Multispektrale optoakustische Tomographie zur funktionellen Bildgebung in der Gefäßforschung

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufnahme multispektraler optoakustischer Bilder von in vivo menschlichen Hautgefäßen. Dazu gehört die Quantifizierung von Hämoglobin und Melanin, die als Chromophore von Interesse für die Funktionsanalyse angesehen werden.

Abstract

Mikrozirkulationsstörungen wurden in verschiedenen Krankheitsprozessen erkannt, die diesem wachsenden Thema in der Gefäßforschung zugrunde liegen. In den letzten Jahren hat die Entwicklung von Live-Bildgebungssystemen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der klinischen Forschung das (analytische) Tempo vorgegeben, mit dem Ziel, neue Instrumente zu schaffen, die in der Lage sind, quantifizierbare Endpunkte in Echtzeit mit klinischem Interesse und Anwendung zu liefern. Nahinfrarotspektroskopie (NIRS), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) sind unter anderem verfügbar, aber Kosten, Bildauflösung und reduzierter Kontrast werden als häufige Herausforderungen erkannt. Die optoakustische Tomographie (OT) bietet eine neue Perspektive auf die vaskuläre funktionelle Bildgebung und kombiniert modernste optische Absorptions- und räumliche Auflösungskapazitäten (von der optischen bis zur akustischen Auflösung im Mikrometerbereich) mit der Gewebetiefe. In dieser Studie haben wir die Anwendbarkeit der multispektralen optoakustischen Tomographie (MSOT) für die funktionelle Bildgebung getestet. Das System verwendet einen abstimmbaren optischen parametrischen Oszillator (OPO), der von einem Nd: YAG-Laser gepumpt wird und Anregungsimpulse liefert, die von einer 3D-Sonde bei Wellenlängen von 680 nm bis 980 nm erfasst werden. Bilder, die vom menschlichen Unterarm erhalten wurden, wurden durch einen speziellen Algorithmus (der in der Software des Herstellers enthalten ist) basierend auf der Reaktion bestimmter Chromophore rekonstruiert. Maximales oxygeniertes Hämoglobin (Max HbO 2) und desoxygeniertes Hämoglobin (Max Hb), Gesamthämoglobin (HbT) und mittlere Sauerstoffsättigung (mSO₂) bis Gefäßdichte (μVu), mittlere Abstände zwischen Einheiten (ζAd) und kapillares Blutvolumen (mm³) können mit diesem System gemessen werden. Das bei diesem OT-System gefundene Anwendbarkeitspotenzial ist relevant. Laufende Softwareentwicklungen werden sicherlich den Nutzen dieses Bildgebungssystems verbessern.

Introduction

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit wiederkehrende häufigste Todesursachen und stellen eine enorme Belastung für jedes Gesundheitssystem dar ^1,2. Die Technologie hat wesentlich zur Erweiterung unseres Verständnisses der grundlegenden Herz- und Gefäßpathophysiologie beigetragen, indem sie präzisere Diagnosewerkzeuge und die Möglichkeit der Früherkennung von Krankheiten und eines effektiveren Managements bietet. Bildgebende Verfahren bieten die Möglichkeit, nicht nur die Herz- und Hauptgefäßleistung zu messen, sondern in einem viel kleineren Maßstab unter anderem auch die Kapillardichte, die lokale Perfusion und das Volumen sowie die endotheliale Dysfunktion zu berechnen. Diese Technologien haben erste quantitative Einblicke in die Gefäßbiologie mit direkter klinischer Anwendung ermöglicht. Veränderungen der Kapillardichte, lokale Perfusionsreduktion oder Okklusion entsprechen wahrscheinlich einem ischämischen Zustand, was dazu beiträgt, die wachsende Rolle der Bildgebung zu erklären und zu einem unverzichtbaren Werkzeug in der kardiovaskulären Forschung und Praxis zu werden ^3,4,5.

In den letzten Jahren hat die funktionelle Bildgebung konsequent den Takt in der technologischen Innovation vorgegeben, mit Ultraschall (US), Nahinfrarotspektroskopie (NIRS), Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) als einige bekannte Beispiele. Mehrere Bedenken schränken jedoch ihre Anwendung ein, von Kosten und Patientensicherheit (sowie Komfort) bis hin zu Bildkontrast und Auflösung ^6,7. Die optoakustische Tomographie (OT) hat sich in jüngster Zeit als neue Richtung in der optisch-basierten Gefäßforschung herausgebildet. Diese Technologie, die sich auf die Detektion von Ultraschallwellen konzentriert, die durch thermoelastische Expansion des mit ultrakurzen Laserpulsen getroffenen Gewebes erzeugt werden, ist seit einiger Zeit bekannt ^6,8. Diese physikalische Reaktion von Wärmeentwicklung und Gewebeausdehnung ruft ein akustisches Signal hervor, das von einem Ultraschallwandler detektiert wird. Die Verwendung von Lichtimpulsen vom sichtbaren bis zum nahen Infrarot und das Fehlen eines akustischen Hintergrundsignals kommen der Auflösungstiefe zugute. Der festgestellte Kontrast ergibt sich aus den wichtigsten vorhandenen Chromophoren (Hämoglobin oder Melanin). Im Vergleich zu anderen Technologien hat OT die Vorteile, dass (1) kein Kontrast benötigt wird (markierungsfreie Bildgebung), (2) besserer Kontrast und Auflösung mit weniger Artefakten als Ultraschall und (3) niedrigerer Preis sowie schnellere Erfassung und einfache Bedienung 6,9,10,11.

Die multispektrale optoakustische Tomographie (MSOT) gehört zur neuesten Generation von OT-Instrumenten. Gebaut mit einem abstimmbaren optischen parametrischen Oszillator (OPO), der von einem Nd:YAG-Laser gepumpt wird, der Anregungspulse liefert, wird ein 3D-Bild von zeitaufgelösten Signalen aufgenommen, die von hochfrequenten Ultraschall-Anregungspulsen bei Wellenlängen von 680 nm bis 980 nm mit einer Wiederholrate von bis zu 50 Hz¹² detektiert werden. Die optoakustische Bildgebungsplattform ermöglicht die Quantifizierung verschiedener Chromophore in der Tiefe (bis zu 15 mm). Variablen wie HbO₂, Hb und Melanin sind leicht zugänglich. Andere Variablen von Interesse, wie maximales sauerstoffreiches Hämoglobin (Max HbO₂) und desoxygeniertes Hämoglobin (Max Hb), sind ebenfalls verfügbar. Rekonstruktionsalgorithmen aus der Software des Herstellers erlauben die Berechnung weiterer Variablen wie Gefäßdichte (μVu), mittlerer Abstand zwischen Einheiten (ζAd) und Kapillarvolumen (mm³).

Die vorliegende Studie untersucht die wesentlichen operativen Aspekte dieses neuen Systems, um seine praktischen Aspekte und potenziellen Anwendungen in der kardiovaskulären präklinischen Forschung besser zu verstehen.

Protocol

Das experimentelle Protokoll wurde zuvor von der Ethikkommission der Fakultät für Gesundheitswissenschaften der Universität (EC. ECTS/P10.21). Die Verfahren beachteten uneingeschränkt die Grundsätze der guten klinischen Praxis, die für die Humanforschung festgelegt wurden¹³. Eine praktische Stichprobe von sechs gesunden Teilnehmern beiderlei Geschlechts (n = 3 pro Geschlecht) mit einem Durchschnittsalter von 32,8 ± 11,9 Jahren wurde aus der Universitätsgemeinschaft ausgewählt. Ausgewählte Teilnehmer mussten normotensiv, Nichtraucher und frei von Medikamenten oder Nahrungsergänzungsmitteln sein. Blutdruck, Herzfrequenz und der Body Mass Index wurden ebenfalls registriert. Alle Teilnehmer wurden zuvor über die Ziele und die Dauer der Studie informiert und erteilten eine schriftliche Einwilligung.

HINWEIS: Diese Studie wurde unter Verwendung der MSOTAcuity (siehe Materialtabelle) durchgeführt, die im Folgenden als optoakustische Bildgebungsplattform bezeichnet wird.

1. Vorbereitung der Akquisition

HINWEIS: In der folgenden experimentellen Beschreibung sind Bildschirmbefehle fett gedruckt.

1. Laden von Probandeninformationen: Schalten Sie das optoakustische Bildgebungsgerät ein. Während sich die Ausrüstung aufwärmt, geben Sie die Teilnehmerinformationen an. Das Hauptwillkommensfenster der Software öffnet sich mit der Scan-Übersicht. Geben Sie Daten (einschließlich Name, Studienbezeichnung, persönliche Daten und alle relevanten Beobachtungen) ein, nachdem Sie auf Patienten-ID geklickt haben, und beenden Sie den Antrag durch Drücken von Auswählen.
2. Voreingestellte Auswahl: Stellen Sie sicher, dass die Meldung Laser is Ready (Laser ist bereit ) auf dem Gerätebildschirm angezeigt wird. Nach der Aufwärmzeit muss die Laserstatusleiste auf dem Gerätebildschirm von Laser Standby zu Laser is Ready (Laser ist bereit) geändert werden. Für dieses Protokoll ist die Voreinstellung für die Chromophore Hb, HbO₂ und Melanin ausgelegt. Nach Auswahl der richtigen Voreinstellung wird die Laserleistung getestet.
3. Stellen Sie an dieser Stelle sicher, dass auf dem Bildschirm eine Meldung angezeigt wird, die jeden Teilnehmer im Raum daran erinnert, Laserschutz-Googles anzuwenden. Drücken Sie das Fußpedal des Laserschalters und warten Sie, bis die Laserleistung selbst überprüft wird. Nach einigen Sekunden erscheint ein Fenster mit dem aktuellen Laserstatus mit einem Check-up-Bericht. Lassen Sie dieses Fenster los, indem Sie die verfügbare OK-Taste drücken.
   HINWEIS: Die optoakustische Bildgebungsplattform verwendet einen Nd:YAG-Laser, der als Laser der Klasse 4 gilt, der für das menschliche Auge besonders gefährlich ist. Daher muss dieser Laser mit angemessener Sorgfalt behandelt werden.
   VORSICHT: Kein Erwerb sollte stattfinden, ohne sicherzustellen, dass alle Sicherheitsmaßnahmen, einschließlich eines geeigneten Augenschutzes, vorhanden sind.

2. Positionierung und Bildaufnahme

1. Akklimatisieren Sie den Teilnehmer an die Laborumgebung (21 ° C ± 1 ° C; 40% -60% relative Luftfeuchtigkeit) und wählen Sie eine bequeme Position, um unnötige Bewegungen zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass der zu scannende Bereich zuvor gereinigt wurde.
   HINWEIS: Die Empfehlung des Herstellers, den abzubildenden Bereich mit einer 70%igen Ethanol/Wasser-Lösung zu reinigen, wird empfohlen. Darüber hinaus wird für eine optimale Bildaufnahme die Entfernung von Haaren (falls zutreffend) empfohlen.
2. Sondenhalter und Bildstabilisierung
   1. Tragen Sie eine dünne Schicht Ultraschallgel auf die 3D-Tasse auf. Die Bildstabilisierung erfordert, dass die 3D-Tasse in der gewünschten Bildposition gehalten wird. Positionieren und stabilisieren Sie einen arretierbaren Arm für den interessierenden Bereich. Der in dieser Studie verwendete Arm wurde im eigenen Haus entworfen und mit Aluminiumprofilkomponenten gebaut (Abbildung 1).
   2. Nachdem Sie den 3D-Becher auf den interessierenden Bereich gelegt haben, verriegeln Sie die stabilisierende Armsperre teilweise für die Bildaufnahme.
      HINWEIS: Die Qualität und gleichmäßige Anwendung des Ultraschallgels ist entscheidend; Das Vorhandensein von Luftblasen kann die Bilddefinition beeinträchtigen.
3. Bildaufnahme für dynamische Bedingungen mit dem PORH-Manöver (Post-Occlusive Reactive Hyperemia) auf der Menüregisterkarte Untersuchung .
   1. Erfassen Sie den Baseline-Kontrollscan. Nachdem Sie ein Sichtfeld für die Bildgebung gefunden haben, verriegeln Sie mit der entleerten Blutdruckmanschette den 3D-Becherpositionierungsarm sicher.
   2. Üben Sie minimalen Druck auf die Bildgebungsstelle aus, da höhere Drücke die Messwerte beeinträchtigen können. Pushen Sie die Standardvoreinstellung Hb, HbO 2 und Melanin des Herstellers, die gleichzeitig Chromophore für Hb, HbO₂ und Melanin misst.
      ACHTUNG: Es ist obligatorisch, die Augen während des Betriebs mit einer geeigneten Schutzbrille zu schützen.
      HINWEIS: Hautfototypen IV bis VI (dunkle Haut) sind anfällig für Fehllesungen und erfordern ein Baseline-Kontrollbild für die weitere Verarbeitung. Die Verwendung einer Schutzbrille während der Bildaufnahme (wenn der Laser aktiv ist) ermöglicht es dem menschlichen Auge nur, gelbe und blaue Farben zu erkennen. Farben können während der Bildbearbeitung bearbeitet werden.
   3. Wählen Sie den anatomischen Bereich für die Aufnahme von Basisbildern aus. Für Erkundungszwecke wird der ventrale Unterarm empfohlen. Fahren Sie fort, indem Sie das Laser-Fußschalterpedal drücken.
      HINWEIS: Die Touchscreen-Taste mit der Bezeichnung Ansicht (gelb gefärbt), die das Livebild auf dem Bildschirm anzeigt, wenn sie gedrückt wird. Der Bildstabilitätsstatus wird als grauer Balken in der Mitte des Touchscreens angezeigt, der die Stabilität der 3D-Sonde anzeigt.
      1. Wenn die Bildstabilität maximiert ist, machen (oder erfassen) Sie einen Schnappschuss des Bereichs, indem Sie die Schnappschusstaste auf dem Touchscreen drücken. Jeder Scan erfasst 10-12 Bilder in einer akustischen Tiefe von 150 mm für jede Wellenlänge, die innerhalb der Voreinstellung definiert ist, über eine Aufnahmezeit von 2 s. Dieser Baseline-Erfassungsscan umfasst insgesamt 30-36 Frames.
         HINWEIS: Für jedes detektierte Chromophor (Hb, HbO₂ und Melanin) werden 10 Frames mit einer maximalen Tiefe von 15 mm gesammelt.
      2. Drücken Sie weiterhin das Laser-Fußschalterpedal für eine kontinuierliche Videoaufnahme und achten Sie auf die Ansichtstaste (gelb eingefärbt) auf dem Touchscreen. Das stabilisierte Bild wird angezeigt. Drücken Sie Aufnahme (blau eingefärbt), um die Live-Bildaufnahme zu starten.
      3. Stoppen Sie die Aufnahme, indem Sie die Stop-Taste (schwarz gefärbt) drücken. Die optoakustische Bildgebungsplattform stoppt die Aufnahme und rendert das Video automatisch in den Vorschaumodus.
   4. Dynamische Messungen (PORH-Abbildung): Stellen Sie die Druckmanschette am Arm des Patienten oberhalb des Ellenbogens ein, um dieses Manöver zu veranschaulichen. Blasen Sie die Manschette mit suprasystolischem Druck (~ 200 mmHg) auf und fahren Sie gemäß den Schritten 2.3.1 bis 2.3.3.1 fort, um das abgebildete Gefäßsystem unter Druck zu erfassen.
   5. Um ein Video aufzunehmen, um die Auswirkungen der Druckentlastung auf das abgebildete Gefäßsystem zu beurteilen, öffnen Sie das Druckventil, während Sie das Video wie in 2.3.3.2 aufnehmen. Folgen Sie wie zuvor dem Live-Bild auf dem Bildschirm.
      HINWEIS: Um dieses Manöver auszuführen, sollte der suprasystolische Druck für 1-5 min aufrechterhalten werden; Es ist wichtig zu wissen, dass dieser Druck unterschiedliche Toleranzgrade und Beschwerden beim Patienten hervorrufen kann. Dieser Aspekt sollte während der Experimente sorgfältig behandelt werden.

3. Bildanalyseprotokoll

1. Kopieren Sie die aufgezeichneten Scans in einen ausgewählten/dedizierten Ordner zur Sicherung und weiteren Analyse auf einem separaten Computerarbeitsplatz mit der speziellen Analysesoftware des Herstellers. Jeder Scan wird nach Erfassungszeit gespeichert und vom Programm in einem Studienordner mit einem laufenden Code geordnet.
   HINWEIS: Eine Sicherungskopie wird dringend empfohlen. Das direkte Arbeiten mit den aufgezeichneten Rohdaten ist möglich, es wird jedoch dringend davon abgeraten, da ein potenzieller Festplattenabsturz die Rohdaten beschädigen könnte.
2. Öffnen Sie das Analyseprogramm auf dem Arbeitsplatzrechner. Wählen Sie Programmmenü > Studie öffnen , um Dateien zu importieren und auf Backup-Scans zuzugreifen. Öffnen Sie die Studie, und scrollen Sie zum Ende des Ordners (mit aufgezeichneten Scans), um Dateien mit einer . NOD-Erweiterung. Dies ist der einzige Dateityp, der von der Software erkannt wird, um eine Studie zu öffnen.
   ANMERKUNG:. NOD-Dateien werden automatisch mit einer laufenden Nummer für jede Studie benannt und enthalten keine Patienteninformationen im Dateinamen.
3. Für die Bildrekonstruktion öffnen Sie das Bildanalysemodul, indem Sie auf das Softwaremenü > Erweiterte Verarbeitung zugreifen.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Registerkarten des Programm-Workflows in der oberen Menüleiste sichtbar (schwarz eingefärbt) sind (zusätzliche Abbildung 1): Menü; Scan-Übersicht; Wiederaufbau; Fluence-Korrektur; Spektrale Entmischung; Visualisierung & Analyse. Während der Analyse wird jede aktivierte Workflow-Registerkarte blau eingefärbt.
      HINWEIS: Wenn Advance Processing nicht geöffnet ist, zeigt die Software nur Scan-Übersicht und Visualisierung & Analyse an.
4. Rekonstruieren Sie das Bild über die Registerkarte Rekonstruktion der Software. Wählen Sie die zu rekonstruierenden Scans auf der linken Seite des Hauptprogrammmenüs aus. Geladene Scans werden auf der rechten Seite des Bildschirms angezeigt. Behalten Sie die standardmäßigen sechs optoakustischen Emissionswellenlängen (700, 730, 760, 800, 850 und 900 nm) bei, da sie das maximale optoakustische Signal für HbO₂ bei 900 nm, für Hb bei 760 nm und Melanin bei 700 nm enthalten.
   1. Führen Sie die Scanrekonstruktion mithilfe des Symbols auf der rechten Seite durch. Folgen Sie dem Programm-Workflow, indem Sie die Scan-Vorgabe und das Sichtfeld (Auflösung) auswählen. Die Informationen werden in der oberen linken Ecke des Hauptbildschirms angezeigt. Stellen Sie die Schallgeschwindigkeit ein, um den Scanfokus anzupassen (ergänzende Abbildung 2). Das Rekonstruktionspanel zeigt auch die Anzahl der Frames jedes aufgenommenen Scans an und ermöglicht die Auswahl der Wiederholungen, die (falls erforderlich) analysiert werden können.
      HINWEIS: Jeder Scan wird mit einer Standardschallgeschwindigkeit von -90 geladen, die vom Benutzer angepasst werden sollte. Die Schallgeschwindigkeit kann auch automatisch mit einer Autofokus-Funktion (AF) angepasst werden.
5. Drücken Sie die Taste Scans rekonstruieren am oberen Bildschirmrand, um zur Scanrekonstruktion zu gelangen. Ein temporäres Dashboard mit der Meldung Job Processing (Auftragsbearbeitung) wird angezeigt. Dieses Panel kann auch über das Menü > Bearbeitungsstatus aufgerufen werden. Nach Abschluss der Rekonstruktion muss die Bildnachbearbeitungsanalyse zur Fluence-Korrektur übergehen.
6. Aktivieren Sie die Fluence-Korrektur von rekonstruierten Bildern im Dashboard-Menü. Rekonstruierte Bilder müssen zur Fluencekorrektur geladen werden. Diese werden mit einem Flag neben jeder Scannummer angezeigt. Geladene Dateien werden sofort auf der rechten Seite des Bildschirms als Ausgewählte Rekonstruktionen angezeigt. Aktivieren Sie die Fluence-Korrektur , indem Sie mit dem Symbol auf der rechten Seite des Bildschirms interagieren (ergänzende Abbildung 3). Drücken Sie die Save Fluence Korrektur(en), um fortzufahren.
7. Nachdem Sie die Fluenzkorrektur gespeichert haben, führen Sie die spektrale Entmischung des erworbenen Presets (Hb, HbO₂ und Melanin) durch. Wählen Sie die Registerkarte Spektrale Entmischung, um die Liste der ausgewählten Rekonstruktionen für die spektrale Entmischung zu öffnen. Eine Liste mit jedem Scan der ausgewählten Studie wird mit der Historie der vorherigen Bildverarbeitungsschritte angezeigt.
8. Laden Sie die zuvor gespeicherten Fluence-Korrekturdateien. Geladene Scans werden sofort auf der rechten Seite des Bildschirms als Selected Reconstructions (Ausgewählte Rekonstruktionen) angezeigt (Ergänzende Abbildung 4). Aktivieren Sie die spektrale Entmischung, indem Sie auf das Symbol auf der rechten Seite des Bildschirms drücken.
   1. Beobachten Sie die Wellenlängen, die ungemischt sein sollen. Alle sechs optoakustischen Emissionswellenlängen (700, 730, 760, 800, 850 und 900 nm), die in den Rekonstruktionsschritt (Schritt 3.4) einbezogen wurden, werden automatisch für die spektrale Entmischung ausgewählt. Bearbeiten Sie ggf. die gewünschten zu verarbeitenden Spektren (z. B. Spektren: Hb, HbO₂ und Melanin) über das XYZ-Symbol .
   2. Nachdem Sie die angepassten Parameter bestätigt haben, klicken Sie auf Start Spectral Unmixing , damit die spektrale Entmischung fortgesetzt werden kann. Eine Verarbeitungsmenüleiste wird angezeigt, die den Fortschritt des Vorgangs anzeigt.
      HINWEIS: Während der spektralen Entmischung sind verschiedene Parameteranpassungen möglich, und es stehen mehrere Entmischungsmethoden zur Verfügung. In diesem Protokoll wird die lineare Regressionsmethode als Standard verwendet, um Hb, HbO₂ und Melanin zu entmischen.
9. Greifen Sie auf die Registerkarte Visualisierung und Analyse zu. Klicken Sie auf einen aktivierten Scan, um alle in Schritt 1.1 eingeführten Themeninformationen und Kommentare anzuzeigen (ergänzende Abbildung 5).
   HINWEIS: Mehrere Scans können parallel visualisiert werden.
   1. Drücken Sie die Taste + , um eine Analyse mit mehreren Scans zu erstellen. Rufen Sie in diesem Fenster eine Mehrfachscanansicht ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern . Nach dem Speichern des Ansichtsnamens wird ein neues Dashboard angezeigt, das alle Scans der analysierten Studie enthält.
   2. Wählen Sie jeden gewünschten Scan aus, um (jeden) zur gespeicherten Analyseansicht hinzuzufügen. Fügen Sie zusätzliche Scans in der oberen linken Ecke hinzu, und diese werden automatisch in der Analyseansicht angezeigt.
10. Legen Sie in der Analyseansicht die richtigen Farbnachschlagetabellen fest, um das Bild für die Analyse vorzubereiten. Klicken Sie in der oberen Menüleiste auf Weitere Bildsteuerungsoptionen und aktivieren Sie das Symbol Max. Intensitätsprojektion . Ordnen Sie Ebenen Farben zu, indem Sie auf das Symbol in der unteren rechten Ecke der Bildanzeige neben der 2D+-Bildanzeige klicken.
11. Wählen Sie Mehr , um die Farben aller Kanäle gleichzeitig zu bearbeiten. Dieses Menü zeigt alle Chromophore unvermischt an und ermöglicht die Auswahl mehrerer Schichten zur Anzeige.
    HINWEIS: Wenn Sie die Maus über die Softwaresymbole bewegen, wird deren Name grau dargestellt, wie er im Protokoll angezeigt wird.
12. Passen Sie die Farbintensität jeder Ebene mit den Werkzeugen unten links auf dem Bildschirm an.
    HINWEIS: Die Anpassung mit Min/Max-Interpolation für jeden Kanal führt im Allgemeinen zu guten Ergebnissen.

4. Analyse der Region of Interest (ROI)

HINWEIS: Die Auswahl einer Region of Interest (ROI) ist für die Datenanalyse obligatorisch.

1. Identifizieren Sie den zu analysierenden ROI. Umgeben Sie den ROI mit den im XY-Bild verfügbaren Formen (in der Menüleiste), während Sie denselben ROI innerhalb der orthogonalen Ansichten auf der XZ- und YZ-Achse nachzeichnen (ergänzende Abbildung 6).
   HINWEIS: Für die aktuelle ROI-Analyse wurde eine Polygonform verwendet.
   1. Folgen Sie der ROI-Form in der verbleibenden XZ- und YZ-Achse (Beispiel in Abbildung 2), während Sie mehrere Polygon-Layer mit der Funktion Interpolieren hinzufügen und Unterbereiche entfernen platzieren. Die Daten können nach der Definition/Auswahl des gewünschten ROI grafisch dargestellt werden.
   2. Klicken Sie auf das Symbol Import Region of Interest to Quantification und beobachten Sie die Multispektrenkomponente, die auf der rechten Seite des Bildschirms als grafisches Detail des ausgewählten ROI angezeigt wird.
   3. Exportieren Sie ROI-Daten, indem Sie auf das Excel-Symbol am unteren Rand der grafischen Ansicht der ROI-Daten klicken. Das gesamte Datenpaket aus allen Regionen wird als Bündel in eine Tabellenkalkulation zur anschließenden Analyse exportiert. Abbildung 3 zeigt Daten eines Teilnehmers, der sich einer auf 200 mmHg aufgeblasenen Druckmanschette unterzog und das Gefäßsystem im Vergleich zum Ruhezustand des Gefäßsystems bei 0 mmHg analysierte.
2. Quantifizieren Sie mehrere ROI-Objekte gleichzeitig, indem Sie die Schritte 4.1-4.1.3 ausführen.
3. Exportieren Sie Bilder aus demselben Menü wie TIFF-Dateien mit allen eingebetteten Daten und integriertem ROI-Umriss (Abbildung 2).

Representative Results

Daten, die durch optoakustische Bildgebung bereitgestellt werden, können in nachbearbeiteten Exportbildern (Abbildung 2) und geplotteten Daten (Abbildung 3) analysiert werden. Ziel war es, die Funktionsweise der optoakustischen funktionellen Bildgebung vorzustellen und ihre Anwendung in der bekannteren Gefäßforschung zu erforschen. Dazu verglichen wir Bilder, die während der Ruhe und nach einem 200 mmHg-Verschluss einer Hauptversorgungsarterie aufgenommen wurden (Abbildung 2). Diese Beobachtungen können nach ROI-Analyse und Export quantifiziert werden. In der XY-Ebene kann das höhere Signal von Melanin im Vergleich zu den Ebenen YZ und XZ beobachtet werden, was die Epidermisgrenze anzeigt. Der Verschluss der Arteria brachialis (Arm) provoziert eine gewisse Stasis in den Gefäßen vor der Platzierung der OT-Sonde (ventraler Unterarm). In der Folge stellten wir einen Anstieg der Gesamtsignale fest, die als Anstieg von Blau (Hb) und Rot (HbO₂) an den Achsen XY, YZ und XZ dargestellt wurden. Die Stasis kann in der XY-Ebene verfolgt werden, während der Druck von 200 mmHg in der Manschette gehalten wird. Die YZ- und XZ-Achsen zeigen ein erhöhtes Blutvolumen aufgrund der obigen Okklusion im Vergleich zu den normalen Perfusionsbedingungen (keine Okklusion), hervorgehoben durch die magentafarbenen maskierten Bereiche.

Die exportierte ROI-Analyse desselben Mikrovaskulaturbereichs quantifiziert die Chromophore HbO 2 (rot), Hb (blau) und HbT (rosa), mSO₂ (tiefrot) und Melanin (gelb) aus stabilisierten Bildern, die über 8,6 s gesammelt wurden. Die Druckentlastung wird sofort erkannt; Abbildung 3 zeigt die Entwicklung der Hb-, HbO2- und HbT-Erholung nach Okklusion, während die optoakustische Datenausgabe den Beobachtungen in Abbildung 1 folgt. Die Software berechnet Blutsauerstoffsättigung (mSO₂) und HbT-Werte aus der Addition der Hb- und HbO2-Arbiträrsignale. Die Melaninkonzentration bleibt innerhalb der 200 mmHg-Okklusion und im Ruhezustand innerhalb des Zeitintervalls der Bildaufnahme konstant.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des flexiblen Arms, der die Messsonde in stabilisiertem Kontakt mit der Haut des Teilnehmers hält. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Repräsentative optoakustische Bilder mit Veränderungen des Gefäßsystems in Ruhe oder unter Druck von 200 mmHg. Das gezeigte Bild enthält drei Farben, die Hb (blau), HbO₂ (rot) und Melanin (gelb) darstellen, wie in der Bildanalyse in Abschnitt 4 beschrieben. Jedes optoakustische Bild stellt eine maximale Intensitätsprojektion aller Ebenen dar, die jedem gescannten Chromophor zugeordnet sind. (A) Die XY-Ebene der optoakustischen Erfassung. (B) Die orthogonale YZ-Ansicht derselben optoakustisch abgebildeten Stelle. (C) Die XZ-Ansicht des gescannten Bereichs. Die Magenta-Pfeile zeigen auf die Bereiche mit erhöhter Stasis; Der magentafarbene Maskenbereich markiert das erhöhte Blutvolumen, das aufgrund des Verschlusses der Arteria brachialis im Vergleich zu den normalen Perfusionsbedingungen (kein Okklusion) in den Gefäßen eingeschlossen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentativer Datenexport eines quantifizierten ROI. Natürliche Chromophore von HbO 2 (Rot), Hb (Blau) und HbT (Rosa), mSO₂ (tiefrot) und Melanin (Gelb) werden aus den Daten der stabilisierten Bilder dargestellt, die über 8,6 s gesammelt wurden. Die Grafiken von Hb, HbO₂ und HbT zeigen eine Erholungssteigung von der Okklusion in Richtung des nicht verdeckten Ruhezustands. Die berechnete Blutoxygenierung mSO₂ und die Melaninkonzentration bleiben innerhalb des 200 mmHg-Verschlusses und im Ruhezustand innerhalb des Zeitintervalls der Bildaufnahme konstant. Die extrahierten Bilder sind Datenpunkte, die als Mittelwert ± sd von n = 10 Bildern pro Frame dargestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Abbildung 1: Scan-Übersichtsfenster und Hauptmenü der Analysesoftware. Wenn Sie die Menü-Taste (in schwarz) drücken, werden im Hauptmenü Dropdown-Optionen angezeigt, um die ausgewählte Studie auszuwählen. Diese Aktion wählt die von der Software erkannte ".nod"-Datei aus und lädt sie. Die Scan-Übersicht (blau) zeigt alle Scans der Studie. Details (schwarz) werden rechts angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Arbeitsablauf der Rekonstruktionsanalyse. Panel 1 - Wählen Sie den zu rekonstruierenden Scan aus und drücken Sie den nach rechts gerichteten Pfeil auf der rechten Seite des Displays (violetter Pfeil), um fortzufahren. Panel 2 - Beobachten Sie die Schallgeschwindigkeit und stellen Sie den Schieberegler auf den besten Fokus ein (blauer Pfeil); a) angepasster Fokus, der im rechten Fenster angezeigt wird; b) Auswahl der zu analysierenden Wiederholungen (gelber Pfeil); c) Drücken Sie die Schaltfläche Scans rekonstruieren , um fortzufahren (grüner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Fluence-Korrektur-Panel Workflow. Panel 1 - Wählen Sie die zu korrigierenden Scans aus und drücken Sie den nach rechts gerichteten Pfeil auf der rechten Seite des Bildschirms. Panel 2 - Drücken Sie Save Fluence Correction(s), um fortzufahren (grüner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 4: Arbeitsablauf des Spectra-Entmischungspanels. Bedienfeld 1 - Wählen Sie die zu entmischenden Scans aus und drücken Sie den nach rechts gerichteten Pfeil (violetter Pfeil). Panel 2 a) Wählen Sie den Scan zum Entmischen (blauer Pfeil) und eine Vorschau des angepassten Bildes wird auf der rechten Seite angezeigt; b) Wählen Sie die zu entmischenden Wiederholungen aus (gelber Pfeil); c) Drücken Sie Start spectral unmixing , um fortzufahren (grüner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 5: Visualisierungspanel und Auswahl der Chromophorfarben. Panel 1) Wählen Sie die anzuzeigenden Scans mit einem Doppelklick aus (violetter Pfeil); Panel 2) Aufgenommenes Bild in den Achsen XY (blaues Quadrat), XZ (gelbes Quadrat) und YZ (grünes Quadrat); 2a) Bildanalyse-Taste, die die erfassten Wellenlängen anzeigt; 2b) Wählen Sie Weitere Bildsteuerungsoptionen in der oberen Menüleiste und aktivieren Sie das Symbol Max. Intensitätsprojektion ; Wählen Sie Mehr aus, um die Farben der Kanäle zu bearbeiten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 6: Auswahl der Region of Interest (ROI). Wählen Sie das Lasso-Werkzeug (gelber Pfeil) aus und definieren Sie die Grenzen des ROI innerhalb der XY-Achse (Magenta-Pfeil). Es ist möglich, verschiedene Formbereiche (Polygon, Rechteck, Quadrat, Kreis oder Elipse) zu definieren. Folgen Sie der ROI- in XZ- und YZ-Achse und fügen Sie der ersten Auswahl Unterbereiche (grüner Pfeil) hinzu. Es werden mehrere Unterbereiche angezeigt (Cyanpfeil). Um Daten aus dem ausgewählten ROI zu extrahieren, klicken Sie auf das Symbol Region von Interesse zur Quantifizierung importieren und fahren Sie fort. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll betont die Arbeitsschritte, die als praktische Anforderungen für den Betrieb dieses neuen optoakustischen Bildgebungsinstruments angesehen werden, von der geeigneten Positionierung (Teilnehmer, Sonde), die für die Stabilisierung der 3D-Bechersonde erforderlich ist, bis hin zur Bildaufnahme, ROI-Auswahl und Bildrekonstruktion und -analyse.

Der vorgeschlagene experimentelle Ansatz, bei dem "sofortige" Aufnahmen zusammen mit Bildern verwendet werden, die unter dynamischen Bedingungen aufgenommen wurden, veranschaulicht das Interesse und den Nutzen dieses Instruments für den Zugang zur menschlichen Gefäßphysiologie in vivo . Wie gezeigt, ist die akustische Bildauflösung von 150 μm in einem Volumen von bis zu 15^mm3 von anderen Tomographietechniken unerreicht.

Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich in Bezug auf (i) die Bedeutung der Sondenstabilisierung für die Bildaufnahme; Die Verwendung eines flexiblen, sicheren Sondenhalters verbessert die Bildaufnahme deutlich; ii) die korrekte Identifizierung der Gefäßstrukturen; sonographische Referenzen wie Melanin im epidermal-dermalen Übergang könnten als Marker verwendet werden, um die oberen Plexusgefäße in der Haut zu identifizieren; und (iii) die funktionale Bildanalyse, die über die Rekonstruktionssoftware des Herstellers durchgeführt wird.

Die erweiterte Analyse der ROI-Daten und des Bildexports erfordert ein tieferes Verständnis der dedizierten Software und der entwickelten Algorithmen. Das aktuelle optoakustische Bildgebungsinstrument ist in der Lage, ein 3D-Volumen von 15^mm3 Gewebe mit einer Auflösung von 150 μm zu rekonstruieren. Diese Kapazität sollte potenziert werden, um die mikrovaskuläre Funktion(en) in der Tiefe besser zu quantifizieren. Dennoch ermöglicht die grundlegende Bedienung die direkte Beobachtung von Referenzchromophoren und die Erfassung mehrerer Presets aus demselben Bereich, was schnelle Scan- und Live-Videoaufnahmen ermöglicht.

Das Anwendbarkeitspotenzial des optoakustischen Bildgebungssystems ist relevant. Laufende Softwareentwicklungen werden sicherlich den Nutzen dieses Bildgebungssystems verbessern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cuff	PIC	107001
Drapes	Pajunk	021151-1501
Ethanol 70%	Sigma Aldrich	EX0281
Gogless	Univet	559G.00.00.201
Kimwipes	Amoos	5601856202331.00
MSOT	iThera	MSOTAcuity
Stabilizing arm	ITEM		Self designed and assemble
Ultrasound gel	Parker Laboratories	308
Waxing cream	Veet	kkdg08hagd