Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektroporation af plasmid-DNA i musens skeletmuskel

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

Elektroporation af plasmid-DNA i skeletmuskulatur er en levedygtig metode til at modulere genekspression uden at gå på kompromis med muskelkontraktilitet hos mus.

Abstract

Transient genekspressionsmodulation i murine skeletmuskulatur ved plasmidelektroporation er et nyttigt værktøj til vurdering af normal og patologisk fysiologi. Overekspression eller knockdown af målgener gør det muligt for efterforskere at manipulere individuelle molekylære begivenheder og dermed bedre forstå de mekanismer, der påvirker muskelmasse, muskelmetabolisme og kontraktilitet. Derudover giver elektroporation af DNA-plasmider, der koder for fluorescerende tags, efterforskere mulighed for at måle ændringer i subcellulær lokalisering af proteiner i skeletmuskulatur in vivo. En vigtig funktionel vurdering af skeletmuskulatur omfatter måling af muskelkontraktilitet. I denne protokol viser vi, at undersøgelser af hele muskelkontraktilitet stadig er mulige efter plasmid-DNA-injektion, elektroporation og genekspressionsmodulation. Målet med denne instruktionsprocedure er at demonstrere den trinvise metode til DNA-plasmidelektroporation i museskeletmuskulatur for at lette optagelse og ekspression i myofibrene i tibialis forreste og extensor digitorum longus muskler samt at demonstrere, at skeletmuskelkontraktilitet ikke kompromitteres ved injektion og elektroporation.

Introduction

Plasmid DNA-elektroporation i skeletmuskulatur in vivo er et vigtigt redskab til vurdering af ændringer i skeletmuskelfysiologi og molekylær signalering ved at modulere genekspression i en række fysiologiske og patofysiologiske tilstande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Eksperimentel genoverførsel til skeletmuskulatur blev demonstreret allerede i 1990 af Wolff et al., hvor både RNA og DNA med succes blev overført uden elektroporation, og luciferaseekspression blev opretholdt i mindst 2 måneder10. Den relativt lave transfektionseffektivitet kun med injektion er problematisk, og Aihara og Miyazaki demonstrerede øget genoverførsel med elektroporation i 1998 ved at elektroporere en pCAGGS-IL-5-konstruktion i tibialis forreste (TA) muskel og måle serum IL-5-ekspression11. Siden da har mange undersøgelser undersøgt effekten af forskellige DNA-koncentrationer, volumener og elektroporationsparametre for at sikre maksimal genoverførselseffektivitet. Mir et al. testede forskellige elektroporationsparametre, herunder spænding, pulstal, pulsvarighed og frekvens samt DNA-koncentration og fastslog, at større spænding, pulstal og DNA-koncentration alle bidrog til øget elektroporationseffektivitet12. En stor advarsel mod høj elektroporationsspænding er, at mens det letter øget DNA-optagelse i myofibre, forårsager det også muskelskader, hvilket kan forvirre resultaterne. Schertzer et al. viste, at elektroporation ved 200 V forårsagede skade i omkring 50% af myofibrene 3 dage efter elektroporation, mens kun 10% af myofibrene blev beskadiget ved 50 V13. Vi har taget højde for de variabler, der påvirker effektiv DNA-overførsel versus muskelskade og fundet ud af, at en spænding på 125 V pr. Centimeter kaliberbredde er tilstrækkelig til at opnå effektiv genoverførsel.

Analyse af muskelfibertværsnitsareal og hel muskelkontraktilitet efter elektroporation er vigtige aspekter af metoden til måling af ændringer i muskelstørrelse og funktion på grund af genmodulation. Vi og andre har tidligere vist, at elektroporation af kontrolvektorer alene ikke forårsager et fald i myofiberområdet. Konstruktionen af det grønne fluorescerende protein (EGFP) var en nyttig fluorescerende indikator for DNA-transfektion i disse undersøgelser13,14. En række undersøgelser har undersøgt in situ kontraktilitet af TA efter elektroporation og fundet varierende resultater. En undersøgelse viste, at 75 V / cm elektroporation forårsagede ca. 30% reduktion i tetanisk kraft 3 dage efter elektroporation, og ved 7 dage efter elektroporation var tetanisk kraft tilbage til kontrolniveauet, mens 50 V / cm elektroporation ikke kompromitterede kraft13,15. En anden undersøgelse viste, at der var et tab på 30% af tetanisk kraft 3 timer efter 180 V / cm elektroporation, som kom sig til de falske kraftniveauer efter 7 dage16.

I den følgende detaljerede procedure demonstrerer vi injektion og elektroporation af et pcDNA3-EGFP plasmid i TA og extensor digitorum longus (EDL) muskler hos mus. Vi viser også, at denne metode ikke påvirker EDL helmuskelkontraktilitet. Målet er at demonstrere effektiv plasmidoptagelse i myofibre uden at forårsage tab af funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med dyr blev udført på Penn State College of Medicine, godkendt af Penn State University's Institutional Animal Care and Use Committee og udført i overensstemmelse med de etiske standarder, der er fastsat i Helsinki-erklæringen fra 1964 og dens senere ændringer. 12 uger gamle C57BL/6-hunmus blev anvendt til denne procedure. Alle kirurgiske værktøjer blev autoklaveret for sterilitet inden eksperimentering.

1. Forberedelse af injektion/elektroporation af TA og EDL

BEMÆRK: Disse trin er identiske for TA- og EDL-injektions-/elektroporationsforberedelse.

  1. Ekspressionsplasmidet renses til en koncentration på 1 μg/μL fortyndet i steril PBS forud for forsøget. Til denne procedure blev et kommercielt tilgængeligt endotoksinfrit rensningssæt anvendt til at rense pcDNA3-EGFP (GFP) eller pcDNA3 tom vektor (kontrol).
  2. Plasmidkoncentrationen beregnes for at sikre et tilstrækkeligt injektionsvolumen (TA 50 μg DNA i 50 μL steril PBS. EDL 10 μg DNA i 10 μL sterile PBS) og aliquotprøver.
  3. Programmer elektroporatorindstillingerne ved hjælp af valghjulet og tryk på hjulet for at vælge parametrene som følger: Tilstand - LV, Spænding - 12,5 V / mm (justeres på injektionstidspunktet), pulslængde - 20 ms, antal impulser - 5, interval - 200 ms, polaritet - unipolær.
  4. Bedøv musene ved hjælp af isoflurangas. Anbring musene i en induktionsboks med 5% isofluran. Bekræft det kirurgiske anæstesiplan ved fravær af tåspidsrefleksen ved hjælp af pincet og reducer isofluran til 2% vedligeholdelsesdosis. Musene overføres til en passende næsekegle, der hviler på en cirkulerende vandplade ved 37 °C, resten af proceduren.
  5. Fjern hår fra begge bagben ved hjælp af små hårklippere. Skrub underekstremiteterne med skiftevis 70% ethanol/betadin for at desinficere injektionsområdet.

2. Ta-injektion/elektroporation

  1. Med musen i en liggende stilling skal du lokalisere TA-senen synlig gennem huden på den laterale side af underbenet. Ved hjælp af en 50 μL mikrosprøjte med en aftagelig 30 G nål indsættes nålen 1-2 mm over det myotendinøse kryds i en lav vinkel på 5 °, indtil nålen når den overlegne ende af musklen.
    BEMÆRK: Injektion i midten af musklen er målet.
  2. Tryk langsomt stemplet ned, mens du langsomt trækker nålen tilbage langs injektionsbanen for at levere 50 μL plasmidopløsning. Musklen skal svulme.
  3. Indstil timeren i 1 min og mål tykkelsen af benet ved TA. Afhængigt af musens størrelse kan dette være fra 5-10 mm. Kaliberelektroderne indstilles til den målte tykkelse, og elektroporatorspændingen indstilles til 12,5 V/mm.
  4. Efter 1 min placeres kaliberelektroderne omkring underekstremiteten. Elektroderne skal være tætte, men ikke alt for stramme. Lever 5 firkantede bølgeimpulser med 20 ms varighed og 200 ms intervaller (musklen skal rykke med hver puls).
  5. Gentag med det alternative lem ved hjælp af kontrolvektoren.
  6. Fjern musen fra anæstesien, og lad den komme sig på en varmepude indstillet til 37 °C. Når den er genoprettet, skal du returnere musen til buret.

3. EDL-injektion/elektroporation

  1. Med musen i en liggende position skal du lokalisere skinnebensknoglens forreste kam visuelt og gennem blid palpation.
    1. Brug en skalpel til at lave et lavt snit gennem huden på den laterale side af skinnebenets forreste kam 5 mm ringere end knæet til 2 mm bedre end TA myotendinous junction.
    2. Brug en lille saks til at dissekere fasciaen og udsætte TA-musklen.
    3. Igen, ved hjælp af stump dissektion med saks, adskille TA-musklen fra skinnebenet forsigtigt ved at trække musklen sideværts og udsætte EDL. Små, buede pincet kan bruges til at holde TA fri fra EDL under proceduren.
  2. Brug en 50 μL mikrosprøjte med en aftagelig 30 G nål til at indsætte nålen i EDL i længderetningen, indtil nålen når den overlegne ende af musklen.
  3. Tryk langsomt stemplet ned, mens du langsomt trækker nålen tilbage langs injektionsvejen for at injicere 10 μL af plasmidopløsningen (musklen skal svulme op).
  4. Indstil en timer i 1 min og mål tykkelsen af benet ved EDL. Afhængigt af musens størrelse kan dette være fra 5-10 mm. Kaliberelektroderne indstilles til den målte tykkelse, og elektroporatorspændingen indstilles til 12,5 V/mm.
  5. Efter 1 min placeres kaliberelektroderne omkring underekstremiteten. Elektroderne skal være tætte, men ikke alt for stramme. Lever 5 kvadratbølgeimpulser med 20 ms varighed og 200 ms intervaller (muskel skal rykke med hver puls).
  6. Luk snittet ved hjælp af engangs 4/0 ikke-absorberbare nylon suturer.
  7. Gentag med det alternative lem eller lad lemmet være uberørt som absolut kontrol.
  8. Fjern musen fra anæstesien, og lad den komme sig på en varmepude indstillet til 37 °C. Administrer et passende subkutant analgetikum umiddelbart efter operationen og 12-24 timer efter operationen. Når den er genoprettet, skal du returnere musen til buret.
    BEMÆRK: Tidligere undersøgelser har vist et muskelkontraktilitetsunderskud i TA umiddelbart efter elektroporation, og at kontraktil genopretning sker i løbet af 3 dage13,15. Af denne grund udføres analysen af både TA- og EDL-musklerne for histologi, proteinekspression eller muskelkontraktilitet 3-10 dage efter elektroporation. Langvarig ekspression af EGFP er blevet observeret op til 3 uger efter proceduren13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Elektroporation for at lette genoverførsel i skeletmuskulatur er en nyttig teknik, der bruges til at evaluere ændringer i muskelfysiologi. Vi har demonstreret en detaljeret, trin-for-trin procedure for at opnå effektiv genoverførsel i både TA- og EDL-musklerne. Forskelle i transfektionseffektivitet opstår på grund af en række variabler. Blandt disse variabler er elektroporationsparametre (pulser, spænding, pulsvarighed osv.), Genkonstruktionsstørrelse og koncentration / volumen af injiceret DNA. Vi har tidligere vist, at elektroporationsparametre på 5 impulser ved 125 V/cm, med 20 ms varighed adskilt af 200 ms intervaller, er tilstrækkelige til at opnå effektiv genoverførsel i TA14. Vi viser også i den aktuelle undersøgelse, at injektion / elektroporation af DNA ikke forårsager tab af muskelkontraktilitet i EDL 3-dages post-eksperimentering.

For at visualisere genoverførsel blev en pcDNA3-EGFP- eller pcDNA3-konstruktion (kontrol) elektroporeret til mus TA- eller EDL-muskel. 3 dage efter proceduren blev TA eller EDL omhyggeligt dissekeret, anbragt i medier med optimal skæretemperatur (OTC) og snapfrosset i flydende nitrogenkølet isopentan (2-methylbutan) som tidligere beskrevet 14,17,18,19. 10 μm muskelsektioner blev opnået ved hjælp af en kryostat taget fra midten af maven af hver muskel. Sektioner blev derefter inkuberet i 1% paraformaldehyd i 5 min, efterfulgt af 3-5 minutters vask i PBS. Sektioner blev derefter inkuberet i hvedekim agglutinin konjugeret til Texas Red fortyndet 1:100 i PBS i 90 minutter i mørke. Sektioner blev igen vasket i PBS 3 gange i 5 minutter hver. Muskelsektioner blev derefter dækket i vandige monteringsmedier og afbildet i 594 nm bølgelængde (rød) for at visualisere de enkelte muskelfibre og i 480 nm bølgelængde for at detektere GFP (figur 1A). Kontrolmusklerne injiceret med pcDNA3 blev afbildet i begge kanaler med de samme eksponeringsindstillinger for at kontrollere for potentiel autofluorescens. Muskler injiceret / elektroporeret med EGFP viste positive grønne fibre, der demonstrerede optagelse af pcDNA3-EGFP-konstruktionen, mens muskler injiceret / elektroporeret med pcDNA3 (kontrol) viste ingen grønne positive fibre. Vi og andre har tidligere vist, at myofibertværsnitsarealet ikke kompromitteres af GFP-ekspression ved at sammenligne GFP-positive fibre (grøn) med ikke-GFP-ekspressive fibre (sort) inden for de samme muskelafsnit 4,6,19. Når det afbildes ved en lavere forstørrelse, visualiseres EDL-muskeltransfektionseffektivitet gennem udseendet af grønne fibre (positive) versus sorte fibre (negativ) (figur 1B). Transfektionseffektiviteten ved hjælp af denne procedure var 56,6% ± 4,7%, målt i 3 EDL-muskler. Disse data viser, at injektion og elektroporation af TA-musklen er tilstrækkelig til effektiv genoverførsel. Derudover fremkalder injektion og elektroporation af EDL effektiv optagelse af genkonstruktioner.

Et vigtigt redskab til evaluering af skeletmuskelfysiologi er måling af muskelkontraktilitet. Tidligere undersøgelser har vist, at kontraktiliteten af ta målt in situ kan blive kompromitteret tidligt efter injektion og elektroporation af bagbenet13. For at teste, om EDL-kontraktiliteten er kompromitteret efter injektion og elektroporation, udsatte vi EDL kirurgisk, injicerede den med pcDNA3-EGFP eller konstruerede og elektroporerede bagbenet. Som en kontrol blev det alternative lem uberørt til sammenligning. Musene blev aflivet 3 dage senere, og EDL helmuskelkontraktiliteten blev målt ved hjælp af feltstimulering i et fysiologisk bad, som tidligere beskrevet 14,19,20,21. Kort fortalt blev EDL dissekeret, og senerne blev bundet via 4/0 silke sutur til rustfrit stål kroge og ophængt mellem en krafttransducer og statisk base. Musklerne blev badet i Tyrode buffer, som er en fysiologisk badeopløsning (121 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2, 0,4 mM NaH2PO4, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA, 5,5 mM glukose) og boblet med 100% ilt under hele proceduren. Muskelkontraktion blev stimuleret ved hjælp af platinelektroder for at levere en supramaksimal stimulus. Muskel optimal længde (Lo) blev justeret for at give den maksimale kraft i begyndelsen af proceduren. Forholdet mellem kraft og frekvens blev bestemt ved hjælp af stimuleringsfrekvenser mellem 1-150 Hz (0,5 ms impulser ved supramaksimal spænding). Musklen fik lov til at slappe af i 3 minutter mellem hver stimulering. Efter stimuleringsproceduren blev afsluttet, blev muskelens vægt og længde målt. Den specifikke kraft blev beregnet ved at normalisere den absolutte kraft til hele muskeltværsnitsarealet, som beregnes som vægten divideret med længden og ved hjælp af den tidligere bestemte muskeltæthedskonstant (1.056 kg / m-3)21. Vi har vist, at repræsentative injicerede og elektroporerede EDL'er har lignende tetaniske reaktioner ved 100 Hz sammenlignet med kontrol ikke-injicerede eller elektroporerede muskler (figur 2A og figur 2B). Vi fandt, at muskel tetanisk kraft, specifik tetanisk kraft, tid til topspænding og halv afslapningstid ikke blev kompromitteret i den injicerede og elektroporerede EDL sammenlignet med den uberørte kontrol (tabel 1). Vores data viser, at proteinekspression, der påvirker kontraktilitet, kan moduleres ved hjælp af elektroporation i EDL uden at forårsage bivirkninger.

Figure 1
Figur 1: Elektroporation af pcDNA3-EGFP er tilstrækkelig til DNA-optagelse i TA- og EDL-muskler. A) Repræsentative tværsnit fra TA- og EDL-kontroller (injiceret med kontrolvektor og elektroporeret 125 V / cm) og GFP (injiceret med pcDNA3-EGFP og elektroporeret 125 V / cm). Skalabjælke 50 μm. B) Repræsentativt tværsnit fra EDL, der viser transfektionseffektivitet. Skalalinje 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Injektion og elektroporation kompromitterer ikke muskelfunktionen. Repræsentative tetaniske kraftkurver ved 100 Hz fra A) ikke-injiceret / elektroporeret EDL (kontrol) og B) injiceret / elektroporeret EDL (GFP). Klik her for at se en større version af denne figur.

Kontrol (n=3) GFP (n=3) p-værdi
FO (g) 34.13 ± 1.15 35,87 ± 1,55 0.1918
sFO (kN/m2) 691,56 ± 45,80 660,00 ± 33,61 0.3917
TTP (sek.) 0,249 ± 0,0203 0,247 ± 0,0197 0.9084
RT1/2 (sek.) 0,035 ± 0,0035 0,033 ±,0031 0.6458
Kontrol -ikke-injiceret / ikke-elektroporeret; GFP-injiceret med pcDNA3-EGFP og elektroporeret. Værdier er middelværdier ± SD. p = 0,05 betragtes som signifikant. F0- Rå tetanisk kraft ved 100Hz, sF 0-tetanisk specifik kraft ved 100Hz, TTP- Tid til at toppe ved 1Hz, RT1/2- Tid til halv afslapning ved 1Hz.

Tabel 1: Hel muskelkontraktilitet fra kontrol versus elektroporerede EDL'er. Tabel, der viser, at forskellige muskelkraftparametre ikke kompromitteres i injicerede / elektroporerede EDL'er (GFP) sammenlignet med ikke-injicerede / ikke-elektroporerede kontroller. F0 = tetanisk kraft ved 100 Hz, sF0 = specifik tetanisk kraft ved 100 Hz, TTP = tid til maksimal spænding ved 1 Hz, RT1/2 = halv afslapningstid. Elevens t-test; Betydning ved p = 0,05. n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In vivo-genoverførsel i skeletmuskulatur forstærket ved elektroporation er et nyttigt og relativt simpelt værktøj til modulering af proteinekspression i muskler. Vi har vist de trin, der kræves for at opnå effektiv genoverførsel i EDL- og TA-musklerne og demonstreret, at kontraktilitetsmåling af EDL er levedygtig efter proceduren. Denne teknik kræver ikke mere komplicerede virale vektorer og giver mulighed for sammenligning af transinficeret og ikke-transficeret muskelfiber tværsnitsareal i en enkelt muskel. En begrænsning for denne procedure er, at konstruktionens optagelseseffektivitet ikke var fuldstændig, og nogle myofibre forblev ikke-transficeret.

De diskuterede procedurer er ikke begrænset til elektroporation af ekspressionsvektorer. Vi har tidligere vist, at protein knockdown kan opnås ved at følge de samme procedurer, men ved hjælp af enten siRNA- eller shRNA-konstruktioner in vivo14. Derudover kan reporterkonstruktioner bruges til at måle transkriptionsaktiviteten af målgener 2,4,22. Disse værktøjer giver mulighed for manipulation af flere proteiner samtidigt i en enkelt skeletmuskulatur, samtidig med at investigator får mulighed for let at måle transkriptionelle ændringer. Skeletmuskulatur kan også co-transficeret med en ekspression eller sh / siRNA vektor og fluorescerende reporter. Undersøgelser har vist, at op mod 95% af muskelfibre, der optager en vektor, også vil optage en anden vektor23. Dette er nyttigt, når mærkede konstruktioner ikke er levedygtige. Lignende eksperimenter kan udføres i forskellige muskler, herunder soleus, gastrocnemius, quadriceps og flexor digitorum brevis, blandt andre24. Proceduren er ikke begrænset til mus. Rotter er blevet brugt i vid udstrækning til muskelgenoverførsel, men ændringer i injektionsvolumen, DNA-koncentration og elektroporationsparametre bør overvejes. Det er vigtigt, at genoverførselseffektiviteten falder, når elektroporation påføres store områder, og større muskler kan kræve flere injektioner24.

Dyr efter genoverførsel kan bruges til at studere en række fysiologiske og patofysiologiske tilstande. De vigtigste determinanter for effektiviteten af denne procedure, der skal tages i betragtning, er transfektionseffektiviteten af den ønskede konstruktion og undersøgelsens varighed. Mens øget proteinekspression er blevet observeret så længe som 270 dage efter elektroporation12, har undersøgelser vist, at der er en reduktion i ekspression over tid13,25. Enkelheden og effektiviteten af denne procedure gør den yderst anvendelig til undersøgelsen af skeletmuskelfysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. og D.L.W hævder ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

Biologi udgave 182
Elektroporation af plasmid-DNA i musens skeletmuskel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter