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Immunology and Infection

संवर्धन और आनुवंशिक रूप से एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड में हेरफेर करना

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63885
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biological Sciences, The George Washington University, 2Department of Microbiology, Immunology, and Tropical Medicine, School of Medicine and Health Sciences, The George Washington University

Summary

एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड बैक्टीरिया के साथ सहजीवन में रहते हैं और साथ में वे अपनी जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली को कमजोर करके कीड़ों को सफलतापूर्वक संक्रमित करते हैं। सूत्रकृमि संक्रमण के आनुवंशिक आधार पर अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड को बनाए रखने और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के तरीकों का वर्णन किया गया है।

Abstract

जेनेरा हेटरोरहाब्डाइटिस और स्टेनरनेमा में एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड मिट्टी में रहने वाले कीड़ों के परजीवी हैं। उनके जीवन चक्र की मुख्य विशेषता क्रमशः बैक्टीरिया फोटोरहाब्डस और ज़ेनोरहाब्डस के साथ पारस्परिक संबंध है। सूत्रकृमि परजीवी उपयुक्त कीट मेजबानों का पता लगाने और प्रवेश करने में सक्षम हैं, कीट प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को नष्ट कर देते हैं, और अगली पीढ़ी का उत्पादन करने के लिए कुशलतापूर्वक गुणा करते हैं जो सक्रिय रूप से संक्रमित करने के लिए नए कीट शिकार का शिकार करेंगे। उनके जीवन चक्र के गुणों के कारण, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड लोकप्रिय जैविक नियंत्रण एजेंट हैं, जिनका उपयोग विनाशकारी कृषि कीट कीटों को नियंत्रित करने के लिए कीटनाशकों के साथ संयोजन में किया जाता है। इसके साथ ही, ये परजीवी सूत्रकृमि सूत्रकृमि का विश्लेषण करने और विरोधी सूत्रकृमि प्रतिक्रियाओं की मेजबानी करने के लिए एक शोध उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह शोध संक्रमण के दौरान नेमाटोड स्रावित अणुओं की भूमिका को समझने के लिए आनुवंशिक तकनीकों और ट्रांसक्रिप्टोमिक दृष्टिकोणों के हालिया विकास से सहायता प्राप्त है। यहां, एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड को बनाए रखने और जीन नॉकडाउन प्रक्रिया का उपयोग करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। ये पद्धतियां एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड संक्रमण कारकों के कार्यात्मक लक्षण वर्णन को बढ़ावा देती हैं।

Introduction

एकीकृत कीट प्रबंधन रणनीतियों में इन परजीवियों की उपयोगिता और बुनियादी जैव चिकित्सा अनुसंधान 1,2 में उनकी भागीदारी के कारण पिछले कुछ वर्षों में एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड (ईपीएन) पर अनुसंधान तेज हो गया है। हाल के अध्ययनों ने ईपीएन को मॉडल जीवों के रूप में स्थापित किया है जिसमें संक्रमण प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के दौरान सक्रिय होने वाले सूत्रकृमि आनुवंशिक घटकों की जांच करना है। यह जानकारी मेजबान शरीर विज्ञान को बदलने और कीट जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 3,4 को अस्थिर करने के लिए परजीवी द्वारा स्रावित अणुओं की प्रकृति और संख्या पर महत्वपूर्ण सुराग प्रदान करती है। इसके साथ ही, यह ज्ञान आमतौर पर कीट मेजबान प्रतिरक्षा सिग्नलिंग मार्गों के प्रकार और रोगजनकों 5,6 के प्रवेश और प्रसार को प्रतिबंधित करने के लिए विनियमित कार्यों पर उपन्यासविवरणों द्वारा पूरक होता है। ईपीएन और उनके कीट मेजबानों के बीच गतिशील परस्पर क्रिया के दोनों किनारों की कल्पना करने के लिए इन प्रक्रियाओं को समझना महत्वपूर्ण है। ईपीएन-कीट मेजबान संबंधों की बेहतर प्रशंसा निस्संदेह स्तनधारी परजीवी नेमाटोड के साथ समान अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी, जिससे मानव प्रतिरक्षा प्रणाली में हस्तक्षेप करने वाले संक्रमण कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन हो सकता है।

ईपीएन नेमाटोड हेटरोरहाब्डाइटिस एसपी और स्टेनरनेमा एसपी कीड़ों की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित कर सकते हैं, और उनके जीव विज्ञान का पहले गहन अध्ययन किया गया है। दो नेमाटोड परजीवी प्रजनन के अपने तरीके में भिन्न होते हैं हेटरोरहाब्डिटिस आत्म-निषेचित होने और स्टीनरनेमा एम्फीमिक प्रजनन से गुजरने के साथ, हालांकि हाल ही में एस हेर्मैफ्रोडाइटम को हेर्मैफ्रोडाइट्स के आत्म-निषेचन द्वारा या पार्थेनोजेनेसिस 7,8,9 के माध्यम से प्रजनन करने के लिए दिखाया गया था। हेटरोरहाब्डाइटिस और स्टेनरनेमा नेमाटोड के बीच एक और अंतर क्रमशः ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, फोटोरहाब्डस और ज़ेनोरहाब्डस के दो अलग-अलग जेनेरा के साथ उनका सहजीवी पारस्परिकता है, जो दोनों कीड़ों के शक्तिशाली रोगजनक हैं। ये बैक्टीरिया ईपीएन के मुक्त-जीवित और गैर-खिला संक्रामक किशोर (आईजे) चरण में पाए जाते हैं, जो अतिसंवेदनशील मेजबानों का पता लगाते हैं, कीट हेमोकोएल तक पहुंच प्राप्त करते हैं जहां वे अपने संबंधित बैक्टीरिया को छोड़ते हैं जो तेजी से दोहराते हैं, और कीट ऊतकों को उपनिवेशित करते हैं। ईपीएन और उनके बैक्टीरिया दोनों विषाणु कारकों का उत्पादन करते हैं जो कीट सुरक्षा को निरस्त्र करते हैं और होमियोस्टेसिस को खराब करते हैं। कीट मृत्यु के बाद, सूत्रकृमि आईजे वयस्क ईपीएन बनने और अपने जीवन चक्र को पूरा करने के लिए विकसित होते हैं। भोजन की कमी और कीट शव के भीतर भीड़भाड़ के जवाब में गठित आईजे का एक नया समूह अंततः उपयुक्त मेजबान 9,10,11,12 का शिकार करने के लिए मिट्टी में उभरता है।

यहां, ईपीएन नेमाटोड को बनाए रखने, बढ़ाने और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल सहजीवी एच बैक्टीरियोफोरा और एस कार्पोकैप्से आईजे की प्रतिकृति, एक्सेनिक नेमाटोड आईजे की पीढ़ी, माइक्रोइंजेक्शन के लिए एच बैक्टीरियोफोरा हेर्मैफ्रोडाइट्स का उत्पादन, डीएसआरएनए की तैयारी और माइक्रोइंजेक्शन तकनीक को रेखांकित करता है। ये विधियां नेमाटोड रोगजनकता और मेजबान विरोधी सूत्रकृमि प्रतिरक्षा के आणविक आधार को समझने के लिए आवश्यक हैं।

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Protocol

1. सहजीवी सूत्रकृमि संक्रामक किशोरों का उत्पादन

  1. फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ एक पेट्री डिश (10 सेमी) को कवर करें और लगभग 10-15 गैलेरिया मेलोनेला लार्वा (चित्रा 1 ए) जोड़ें।
  2. एक पिपेट का उपयोग करके, मोम के कीड़े पर लगभग 25-50 आईजे प्रति 10 μL निलंबन युक्त 2 मिलीलीटर पानी वितरित करें। पेट्री डिश को कमरे के तापमान पर एक कैबिनेट में स्टोर करें।
  3. फिल्टर पेपर की नमी के आधार पर, हर 2 दिनों में 1-2 मिलीलीटर पानी जोड़ें। आईजे से संक्रमित वैक्सवर्म सामान्य रूप से 48 घंटे के भीतर मर जाएंगे।
  4. मोम के कीड़े आईजे8 (चित्रा 1 बी, सी) से संक्रमित होने के लगभग 10 दिन बाद व्हाइट के पानी के जाल तैयार करें। फिल्टर पेपर के बिना सोके हुए हिस्से पर मृत कीड़ों को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। नीचे पेट्री डिश को भरने के लिए नल के पानी का उपयोग करें और वेंटिलेशन के लिए स्पेसर के रूप में 15 एमएल ट्यूब की टोपी रखें।
  5. प्लास्टिक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर फिल्टर पेपर से धीरे-धीरे उठाकर नरम और नाजुक मोम कीड़े सावधानी से स्थानांतरित करें। विखनिज्ड या विआयनीकृत पानी के बजाय नल के पानी का उपयोग करें। उत्तरार्द्ध सूत्रकृमि एकत्रीकरण का कारण बनता है।
    1. सुनिश्चित करें कि पानी के जाल में पानी का स्तर पेट्री डिश की लगभग आधी ऊंचाई तक पहुंच जाता है। उम्मीद है कि कमरे में तापमान और आर्द्रता की स्थिति के आधार पर समय के साथ जल स्तर बदल जाएगा।
  6. जब छोटे पेट्री डिश में पानी नेमाटोड की उपस्थिति के कारण बादल हो जाता है, तो आईजे की नई पीढ़ी को टी 25 या टी 75 सेल संस्कृति फ्लास्क में स्थानांतरित करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें।
  7. उपयुक्त घनत्व (चित्रा 1 सी) तक पहुंचने तक मात्रा के लगभग 40% तक नल का पानी जोड़ें। सूत्रकृमि भीड़ से बचें और सेल संस्कृति फ्लास्क को क्षैतिज रूप से स्टोर करें।
  8. नीचे पेट्री डिश में अधिक पानी जोड़ें और चरण 1.6 और 1.7 दोहराएं जब तक कि आईजे लगभग 3-5 दिनों में कीट शवों से उभरना बंद न कर दें।

2. एक्सेनिक नेमाटोड संक्रामक किशोरों का उत्पादन

नोट: एक्सेनिक नेमाटोड का उपयोग किया जाता है क्योंकि नेमाटोड-बैक्टीरिया कॉम्प्लेक्स कीट के अंदर अलग होने के बाद, प्रत्येक पारस्परिक साथी एक अलग मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त करता है5. फोटोरहाब्डस टेम्परेटा के उत्परिवर्ती तनाव रेट 16 का उपयोग किया जाता है क्योंकि ये बैक्टीरिया एच बैक्टीरियोफोरा के विकास का समर्थन करते हैं लेकिन नेमाटोड आंत13,14 का उपनिवेश करने में विफल रहते हैं।

  1. Heterorhabditis bacteriophora संक्रामक किशोर
    1. एक बाँझ पिपेट टिप या स्पैटुला का उपयोग करके, एकल उपनिवेशों के लिए मैककॉन्की प्लेट और लकीर पर पी टेम्परेटा रेट 16 की एक जमे हुए संस्कृति के कई गुच्छे खुरचना करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 दिनों के लिए प्लेट सेते हैं।
    2. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक कॉलोनी के साथ एलबी शोरबा के 10 मिलीलीटर टीका और एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 28 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संस्कृति सेते हैं। केवल उन प्राथमिक चरण कॉलोनियों का उपयोग करें जो मैककॉन्की अगर पर लाल हैं। माध्यमिक चरण की कॉलोनियां मैककॉन्की अगर पर ऑफ-व्हाइट होंगी।
    3. 17,900 एक्स जी पर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा 1 एक्स पीबीएस के 900 μL के साथ रातोंरात संस्कृति के 100 μL धो लें। सतह पर तैरनेवाला डिकेंट करें। 1x पीबीएस में संस्कृति 10x पतला। ट्यूब को बर्फ पर छोड़ दें।
    4. मोम के कीड़े को 70% इथेनॉल समाधान में विसर्जित करें, कीड़ों को एक पेपर तौलिया के साथ सुखाएं, और उन्हें 50 एमएल ट्यूब में रखें।
    5. मोम कीड़े को स्थिर करने के लिए 20 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें।
    6. पेट्री डिश (10 सेमी) के ऊपर और नीचे के हिस्सों को कवर करने के लिए एक फिल्टर पेपर का उपयोग करें। इंजेक्शन के लिए आधार समर्थन के रूप में फिल्टर पेपर के साथ कवर पेट्री डिश ढक्कन का उपयोग करें। नीचे पेट्री डिश के फिल्टर पेपर को गीला करें और इंजेक्शन मोम के कीड़े को ठीक करने में मदद करने के लिए बर्फ पर स्थानांतरित करें।
    7. पैराफिल्म के एक टुकड़े पर बर्फ-ठंडे बैक्टीरिया के पिपेट 50 μL और 22 जी सुई सिरिंज तैयार करते हैं। सुई की नोक पर हवा को हटाने के लिए प्लंजर को धीरे से दबाएं।
    8. स्टीरियोस्कोप (चित्रा 2) के तहत पीछे के छोर के करीब एक मोम कीड़ा रखें।
    9. वक्ष के पृष्ठीय पक्ष में जीवाणु संस्कृति के 50 μL इंजेक्ट करें, अधिमानतः दो खंडों के बीच जंक्शन पर। आंतरिक क्षति को कम करने के लिए, छल्ली के ठीक नीचे इंजेक्ट करें, जितना संभव हो सके मोम कीड़े के समानांतर। मोम कीड़ा छेदने पर हेमोलिम्फ की एक बूंद का खून बहना स्वाभाविक है
    10. वसूली पेट्री डिश के लिए इंजेक्शन कीड़े स्थानांतरण।
    11. चरण 2.1.7-2.1.9 दोहराएं जब तक कि सभी कीड़े बैक्टीरिया के साथ इंजेक्ट न हो जाएं। कीड़ों को संवेदनाहारी करने के लिए, उन्हें 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    12. पेट्री डिश को अंधेरे में रखें (जैसे, दराज या कैबिनेट) और सूखा दिखाई देने पर फिल्टर पेपर में नल का पानी जोड़ें। वैक्सवॉर्म इंजेक्शन के 2 दिन बाद दम तोड़ देंगे, और लगभग 3-4 दिनों के बाद ईंट लाल दिखाई देंगे। यदि कीड़े भूरे रंग के दिखाई देते हैं, तो जीवाणु संक्रमण असफल रहा है।
    13. संक्रमण के 7 दिनों के बाद, एक ताजा फिल्टर पेपर-पंक्तिबद्ध पेट्री डिश पर विशेषता ईंट लाल रंग के साथ कीड़ों को स्थानांतरित करें, और चरण 1 से "सहजीवी सूत्रकृमि संक्रामक किशोरों का उत्पादन" जारी रखें। यदि सहजीवी सूत्रकृमि का उपयोग कर रहे हैं, तो चरण 2.1 से प्रक्रिया को दोहराएं। पहले दौर से नए उत्पादित आईजे का उपयोग करना।
    14. सतह-स्टरलाइज़िंग एच बैक्टीरियोफोरा आईजे
      1. 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 100 μL गोली बनाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पर्याप्त सहजीवी एच बैक्टीरियोफोरा और उम्मीदवार एक्सेनिक आईजे एकत्र करें।
      2. प्रत्येक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में गोली के लिए 5% ब्लीच के 500 μL जोड़ें और पलटें। 10 मिनट के लिए सेते हैं। 1 मिनट के लिए 17,900 x g पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      3. बाँझ पानी के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो लें और सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं। सतह पर तैरनेवाला निकालें। इस चरण को चार बार दोहराएं।
    15. अक्षेनिकता की जाँच कर रहा है
      1. धोया सहजीवी और उम्मीदवार-अक्षीय एच बैक्टीरियोफोरा नेमाटोड के लिए बाँझ पानी के पिपेट 400 μL।
      2. पेट्री डिश में कीड़ों पर नेमाटोड रखें और तदनुसार उपचार को लेबल करें।
      3. पेट्री डिश को संक्रमित कीड़ों के साथ अंधेरे में रखें और समय-समय पर जांचें कि मोम के कीड़े लाल हो जाते हैं या नहीं।
        नोट: एच बैक्टीरियोफोरा सहजीवी सूत्रकृमि से संक्रमित वैक्सवर्म संक्रमण के 2 दिनों के भीतर लाल हो जाएंगे। वैक्सवॉर्म मलिनकिरण संक्रमण प्रक्रिया के दौरान पारस्परिक फोटोराब्डस बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित विभिन्न यौगिकों के स्राव के कारण होता है। संक्रमण के 4 दिन बाद संक्रमित मोम के कीड़े में लाल रंग की कमी इस बात की पुष्टि करती है कि एच। ऐसा इसलिए है क्योंकि पी टेम्परेटा रेट 16 बैक्टीरिया नेमाटोड आंत में मौजूद नहीं हैं।
    16. अक्षेनेसिटी को सत्यापित करने के लिए वैकल्पिक विधि
      1. बैक्टीरियोफोरा आईजे और उम्मीदवार-अक्षीय एच बैक्टीरियोफोरा आईजे चरण 2.1.14 में वर्णित के रूप में।
      2. बाँझ मूसल का उपयोग करके माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में बाँझ 1 एक्स पीबीएस के 500 μL में लगभग 500 आईजे को होमोजेनाइज़ करें। होमोजेनेट को नीचे स्पिन करें, सतह पर तैरनेवाला को डिकेंट करें, और इसे एलबी अगर पर फैलाएं। 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों सेते हैं।
      3. प्रत्येक प्लेट के लिए कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएफयू) की गणना करें। बैक्टीरियोफोरा के नमूने सहजीवी पी ल्यूमिनेसेंस बैक्टीरिया की कोई कॉलोनियां नहीं बनाएंगे ।
  2. Steinernema carpocapsae संक्रामक किशोर
    1. लिपिड अगर प्लेटों की तैयारी (300 एमएल समाधान लगभग 20 विभाजित प्लेटें बनाता है)
      1. 2.4 ग्राम पोषक तत्व शोरबा, 4.5 ग्राम खमीर निकालने, और 1.5 ग्राम अगर वजन करें और उन्हें 267 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी में जोड़ें। समाधान को आटोक्लेव करें।
      2. 1 एम एमजीसीएल2 के 3 एमएल, मकई के तेल के 1.2 एमएल और 7% मकई सिरप के 28.8 एमएल जोड़ें।
      3. एमएल कनामाइसिन के 300 μL और 50 मिलीग्राम / एमएल एम्पीसिलीन के 300 μL (0.2 μm फिल्टर के साथ निष्फल) के समाधान में जोड़ें और जोड़ें।
      4. एक विभाजित पेट्री डिश/स्प्लिट प्लेट के आधे हिस्से पर मिश्रण को डिकेंट करें।
    2. एक्स नेमाटोफिला (तनाव ΔrpoS) जीवाणु लॉन की तैयारी
      1. संस्कृति एक्स नेमाटोफिला (एक्सएन) ΔrpoS सीधे एक जमे हुए जीवाणु स्टॉकिन से एलबी /
      2. एमएल कनामाइसिन और 50 μg / एमएल एम्पीसिलिन युक्त एलबी माध्यम के 5 एमएल को रातोंरात संस्कृति के 250 μL के साथ टीका लगाएं और एक प्रकार के बरतन पर रात भर बैक्टीरिया को विकसित करें।
        नोट: जमे हुए स्टॉक से चयन लिपिड अगर मीडिया पर सीधे लकीर होने पर एक्सएन बैक्टीरिया अच्छी तरह से नहीं बढ़ते हैं। यदि आवश्यक हो, तो प्राथमिक और माध्यमिक चरण एक्सएन को सबसे पहले एनबीटीए मीडिया (पोषक तत्व अगर 25 मिलीग्राम ब्रोमोथाइमोल ब्लू एल −1 और 40 मिलीग्राम ट्राइफेनिल्टेट्राज़ोलियम क्लोराइड एल −1 के साथ पूरक) पर पुष्टि की जा सकती है।
      3. लिपिड अगर प्लेटों पर संस्कृति के पिपेट 100 μL और एक बाँझ टीका पाश के साथ पूरी प्लेट पर फैल गया। 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेटों सेते हैं।
    3. सतह-स्टरलाइज़िंग एस कार्पोकैप्से आईजे
      1. एक कोण पर आईजे युक्त एक फ्लास्क छोड़ दें जैसे कि आईजे फ्लास्क के एक कोने में डूब जाएं। एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में बसे आईजे के 1 एमएल की आकांक्षा करें। 10 एस के लिए 17,900 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      2. 1% ताजा तैयार ब्लीच समाधान के 1 एमएल जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूबों को पलटें। 1 मिनट के लिए सेते हैं (लंबे समय तक ब्लीच इनक्यूबेशन आईजे मौत के लिए नेतृत्व करेंगे)। 10 एस के लिए फिर से स्पिन सतह पर तैरनेवाला निकालें।
      3. ब्लीच अवशेषों को हटाने के लिए, नेमाटोड को 1 एमएल बाँझ आसुत जल और 10 एस के लिए अपकेंद्रित्र के साथ धो लें। इसे चार बार दोहराएं।
      4. स्टीरियोस्कोप के तहत धोए गए आईजे के 10-20 μL की गिनती करके प्रति एमएल आईजे गिनती का अनुमान लगाएं और तदनुसार आईजे की एकाग्रता को समायोजित करें।
    4. पालन एस. कार्पोकैप्से आईजे
      1. लिपिड अगर विभाजन प्लेटों (चित्रा 3, बाईं छवि) पर 1000 आईजे के आसपास एक विंदुक के साथ स्थानांतरण। प्लेटों को एक आर्द्र कैबिनेट या दराज में रखें। नमी बढ़ाने के लिए नम पेपर तौलिए का इस्तेमाल करें। कमरे के तापमान (22-25 डिग्री सेल्सियस) पर प्लेटों को बनाए रखें।
      2. यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे नम रहें, हर दूसरे दिन पेपर तौलिए की जांच करें। यदि आवश्यक हो, तो कैबिनेट या दराज में आर्द्रता बनाए रखने के लिए पेपर तौलिए में हर दूसरे दिन पानी जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, आर्द्रता बढ़ाने के लिए कैबिनेट के नीचे पानी का स्नान रखें।
      3. जब आईजे केवल दिखाई देते हैं, तो प्लेट के दूसरी तरफ पानी जोड़ें, और प्लेट के बीच में फिल्टर पेपर की एक परत रखें (पानी का जाल, चित्रा 3, सही तस्वीर)। एक टी 75 सेल संस्कृति फ्लास्क में पहले दौर के आईजे युक्त इस पानी को इकट्ठा करें। ये राउंड आई एस कार्पोकैप्से नेमाटोड हैं।
      4. ब्लीच (चरण 2.2.3) के साथ सतह-निष्फल फिर से और राउंड 1 एस कार्पोकैप्से नेमाटोड का उपयोग करके चरण 2.2 से प्रक्रिया को दोहराएं। परिणाम राउंड 2 एस कार्पोकैप्से नेमाटोड होगा।
      5. नेमाटोड के विकास को ट्रैक करने के लिए हर कुछ दिनों में एक स्टीरियोस्कोप के तहत जांचें।
    5. एस कार्पोकैप्से आईजे की अक्षीय स्थिति को सत्यापित करना
      1. चरण 2.2.3 में वर्णित ब्लीच के साथ राउंड 1, राउंड 2 और सहजीवी एस कार्पोकैप्से आईजे को सतह-निष्फल करें।
      2. बाँझ प्लास्टिक मूसल का उपयोग करके माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में लगभग 400-700 आईजे को होमोजेनाइज करें। होमोजेनेट अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला डिकेंट करें, और एलबी अगर प्लेटों पर समाधान फैलाएं। 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक इनक्यूबेटर में अगर प्लेटों रखें।
      3. प्रत्येक प्लेट के लिए सीएफयू के गठन की गणना करें। एक्सेनिक नेमाटोड के नमूने किसी भी जीवाणु वृद्धि का उत्पादन नहीं करेंगे।
    6. पीसीआर द्वारा एस कार्पोकैप्से आईजे की अक्षीय स्थिति को सत्यापित करना
      1. चरण 2.2.3 में वर्णित ब्लीच के साथ राउंड 1, राउंड 2 और सहजीवी एस कार्पोकैप्से आईजे को सतह-निष्फल करें।
      2. होमोजेनेट से डीएनए निकालें। एक विस्तृत निष्कर्षण प्रक्रिया नीचे धारा 4.1.2 में वर्णित है।
      3. एनीलिंग तापमान 61 डिग्री सेल्सियस के साथ एक्सपीटीए 2 प्राइमरों का उपयोग करके पीसीआर का संचालन करें:
        एक्सपीटीए एफ: 5'-जीसीसीटीजीजीएजीजीजीए -3 '।
        एक्सपीटीए आर: 5'-जीटीएजीएसीसीजीसीएसीटीसी -3'।
        नोट: ये प्राइमर एक्स नेमाटोफिला के कीटनाशक जीन एक्सपीटीए 2 को बढ़ाते हैं, जो 231 बीपी आकार के एम्पलीकॉन का उत्पादन करते हैं। साइकिल चालन कार्यक्रम इस प्रकार था: 2 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 34 चक्र, 1 मिनट के लिए 61 डिग्री सेल्सियस का एनीलिंग तापमान और 1 मिनट के लिए 73 डिग्री सेल्सियस के बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      4. एक 1.5% अगारोज जेल में जुदाई द्वारा प्रवर्धित टुकड़े कल्पना करें। एक्सेनिक सतह-निष्फल नमूने कोई बैंड नहीं बनाएंगे।

3. माइक्रोइंजेक्शन के लिए एच बैक्टीरियोफोरा हेर्मैफ्रोडाइट्स को बढ़ाना

  1. एनए + चोल (1.5x पोषक तत्व शोरबा, 1.5% अगर, और 10 μg / एमएल कोलेस्ट्रॉल) के साथ 6 सेमी पेट्री डिश प्लेटें तैयार करें।
  2. 10 एमएल संस्कृति ट्यूब में पीपी 3 समाधान (2% प्रोटीज पेप्टोन # 3, पीपी 3) के 3 एमएल तैयार करें।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा पी ल्यूमिनेसेंस ग्लिसरॉल स्टॉक (25% वॉल्यूम / वॉल्यूम बाँझ ग्लिसरॉल) के शीर्ष को खुरचने के लिए एक बाँझ 20 μL टिप का उपयोग करें और इसे संस्कृति ट्यूब में छोड़ दें।
  4. 28 डिग्री सेल्सियस, 200 आरपीएम पर सेट तापमान नियंत्रित शेकर में रात भर ट्यूब सेते हैं।
  5. अगले दिन, संस्कृति हल्के लाल रंग की होगी। एक 6 सेमी एनए + चोल पेट्री डिश पर संस्कृति की प्लेट 50 μL और एक परिपत्र तरीके से एक जीवाणु स्प्रेडर का उपयोग करके इसे फैलाएं।
  6. प्लेटों को 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। पी ल्यूमिनेसेंस लॉन 24-36 घंटे में तैयार हो जाएगा और रंग में हल्का लाल दिखाई देगा।
  7. 50-100 सतह निष्फल आईजे के साथ प्लेट को टीका लगाएं और प्लेट को 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  8. स्वस्थ एल 4 हेर्मैप्रोडाइट टीकाकरण के लगभग 48-54 घंटे बाद दिखाई देना शुरू कर देगा। इंजेक्शन के लिए स्वस्थ, गैर-भूखे देर से एल 4 एच बैक्टीरियोफोरा हेर्मैफ्रोडाइट्स की आवश्यकता होती है।

4. डीएसआरएनए की तैयारी

  1. प्राइमर डिजाइन
    1. एच बैक्टीरियोफोरा डीएनए के ~ 500 बेस पेयर एक्सॉन क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए डीएसआरएनए के लिए डिज़ाइन प्राइमर।
      1. ब्याज के क्षेत्रों के लिए प्राइमरों को प्राइमर 3 (https://primer3.ut.ee) या इसी तरह के कार्यक्रम का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है, 500 बेस जोड़े की इष्टतम उत्पाद लंबाई, 60 डिग्री सेल्सियस के टीएम और 22 न्यूक्लियोटाइड की प्राइमर लंबाई का चयन करना।
      2. इन विट्रो प्रतिलेखन की अनुमति देने के लिए प्रत्येक फॉरवर्ड प्राइमर के 5 'सिरों पर एक टी 7 साइट (टीएटीएसीजीएसीटीसीएटीएजीजीजी) जोड़ें।
  2. जीनोमिक डीएनए अलगाव
    1. डीएसआरएनए संश्लेषण के लिए ~ 50,000 एच बैक्टीरियोफोरा आईजे के जमे हुए छर्रों से पृथक जीनोमिक डीएनए का उपयोग करें।
    2. वी) जिलेटिन, 10 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.2, 0.45% ट्वीन 20, 60 μg / एमएल प्रोटीनेज के, 2.5 एमएम एमजीसीएल2) के 50 μL में कम से कम 30 मिनट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया आईजे गोली का उपयोग करें।
    3. एक छोटे ट्यूब मूसल के साथ गोली को समरूप करें।
    4. कमरे के तापमान के समाधान को गर्म करें और 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, हर 15 मिनट भंवर।
    5. 95 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए होमोजेनाइज्ड ऊतक सेते हुए प्रोटीनेज के को विकृत करें।
    6. 1 मिनट के लिए 3,400 एक्स जी पर 4 डिग्री सेल्सियस और अपकेंद्रित्र के लिए नमूना ठंडा।
    7. बाद के पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में परिणामी सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।
    8. टेम्पलेट डीएनए के 200 एनजी, आगे और रिवर्स प्राइमर के 0.2 μM, और निर्माता की सुझाई गई साइकिल चलाने की स्थिति के साथ एक वाणिज्यिक मास्टरमिक्स का उपयोग करके 50 μL पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित करें।
    9. यह सत्यापित करने के लिए कि प्रतिक्रियाओं ने अनुमानित आकार के एकल बैंड का उत्पादन किया है, यह सत्यापित करने के लिए 1.2% एगरोज़ जेल पर पीसीआर प्रतिक्रिया का विश्लेषण करें।
  3. डीएसआरएनए संश्लेषण
    1. एक वाणिज्यिक प्रतिलेखन किट का उपयोग करें।
    2. इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए एक 5 μL पीसीआर प्रतिक्रिया का प्रयोग करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं।
    4. डीएसआरएनए को केंद्रित करने के लिए अमोनियम एसीटेट /इथेनॉल वर्षा का उपयोग करके एक वाणिज्यिक किट के साथ इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं को साफ करें।
    5. आरएनएएसई मुक्त पानी के 10 μL में गोली डीएसआरएनए को निलंबित करें।
    6. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    7. 1.2% एगरोज़ जेल पर डीएसआरएनए को अलग करके गुणवत्ता का आकलन करें

5. माइक्रोइंजेक्शन

नोट: एक इंजेक्शन पैड केंद्र पर 2% (डब्ल्यू / वी) एगरोज़ की एक परत के साथ एक ग्लास कवरस्लिप है। जब इंजेक्शन लगाए जाने वाले कीड़े इन पैड में स्थानांतरित हो जाते हैं, तो एगरोज़ परत उन्हें प्रक्रिया के लिए स्थिर कर देगी। आम तौर पर, अतिरिक्त पैड सामान्य उपयोग के लिए माइक्रोस्कोप के पास रखे जाते हैं।

  1. इंजेक्शन पैड तैयार करना
    1. 10 मिलीलीटर पानी में 0.2 ग्राम एगरोज डालकर पानी में 2% एगरोज उबालें।
    2. 50 मिमी x 70 मिमी पतली ग्लास कवरस्लिप के केंद्र पर 1-4 बूंदें (~ 50 μL) रखें।
    3. ड्रॉप को समतल करने के लिए एक और कवरस्लिप का उपयोग करें।
    4. कवरस्लिप को बग़ल में फिसलने से पहले 2-3 मिनट के लिए सूखने दें।
    5. ऊपर की ओर कवरस्लिप के दाईं ओर 'आर' के साथ चिह्नित करें।
    6. स्लाइड्स को उपयोग करने से पहले 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें।
  2. इंजेक्शन सुइयों की तैयारी
    1. आंतरिक ठीक फिलामेंट युक्त 1.0 मिमी ग्लास केशिकाओं का उपयोग करें। यह सुई के कुशल भरने की अनुमति देता है।
      नोट: किसी भी वाणिज्यिक सुई खींचने वाला (जैसे, नरीशिगे पीबी -7) का उपयोग किया जा सकता है।
    2. सुई खींचने वाले को चालू करें।
    3. सुनिश्चित करें कि हीटर अधिकतम पर सेट है और आवश्यक सुई तीक्ष्णता और उचित लंबाई सुनिश्चित करने के लिए सोलनॉइड 8.40 पर सेट है।
    4. फिलामेंट के माध्यम से शीर्ष घुंडी रिज में केशिका ट्यूब डालें और शीर्ष घुंडी को कस लें। केशिका ट्यूब का शीर्ष सुई खींचने वाले के शीर्ष के साथ स्तर होगा और हीटिंग फिलामेंट केशिका के बीच में होगा।
    5. नीचे की इकाई को ऊपर ले जाएं और फिर नीचे की घुंडी को कस लें। सुनिश्चित करें कि केशिका सुरक्षित रूप से रखी गई है।
    6. सुई खींचने वाले के कवर को बंद करें और स्टार्ट दबाएं। हरी बत्ती चालू हो जाएगी। कुछ मिनटों के बाद केशिका को गर्म किया जाएगा और दो हिस्सों में अलग करने के लिए अलग किया जाएगा।
      नोट: दो अलग सुइयों एक ही लंबाई के नहीं हैं, लेकिन वे दोनों इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। लंबे सुई बिंदुओं को प्राथमिकता दी जाती है।
    7. मॉडलिंग मिट्टी के एक टुकड़े का उपयोग करके नीचे की ओर अपने बिंदुओं के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में सुइयों को व्यवस्थित करें। वैकल्पिक रूप से, मॉडलिंग मिट्टी के दो स्ट्रिप्स द्वारा आयोजित पेट्री डिश में सुइयों को स्टोर करें।
  3. सुई लोड हो रही है
    नोट: न्यूक्लिक एसिड समाधान निलंबन में मौजूद हो सकता है कि गोली अशुद्धियों के लिए 20,784 x g पर कम से कम 10 मिनट के लिए केन्द्रापसारक किया जाना चाहिए। अशुद्धियों का सेंट्रीफ्यूजेशन उन्हें इंजेक्शन सुई के प्रवाह को अवरुद्ध करने से रोकता है।
    1. सुइयों में न्यूक्लिक एसिड लोड करने के लिए दो तरीकों में से किसी एक का उपयोग करें।
    2. विधि 1
      1. इंजेक्शन सुई के अनियंत्रित अंत करने के लिए केन्द्रापसारक डीएनए नमूना के लगभग 0.5 μL हस्तांतरण करने के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें। यह केशिका ट्यूब के शीर्ष पर बैठे तरल की एक छोटी बूंद के रूप में दिखाई देगा।
      2. तरल नमूना सुई के अंत पर कब्जा करने की अनुमति देने के लिए 5 से 7 मिनट के लिए खड़े हो जाओ। अंतिम उत्पाद एक भरी हुई सुई होगी जिसमें कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं होंगे।
      3. इंजेक्शन से पहले सुई टिप में समाधान की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    3. विधि 2
      1. माइक्रोइंजेक्टर के लिए लोडिंग टिप्स का उपयोग करें।
      2. इस लोडिंग टिप का उपयोग करके, न्यूक्लिक एसिड समाधान के पिपेट 5 μL।
      3. जबकि खींची गई सुई सुई खींचने वाले पर होती है, शीर्ष घुंडी को ढीला करें, ऊपरी खींची गई सुई को थोड़ा ऊपर की ओर ले जाएं, और घुंडी को फिर से दबाएं।
      4. ध्यान से केशिका ट्यूब में लोडर की नोक डालें और इसे इंजेक्शन सुई के नीचे तक बढ़ाएं।
      5. इंजेक्शन सुई में न्यूक्लिक एसिड समाधान पिपेट।
      6. खींची गई सुई से लोडर निकालें और यदि आवश्यक हो तो इसे आगे लोड करने के लिए अलग रखें। एक अलग न्यूक्लिक एसिड मिश्रण लोड करते समय लोडर को स्विच करना सुनिश्चित करें।
  4. इंजेक्शन माइक्रोस्कोप तैयार करना
    नोट: माइक्रोस्कोप बेस से विसरित रोशनी के साथ एक उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कृमि तैयारी, माइक्रोइंजेक्शन और रिकवरी के लिए किया जाता है। 10x और 40x उद्देश्यों के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन उलटा माइक्रोस्कोप के उपयोग का वर्णन किया गया है। माइक्रोस्कोप को एक सुई मैनिपुलेटर के साथ लगाया जाता है जो सुई को रखता है और इसे इंजेक्शन के लिए स्थिति में लाता है। इंजेक्शन पैड की अगारोज परत पर रहते हुए कीड़े को तेजी से निर्जलीकरण से रोकने के लिए माइक्रोइंजेक्शन तेल का उपयोग किया जाता है। उपयोग करने के लिए सुझाया गया तेल हेलोकार्बन ऑयल 700 है।
    1. दीपक पर स्विच करें और नियंत्रण कक्ष के साथ चमक को कैलिब्रेट करें।
    2. कंडेनसर वोलास्टन प्रिज्म पर संख्या की जाँच करें; यह प्रयुक्त उद्देश्य (40x) के अनुरूप होगा।
    3. पुष्टि करें कि "डीआईसी" द्वारा चिह्नित डीआईसी बुर्ज सही स्थिति में है।
    4. सुनिश्चित करें कि उद्देश्य पर घुंडी शून्य (0) पर सेट है।
    5. अंत तक दाईं ओर पीएच रिंग को चालू करें।
    6. पोलराइज़र को इस तरह से समायोजित करें कि तीर क्षैतिज स्थिति में हो।
    7. फोकल पॉइंट (प्रकाश) का निरीक्षण करने के लिए मंच पर कागज का एक टुकड़ा रखें।
    8. फ़ील्ड डायाफ्राम को इस बिंदु पर बंद करें कि कागज पर एक जगह है।
    9. कंडेनसर को ऊपर और नीचे ले जाने के लिए बाईं ओर डायल का उपयोग करें कि टुकड़ा कागज पर एक बहुत तेज प्रकाश स्थान देखा जाता है।
    10. फ़ील्ड डायाफ्राम को धीरे-धीरे इस बिंदु तक खोलें कि प्रकाश का एक छोटा चक्र दिखाई दे रहा है।
    11. कागज के टुकड़े को दूर ले जाएं।
    12. सुनिश्चित करें कि प्रकाश स्थान उद्देश्य के केंद्र में है। अन्यथा, कंडेनसर के शीर्ष पर चांदी के शिकंजा को समायोजित करके उद्देश्य के केंद्र के साथ प्रकाश स्थान को लाइन करें।
    13. क्षेत्र डायाफ्राम को पूरी तरह से खोलें।
    14. जांचें कि विश्लेषक आईसीटी / पी दबाया जाता है।
  5. माइक्रोस्कोप पर इंजेक्शन सुई बढ़ते
    1. माइक्रोइंजेक्शन सुई के लिए नाइट्रोजन गैस प्रवाह चालू करें। सुई के लिए गैस का दबाव लगभग 20 साई होगा।
    2. माइक्रोमैनिपुलेटर घुंडी (माइक्रोस्कोप का हिस्सा जो सुई को स्थानांतरित करता है) की जांच करें, केंद्र में तैनात हैं, जो सुई घुड़सवार होने पर गति की विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देता है।
    3. सुई धारक से इसे हटाने के लिए धातु की छड़ रखने वाली असेंबली को अनस्क्रू करें।
    4. माइक्रोस्कोप के शीर्ष भाग में नई सुई डालें; फिर सुई को स्थिति में रखने के लिए रबर गैस्केट स्थापित करें।
    5. सुई धारक के निचले हिस्से को असेंबली में फिट करके सुरक्षित करें।
    6. सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर पर नाली में रखें और इसे स्थिर रखने के लिए इसे ठीक से पेंच करें। सुनिश्चित करें कि स्क्रू माइक्रोमैनिपुलेटर के अंत से लगभग 1 इंच है।
    7. माइक्रोमैनिपुलेटर से घुंडी और मोटे नियंत्रण का उपयोग करके, स्टेज प्लेट के संबंध में लगभग 45 ° कोण पर दृश्य क्षेत्र के बीच में सुई की नोक रखें। सुई टिप को काफी ऊंचा छोड़ना महत्वपूर्ण है ताकि यह दुर्घटना से टूट न जाए।
  6. सुइयों को तोड़ना
    1. सुई को माइक्रोमैनिपुलेटर में रखें जहां सुई की नोक सामान्य रूप से न्यूक्लिक एसिड समाधान को इसके माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए टूट जाएगी।
    2. एक केशिका को तोड़ें और इसे माइक्रोइंजेक्शन तेल की एक बूंद ले जाने वाली ग्लास स्लाइड के ऊपर रखें।
    3. माइक्रोस्कोप और फोकस पर स्लाइड रखें।
    4. माइक्रोस्कोप (चित्रा 4) के ठीक नियंत्रण का उपयोग कर केशिका की तरफ के रूप में एक ही स्तर पर सुई की नोक लाओ।
    5. सुई की नोक नहीं टूटी है की पुष्टि करने के लिए पैर एक्ट्यूएटर का उपयोग करके संक्षेप में नाइट्रोजन प्रवाह चालू करें। एक त्वरित ऑन-ऑफ पर्याप्त होगा।
    6. सुई को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें ताकि यह मुश्किल से केशिका की तरफ छू सके।
    7. सुई टिप को तोड़ने के लिए माइक्रोस्कोप के किनारे को हल्के ढंग से टैप करें।
    8. केशिका से सुई निकालें और यह जांचने के लिए नाइट्रोजन प्रवाह चालू करें कि सुई ठीक से टूट गई है।
    9. सुई सुई (चित्रा 4) की नोक से लगभग पांच गुना बड़ा एक छोटा इंजेक्शन ड्रॉप बनाएगा। यदि इंजेक्शन ड्रॉप छोटे आकार का है, तो टिप को आगे तोड़ दें। यदि इंजेक्शन की बूंद बड़े आकार की है, तो एक ताजा सुई का उपयोग करने का प्रयास करें।

6. माइक्रोइंजेक्शन

  1. पिपेट एक इंजेक्शन पैड पर माइक्रोइंजेक्शन तेल की एक बूंद।
  2. माइक्रोइंजेक्शन ऑयल ड्रॉप में एक लौ-निष्फल पिक डुबोएं और एक युवा एच इकट्ठा करें। प्लेट से बैक्टीरियोफोरा वयस्क सूत्रकृमि।
  3. इंजेक्शन पैड में बैक्टीरिया कोशिकाओं की उच्च संख्या के हस्तांतरण को रोकने के लिए बैक्टीरिया लॉन के करीब नहीं हैं जो प्लेट के कुछ हिस्सों से नेमाटोड चुनें। इसके अलावा, अच्छी तरह से गठित गोनाड के साथ एक सूत्रकृमि की कटाई करें।
  4. नेमाटोड को इंजेक्शन पैड पर ले जाएं और उन्हें लंबवत स्थिति दें ताकि गोनाड सुई का सामना करें। सुनिश्चित करें कि वल्वा इंजेक्शन सुई के समान दिशा को इंगित करता है, और दो डिस्टल गोनाड हथियार विपरीत दिशा में और सूत्रकृमि शरीर की दीवार के खिलाफ हैं।
    नोट: प्रिस्टियनकस पैसिफिकस की तरह, एच बैक्टीरियोफोरा का गोनाड उदर वल्वल स्थिति से पृष्ठीय रूप से पलायन करता है और फिर उदर स्थिति में वापस चला जाता है।
  5. जांचें कि नेमाटोड को घूमने की अनुमति दिए बिना नेमाटोड निर्जलीकरण को रोकने के लिए तेल की मात्रा पर्याप्त है।
  6. स्लाइड के ऊपर अच्छी तरह से सुई पकड़कर 10x उद्देश्य के साथ नेमाटोड को फोकस में लाएं। तेल में, नेमाटोड गोनाड को कृमि के पूर्वकाल और पीछे के करीब दो स्पष्ट क्षेत्रों के रूप में देखा जाता है। सुनिश्चित करें कि गोनाड फोकस में हैं और कीड़े के अन्य हिस्सों में नहीं।
  7. इंजेक्शन सुई की ओर 15 ° से 45 ° के कोण पर नेमाटोड को व्यवस्थित करें, जो गोनाड के अंदर सुई को अधिक स्थान देगा। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण सुई को पूरे सूत्रकृमि शरीर से गुजरने से रोकता है जब सुई को गोनाड के अंदर पेश किया जाता है।
  8. इंजेक्शन सुई और सूत्रकृमि को धीरे-धीरे सुई को कम करके एक ही स्तर पर रखें जब तक कि इसे ध्यान में नहीं लाया जाता (चित्रा 5)। सुनिश्चित करें कि जैसे ही सुई को कम किया जाता है, यह नेमाटोड के बगल में रहता है और कीड़े के ऊपर नहीं।
  9. सूत्रकृमि के सिंकिटियल गोनाड हाथ पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 40x उद्देश्य का उपयोग करें।
  10. ठीक समायोजक का उपयोग करके सुई को ऊपर और नीचे ले जाएं जब तक कि टिप नेमाटोड सिंसाइटियल गोनाड बांह के साथ फोकस में न हो।
  11. स्लाइडिंग चरण का उपयोग करके सुई की ओर धीरे-धीरे नेमाटोड ले जाएं। फिर धीरे-धीरे नेमाटोड शरीर की दीवार के खिलाफ सुई के साथ स्थिति में गोनाड को धक्का दें, जिसके परिणामस्वरूप नेमाटोड शरीर के अंदर कुशल सुई प्रवेश होगा।
  12. न्यूक्लिक एसिड समाधान के प्रवाह को शुरू करने के लिए पैर एक्ट्यूएटर पर संक्षेप में कदम उठाएं। एक त्वरित ऑन-ऑफ पर्याप्त है। यदि सुई गोनाड के अंदर है, तो गोनाड समाधान से भर जाएगा और सूज जाएगा।
  13. एक बार सुई सही स्थिति में सुनिश्चित हो जाने के बाद, गोनाड को न्यूक्लिक एसिड समाधान से भरें जब तक कि गोनाड की बाहें भर न जाएं। छेद के माध्यम से कीड़े से तरल के निष्कासन से बचना महत्वपूर्ण है जहां सुई ने इसे पंचर किया था।
  14. स्लाइडिंग चरण का उपयोग करके, सावधानी से कीड़े को सुई से दूर ले जाएं।
  15. सुई को उठाएं और इसे वामावर्त घुमाएं।
  16. इसे फ्लोट करने के लिए कीड़े के शीर्ष पर 1x पीबीएस बफर की एक बूंद रखें।
  17. कीड़े को उठाने के लिए लौ-निष्फल पिक का उपयोग करें और अतिरिक्त तेल के कीड़े से छुटकारा पाने के लिए इसे ताजा पी ल्यूमिनेसेंस वरीयता प्राप्त प्लेट पर एम 9 की एक और बूंद में रखें।
  18. एम 9 से नेमाटोड निकालें और इसे बैक्टीरिया लॉन के दूर की ओर रखें।
  19. कई इंजेक्शन नेमाटोड को स्थानांतरित करने के लिए एक ही प्लेट का उपयोग करें।
  20. 2-3 दिनों में, ट्रांसजेनिक फेनोटाइप के लिए पहली पीढ़ी (एफ 1) नेमाटोड का मूल्यांकन करें। ट्रांसजेनिक एफ 1 नेमाटोड को अलग-अलग प्लेटों पर अलग करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन से कीड़े स्थिर ट्रांसजेनिक लाइनें उत्पन्न करेंगे।

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Representative Results

बैक्टीरियोफोरा नेमाटोड की स्थिति का आकलन करने के लिए जो एक्सेनाइजेशन के माध्यम से चले गए हैं, आईजे में पी ल्यूमिनेसेंस बैक्टीरियल कॉलोनियों की उपस्थिति या अनुपस्थिति निर्धारित की गई थी। ऐसा करने के लिए, लगभग 500 आईजे की एक गोली जो पहले सतह को निष्फल और पीबीएस में होमोजेनाइज्ड किया गया था, एकत्र किया गया था। सकारात्मक नियंत्रण उपचार में सहजीवी पी ल्यूमिनेसेंस बैक्टीरिया युक्त सूत्रकृमि संस्कृति से लगभग 500 आईजे की गोली शामिल थी। एक्सेनाइज्ड और सकारात्मक नियंत्रण नेमाटोड के छर्रों को 1x पीबीएस में होमोजेनाइज किया गया था। होमोजेनेट्स को अगर पर पाइप किया गया था और व्यक्तिगत उपनिवेशों के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए फैलाया गया था। अगर प्लेटों को 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। अगले दिन, पी ल्यूमिनेसेंस कॉलोनियों (सीएफयू) की घटना देखी गई। जैसा कि अपेक्षित था, स्टॉक संस्कृति से एच बैक्टीरियोफोरा ने सहजीवी पी। हालांकि, उनके संबद्ध पी ल्यूमिनेसेंस बैक्टीरिया से रहित नेमाटोड एक्सेनिक थे और भविष्य के प्रयोग (चित्रा 6) के लिए अलग से संग्रहीत किए गए थे।

माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया का उपयोग करके आरएनएआई की प्रभावकारिता दिखाने के लिए नोल -5 जीन अभिव्यक्ति के नॉकडाउन का उपयोग एक उदाहरण के रूप में किया गया था। माता-पिता की पीढ़ी में माइक्रोइंजेक्शन किया गया था और प्रभाव एफ 1 संतान में देखा गया था। आरएनएआई माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके नॉल -5 के नॉकडाउन के परिणामस्वरूप संतान के 60% (चित्रा 7) के गोनाड में जर्मलाइन की अनुपस्थिति हुई।

Figure 1
चित्रा 1: संक्रामक किशोरों की पीढ़ी (एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड का मुक्त रहने का चरण). (ए) नेमाटोड संक्रामक किशोरों (टिशू कल्चर फ्लास्क में रखे गए) के साथ गैलेरिया मेलोनेला कीट लार्वा (पेट्री डिश में रखा गया) का संक्रमण। (ख) जल जाल तैयार करने के लिए फिल्टर पेपर के टुकड़े को तह करना। (ग) संक्रामक किशोरों (सूत्रकृमि संक्रमण के 12 दिन बाद) युक्त मृत गैलेरिया मेलोनेला कीट लार्वा के साथ एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड के जल जाल की व्यवस्था। संक्रामक किशोरों की नई पीढ़ी मृत कीड़ों को छोड़कर पानी में चली जाएगी, जिसे बाद में टिशू कल्चर फ्लास्क में संग्रहीत किया जाता है। छवियां बायोरेंडर ग्राफिक सॉफ़्टवेयर (https://biorender.com) का उपयोग करके बनाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जीवाणु तनाव फोटोरहाब्डस टेम्परेटा रेट 16 के साथ गैलेरिया मेलोनेला कीट लार्वा का इंजेक्शन। वैक्सवॉर्म को पेट्री डिश में रखा जाता है, और उन्हें ठंडे उपचार के माध्यम से स्थिर किया जाता है (यानी, उन्हें कुछ मिनटों के लिए बर्फ पर रखा जाता है)। कीट शरीर के पीछे के हिस्से को एक सूजन सतह बनाने के लिए संदंश की एक जोड़ी के साथ दबाया जाता है जो इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है। इंजेक्शन कोण आंतरिक कीट ऊतकों को घायल करने से रोकने के लिए उथला है, जिससे लापरवाह हैंडलिंग के कारण कीट की मृत्यु हो जाएगी। छवियां बायोरेंडर ग्राफिक सॉफ़्टवेयर (https://biorender.com) का उपयोग करके बनाई जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एक्सेनिक स्टेनरनेमा कार्पोकैप्से एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड की पीढ़ी। एक विभाजित पेट्री डिश के आधे हिस्से में लिपिड अगर पर ज़ेनोरहाब्डस नेमाटोफिला ΔrpoS बैक्टीरिया और एस कार्पोकैप्से नेमाटोड के संक्रामक किशोरों का एक लॉन होता है। यह इन विट्रो विधि संक्रामक किशोरों को वयस्क सूत्रकृमि बनने के लिए प्रेरित करती है, जो बाद में अंडे का उत्पादन करेगी जो परजीवी की नई पीढ़ी को जन्म देने के लिए हैच करेगी। जब विभाजित पेट्री डिश के इस हिस्से में बड़ी संख्या में नए उत्पन्न एस कार्पोकैप्से संक्रामक किशोर दिखाई देते हैं, तो नेमाटोड के प्रवास को सुविधाजनक बनाने के लिए फिल्टर पेपर के एक टुकड़े के साथ पकवान के दूसरे आधे हिस्से में पानी जोड़ा जाता है। छवियां बायोरेंडर ग्राफिक सॉफ़्टवेयर (https://biorender.com) का उपयोग करके बनाई गई हैं कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सुई टिप को तोड़ना। सुई की नोक आमतौर पर बंद हो जाती है। वास्तविक इंजेक्शन करने से पहले न्यूक्लिक एसिड समाधान के उचित प्रवाह की जांच की जाती है। एक ग्लास स्लाइड पर, हेलोकार्बन तेल की एक बूंद रखें। सुई बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली एक केशिका ट्यूब रखें, लंबवत रूप से जैसा कि आकृति में दिखाया गया है। 40x पर ध्यान केंद्रित करने के लिए केशिका लाओ और धीरे से केशिका के साथ विमान में सुई नीचे लाने के लिए। धीरे-धीरे केशिका को सुई टिप स्पर्श करें। यह डीएसआरएनए के सुचारू प्रवाह के लिए एक उद्घाटन बनाता है। यदि कोई तरल पदार्थ बाहर नहीं आ रहा है, तो पैर एक्ट्यूएटर का उपयोग करके एक त्वरित ऑन-ऑफ नाइट्रोजन प्रवाह करें। नाइट्रोजन से दबाव और केशिका के साथ सुई टिप का संपर्क सुई को तोड़ देगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: इंजेक्शन की साइट। बैक्टीरियोफोरा का गोनाड उदर वल्वल स्थिति से पृष्ठीय रूप से पलायन करता है और फिर उदर स्थिति में वापस चला जाता है। पलायन करने वाले हथियार वल्वा के पास एक दूसरे को पार करते हैं और दोनों तरफ वल्वा से परे फैलते हैं। लगभग 48 घंटे में, आईजे से उगाए गए एक युवा वयस्क के गोनाड की फैली हुई बाहें वल्वा के पास दिखाई देती हैं। इस स्थिति में माइक्रोइंजेक्शन किया जाता है। स्केल बार: 0.1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: हेटरोरहाब्डाइटिस बैक्टीरियोफोरा एक्सेनाइजेशन का सत्यापन। बैक्टीरियोफोरा संक्रामक किशोरों में फोटोराब्डस ल्यूमिनसेंस बैक्टीरियल कोशिकाओं की अनुपस्थिति की पुष्टि करके एक्सेनाइजेशन प्रक्रिया की सफलता का अनुमान लगाया गया था। इसके लिए, स्टॉक संस्कृति (सहजीवी) या कीड़े से लगभग 500 सतह-निष्फल कीड़े की एक गोली जो एक्सेनाइजेशन प्रक्रिया (एक्सेनिक) से गुजरी थी, को समरूप किया गया था। फिर, होमोजेनेट को अगर प्लेटों पर फैलाया गया था और 24 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, बैक्टीरिया कॉलोनियों (कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों, सीएफयू) की उपस्थिति की निगरानी की गई थी। प्लेटों पर बैक्टीरियल कॉलोनियों की कमी से पता चलता है कि एच बैक्टीरियोफोरा नेमाटोड उनके पी ल्यूमिनेसेंस सहजीवी बैक्टीरिया से मुक्त हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: आरएनएआई ने नोल -5 जीन के नॉकडाउन की मध्यस्थता की। बैक्टीरियोफोरा नोल -5 जीन के परिणामस्वरूप बिना किसी जर्मलाइन के फेनोटाइप होता है। एक जंगली प्रकार की संतान, गैर-इंजेक्शन एच बैक्टीरियोफोरा नेमाटोड (ए) में इसके गोनाड्स में अंडे होते हैं। एक जंगली प्रकार की संतान, नोल -5 आरएनएआई इंजेक्शन एच बैक्टीरियोफोरा नेमाटोड (बी) में नोल -5 आरएनए के नॉकडाउन के कारण इसके खाली गोनाड्स में कोई अंडे नहीं होते हैं। स्केल बार: 0.1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड संक्रमण और कीट विरोधी सूत्रकृमि प्रतिरक्षा के आणविक आधार को समझने के लिए पारस्परिक रूप से जुड़े बैक्टीरिया13,15,16 से परजीवी के पृथक्करण की आवश्यकता होती है। एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड एच बैक्टीरियोफोरा और एस कार्पोकैप्से ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया पी ल्यूमिनेसेंस और एक्स नेमाटोफिला के साथ रहते हैं, क्रमशः17. दोनों जीवाणु प्रजातियों को पहले उन कारकों को एन्कोड करने के लिए दिखाया गया है जो कीट ऊतकों को लक्षित करके और संक्रमण18,19 के दौरान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली का मुकाबला करके रोगजनकता प्रदान करते हैं। यह उन रणनीतियों की पहचान करने के प्रयासों में बाधा डालता है जो नेमाटोड कीट मेजबान के साथ बातचीत करने के लिए विकसित हुए हैं। इसलिए, नेमाटोड घटकों के जीन नॉकडाउन के माध्यम से पहचान और कार्यात्मक लक्षण वर्णन जो संक्रमण प्रक्रिया में भी भाग लेते हैं, एक्सेनिक कीड़े की पीढ़ी द्वारा सुविधाजनक हो सकते हैं। यहां, एक्सेनिक एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड के उत्पादन और एच बैक्टीरियोफोरा में आरएनएआई जीन साइलेंसिंग करने के लिए कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं।

एक्सेनिक नेमाटोड को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए दोनों प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम एच बैक्टीरियोफोरा और एस कार्पोकैप्से आईजे14,20 की सतह-नसबंदी है। विधि के इस हिस्से में ब्लीच समाधान के साथ कीड़े का उपचार शामिल है और इसे एक्सेनाइजेशन प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है क्योंकि यह नेमाटोड छल्ली से पी ल्यूमिनेसेंस और एक्स नेमाटोफिला बैक्टीरिया को हटा देता है। यह सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है कि केवल कीड़े की सतह पर पारस्परिक बैक्टीरिया को साफ किया जाता है और परजीवी के अंदर नहीं। इस चरण के पूरा होने पर ध्यान देने की आवश्यकता है क्योंकि विस्तारित ब्लीच उपचार सूत्रकृमि अस्तित्व को प्रभावित करेगा।

पहले से स्थापित विधि के साथ एस कार्पोकैप्से नेमाटोड के लिए वर्तमान एक्सनाइजेशन प्रोटोकॉल की एक समानता एक्स नेमाटोफिला ΔrpoS उत्परिवर्ती बैक्टीरिया का उपयोग है जो कीड़े21 को उपनिवेशित करने में सक्षम नहीं हैं। वर्तमान पद्धति और पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल के बीच एक अंतर, जिसने पोषक तत्व अगर22 पर सतह निष्फल सूत्रकृमि अंडे पेश किए, माइक्रोबियल संदूषण को बाधित करने के लिए संस्कृति मीडिया में एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा है जो संभवतः नेमाटोड विकास और फिटनेस को प्रभावित करेगा।

माइक्रोइंजेक्शन द्वारा आरएनएआई ओओसाइट्स को आरएनए देने का एक आसान और विश्वसनीय तरीका है। गोनाड के अंदर तरल का फट इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान न्यूक्लिक एसिड समाधान की रिहाई की दृश्य पुष्टि प्रदान करता है। यह दिखाया गया था कि माइक्रोइंजेक्शन द्वारा आरएनएआई भिगोने से आरएनएआई की तुलना में काफी बेहतर है। यह संभवतः आरएनएआई समाधान की ओओसाइट्स तक पहुंचने की क्षमता के कारण है जो गोनाड के अंदर भेदभाव के विभिन्न चरणों में हैं।

प्रक्रिया को अनुकूलित करते समय, बेहतर परिणामों के लिए आरएनए समाधान की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। 50 एनजी/μL से लेकर 10 μg/μL तक आरएनए की विभिन्न सांद्रता का परीक्षण किया गया। यह पाया गया कि 6 μg/μL की एकाग्रता अन्य सांद्रता की तुलना में बेहतर काम करती है। इन विट्रो प्रतिलेखन चरण के दौरान आरएनए उपज बढ़ाने के लिए, प्रोटोकॉल को 4 घंटे इनक्यूबेशन अवधि से 16 घंटे तक संशोधित किया गया था। इसके परिणामस्वरूप आरएनए की अंतिम उपज में पर्याप्त वृद्धि हुई। सफल माइक्रोइंजेक्शन के लिए प्रमुख कारकों में से एक समय की मात्रा है जो एक सूत्रकृमि इंजेक्शन पैड पर खर्च करता है। कम समय के परिणामस्वरूप एक स्वस्थ जीवित सूत्रकृमि और स्वस्थ संतान होती है जिसमें इच्छित फेनोटाइप को देखने की संभावना बढ़ जाती है।

एन्टोमोपैथोजेनिक नेमाटोड की संवर्धन और आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल नेमेटोलॉजी, इम्यूनोलॉजी और होस्ट-परजीवी इंटरैक्शन के क्षेत्र में भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान है। एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड के हेरफेर की अनुमति देने वाले दृष्टिकोणों के संयोजन से आनुवंशिक कारकों की खोज होगी जो नेमाटोड प्रभावक अणुओं और मेजबान प्रतिरक्षा सिग्नलिंग घटकों के बीच परस्पर क्रिया को परिभाषित करते हैं जो एंटी-नेमाटोड गुणों वाले कारकों को एन्कोड करते हैं। यह आगे निर्धारित करेगा कि कौन से प्रमुख सूत्रकृमि आणविक घटक संबंधित बैक्टीरिया के साथ सहजीवी संबंध निर्धारित करते हैं। कृषि प्रथाओं में सुधार और मानव परजीवी सूत्रकृमि के नियंत्रण के लिए उपन्यास साधन विकसित करने के लिए इन सवालों के जवाब देना महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय में जैविक विज्ञान विभाग के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। सभी ग्राफिकल आंकड़े बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए थे। आईई, जेएच, और डी ओ'एच में अनुसंधान। प्रयोगशालाओं द्वारा समर्थित किया गया है जॉर्ज वाशिंगटन विश्वविद्यालय तथा कोलंबियाई कॉलेज ऑफ आर्ट्स एंड साइंसेज धन और क्रॉस-डिसिप्लिनरी रिसर्च फंड की सुविधा प्रदान करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose VWR 97062-244
Ambion Megascript T7 Kit Thermo Fisher Scientific AM1333
Ampicillin Fisher Scientific 611770250
Cell culture flask T25 Fisher Scientific 156367
Cell culture flask T75 Fisher Scientific 156499
ChoiceTaq Mastermix Denville Scientific C775Y42
Corn oil VWR 470200-112
Corn syrup MP Biomedicals/VWR IC10141301
Culture tube 10 mL Fisher Scientific 14-959-14
Eppendorf Femtotips Microloader Tips Eppendorf E5242956003
Ethanol Millipore-Sigma E7023
Falcon tube 50 mL Fisher Scientific 14-432-22
Femtojet Microinjector Eppendorf 5252000021
Filter paper VWR 28320-100
Galleria mellonella waxorms Petco -
Glass coverslip Fisher Scientific 12-553-464 50 x 24 mm
Halocarbon Oil 700 Sigma H8898
Inoculating loop VWR 12000-806
Kanamycin VWR 97062-956
Kwik-Fil Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-3 1.0 mm
LB Agar Fisher Scientific BP1425-500 LB agar miller powder 500 g
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500 LB broth miller powder 500 g
Leica DM IRB Inverted Research Microscope Microscope Central -
MacConkey medium Millipore-Sigma M7408-250G
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit Thermo Fisher Scientific AM1908
Microcentrifuge tube VWR 76332-064 1.5 ml
NanoDrop 2000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Needle syringe VWR BD305155 22G
Nutrient broth Millipore-Sigma 70122-100G
Parafilm VWR 52858-076
Partitioned Petri dish VWR 490005-212
PBS VWR 97062-732 Buffer PBS tablets biotech grade 200 tab
PCR primers Azenta -
Pestle Millipore-Sigma BAF199230001 Bel-Art Disposable Pestle
Petri dish 6 cm VWR 25384-092 60 x 15 mm
Petri dish 10 mm VWR 10799-192 35 x 10 mm
Proteose Peptone #3 Thermo Fisher Scientific 211693
Yeast extract Millipore-Sigma Y1625

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 181 एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड हेटरोरहाब्डाइटिस स्टेनरनेमा परजीवीवाद मेजबान-परजीवी इंटरैक्शन
संवर्धन और आनुवंशिक रूप से एंटोमोपैथोजेनिक नेमाटोड में हेरफेर करना
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Heryanto, C., Ratnappan, R., O'Halloran, D. M., Hawdon, J. M., Eleftherianos, I. Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes. J. Vis. Exp. (181), e63885, doi:10.3791/63885 (2022).

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