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Biology

マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

プラスミドDNAの骨格筋へのエレクトロポレーションは、マウスの筋収縮性を損なうことなく遺伝子発現を調節する実行可能な方法である。

Abstract

プラスミドエレクトロポレーションによるマウス骨格筋における一過性遺伝子発現調節は、正常および病理学的生理学を評価するための有用なツールである。標的遺伝子の過剰発現またはノックダウンにより、研究者は個々の分子事象を操作できるため、筋肉量、筋肉代謝、および収縮性に影響を与えるメカニズムをよりよく理解することができます。さらに、蛍光タグをコードするDNAプラスミドのエレクトロポレーションにより、研究者は in vivoで骨格筋におけるタンパク質の細胞内局在の変化を測定することができます。骨格筋の主要な機能評価には、筋肉収縮性の測定が含まれる。このプロトコールでは、プラスミドDNA注入、エレクトロポレーション、および遺伝子発現調節の後も筋肉全体の収縮性研究が依然として可能であることを実証する。この指導手順の目的は、マウス骨格筋へのDNAプラスミドエレクトロポレーションの段階的な方法を実証して、脛骨前筋および伸筋桁長筋の筋線維における取り込みおよび発現を促進し、ならびに骨格筋収縮性が注射およびエレクトロポレーションによって損なわれないことを実証することである。

Introduction

in vivoでの骨格筋へのプラスミドDNAエレクトロポレーションは、様々な生理学的および病態生理学的条件下で遺伝子発現を調節することによって骨格筋生理学および分子シグナル伝達の変化を評価するための重要なツールである1,2,3,4,5,6,7,8,9 .骨格筋への実験的な遺伝子導入は、Wolffらによって1990年に早くも実証され、そこではRNAとDNAの両方がエレクトロポレーションなしで首尾よく転写され、ルシフェラーゼ発現は少なくとも2ヶ月間維持された10。注射のみではトランスフェクション効率が比較的低いことが問題であり、相原と宮崎は1998年にpCAGGS-IL-5構築物を前脛骨(TA)筋にエレクトロポレーションし、血清IL-5発現を測定することによって、エレクトロポレーションによる遺伝子導入の増加を実証した11。それ以来、多くの研究が、遺伝子導入効率を最大化するために、さまざまなDNA濃度、体積、およびエレクトロポレーションパラメータの有効性を調査してきました。Mirらは、電圧、パルス数、パルス持続時間、周波数、DNA濃度を含むさまざまなエレクトロポレーションパラメータを試験し、電圧、パルス数、DNA濃度のすべてがエレクトロポレーション効率の向上に寄与すると判断しました12。高いエレクトロポレーション電圧に対する主な注意点は、筋線維へのDNA取り込みの増加を促進する一方で、筋肉の損傷も引き起こし、結果を混乱させる可能性があることです。Schertzerらは、200Vでのエレクトロポレーションがエレクトロポレーションの3日後にミオファイバーの約50%に損傷を引き起こしたのに対し、50Vで損傷を受けたのはミオファイバーの10%のみであることを示した13。我々は、効率的なDNA移植と筋肉損傷に影響を及ぼす変数を考慮し、ノギス幅1センチメートルあたり125Vの電圧が効果的な遺伝子導入を達成するのに十分であることを見出した。

エレクトロポレーション後の筋線維断面積および筋全体の収縮性の解析は、遺伝子調節による筋の大きさおよび機能の変化を測定するための方法の重要な側面である。我々および他の人々は、制御ベクターのエレクトロポレーションだけではミオファイバー面積の減少を引き起こさないことを以前に実証した。緑色蛍光タンパク質(EGFP)構築物は、これらの研究においてDNAトランスフェクションの有用な蛍光指標であった13、14。多くの研究がエレクトロポレーション後のTAのin situ収縮性を調査し、様々な結果を見出した。ある研究では、75V/cmエレクトロポレーションはエレクトロポレーションの3日後に破傷風力の約30%の減少を引き起こし、エレクトロポレーションの7日後には破傷風力は制御レベルに戻ったが、50V/cmのエレクトロポレーションは力を損なわなかった13,15。別の研究では、180V/cmエレクトロポレーションの3時間後に破傷風力が30%減少し、7日後に偽の力レベルに回復したことを示しました16。

以下の詳細な手順では、我々は、マウスのTAおよび伸筋デジトーラムロンガス(EDL)筋肉におけるpcDNA3-EGFPプラスミドの注入およびエレクトロポレーションを実証する。我々はまた、この方法がEDL全筋収縮性に影響を及ぼさないことを実証する。その目的は、機能喪失を引き起こすことなく筋線維への効率的なプラスミド取り込みを実証することです。

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Protocol

動物を用いたすべての実験は、ペンシルベニア州立大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されたペンシルベニア州立医科大学で行われ、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の修正で定められた倫理基準に従って実施された。この処置には、12週齢の雌性C57BL/6マウスを使用した。すべての手術器具は、実験前に無菌性のためにオートクレーブ処理された。

1. TAおよびEDL注射/エレクトロポレーション調製

メモ:これらの手順は、TAおよびEDL注射/エレクトロポレーション調製の場合と同じです。

  1. 実験前に発現プラスミド構築物を滅菌PBSで希釈した1 μg/μLの濃度に精製する。この手順のために、市販のエンドトキシンフリー精製キットを使用して、pcDNA3−EGFP(GFP)またはpcDNA3空ベクター(コントロール)を精製した。
  2. プラスミド濃度を計算して、適切な注入量を確保します(50μLの滅菌PBS中のDNAのTA 50μg;EDL 10 μg の DNA を 10 μL の滅菌 PBS) およびアリコートサンプルに含めます。
  3. エレクトロポレーターの設定をプログラムするには、セレクトホイールを使用し、ホイールを押し下げて、モード - LV、電圧 - 12.5 V/mm(注入時に調整)、パルス長 - 20 ms、パルス数 - 5、間隔 - 200 ms、極性 - ユニポーラ。
  4. イソフルランガスを用いてマウスを麻酔する。マウスを5%イソフルランを含む誘導箱に入れる。鉗子を使用してつま先ピンチ反射がないことによって麻酔の手術面を確認し、イソフルランを2%の維持用量に減らす。マウスを、残りの手順のために37°Cの循環水プレートに載せた適切な鼻錐に移す。
  5. 小さなバリカンを使用して両方の後肢から髪を取り除きます。注射領域を消毒するために交互に70%エタノール/ベタジンで下肢をこする。

2. TAインジェクション/エレクトロポレーション

  1. マウスを仰臥位に置いた状態で、下肢の側方の皮膚を通して見えるTA腱の位置を突き止める。取り外し可能な30G針を備えた50μLマイクロシリンジを使用して、針が筋肉の上端に達するまで、筋腱接合部よりも1〜2mm優れた針を浅い5°の角度で挿入する。
    注:筋肉の中央への注射が目標です。
  2. 注射経路に沿って針をゆっくりと引き込みながらプランジャーをゆっくりと押し下げて、50 μLのプラスミド溶液を送達します。筋肉は腫れるはずです。
  3. タイマーを1分間設定し、TAで脚の太さを測定します。マウスのサイズに応じて、これは5〜10mmの範囲であり得る。ノギス電極を測定された厚さに設定し、エレクトロポレーター電圧を12.5 V/mmに設定します。
  4. 1分後、キャリパー電極を下肢の周囲に置きます。電極はぴったりとくっついている必要がありますが、過度にきつくてはなりません。20ミリ秒の持続時間と200ミリ秒の間隔で5つの方形波パルスを送達する(筋肉は各パルスで痙攣するべきである)。
  5. コントロールベクトルを使用して、代替肢で繰り返します。
  6. マウスを麻酔から外し、37°Cに設定した加熱パッドで回復させます。 回復したら、マウスをケージに戻します。

3. EDL注入/エレクトロポレーション

  1. マウスを仰臥位に置いた状態で、視覚的および穏やかな触診を通して脛骨前紋を見つける。
    1. メスを用いて、膝より5mm下方の脛骨前堤の外側の皮膚からTA筋腱接合部より2mm優れた浅い切開を行う。
    2. 小さなはさみを使用して、筋膜を鈍く解剖し、TA筋肉を露出させる。
    3. ここでも、はさみによる鈍い解剖を用いて、筋肉を横方向に引っ張ってTA筋を脛骨から優しく分離し、EDLを露出させる。小さく湾曲した鉗子を使用して、手順中にTAをEDLから明確に保つことができます。
  2. 取り外し可能な30G針を備えた50μLマイクロシリンジを使用して、針が筋肉の上端に達するまで針を縦方向にEDLに挿入する。
  3. 注射経路に沿って針をゆっくりと引っ込めながらプランジャーをゆっくりと押し下げ、10μLのプラスミド溶液を注入します(筋肉は腫れます)。
  4. タイマーを1分間設定し、EDLで脚の太さを測定します。マウスのサイズに応じて、これは5〜10mmの範囲であり得る。ノギス電極を測定された厚さに設定し、エレクトロポレーター電圧を12.5 V/mmに設定します。
  5. 1分後、キャリパー電極を下肢の周囲に置きます。電極はぴったりとくっついている必要がありますが、過度にきつくてはなりません。20ミリ秒の持続時間と200ミリ秒の間隔で5つの方形波パルスを送達する(筋肉は各パルスで痙攣するべきである)。
  6. 使い捨ての4/0非吸収性ナイロン縫合糸を使用して切開部を閉じます。
  7. 代替肢で繰り返すか、絶対的な制御として手足を手つかずのままにしておきます。
  8. マウスを麻酔から外し、37°Cに設定した加熱パッドで回復させます。 手術直後および手術後12〜24時間に適切な皮下鎮痛剤を投与する。回復したら、マウスをケージに戻します。
    注:以前の研究では、エレクトロポレーション直後のTAの筋肉収縮性欠損および収縮性回復が3日間にわたって起こることが示されている13,15。このため、組織学、タンパク質発現、または筋収縮性に関するTAおよびEDL筋の両方の解析は、エレクトロポレーションの3〜10日後に行われる。EGFPの長期発現は、手順13に続いて3週間まで観察された。

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Representative Results

骨格筋における遺伝子導入を促進するエレクトロポレーションは、筋肉生理学の変化を評価するために使用される有用な技術である。我々は、TAおよびEDL筋肉の両方で効率的な遺伝子導入を達成するための詳細なステップバイステップの手順を実証した。トランスフェクション効率の違いは、多数の変数のために発生します。これらの変数には、エレクトロポレーションパラメータ(パルス、電圧、パルス持続時間など)、遺伝子構築物のサイズ、および注入されたDNAの濃度/体積が含まれます。我々は以前、125V/cmで5パルスのエレクトロポレーションパラメータを200ms間隔で区切った20msの持続時間で、TA14における効率的な遺伝子導入を達成するのに十分であることを示した。我々はまた、現在の研究において、DNAの注入/エレクトロポレーションが実験後3日間のEDLにおいて筋肉収縮性の喪失を引き起こさないことを実証する。

遺伝子導入を可視化するために、pcDNA3−EGFPまたはpcDNA3(対照)構築物をマウスTAまたはEDL筋肉にエレクトロポレーションした。手順の3日後、TAまたはEDLを注意深く解剖し、最適切断温度(OTC)培地に入れ、液体窒素冷却イソペンタン(2−メチルブタン)中で急速凍結した(前述のように、14、17、18、19。各筋肉の中腹部から採取したクライオスタットを用いて10μmの筋肉切片を得た。次いで、切片を1%パラホルムアルデヒド中で5分間インキュベートし、続いてPBS中で3〜5分間洗浄した。次いで、切片を、PBSで1:100に希釈したテキサスレッドにコンジュゲートした小麦胚芽凝集体中で、暗所で90分間インキュベートした。切片をPBSでそれぞれ5分間3回再度洗浄した。次いで、筋肉切片を水性マウント媒体中でカバースリップし、594nmの波長(赤色)で画像化して個々の筋線維を視覚化し、480nmの波長でGFPを検出した(図1A)。pcDNA3を注射した対照筋肉を、潜在的な自己蛍光を制御するために、同じ曝露設定で両方のチャネルで画像化した。EGFPを注入/エレクトロポレーションした筋肉は陽性の緑色線維を示し、pcDNA3-EGFP構築物の取り込みを示したが、pcDNA3を注入/エレクトロポレーションした筋肉(対照)は緑色の陽性線維を示さなかった。我々および他の人々は、同じ筋肉切片内のGFP陽性線維(緑色)と非GFP発現線維(黒色)を比較することによって、筋線維断面積がGFP発現によって損なわれないことを以前に示した4、6、19。より低い倍率で画像化した場合、EDL筋トランスフェクション効率は、緑色繊維(陽性)対黒色線維(陰性)の出現を通して視覚化される(図1B)。この手順を用いたトランスフェクション効率は、3つのEDL筋肉で測定したところ、56.6%±4.7%であった。このデータは、TA筋の注入およびエレクトロポレーションが効率的な遺伝子導入に十分であることを示している。さらに、EDLの注入およびエレクトロポレーションは、遺伝子構築物の効率的な取り込みを惹起する。

骨格筋生理学の評価のための重要なツールは、筋肉収縮性の測定である。以前の研究者らは、その場で測定されたTAの収縮性が、後肢13の注入およびエレクトロポレーション後の早期に損なわれ得ることを示した。注入およびエレクトロポレーション後にEDL収縮性が損なわれるかどうかを試験するために、EDLを外科的に露出させ、pcDNA3-EGFPまたは構築物を注入し、後肢をエレクトロポレーションした。対照として、代替肢は比較のために手つかずのまま残された。マウスを3日後に安楽死させ、EDL全筋収縮性を、生理学的浴中での野蛮刺激を用いて測定した(前述のように14、19、20、21)。簡単に言うと、EDLを解剖し、腱を4/0シルク縫合糸を介してステンレス鋼フックに接続し、力変換器と静的ベースの間に吊り下げました。筋肉を生理学的浴液であるタイロード緩衝液(121 mM NaCl、5.0 mM KCl、1.8 mM CaCl 2、0.5 mM MgCl2、0.4 mM NaH2 PO4、24 mM NaHCO3、0.1mM EDTA、5.5 mM グルコース)に浸し、手順全体を通して100%酸素でバブリングした。筋肉収縮は、最大超刺激を送達するために白金電極を用いて刺激された。筋肉最適長さ(Lo)は、処置の開始時に最大力をもたらすように調整した。力と周波数の関係は、1〜150Hz(最大電圧で0.5msパルス)の刺激周波数を使用して決定した。筋肉を各刺激の間に3分間弛緩させた。刺激手順が完了した後、筋肉の重量および長さを測定した。比力は、絶対力を筋肉断面積全体に正規化し、重量を長さで割った値として計算し、以前に決定した筋肉密度定数(1.056kg/m−3)を使用して計算した21。我々は、代表的な注入およびエレクトロポレーションEDLが、対照の非注入またはエレクトロポレーション筋肉と比較して、100Hzで同様の破傷風応答を有することを示した(図2Aおよび図2B)。我々は、筋肉破傷風力、特異的破傷風力、ピーク張力までの時間、および半分の弛緩時間が、手つかずの対照と比較して注入およびエレクトロポレーションEDLにおいて損なわれないことを発見した(表1)。我々のデータは、収縮性に影響を及ぼすタンパク質発現が、有害作用を引き起こすことなくEDLにおけるエレクトロポレーションを用いて調節され得ることを実証している。

Figure 1
図1:pcDNA3-EGFPのエレクトロポレーションは、TAおよびEDL筋肉におけるDNA取り込みに十分である。A) TAおよびEDLコントロール(コントロールベクターを注入し、125V/cmをエレクトロポレーション)およびGFP(pcDNA3-EGFPを注入し、125V/cmをエレクトロポレーション)からの代表的な断面。スケールバー 50 μm. B) トランスフェクション効率を実証するEDLからの代表的な断面。スケール バー 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:注射とエレクトロポレーションは筋肉機能を損なわない。A)非注入/エレクトロポレーションEDL(コントロール)およびB)注入/エレクトロポレーションEDL(GFP)からの100Hzでの代表的な破傷風力曲線。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

制御 (n=3) GFP (n=3) p値
FO (g) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1.55 0.1918
sFO (kN/m2) 691.56 ± 45.80 660.00 ± 33.61 0.3917
TTP (秒) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
RT1/2 (秒) 0.035 ± 0.0035 0.033 ± .0031 0.6458
制御 - 非注入/非エレクトロポレーション;GFPをpcDNA3-EGFPで注入し、エレクトロポレーションした。値はSD ±平均値で、p=0.05 は有意と見なされます。F0-100Hzでの生破傷風力、100HzでのsF0-破傷風比力、TTP-1Hzでのピークまでの時間、RT1/2-1Hzでの半緩和までの時間。

表1:コントロールとエレクトロポレーションEDLによる全筋収縮性。 表は、非注入/非エレクトロポレーション対照と比較して、注入/エレクトロポレーションEDL(GFP)において異なる筋力パラメータが損なわれないことを示す。F0 = 100 Hz における破傷風力、sF0 = 100 Hz における比破傷風力、TTP = 1 Hz におけるピーク張力までの時間、RT1/2 = 半緩和時間。学生の t 検定;p = 0.05での有意性。n = 3。

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Discussion

エレクトロポレーションによって増強された骨格筋におけるインビボ遺伝子導入は、筋肉におけるタンパク質発現を調節するための有用で比較的単純なツールである。我々は、EDLおよびTA筋肉における効率的な遺伝子導入を達成するために必要なステップを示し、EDLの収縮性測定が手順に従って実行可能であることを実証した。この技術は、より複雑なウイルスベクターを必要とせず、単一の筋肉におけるトランスフェクトおよび非トランスフェクト筋線維断面積の比較を可能にする。この手順の限界は、コンストラクトの取り込み効率が完全ではなく、一部の筋線維がトランスフェクトされていないままであったことです。

議論される手順は、発現ベクターのエレクトロポレーションに限定されない。我々は以前、タンパク質ノックダウンが同じ手順に従うことによって達成できることを示したが、in vivoでsiRNAまたはshRNA構築物のいずれかを使用する14。さらに、レポーター構築物は、標的遺伝子2、4、22の転写活性を測定するために利用することができる。これらのツールは、単一の骨格筋で同時に複数のタンパク質を操作することを可能にすると同時に、研究者に転写変化を容易に測定するオプションを提供する。骨格筋は、発現またはsh/siRNAベクターと蛍光レポーターとを同時トランスフェクトすることもできる。研究によると、あるベクターを取り込む筋線維の95%以上が別のベクター23も取り込むことが示されています。これは、タグ付きコンストラクトが実行できない場合に便利です。同様の実験は、ヒラメ、腓腹筋、大腿四頭筋、屈筋デジトルム・ブレビスなど、さまざまな筋肉で実施することができます24。この手順はマウスに限定されない。ラットは筋肉遺伝子導入に広く使用されてきたが、注入量、DNA濃度、およびエレクトロポレーションパラメータの変化を考慮する必要がある。重要なことに、エレクトロポレーションが広い領域に適用されると遺伝子導入効率が低下し、より大きな筋肉は複数回の注射24を必要とすることがある。

遺伝子導入後動物は、様々な生理学的および病態生理学的状態を研究するために使用することができる。考慮に入れるべきこの手順の有効性の主な決定要因は、所望の構築物のトランスフェクション効率および研究の期間である。タンパク質発現の増加はエレクトロポレーション12の270日後まで観察されているが、研究は経時的な発現の減少があることを示している13、25。この手順の単純さと有効性は、骨格筋生理学の研究に非常に適用可能にします。

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Disclosures

B.A.H.およびD.L.W.は、利益相反を主張しません。

Acknowledgments

何一つ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

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生物学 第182号
マウス骨格筋へのプラスミドDNAのエレクトロポレーション
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Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

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