小鼠大脑中动脉闭塞诱导卒中后脑肌吻合术治疗模型

摘要

本方案旨在提供一种将带血管蒂的颞肌瓣移植至缺血性脑组织软脑膜表面的脑-肌-血管融合术，用于治疗非烟雾病性急性缺血性卒中。通过小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型，评估该方法在促进血管新生方面的有效性。

摘要

目前大多数缺血性卒中患者尚无有效的治疗方法，因此开发新的治疗手段势在必行。脑组织在缺血性卒中后自我修复的能力受限于受损区域的血液供应不足。脑-肌吻合术（Encephalomyosynangiosis, EMS）是一种神经外科手术，可促进烟雾病患者的血管新生。该手术包括开颅，并将带血管的颞肌移植物置于缺血性脑表面。EMS 尚未在小鼠急性缺血性卒中模型中进行过研究。本研究的假设是，EMS 可增强移植物周围皮质表面的脑血管新生。本文所示方案描述了该手术的操作流程，并提供了初步数据以支持 EMS 方法的可行性和有效性。在本方案中，小鼠经历60分钟短暂性大脑中动脉阻塞（MCAo）后，被随机分为 MCAo 组或 MCAo + EMS 治疗组。EMS 手术在阻塞后3-4小时进行。小鼠在 MCAo 或 MCAo + EMS 治疗后7天或21天被处死。采用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-四唑盐还原酶（nicotinamide adenine dinucleotide reduced-tetrazolium reductase）检测法评估颞肌移植物的存活能力。利用小鼠血管新生阵列定量分析促血管生成和神经调节蛋白的表达水平。通过免疫组织化学染色观察移植物与脑皮层的结合情况以及血管密度的变化。此处的初步数据显示，移植的肌肉组织在 EMS 术后21天仍保持活性。免疫染色显示移植物成功植入，并在肌肉移植物附近观察到血管密度增加，提示血管新生增强。数据表明，EMS 可在卒中后上调成纤维细胞生长因子（FGF）水平，并降低骨桥蛋白（osteopontin）水平。此外，卒中后实施 EMS 未增加死亡率，表明该方案安全可靠。这一新型手术方法有效且耐受性良好，有望为促进急性缺血性卒中后血管新生的新型干预措施提供重要信息。

引言

缺血性卒中是一种具有严重慢性后遗症的急性神经血管损伤。在美国，每年有65万名卒中幸存者，其中大多数长期遭受功能性残疾的困扰¹。目前尚无任何可用的治疗方法可在缺血性卒中急性期后提供神经保护或促进功能恢复。急性缺血性卒中发生后，直接供血和侧支循环血流均减少，导致脑细胞和神经网络功能障碍，从而引发突发性神经功能缺损^2,3。恢复缺血区域的血液供应仍是卒中治疗的首要目标。因此，通过促进缺血区域的血管新生以改善血液供应，是一种具有前景的治疗策略；然而，既往研究的促进卒中后血管新生的方法，包括促红细胞生成素、他汀类药物和生长因子等，均因毒性过高或临床转化能力不足而受到限制⁴。

脑肌血管融合术（Encephalomyosynangiosis，EMS）是一种外科手术，可增强烟雾病患者的大脑血管生成。烟雾病是一种颅内动脉狭窄的疾病，常导致中风。EMS手术包括将患者颞肌的血管部分从颅骨上部分剥离，随后进行开颅手术，并将该肌肉移植至受累的大脑皮层。该手术耐受性良好，能够诱导脑部血管生成，降低烟雾病患者发生缺血性中风的风险^5,6。因此，该手术在这些患者中主要起到预防作用。通过该手术引发的血管生成还可能在缺血性中风情况下促进神经血管保护与功能恢复。本研究报告支持如下假说：EMS所诱导的血管生成有望拓展人们对脑缺血机制的理解，并提供新的治疗选择。

除了电刺激（EMS）外，还有多种药理学和外科方法可促进血管生成，但这些方法存在若干局限性。例如，给予血管内皮生长因子（VEGF）等药理学手段已被发现效果不足甚至有害，其局限性包括形成混乱、无序、渗漏且原始的血管丛，这类结构类似于肿瘤组织中的血管^7,8，且在临床试验中未显示出有益效果⁹。

手术方法包括直接吻合，如颞浅动脉-大脑中动脉吻合术，以及间接吻合，如脑-硬脑膜-动脉-血管融合术（EDAS）、脑-肌血管融合术（EMS），还有直接与间接吻合的联合术式¹⁰。除EMS外，所有这些手术在小型动物中均具有极高的技术难度和挑战性。其他手术需要复杂的血管吻合操作，而EMS仅需相对简单的肌肉移植。此外，颞肌与大脑皮层位置邻近，是移植的天然选择，因其无需完全切除或中断血供，而若采用距离较远的肌肉进行移植，则必须切断其血液供应。

在大鼠慢性脑低灌注模型中已对EMS进行了研究^7,11然而，使用颞肌移植物的脑表面电刺激（EMS）在啮齿类动物急性缺血性卒中中的应用尚未被研究。本文中，我们描述了一种在小鼠缺血性卒中后进行EMS的新型实验方案 通过 大脑中动脉闭塞模型（MCAo）。本论文旨在描述在MCAo后小鼠中应用EMS这一新方法的技术流程及早期数据。

方案

所有实验均经康涅狄格大学健康中心机构动物照护与使用委员会批准，并依照美国相关指南进行。以下方案适用于任何物种或品系的啮齿类动物。本实验中使用8至12周龄、年龄和体重相匹配的C57BL/6野生型雄性小鼠。小鼠可自由摄取标准饲料和水。ad libitum。饲养环境保持在72.3 °F ，相对湿度30%–70%，光照周期为12小时光照/12小时黑暗。

1. 术前准备

1. 手术前通过高压灭菌对所有器械进行灭菌。使用70%乙醇对操作台面进行消毒，并用电热垫将操作台面加热至37 °C。
2. 使用诱导室以4%-5%异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，随后给予1.5%-2.0%异氟烷 通过 手术结束前，将小鼠的鼻锥连接至麻醉维持装置。术前需确认小鼠已充分麻醉，表现为对后肢足部施加有力捏压无反应，且姿势反射与翻正反射消失。
3. 将小鼠置于操作台面上，使其左侧卧，涂抹眼膏以保护双眼。
4. 在手术区域（即眼睛与耳朵之间的右侧颅侧部）剃除毛发 电推剪。清洁手术区域 从手术部位中心向外呈同心圆状 用70%乙醇处理，随后用聚维酮溶液处理，重复上述步骤2次。
   注意： 由于手术部位靠近眼睛，可能无法切除手术区域周围150%的范围，以避免对眼睛造成刺激或意外损伤。
5. 以0.25%布比卡因按不超过8 mg/kg体重的剂量，于手术部位皮下注射，作为术前镇痛的单次给药。
6. 在4倍放大倍数下设置手术显微镜。所有手术步骤均使用该显微镜。

2. 手术操作

注意：手术步骤见图1。本方案中，将三只小鼠分配至假手术组，三只小鼠用于仅接受EMS治疗组，12只小鼠用于MCAo组，23只小鼠用于MCAo联合EMS治疗组。

1. MCAo 手术
   注意：MCAo 是一种在啮齿类动物中建立缺血性脑卒中的特征明确的模型，已由我们及其他研究者进行了描述^12,13,14手术步骤简述如下：在异氟烷麻醉下，通过60分钟的右侧大脑中动脉阻断（MCAo）诱导局灶性短暂性脑缺血，随后再灌注7天或21天。
   1. 沿颈部腹侧正中线切开，随后通过颈内动脉分叉处插入一根10-11 mm长的6.0号硅胶包被单丝线，进行右侧大脑中动脉阻塞（MCAo） 通过 外部颈动脉残端。在假手术小鼠中，除不将缝线插入颈内动脉外，其余手术步骤相同。
   2. 使用温控系统测量直肠温度，并在手术期间通过自动加热垫将体温维持在约37 °C。
   3. 使用激光多普勒血流仪在缝合插入前测量脑血流，将多普勒探头置于侧颅骨（对应大脑中动脉区域）并记录数值⁸为确认血流阻塞减少至基线脑血流量的15%，在缝线推进后采用相同方法进行验证。为确认再灌注，在移除缝线后采用相同方法进行验证。
   4. 手术后及直至处死前或术后1周内，均应以湿拌饲料喂养所有动物，以确保慢性终点指标所需的充足营养，因为动物在卒中后存在摄食能力下降的问题。
2. EMS 手术
   1. 在大脑中动脉闭塞（MCAo）60分钟后，将小鼠随机分为仅MCAo组或MCAo + 电刺激（EMS）组。在MCAo后4小时对MCAo + EMS组实施电刺激，或在部分实验中进行假手术（仅EMS组）。手术前更换为一副新的无菌外科手套。
      注意：小鼠在麻醉后60分钟恢复 MCAo 后在 EMS 手术前重新麻醉。
   2. 对于接受电刺激（MCAo + 电刺激组或仅电刺激组）的实验组，使用剪刀从右耳前方1-2 mm处开始，向右眼后方1-2 mm处延伸，做一长度为10-15 mm的皮肤切口。
      注意：使用无菌剪刀以防止意外损伤下方的颞肌。
   3. 使用钳子牵拉皮瓣，直观辨认颞肌和颅骨。
   4. 用剪刀采用撑开技术钝性分离颞肌与颅骨。沿肌肉后缘进行2-3 mm的肌膜切开，方向朝向腹侧，以利于将肌肉向腹侧翻转。
   5. 使用微型钻头在颞肌翻折处下方的颅骨上进行直径约5 mm的开颅手术。
   6. 用镊子去除硬脑膜，以暴露脑的软脑膜表面。操作时需格外小心，避免对脑组织造成意外损伤。
   7. 用6-0 Monocryl缝线将颞肌的背侧边缘与背侧皮瓣的皮下组织缝合，使其与暴露的脑皮层齐平。
   8. 用6-0单股缝线闭合皮肤切口。将小鼠放回笼中，监测直至从麻醉中恢复。将小鼠送回饲养设施。

3. 术后注意事项

1. 每天监测小鼠的健康状况及手术部位是否感染，并每天皮下注射等渗盐水（按体重1%的体积）以维持水合状态。
2. 监测严重脱水（体重下降） >20%），持续至术后7天。如果需要，按体重给予额外一次皮下注射生理盐水，剂量为体重的1%体积。 >20% 体重减轻
3. 继续进行注射、生理监测及其他检测，无需特殊考虑。
   注意：在此操作过程中，根据机构内部动物护理与使用委员会的建议，避免使用阿片类药物或非甾体抗炎药（NSAIDs）治疗术后疼痛，因为这些药物已知会影响卒中预后或梗死面积^15,16,17,18然而，对于其他模型的EMS手术，强烈建议使用术后镇痛。请就此咨询机构动物护理和使用委员会（IACUC）。

结果

本研究共使用41只小鼠。在发生三例死亡（MCAo组1例，MCAo + EMS组2例）后，最终共有38只小鼠用于获得所示结果。

统计学
每个实验的数据均以均值 ± 标准差（S.D.）表示。两组之间的比较采用非配对学生t检验，两组以上则采用单因素方差分析（one-way ANOVA），并使用Newman−Keuls事后检验对多重比较进行校正。

还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-四氮唑还原酶（NADH-TR）染色
该染色方法用于评估移植肌肉的长期存活能力，参照 Turoczi 等人的方法¹⁹。简言之，在动物处死后，小心切除移植的肌瓣，用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，并在 -80 °C 条件下用最佳切割温度（OCT）包埋剂进行冷冻保存。对颞肌组织的多个 12 µm 厚冷冻切片进行 NADH-TR 酶组织化学反应染色。载玻片在 37 °C 下孵育 30 分钟，孵育液为含硝基蓝四氮唑（1.8 mg/dL）和 N...

讨论

本方案描述了一种在MCAo诱导的卒中小鼠模型中成功实施的脑-肌肉-头皮吻合术（EMS）。数据显示，移植组织在EMS手术后长时间内仍保持活性，并能与大脑皮层形成连接。这些发现支持了利用脑-肌肉移植在卒中部位逐步建立富含血管的营养环境的理论依据。EMS是一种具有前景的治疗方法，有望在同一环境中修复梗死的脑组织。

该方案的关键步骤包括第2.2.4步：此步骤会对颞肌（TM）造成不可避免的创伤，可能降低其与皮层结合并释放神经营养因子的能力。应尽可能减少对颞肌的损伤。另一种减少组织创伤的策略是仅在颞肌背侧边缘处将其钝性分离，而不进行肌切开术。在这种情况下，颞肌将被从颅骨上抬起（而非完全翻转），并在肌肉下方使用颅骨钻进行颅骨开窗。这种方法会减少该操作步骤的可用空间，但可能进一步减轻颞肌的损伤。此外，在第2.2.5和2.2.6步中必须格外小心并经过充分练习，以防止在开颅及硬脑膜操作过程中损伤下方的脑皮层。

该EMS模型是已建立的MCAo模型的自然补充。由于MCAo模型能够紧密模拟人类患者中常见的缺血性病理生理学变化和血管网络损伤，因此MCAo...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 单丝缝合线	Ethilon	697G
用于消毒手术表面的 70% 乙醇	Walgreens
0.25% 布比卡因溶液	Midwest Vet
用于组织牵拉的钳子	Roboz
带硅胶涂层的 Doccal 缝合线	Doccal Corporation	602145PK10Re
用于手术表面的电热垫
异氟烷麻醉剂	Piramal Critical Care Inc
异氟烷输送装置	B6Surgivet (Isotech 4)
微型钻机	Harvard Apparatus
显微解剖镊子，弯型，2 把	Piramal Critical Care Inc
小鼠血管生成检测试剂盒	R&D biotech	ARY015
持针器	Ethilon
用于眼部保护的眼膏	Walgreens
手术显微镜	Olympus
手术台面	Olympus
聚维酮碘溶液	Walgreens
直肠温度计	World Precision Instruments
用于灌洗的生理盐水或 70% 乙醇	Walgreens
用于剃除手术区域毛发的小型电动剃刀	Generic
手术剪	Roboz