mL plastic syringes ThermoFisher Scientific 14-823-434 (BD 309659) Components of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
1,4-Dioxane, anhydrous MilliporeSigma 296309 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl) MilliporeSigma 324124 Triphosphorylation reagent (sections 2–4)
30 mL glass bottles MilliporeSigma 23232 Bottles for preparing triphosphorylation solvents and TBAP solution (section 2)
3-way Stopcock, polycarbonate/polypropylene Bio-Rad Laboratories 7328103 Component of triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
40% acrylamide/bis-acrylamide solution, 19:1 Bio-Rad Laboratories 1610144 For PAGE (sections 5–7)
Acetonitrile, anhydrous, 100 mL Glen Research 40-4050-50 Triphosphorylation solvent (sections 2–4)
Ammonia-neutralizing Trap ThermoFisher Scientific ANT100 and ANS121 For use with Speedvac DNA130 (section 5)
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad Laboratories 1610700 For PAGE, catalyst for acrylamide polymerization (sections 5–7)
Aqueous ammonia, 28% MilliporeSigma 338818 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Aqueous methylamine, 40% TCI America TCI-M0137 For preparing AMA deprotection reagent (section 5)
Automated DNA/RNA oligonucleotide synthesizer PerSeptive Biosystems Expedite 8909 DNA/RNA Synthesizer any column-based synthesizer is acceptable (section 1)
Bead-capture magnet ThermoFisher Scientific 12320D For streptavidin bead capture (section 7)
Bromophenol blue Bio-Rad Laboratories 1610404 For PAGE urea loading buffer (section 5)
Deep vacuum oil pump ThermoFisher Scientific VLP200-115 For use with lyophilizer (section 5)
Drierite dessicant, 10-20 mesh MilliporeSigma 737828 Desiccant for storing triphosphorylation chemicals and equipment (sections 1–2)
D-RNA 27.3t cross-chiral polymerase prepared in house18 5′-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
D-RNA CPG solid supports, 1,000Å, prepackaged 1 µmole synthesis columns Glen Research 20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
D-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes ANP-3201, 3202, 3203, 3205 representative, for D-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Empty Expedite Synthesis Columns, 1µm Glen Research 20-0021-01 Synthesis columns for use with Expedite DNA/RNA synthesizer (section 1)
EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(3-propanesulfonic acid), solid MilliporeSigma E1894 Ribozyme reaction buffer component (section 6)
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), solid MilliporeSigma EDS Divalent metal ion chelator for use in various buffers (sections 5–7)
Filters for Expedite synthesis columns Glen Research 20-0021-0F Expedite-style synthesis column filters, for use with empty synthesis columns (section 1)
Fluorescent/phosphorescent gel scanner Cytiva Amersham Typhoon RGB, 29187193 For visualizing analytical PAGE (sections 6–7)
Formamide, deionized VWR Life Science 97062 For PAGE formamide gel loading buffer (sections 6–7)
Gel image quantitation software Cytiva ImageQuant TL For quantifying scanned gel images (section 6)
Glass desiccator MilliporeSigma CLS3121150 Triphosphorylation solvent storage (section 2)
L-RNA CPG solid supports, 1,000Å, bulk ChemGenes N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
L-RNA hammerhead template prepared in house18 5′-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA primer prepared in house18 5′-fluorescein-GGCUCGA-3′ For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
L-RNA TOM-protected phosphoramidites ChemGenes OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205 L-RNA oligonucleotide synthesis (section 1)
Lyophilizer/Freeze Dryer VirTis Benchtop K For concentrating oligonucleotides (section 5)
Magnesium Chloride Hexahydrate, solid MilliporeSigma M2670 For ribozyme reactions (sections 6–7)
N,N-Dimethylformamide, anhydrous MilliporeSigma 227056 Triphosphorylation solvent (section 2)
NAP-25 Desalting column (Sephadex G-25 resin) ThermoFisher Scientific 45000150 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-25 resin (section 5)
Non-coring stainless steel needle, 20 G ThermoFisher Scientific 14-815-410 Needles for piercing rubber septa (sections 2–4)
Oligonucleotide extinction coefficient calculator Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool Nearest-Neighbor Model Short Oligonucleotide 260nm extinction coefficient calculator (section 5)
Oxidizer solution, 0.1 M Iodine in THF/pyridine/water ChemGenes RN-1456 Triphosphorylation reagent (section 4)
PAGE plates Timberrock/CBS NGP-250-BO and NO For PAGE (sections 5–7)
PAGE power supply Bio-Rad Laboratories PowerPac HV 1645056 For PAGE (sections 5–7)
PAGE spacers and combs (analytical) Timberrock/CBS VGS-0725 and VGC-0714 For PAGE (sections 6–7)
PAGE spacers and combs (preparative) Timberrock/CBS VGS-3025R and VGC-3001 For PAGE (section 5)
PAGE stand Timberrock/CBS ASG-250 For PAGE (sections 5–7)
Parafilm M ThermoFisher Scientific 13-374-12 (Bemis PM999) Wax sealing film for triphosphorylation apparatus (sections 2–4)
PCR thermocycler Bio-Rad Laboratories C1000 Touch Thermalcycler For cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
PD 10 Desalting column (Sephadex G-10 resin) MilliporeSigma GE17-0010-01 Disposable gravity-flow size exclusion chromatography columns containing Sephadex G-10 resin, for oligonucleotides < 15 nt (section 5)
Phosphor screens Cytiva 28956480 For visualizing 32P-labeled RNA (section 6)
Phosphoramidite synthesis reagents Glen Research 30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62 representative, for standard RNA/DNA synthesis (section 1)
Polypropylene screw-cap sealable tube MilliporeSigma BR780752 1.5 mL microcentrifuge tubes with screw-cap and silicone O-ring, for safe AMA deprotection (section 5)
Pyridine, anhydrous MilliporeSigma 270970 Triphosphorylation solvent (section 2)
Reverse-phase liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (RP-LC/ESI-MS) Novatia n/a Commercial service for LC/MS specializing in oligonucleotides (section 5)
Rubber Septa (ID x OD 7.9 mm x 14 mm), white MilliporeSigma Z564702 Septa for preparing triphosphorylation solvents and TBAP (section 2)
Self-replicator ribozyme E prepared in house14 5′-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate A prepared in house14 5′-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3′-OH For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Self-replicator substrate B, transcribed prepared in house14 5′-pppGAGACCGCAA CUUA-3′ For self-replicator ribozyme reactions (section 6)
Small Drying Traps, 4 Å molecular sieves ChemGenes DMT-1975 Drying traps for DNA/RNA synthesizer phosphoramidites and triphosphorylation reagents (sections 1–2)
Sodium Chloride (NaCl), solid MilliporeSigma S7653 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Sodium Hydroxide (NaOH), solid MilliporeSigma S8045 Salt for use in various buffers (sections 5–7)
Statistical data-fitting software GraphPad Prism For fitting data from analytical PAGE to kinetic models (section 6)
Streptavidin-coated magnetic beads ThermoFisher Scientific 65002 For capturing biotin-labeled RNA in cross-chiral ribozyme reactions (section 7)
Sucrose MilliporeSigma 84097 For PAGE urea loading buffer (section 5)
TBE running buffer, 10x ThermoFisher Scientific AAJ62788K3 For PAGE (sections 5–7)
Tetrabutylammonium Fluoride, 1.0 M solution in Tetrahydrofuran Aldrich 216143 For removing 2′-silyl protecting groups (section 5)
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad Laboratories 1610801 For polymerizing acrylamide for PAGE (sections 5–7)
Tributylamine MilliporeSigma 90781 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tributylammonium pyrophosphate (TBAP) MilliporeSigma P8533 Triphosphorylation reagent (section 2)
Tris base MilliporeSigma T6666 Buffering agent for use in various buffers (sections 5–7)
TWEEN20 polysorbate detergent MilliporeSigma P7949 Neutral detergent for use with magnetic beads (Section 7)
Urea MilliporeSigma U5378 For PAGE and gel loading buffer (sections 5–7)
UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific NanoDrop 2000, ND2000 For measuring oligonucleotide concentrations (section 5)
Vacuum centrifuge ThermoFisher Scientific Savant Speedvac DNA130-115 Vacuum Concentrator For removing AMA and THF (section 5)
Xylene cyanol Bio-Rad Laboratories 1610423 For PAGE urea loading buffer (section 5)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shuman, S. What messenger RNA capping tells us about eukaryotic evolution. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (8), 619-625 (2002).
  2. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  3. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  4. Myong, S., et al. Cytosolic viral sensor RIG-I is a 5'-triphosphate-dependent translocase on double-stranded RNA. Science. 323 (5917), 1070-1074 (2009).
  5. Takeuchi, O., Akira, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 140, 805-820 (2010).
  6. Wang, Y., et al. Structural and functional insights into 5'-ppp RNA pattern recognition by the innate immune receptor RIG-I. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 781-787 (2010).
  7. Goubau, D., et al. Antiviral immunity via RIG-I-mediated recognition of RNA bearing 5'-diphosphates. Nature. 514 (7522), 372-375 (2014).
  8. Joyce, G. F. Forty years of in vitro evolution. Angewandte Chemie. 46 (34), 6420-6436 (2007).
  9. Robertson, M. P., Ellington, A. D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. Nature Biotechnology. 17 (1), 62-66 (1999).
  10. Robertson, M. P., Hesselberth, J. R., Ellington, A. D. Optimization and optimality of a short ribozyme ligase that joins non-Watson-Crick base pairings. RNA. 7 (4), 513-523 (2001).
  11. Hesselberth, J. R., Robertson, M. P., Knudsen, S. M., Ellington, A. D. Simultaneous detection of diverse analytes with an aptazyme ligase array. Analytical Biochemistry. 312 (2), 106-112 (2003).
  12. Lam, B. J., Joyce, G. F. Autocatalytic aptazymes enable ligand-dependent exponential amplification of RNA. Nature Biotechnology. 27 (3), 288-292 (2009).
  13. Lam, B. J., Joyce, G. F. An isothermal system that couples ligand-dependent catalysis to ligand-independent exponential amplification. Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 3191-3197 (2011).
  14. Olea, C., Horning, D. P., Joyce, G. F. Ligand-dependent exponential amplification of a self-replicating L-RNA enzyme. Journal of the American Chemical Society. 134 (19), 8050-8053 (2012).
  15. Olea, C., Joyce, G. F. Real-Time Detection of a Self-Replicating RNA Enzyme. Molecules. 21 (10), (2016).
  16. Sczepanski, J. T., Joyce, G. F. A cross-chiral RNA polymerase ribozyme. Nature. 515 (7527), 440-442 (2014).
  17. Tjhung, K. F., Sczepanski, J. T., Murtfeldt, E. R., Joyce, G. F. RNA-catalyzed cross-chiral polymerization of RNA. Journal of the American Chemical Society. 142 (36), 15331-15339 (2020).
  18. Bare, G. A. L., Joyce, G. F. Cross-chiral, RNA-catalyzed exponential amplification of RNA. Journal of the American Chemical Society. 143 (45), 19160-19166 (2021).
  19. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15 (21), 8783-8798 (1987).
  20. Chelliserrykattil, J., Ellington, A. D. Evolution of a T7 RNA polymerase variant that transcribes 2'-O-methyl RNA. Nature Biotechnology. 22 (9), 1155-1160 (2004).
  21. Ibach, J., et al. Identification of a T7 RNA polymerase variant that permits the enzymatic synthesis of fully 2′-O-methyl-modified RNA. Journal of Biotechnology. 167 (3), 287-295 (2013).
  22. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  23. Pleiss, J. A., Derrick, M. L., Uhlenbeck, O. C. T7 RNA polymerase produces 5' end heterogeneity during in vitro transcription from certain templates. RNA. 4 (10), 1313-1317 (1998).
  24. Schenborn, E. T., Mierendorf, R. C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucleic Acids Research. 13 (17), 6223-6236 (1985).
  25. Martin, C. T., Muller, D. K., Coleman, J. E. Processivity in early stages of transcription by T7 RNA polymerase. Biochemistry. 27 (11), 3966-3974 (1988).
  26. Gholamalipour, Y., Karunanayake Mudiyanselage, A., Martin, C. T. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9253-9263 (2018).
  27. Vasilyev, N., Serganov, A. Preparation of short 5′-triphosphorylated oligoribonucleotides for crystallographic and biochemical studies. Nucleic Acid Crystallography: Methods and Protocols. , 11-20 (2016).
  28. Lebedev, A. V., Koukhareva, I. I., Beck, T., Vaghefi, M. M. Preparation of oligodeoxynucleotide 5'-triphosphates using solid support approach. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 20 (4-7), 1403-1409 (2001).
  29. Paul, N., Springsteen, G., Joyce, G. F. Conversion of a ribozyme to a deoxyribozyme through in vitro evolution. Chemistry & Biology. 13 (3), 329-338 (2006).
  30. Zlatev, I., et al. Efficient solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphates of DNA, RNA, and their analogues. Organic Letters. 12 (10), 2190-2193 (2010).
  31. Zlatev, I., Manoharan, M., Vasseur, J. -J., Morvan, F. Solid-phase chemical synthesis of 5'-triphosphate DNA, RNA, and chemically modified oligonucleotides. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 1, Unit1.28 (2012).
  32. Zlatev, I., et al. Automated parallel synthesis of 5'-triphosphate oligonucleotides and preparation of chemically modified 5'-triphosphate small interfering RNA. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (3), 722-732 (2013).
  33. Goldeck, M., Tuschl, T., Hartmann, G., Ludwig, J. Efficient solid-phase synthesis of pppRNA by using product-specific labeling. Angewandte Chemie. 53 (18), 4694-4698 (2014).
  34. Sarac, I., Meier, C. Efficient automated solid-phase synthesis of DNA and RNA 5′-triphosphates. Chemistry-A European Journal. 21 (46), 16421-16426 (2015).
  35. Sarac, I., Meier, C. Solid-phase synthesis of DNA and RNA 5'-O-triphosphates using cycloSal chemistry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 64 (1), 4-67 (2016).
  36. Perez, J. T., et al. Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11525-11530 (2010).
  37. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. The Journal of Organic Chemistry. 54 (3), 631-635 (1989).
  38. Gaur, R. K., Sproat, B. S., Krupp, G. Novel solid phase synthesis of 2'-o-methylribonucleoside 5'-triphosphates and their α-thio analogues. Tetrahedron Letters. 33 (23), 3301-3304 (1992).
  39. Reddy, M. P., Hanna, N. B., Farooqui, F. Fast cleavage and deprotection of oligonucleotides. Tetrahedron Letters. 35 (25), 4311-4314 (1994).
  40. Hogrefe, R. I., McCaffrey, A. P., Borozdina, L. U., McCampbell, E. S., Vaghefi, M. M. Effect of excess water on the desilylation of oligoribonucleotides using tetrabutylammonium fluoride. Nucleic Acids Research. 21 (20), 4739-4741 (1993).
  41. Pitsch, S., Weiss, P. A., Jenny, L., Stutz, A., Wu, X. Reliable chemical synthesis of oligoribonucleotides (RNA) with 2′-O-[(Triisopropylsilyl)oxy]methyl(2′-O-tom)-protected phosphoramidites. Helvetica Chimica Acta. 84 (12), 3773-3795 (2001).
  42. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), (2019).
  43. Paul, N., Joyce, G. F. A self-replicating ligase ribozyme. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 12733-12740 (2002).
  44. Lincoln, T. A., Joyce, G. F. Self-sustained replication of an RNA enzyme. Science. 323 (5918), 1229-1232 (2009).
  45. Robertson, M. P., Joyce, G. F. Highly efficient self-replicating RNA enzymes. Chemistry & Biology. 21 (2), 238-245 (2014).
  46. Singh, J., et al. Synthesis of modified nucleoside oligophosphates simplified: fast, pure, and protecting group free. Journal of the American Chemical Society. 141 (38), 15013-15017 (2019).
  47. Bellon, L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl) groups. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , Chapter 3., Unit 3.6 (2001).

Tags

Биоинженерия выпуск 184
Химическое трифосфорилирование олигонуклеотидов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bare, G. A. L., Horning, D. P.… More

Bare, G. A. L., Horning, D. P. Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides. J. Vis. Exp. (184), e63877, doi:10.3791/63877 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter