Summary
In questo protocollo, il nuovo innesto di bypass venoso del maiale è stato eseguito attraverso una piccola incisione nella parete toracica sinistra senza bypass cardiopolmonare. È stato condotto uno studio di patologia postoperatoria, che ha mostrato ispessimento intimale.
Abstract
La malattia da trapianto venoso (VGD) è la principale causa di fallimento dell'innesto di bypass coronarico (CABG). Sono necessari grandi modelli animali di CABG-VGD per lo studio dei meccanismi della malattia e lo sviluppo di strategie terapeutiche.
Per eseguire l'intervento chirurgico, entriamo nella camera cardiaca attraverso il terzo spazio intercostale e sezioniamo attentamente la vena mammaria interna e la immergiamo nella normale soluzione salina. L'arteria coronaria principale destra viene quindi trattata per l'ischemia. La nave bersaglio viene incisa, viene posizionato un tappo di derivazione e l'estremità distale della vena dell'innesto viene anastomizzato. L'aorta ascendente è parzialmente bloccata e l'estremità prossimale della vena dell'innesto viene anastomizzata dopo la perforazione. La vena dell'innesto viene controllata per la pervietà e l'arteria coronaria destra prossimale è legata.
La chirurgia CABG viene eseguita in maialini per raccogliere la vena mammaria interna sinistra per il suo uso come innesto vascolare. I test biochimici del siero vengono utilizzati per valutare lo stato fisiologico degli animali dopo l'intervento chirurgico. L'esame ecografico mostra che l'estremità prossimale, media e distale del vaso di innesto non è ostruita. Nel modello chirurgico, il flusso sanguigno turbolento nell'innesto viene osservato all'esame istologico dopo l'intervento chirurgico CABG e la stenosi venosa dell'innesto associata a iperplasia intimale è osservata nell'innesto. Lo studio fornisce procedure chirurgiche dettagliate per la creazione di un modello VGD indotto da CABG ripetibile.
Introduction
Sebbene la mortalità per malattia coronarica sia diminuita significativamente negli ultimi anni, la metà degli adulti di mezza età negli Stati Uniti sviluppa sintomi ischemici legati al cuore ogni anno e un terzo degli anziani muore di malattia coronarica1. L'innesto di bypass coronarico (CABG) è una modalità chirurgica efficace per migliorare l'ischemia miocardica e, cosa più importante, è una modalità chirurgica insostituibile per il trattamento della malattia coronarica multivasale2. Nel corso del tempo, tuttavia, gli innesti vascolari sviluppano infiammazione, iperplasia intimale e aterosclerosi progressiva, che è nota per portare a insufficienza dell'innesto venoso o malattia dell'innesto venoso (VGD)3. Nei pazienti dopo CABG, se si verifica restenosi, solo il vaso sanguigno malato può essere sostituito in alcuni casi2. I pazienti più anziani e le comorbidità aggiunte rendono il rifacimento dell'innesto di bypass coronarico piuttosto impegnativo. Ritardare o controllare i problemi patologici associati ai vasi sanguigni trapiantati è un problema urgente da risolvere. Sono necessari grandi modelli animali di CABG-VGD per lo studio dei meccanismi della malattia e lo sviluppo di strategie terapeutiche. I ricercatori hanno stabilito con successo modelli VGD animali in animali piccoli e grandi come topi4, ratti5, conigli6 e maiali7. Rispetto ai piccoli animali, gli animali di grandi dimensioni come i maiali hanno strutture anatomiche e caratteristiche fisiologiche simili all'uomo e hanno una durata di vita più lunga 8,9. Pertanto, gli animali di grandi dimensioni sono più adatti per esplorare i cambiamenti patologici a lungo termine nella malattia venosa del trapianto e per i test preclinici di farmaci o dispositivi. Noi e il nostro team di collaboratori abbiamo applicato con successo tecniche chirurgiche per stabilire un modello di insufficienza cardiaca suina e descritto i cambiamenti patologici cardiaci in questo modello10.
La chirurgia CABG è stata standardizzata nella pratica clinica, ma quando viene applicata alla creazione di modelli animali VGD, le differenze tra le specie, l'acquisizione di attrezzature e strutture per animali, le operazioni chirurgiche per animali e l'alimentazione e l'allattamento degli animali sono enormi sfide per i ricercatori. Come nella pratica clinica, gli approcci per la chirurgia CABG utilizzati per stabilire modelli animali VGD includono la sternotomia11 della linea mediana e la toracotomia laterale sinistra12. La sternotomia della linea mediana è più comunemente usata13,14. Tuttavia, questo approccio presenta rischi elevati sia per gli esseri umani che per gli animali. Nello studio riportato da Thankam et al., due dei sei maiali utilizzati per la modellazione sono morti durante l'intervento chirurgico15. L'elevata mortalità del modello aumenta i costi di studio e influisce sull'accuratezza dei risultati. Uno studio ha dimostrato in precedenza che un'incisione della parete toracica sinistra era fattibile per stabilire VGD indotta da CABG nei suini11. Qui, questo studio mira a descrivere un protocollo passo-passo per stabilire un intervento chirurgico riproducibile per un modello VGD indotto da CABG in maialini e per valutare il fenotipo di questo modello. Il protocollo sperimentale è stato progettato congiuntamente dai team di cardiochirurgia e anestesia. L'approccio chirurgico per il terzo spazio intercostale sinistro è stato determinato in base ai cadaveri di altri maialini in laboratorio prima dell'intervento chirurgico e il metodo di anestesia è stato eseguito secondo il metodo utilizzato al centro16. Sono stati condotti test biochimici del sangue, esame ecografico e esame istologico per valutare i modelli animali.
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Protocol
Le procedure per la cura e l'uso degli animali da laboratorio sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Istituto di monitoraggio degli animali da laboratorio del Guangdong. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (8th Ed., 2011, National Research Council, USA). La procedura chirurgica è mostrata nella Figura 1.
1. Preparazione preoperatoria degli animali
- Dividi casualmente 10 maialini maschi di 3 mesi del peso di 30-35 kg nel gruppo sham (n = 5) e nel gruppo VGD (n = 5).
- Valutare le condizioni di salute preoperatorie e postoperatorie dei suini utilizzando l'indice di massa corporea (BMI). Calcola il BMI come segue:
BMI = peso corporeo (kg)/(lunghezza corpo [cm] × lunghezza corpo [cm])
NOTA: La lunghezza del corpo viene misurata dal naso del maiale alla base della coda. - Digiunare gli animali per 12 ore prima dell'intervento chirurgico per evitare l'aspirazione dopo l'anestesia. Preparare apparecchi per anestesia e strumenti chirurgici, tra cui una macchina per anestesia, gas, farmaci per anestetici, una pipeline per anestesia, uno speciale laringoscopio e strumenti chirurgici, un fermo costolica, punti di sutura, un divaricatore tiroideo, pinze chirurgiche, ecc. Sterilizzare tutti gli strumenti da utilizzare nell'ambulatorio.
2. Preparare gli animali per l'intervento chirurgico
- Pesare gli animali e calcolare la dose di anestetico. Somministrare per via intramuscolare la miscela anestetica comprendente 2 mg/kg di 1:1 Tiletamina e Zolazepam, 0,2 mg/kg diazepam e 0,02 mg/kg di atropina17. Utilizzare fentanil (50 mg / kg) per alleviare il dolore intraoperatorio30.
- Assicurarsi che si raggiunga un piano anestetico adeguato e inserire un catetere venoso permanente (20G) nella vena dell'orecchio marginale per stabilire l'accesso all'orecchio. Trasferire il maiale sul tavolo operatorio e posizionarlo in posizione supina. Immobilizzare gli arti con bende ed elevare la testa con un drappeggio sterile.
NOTA: Lo stato dell'anestesia è stato monitorato mediante fissazione centrale del bulbo oculare, miosi, perdita del riflesso pupillare e perdita del riflesso del dolore. La frequenza cardiaca e la pressione sanguigna sono state mantenute a un livello inferiore rispetto al basale. Il chirurgo deve monitorare la FC, la pressione sanguigna e altri parametri sotto paralisi e aumentare la dose di anestetico se l'HR aumenta > 20% rispetto al basale. - Esporre l'epiglottide e la glottide utilizzando un laringoscopio veterinario. Eseguire l'intubazione tracheale con un tubo 7.0-7.5Fr e collegarlo al circuito respiratorio dell'anestesia.
NOTA: Il ventilatore viene utilizzato per la ventilazione continua a pressione positiva con volume corrente 280 ml, rapporto inspiratorio/espiratorio 1:2, frequenza respiratoria 20 volte/min e pressione positiva di fine espirazione (5 cm H2O). - Iniettare bromuro di vecuronio per via endovenosa (0,1 mg/kg) per rilassare i muscoli durante le procedure chirurgiche e utilizzare isoflurano al 2% per mantenere l'anestesia a una frequenza respiratoria di 16-20 bpm e un volume corrente di 10 ml/kg.
NOTA: Il vecuronio viene somministrato per garantire un'adeguata profondità dell'anestesia negli animali paralizzati, soprattutto perché la dose di farmaco di induzione e isoflurano è all'estremità inferiore di quella raccomandata. - Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi del maiale per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Utilizzare termocoperte per mantenere la temperatura corporea del maiale a 38 °C ± 5 °C.
- Utilizzare un elettrocardiogramma per monitorare la frequenza cardiaca, i livelli di ossigeno nel sangue e la temperatura corporea.
3. Procedure chirurgiche
- Rasare la parete toracica sinistra e applicare tre cicli alternati di iodio allo 0,7% e alcol al 75% per preparare asetticamente l'area chirurgica fino all'angolo mandibolare sinistro, fino al cordone ombelicale, sinistra alla linea ascellare posteriore e destra al fronte ascellare. Posizionare un drappo chirurgico sterile intorno all'area chirurgica.
- Fare un'incisione trasversale di 7-10 cm con un coltello elettrico nel terzo spazio intercostale sinistro e separare i tessuti sottocutanei strato per strato (Figura 2A). Rimuovere un segmento di 5-6 cm della terza costola con le forbici ossee ed esporre la vena mammaria interna con un divaricatore dopo aver esposto la terza articolazione costola-sternale (Figura 2B).
- Individuare la vena mammaria interna insieme con l'arteria mammaria interna sinistra sul lato sinistro dello sterno. Eseguire una dissezione smussata della vena mammaria interna con una pinza vascolare.
- Eseguire l'emostasi mediante elettrocoagulazione dei rami della vena mammaria interna sinistra con un coltello elettrico. Se l'emostasi è incompleta, utilizzare la legatura del filo di cotone per l'emostasi. Argare e segnare le due estremità della vena durante la raccolta (Figura 2C).
- Preparare soluzione salina normale di eparina aggiungendo 2 ml di soluzione di eparina sodica e 98 ml di soluzione salina normale. Dopo aver rimosso la vena, iniettare soluzione salina normale di eparina nella vena per il pretrattamento (Figura 2D). Quindi, mettere la vena in soluzione salina normale e tenerla per il backup.
- Fare un'incisione simile a quella sopra descritta e rimuovere la vena mammaria interna nel gruppo fittizio. Apri il pericardio, quindi chiudi la parete toracica nel gruppo fittizio. Utilizzare la vena mammaria interna del gruppo fittizio per il controllo patologico senza innesto di bypass coronarico.
- Fare un'incisione di ~ 7 cm con un coltello elettrico sul pericardio per esporre il tronco dell'arteria coronaria destra. Sospendere il pericardio e cucire sulla pelle sul lato omolaterale con le suture chirurgiche 1-0 (Figura 2E). Separare il tronco coronarico destro dai tessuti circostanti (Figura 2E).
- Bypassare la banda bloccante sotto l'estremità prossimale dell'arteria coronaria destra isolata vicino all'aorta con un gancio metallico e trattare il miocardio con tre cicli di ischemia di 2 min e riperfusione di 5 min stringendo e rilassando la banda di blocco (Figura 2F). Monitorare l'attività elettrica del cuore con il monitor dell'elettrocardiogramma durante il precondizionamento dell'ischemia/riperfusione (Figura 2G).
NOTA: Quando l'arteria coronaria destra è bloccata, l'elettrocardiogramma mostra un aumento della frequenza cardiaca e dell'elevazione del segmento ST. - Stringere la fascia per bloccare il flusso sanguigno coronarico destro. Tagliare l'epicardio che copre i vasi sanguigni. Esporre la parete dell'arteria coronaria e tagliare longitudinalmente con la punta di una lama chirurgica contro il centro della parete anteriore dei vasi sanguigni.
- Dopo aver tagliato il lume, allargare l'incisione con le forbici e posizionare uno shunt coronarico. Inserire un'estremità dello shunt con una bobina nell'arteria coronaria distale attraverso la lacrima. Deviare il sangue nelle arterie coronarie nello shunt coronarico cavo per garantire un campo operativo chiaro (Figura 2H).
- Eseguire una sutura continua end-to-side tra la vena mammaria interna e il tronco coronarico destro con la sutura in polipropilene 7-0 (Figura 2I). Nel mezzo dell'aorta ascendente, occludere la parete anterolaterale sinistra dell'aorta ascendente con un morsetto semi-occlusivo.
- Utilizzare una lama chirurgica per fare una piccola incisione nella parete aortica in cui è stata tagliata l'avventizia, inserire l'estremità della testa dell'albero scorrevole all'estremità della testa del pugno nella cavità aortica attraverso questa incisione, contrarre l'albero di scorrimento verso l'esterno e il coltello circolare sopra di esso taglia un pezzo della parete arteriosa. Il blocco di tessuto tagliato dal punzone ha un diametro di circa 3 mm (Figura 2J).
- Tira fuori lo shunt. Eseguire una sutura continua end-to-side tra la vena mammaria interna e la parete aortica con la sutura in polipropilene 6-0 (Figura 2K). Aprire il morsetto di semi-occlusione.
- Registrare il flusso di bypass del tronco coronarico destro prossimale al sito di anastomosi utilizzando gli ultrasuoni. Monitorare l'attività elettrica del cuore utilizzando l'elettrocardiogramma (Figura 2L).
- Installare un tubo di drenaggio temporaneo (Fr: 16) nella cavità toracica per consentire al sangue e ai liquidi di drenare. Cucire l'incisione del pericardio usando un filo di cotone 1-0 e chiudere il torace strato per strato (dall'interno verso l'esterno: strato di pleura, strato muscolare, strato di tessuto sottocutaneo, strato di pelle) mentre si posiziona la polvere di penicillina (circa 0,5 g) su ogni strato. Rimuovere il tubo di drenaggio dopo aver cucito l'incisione cutanea utilizzando un filo di cotone 1-0.
4. Assistenza post-operatoria
- Rimuovere il tubo endotracheale dopo che gli animali sono tornati alla respirazione spontanea. L'anestesista deve valutare i parametri vitali dell'animale (ad esempio, frequenza respiratoria, frequenza cardiaca, saturazione di ossigeno, ecc.) e rimuovere l'ECG dopo che gli animali si svegliano e tornano all'attività spontanea. Rimanda gli animali nella stanza di alimentazione e metti gli animali finti in un altro recinto nella stanza di allevamento. Tieni gli animali al caldo con una coperta elettrica. Osservare gli animali ogni ora dopo l'intervento chirurgico (almeno 4 volte).
- Dai da mangiare all'animale il giorno dopo l'intervento chirurgico. Aggiungere l'aspirina (200 mg) 2 volte al giorno per 7 giorni al mangime per prevenire la trombosi post-operatoria e ridurre il dolore della ferita.
NOTA: Evitare di nutrire gli animali il giorno dell'intervento chirurgico per prevenire l'aspirazione. - Somministrare l'animale con un'iniezione intramuscolare di penicillina 1 volta al giorno per 7 giorni consecutivi per prevenire l'infezione post-operatoria (14.000 unità per kg).
5. Esame ultrasonico
- Dopo l'intervento chirurgico CABG, utilizzare un manicotto sterile per sonda ad ultrasuoni per avvolgere la sonda lineare ad alta frequenza. Posizionare la sonda sulla superficie dell'innesto venoso.
- Visualizza il contorno dell'innesto nella modalità ecografica bidimensionale, quindi passa alla modalità Color Doppler per rilevare il flusso sanguigno nell'innesto.
6. Raccolta di tessuto venoso
- Raccogliere 10 ml di campione di sangue dal circuito venoso della vena dell'orecchio per test biochimici. (Tabella 1). Centrifugare il campione di sangue a 1.000 x g per 5 minuti ed eseguire test biochimici con un analizzatore biochimico automatico.
- Anestetizzare l'animale come descritto in precedenza. Dopo aver confermato la profondità dell'anestesia, iniettare il 10% di cloruro di potassio 0,5 ml / kg di peso corporeo dalla vena marginale dell'orecchio o dalla vena degli arti anteriori. Quindi, eseguire un'incisione sternale mediana di 10 cm con un coltello elettrico per raccogliere l'innesto venoso 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. Fissare la posizione del corpo come nel punto 2.2., e dopo la sterilizzazione e il posizionamento di un drappo, fare un'incisione mediana dello sterno per dividere lo sterno. Durante la separazione, evitare i principali vasi sanguigni e il cuore e separare i vasi sanguigni innestati strato per strato.
- Tagliare rapidamente i grandi vasi sanguigni che si collegano al cuore, posizionare il cuore e l'aorta ascendente su trucioli di ghiaccio e rimuovere il ponte vascolare dell'innesto, l'aorta collegata e l'arteria coronaria destra. Risciacquare tutti i campioni con soluzione salina normale a 4 °C.
- Prendi l'intero recipiente di innesto di circa 3-4 cm, dividilo in 4-5 parti uguali e trasferiscilo nei tubi di crioconservazione. Mettere rapidamente i tubi in azoto liquido per congelare e passare a un congelatore a temperatura ultra bassa a -80 °C per la conservazione.
- Per l'analisi, sciacquare l'innesto con soluzione salina ghiacciata allo 0,9% e fissarlo in una soluzione di paraformaldeide al 4%. Mantenere un rapporto tra la dimensione del blocco tissutale e la soluzione fissativa di 1:10 e fissare il tessuto per più di 12 ore.
- Colorare le sezioni in 50 ml di soluzione acquosa di ematossilina per 3 min. Separare le sezioni lavando con 50 ml di etanolo acido cloridrico allo 0,5% e 50 ml di acqua ammoniacale allo 0,2% per 10 s ciascuno.
- Risciacquare con acqua corrente per 1 ora e poi pulire in acqua distillata immergendo per 3 min. Disidratare in etanolo al 70% e al 90% per 10 minuti ciascuno. Introdurre in 50 ml di soluzione colorante di eosina alcolica allo 0,5% per 2-3 minuti.
- Disidratare le sezioni colorate con etanolo puro per 10 minuti e quindi immergere in xilene puro per 10 minuti per rendere trasparenti i campioni. Gocciolare le sezioni trasparenti con colla neutra e coprire con un coprivetrino. Osservare le sezioni patologiche al microscopio ottico con ingrandimento 40x.
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Representative Results
BMI e indici biochimici sierici
Il BMI tra i gruppi sham e VGD non era significativamente diverso (sham vs. VGD, 22,05 kg/cm 2 ± 0,46 kg/cm 2 vs. 21,14 kg/cm 2 ± 0,39 kg/cm 2, p = 0,46). I risultati biochimici del siero sono elencati nella Tabella 1. Cambiamenti statisticamente significativi tra i gruppi sono stati trovati in quattro indici biochimici, tra cui aspartato aminotransferasi (AST, sham vs. VGD, 25,25 UI/L ± 1,88 UI/L vs. 31,5 UI/L ± 2,58 UI/L), bilirubina sierica (sham vs. VGD, 2,5 μmol/L ± 0,47 μmol/L vs. 4,5 μmol/L ± 0,14 μmol/L), bilirubina totale (sham vs. VGD, 0,025 μmol/L ± 0,14 μmol/L vs. 0,92 μmol/L ± 0,33 μmol/L), e creatinina (sham vs. VGD, 92,75 μmol/L ± 4,15 μmol/L vs. 141,75 μmol/L ± 12,65 μmol/L).
Esame ecografico
Tutti gli animali nei gruppi sham (n = 5) e VGD (n = 5) sono sopravvissuti. Le procedure chirurgiche di CABG sono mostrate in Figura 1. Il tempo medio di intervento è stato di 105 minuti ± 25 minuti (range: 90-160 min) e il volume medio di sanguinamento intraoperatorio è stato di 85 ml ± 35 mL (range: 50-200 mL). L'influenza del tempo di funzionamento è principalmente la transizione della competenza dell'operatore dall'uomo al maiale e non ha alcun significato speciale. La durata media dall'anastomosi dopo incisione all'estubazione tracheale è stata di 17 minuti ± 5 minuti (range: 15-30 min). L'esame ecografico ha mostrato che l'apporto di sangue del vaso innestato aveva un rigurgito parziale rispetto alla normale arteria coronaria e la direzione complessiva del flusso sanguigno era generalmente normale (Figura 3). Pneumotorace, tamponamento, infezione o altre complicazioni gravi non sono stati osservati dopo l'intervento. Nessuna differenza significativa è stata trovata nel peso o nel BMI tra i gruppi sham e VGD, 1 mese dopo l'intervento.
L'esame ecografico è stato eseguito sull'estremità prossimale (Figura 3A, B), sulla cavità vascolare (Figura 3C, D) e sull'estremità distale (Figura 3E, F) del vaso di trapianto. Il flusso retrogrado è stato osservato alle estremità prossimale e distale del vaso di trapianto; tuttavia, non è stato osservato stravaso di sangue.
Cambiamenti patologici nelle vene
Ogni innesto venoso è stato diviso uniformemente in tre segmenti per lunghezza e una sezione è stata selezionata da ciascun segmento per la valutazione e classificata secondo la classificazione Proudilit modificata per la stenosi coronarica18. I valori medi delle tre sezioni sono stati adottati come risultati per il grado di occlusione. La classificazione specifica era la seguente: grado I = 0 punti, normale senza restenosi; grado II = stenosi lieve a 1 punto <30%; grado III = 2 punti, stenosi tra il 30% e il 50%; grado IV = 3 punti, stenosi grave tra il 50% e il 90%; grado V = 4 punti, occlusione subtotale >90%; e grado VI = 5 punti, occlusione totale, senza flusso sanguigno all'innesto venoso. La classificazione modificata di Proudilit per la stenosi coronarica è stata adottata per valutare i risultati quantificati. Il risultato per il gruppo sham è stato 0,00 ± 0,00, indicando nessuna occlusione vascolare, mentre il risultato per il gruppo CABG è stato 3,12 ± 1,22. Pertanto, la differenza era significativa tra i due gruppi (p < 0,05, tabella 2).
Al microscopio, nel gruppo fittizio, la tunica intima, la tunica media e la parete venosa dell'innesto venoso apparivano normali. Nel gruppo VGD, la tunica intima e il mezzo tunica degli innesti venosi sono stati significativamente ispessiti 30 giorni dopo l'intervento chirurgico CABG. La tunica intima era ambiguamente delimitata dalla tunica media. Lo strato elastico della tunica media è scomparso (Figura 4). Il lume dell'innesto venoso era pieno di tessuti iperplastici (Figura 4). Non è stato osservato alcun cambiamento significativo nel diametro del vaso.
Figura 1: Schema della procedura. (A-C) Pre-operazione: pesare i maialini, controllare le prestazioni del defibrillatore e del ventilatore e collegare il tubo di ventilazione. (D-F) Anestesia: somministrare un'iniezione intramuscolare di anestesia ai maialini, fissare il maialino sul tavolo operatorio, esporre completamente le vie aeree per l'intubazione tracheale, collegare il ventilatore e utilizzare l'anestesia per inalazione per mantenere l'anestesia. (G-I) Durante l'operazione: eseguire una valutazione ecografica preoperatoria della funzione cardiaca nei maialini e completare l'innesto di bypass coronarico attraverso un'incisione della parete toracica sinistra. (J-L) Post operazione: Anastomosi le ferite e prestare attenzione alla cura post-operatoria e all'alimentazione dei maialini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: La procedura chirurgica. (A) Tagliare la parete toracica, (B) isolare la vena mammaria interna, (C) rimuovere la vena mammaria interna, (D) eseguire il precondizionamento dell'eparina, (E) sospendere il pericardio, (F) eseguire la riperfusione dell'ischemia miocardica, (G) monitorare i cambiamenti dell'ECG, (H) bloccare il flusso sanguigno coronarico, (I) anastomizzare l'estremità prossimale del vaso dell'innesto, (J ) sito di anastomosi coronarica distale, (K) anastomosi distali alle arterie coronarie, (L) bypass coronarico completo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Esame ecografico. Dopo il completamento dell'innesto di bypass coronarico, la pervietà del flusso sanguigno del vaso innestato viene valutata mediante ultrasuoni. (A,C,E) Immagini normali del flusso sanguigno coronarico. Segnali continui del flusso sanguigno sono visibili alle estremità (B) prossimale, (D) centrale e (F) distale dei vasi innestati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi istologica . (A) La normale sezione patologica della vena mammaria interna ha mostrato una chiara gerarchia vascolare e nessuna stenosi del lume. (B,C) La patologia della vena mammaria interna 30 giorni dopo il trapianto di arteria coronaria ha mostrato che l'intima della nave era ispessita a vari livelli e il lume era ovviamente ristretto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Indicatori | Gruppo Sham (n=5) | Gruppo di innesto (n=5) |
| ALT (UI/L) | 46 ±5.11 | 47.75±7.88 |
| AST (UI/L) | 25,25 ±1,88 | 31,5±2,58* |
| Proteine totali (UI/L) | 63,12 ±,138 | 60.17±1.91 |
| Albumina (UI/L) | 32,25 ±0,77 | 23.77±5.61 |
| Globulina (g/L) | 30,87 ±,136 | 36.4±6.03 |
| Bilirubina sierica (μmol/L) | 2,5 ±0,47 | 4,5±0,14* |
| Bilirubina totale (μmol/L) | 0,025 ±0,14 | 0,92±0,33* |
| Fosfatasi alcalina (UI/L) | 103 ±19,3 | 104±16.04 |
| Glucosamina (mmol/L) | 4,44 ±0,36 | 5,96±0,42 |
| Azoto ureico (mmol/L) | 2,46 ±0,17 | 2,89±0,65 |
| Creatinina sierica μmol/L | 92,75 ±4,15 | 141,75±12,65* |
| Colesterolo totale (mmol / L) | 2,37 ±0,12 | 2.16±0.06 |
| Trigliceridi (mmol / L) | 0,48 ±0,10 | 0,25±0,05 |
| Lipoproteina ad alta densità mmol/L | 1,05 ±0,07 | 1,03±0,07 |
| Lipoproteine a bassissima densità (mmol/L) | 1,43 ±0,06 | 1,29±0,04 |
| Lattato deidrogenasi (mmol/L) | 384,75 ±26,8 | 478,25±49,58* |
Tabella 1. Indicatori biochimici del siero. Per l'analisi è stato utilizzato un software di analisi statistica. I dati sono stati espressi come media ± errore standard (n = 5). I confronti dei dati di misurazione sono stati analizzati mediante il t-test di Student. Un valore p inferiore a 0,05 indicava la significatività statistica. *p < 0.05, CABG vs. sham.
| Classificazione Proudilit | ||||||
| S. N. del campione | Punteggio immediatamente dopo l'intervento chirurgico CABG | Punteggio 30 giorni dopo l'intervento chirurgico CABG | ||||
| 1 | 0, 0, 0 | 2, 2, 2 | ||||
| 2 | 0, 0, 0 | 1, 2, 2 | ||||
| 3 | 0, 0, 0 | 2, 3, 2 | ||||
| 4 | 0, 0, 0 | 3, 2, 2 | ||||
| 5 | 0, 0, 0 | 2, 1, 2 | ||||
Tabella 2. Risultati statistici dei gradi di occlusione dell'innesto immediatamente dopo l'intervento chirurgico e 30 giorni dopo l'intervento. La scala di classificazione Proudilit modificata è stata utilizzata per il grado di occlusione vascolare: grado I = 0 punti, normale senza restenosi; grado II = stenosi lieve a 1 punto <30%; grado III = 2 punti, stenosi tra il 30% e il 50%; grado IV = 3 punti, stenosi grave tra il 50% e il 90%; grado V = 4 punti, occlusione subtotale >90%; e grado VI = 5 punti, occlusione totale, senza flusso sanguigno all'innesto venoso. I dati includono i risultati di cinque innesti venosi equamente divisi in tre sezioni per lunghezza.
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Discussion
In questo studio, abbiamo descritto in dettaglio il protocollo per la selezione degli animali, la preparazione degli strumenti, le procedure chirurgiche e la valutazione post-operatoria durante lo sviluppo di un modello VGD indotto da CABG. Abbiamo eseguito l'esame ecografico dell'innesto venoso prima e dopo l'intervento chirurgico CABG e l'esame istologico dell'innesto 30 giorni dopo l'intervento. Il flusso sanguigno nella vena mammaria interna era normale prima dell'intervento chirurgico CABG, mentre il flusso retrogrado è stato osservato nell'innesto della vena mammaria interna. Rispetto al gruppo di operazioni fittizie, la funzionalità epatica e renale degli animali nel gruppo operativo è stata danneggiata in una certa misura. Considerando l'insorgenza della malattia coronarica, l'indebolimento della contrattilità miocardica ha comportato un'insufficiente perfusione dei tessuti periferici. L'innesto venoso ha mostrato iperplasia intimale e rimodellamento vascolare 30 giorni dopo l'intervento chirurgico CABG (Figura 4). I cambiamenti fibrotici intorno ai vasi sanguigni sono associati alla guarigione delle ferite, la proliferazione dei fibroblasti si verifica all'inizio della guarigione delle ferite dal giorno 1 al giorno 3 19, la produzione di collagene attivo di tipo I e fibronectina si verifica dal giorno 4 al giorno 6 e l'aggregazione citoplasmatica della fibrilla di actina α-SM si verifica dal giorno 7 al giorno 1419. Le fibre di stress implicano la formazione di miofibroblasti, che coincide con la contrazione della ferita20. Non è chiaro se la fibrosi perivascolare influenzi gli esiti chirurgici.
Qui, abbiamo selezionato i maialini per stabilire il modello di malattia dell'innesto venoso. Mentre piccoli animali come i ratti sono stati utilizzati per studiare i meccanismi patologici della VGD21, i suini sono simili per dimensioni, anatomia e fisiologia agli esseri umani e sono, quindi, più adatti per studiare la patogenesi delle malattie cardiache umane o come strumento per lo sviluppo di dispositivi22. Anche le vene mammarie interne sono spesso selezionate clinicamente come innesti. Studi clinici di due gruppi indipendenti hanno rilevato che gli innesti di vene mammarie interne hanno la caratteristica di un'alta incidenza di lesioni dell'innesto venoso e gli stessi cambiamenti patologici sono stati osservati nel nostro studio (Figura 4) 23,24. Come nella pratica clinica, la scelta di un approccio chirurgico appropriato nella chirurgia animale è fondamentale per il successo della chirurgia; qui, ci riferivamo alla toracotomia sinistra11 di Hocum. Abbiamo scoperto che la toracotomia sinistra poteva esporre chiaramente il campo operatorio, l'anatomia intorno all'incisione era facile da identificare e la quantità di sanguinamento era bassa. Inoltre, rispetto alla toracotomia mediana, la toracotomia laterale non richiede il taglio dello sterno, quindi lo stress chirurgico può essere ridotto.
L'anestesia è fondamentale per il successo di un modello chirurgico. In questo studio, il protocollo è stato modificato da Kotani et al., con la combinazione di ketamina e diazepam utilizzati come induzione dell'anestesia e inalazione di isoflurano come anestesia di mantenimento25. Inoltre, un gruppo di ricerca ha dimostrato che i farmaci per via endovenosa erano adatti anche per l'anestesia di mantenimento26. L'intubazione endotracheale nei suini potrebbe essere difficile per un team chirurgico animale. Rispetto alle vie aeree umane, l'anatomia tracheale dei maiali rende difficile l'esposizione della glottide27. Qui, per esporre meglio la glottide abbiamo premuto la mascella superiore del maiale per aiutare a esporre la glottide del maiale (Figura 1D). D'altra parte, l'uso di una laringoscopia diretta o di una broncoscopia a fibre ottiche aiuterà a visualizzare la glottide nell'intubazione endotracheale28.
Lo stato patologico della malattia venosa del trapianto è principalmente diviso in tre fasi: 1) trombosi acuta (entro 1 mese); 2) stadio subacuto (1-12 mesi) iperplasia intimale; 3) formazione in fase avanzata (più di 12 mesi) di aterosclerosi, che è una causa di stenosi del trapianto e occlusione29. La maggior parte dei cambiamenti nella fase acuta di VGD sono legati a fattori operativi e l'aterosclerosi formata nella fase avanzata è irreversibile. Lo studio dell'ispessimento endometriale subacuto è molto importante per la patogenesi, il trattamento e la prevenzione della VGD. È anche fondamentale che i vasi di innesto scelti siano diversi dai vasi verticali della grande vena safena. La vena mammaria interna di solito sopporta meno pressione idrostatica e i cambiamenti patologici sono più veloci dopo il trapianto rispetto alla grande vena safena. Nel nostro modello, la tipica iperplasia intimale che occlude il lume del vaso innestato è stata osservata nell'esame istologico 30 giorni dopo l'intervento chirurgico e gli stessi cambiamenti patologici sono stati osservati in altri studi clinici23,24. I risultati della modellazione della selezione della vena mammaria interna nei maialini sono stabili nel fenotipo, il tempo di modellazione è breve e il grado di riduzione dei cambiamenti patologici di VGD è elevato, il che favorisce lo sviluppo della ricerca di follow-up.
Il modello ha anche alcune limitazioni. Alcune operazioni di precisione nel grande processo di modellazione animale, il monitoraggio intraoperatorio dei segni vitali degli animali e la rianimazione postoperatoria richiedono una certa esperienza pratica, che richiede chirurghi professionisti e anestesisti per guidare la formazione e ridurre notevolmente la mortalità accidentale degli animali. La chirurgia animale di grandi dimensioni richiede siti sperimentali specifici, personale professionale e un sostegno finanziario sufficiente, che può essere un onere più pesante per gli istituti più piccoli.
In conclusione, sotto la guida di professionisti, laboratori ben attrezzati possono studiare ulteriormente i cambiamenti patologici di VGD stabilendo questo modello VGD minipig, che è di grande importanza per il trattamento di VGD.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute per il supporto tecnico, la cura degli animali e la raccolta di campioni. Si ringrazia inoltre Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, per il supporto tecnico nell'esame ecografico. Questo lavoro è stato supportato dal Guangdong Science and Technology Program, Cina, e dal Jinan University Central Universities Basic Scientific Research Business Expense Project (2017A020215076, 2008A08003 e 21621409).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aortic Punch | Medtronic Inc. , America | 3.0mm, 3.5mm, 4.0mm | Used for proximal coronary bridge anastomosis |
| Automatic biochemical analyzer | IDEXX Laboratories, Inc. America | Catalyst One | |
| Cardiac coronary artery bypass grafting instrument kit | LANDANGER, France | ||
| Cardiogram monitor | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co, Ltd | MEC-1000 | |
| Coronary Shunt | AXIUS | OF-1500, OF-2500, OF-3000 | The product temporarily blocks the coronary artery during arteriotomy to reduce the amount of bleeding in the surgical field and provide blood flow to the distal end during anastomosis. The Axius shunt plug is not an implant and should be removed prior to completion of the anastomosis. |
| Defibrillator | MEDIANA | Mediana D500 | |
| Diazepam | Nanguo pharmaceutical Co. LTD, Guangdong, China | H37023039 | Narcotic inducer |
| Disposable manual electric knife | Covidien, America | E2516H | |
| Electric negative pressure suction machine | Shanghai Baojia Medical Instrument Co, Ltd | YX932D | |
| Esmolol | Guangzhou Wanzheng Pharmaceutical Co. LTD | H20055990 | Emergency drugs |
| Ice machine | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Lidocaine | Chengdu First Pharmaceutical Co. LTD | H51021662 | Emergency drugs |
| Luxtec headlight system | Luxtec, America | AX-1375-BIF | Used for lighting fine parts during operation |
| Medical operation magnifier (glasses) | Germany Lista co, LTD | SuperVu Galilean 3.5× | Used for fine site operation during operation |
| Multi-function high-frequency electrotome | Shanghai Hutong Electronics Co, Ltd | GD350-B | |
| Nitrogen canister | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Nonabsorbable surgical suture (polypropylene suture) | Johnson & Johnson, America | 6-0, 7-0 | Used to suture blood vessels. |
| Nonabsorbable suture (cotton thread) | Covidien, America | 1-0 | Used for skin and muscle tissue tugging |
| Open heart surgery instrument kit | Shanghai Medical Instrument (Group) Co., LTD | ||
| Propofol injection | Xi 'an Libang Pharmaceutical Co. LTD | H19990282 | Anesthetic sedative |
| Refrigerator | Local suppliers, Guangzhou, China | ||
| Respiratory anesthesia machine for animal | Shenzhen Reward Life Technology Co, Ltd, China | R620-S1 | |
| Semi-occlusion clamp | Xinhua Surgical Instrument Co., Ltd. | ZL1701RB | Temporarily cut off the aortic flow |
| vecuronium bromide | Richter, Hungary | JX20090127 | Muscle relaxant |
| Veterinary ultrasound system | Royal Philips, Netherlands | CX50 | |
| Zoletil | Virbac, France | Zoletil 50 | Animal narcotic |
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