Summary
Her beskriver vi en ny metode for å bidra til å belyse mekanismene for cellulær immunitet mot Plasmodium under blodstadiet av infeksjon. Dette er en in vitro-analyse som måler infisert drap av røde blodlegemer av cytotoksiske lymfocytter.
Abstract
Malaria er et stort folkehelseproblem, og presenterer mer enn 200 millioner tilfeller per år over hele verden. Til tross for mange års vitenskapelig innsats er beskyttende immunitet mot malaria fortsatt dårlig forstått, hovedsakelig på grunn av metodologiske begrensninger av langsiktig Plasmodiumkultur, spesielt for Plasmodium vivax. De fleste studier har fokusert på adaptiv immunitetsbeskyttelse mot malaria av antistoffer, som spiller en nøkkelrolle i å kontrollere malaria. Den sterile beskyttelsen indusert av svekkede Plasmodium sporozoites-vaksiner er imidlertid relatert til cellulær respons, hovedsakelig til cytotoksiske T-lymfocytter, slik som CD8+ og gamma delta T-celler (γδ T). Derfor må nye metoder utvikles for å bedre forstå funksjonene til den cellulære immunresponsen og dermed støtte fremtidig terapi og vaksineutvikling. For å finne en ny strategi for å analysere denne cellemedierte immuniteten mot Plasmodium blodstadiuminfeksjon, etablerte vår gruppe en in vitro-analyse som måler infiserte røde blodlegemer (iRBC) drap av cytotoksiske lymfocytter. Denne analysen kan brukes til å studere cellulære immunresponsmekanismer mot forskjellige Plasmodium spp. i blodstadiet. Medfødte og adaptative cytotoksiske immunceller kan direkte eliminere iRBC og den intracellulære parasitten i en effektor:målmekanisme. Mål-iRBC er merket for å evaluere cellelevedyktighet, og samkulturert med effektorceller (CD8 + T, γδ T, NK-celler, etc.). Lysisprosenten beregnes ut fra testede forhold, sammenlignet med spontan lysiskontroll i en flowcytometribasert analyse. Til syvende og sist er denne drapsanalysemetoden et stort fremskritt i forståelsen av cellemediert immunitet mot malaria i blodstadiet, og bidrar til å avdekke nye potensielle terapeutiske mål og akselerere utviklingen av malariavaksiner.
Introduction
Malaria er fortsatt en global helsekrise, med mer enn 240 millioner tilfeller og 627 000 malariarelaterte dødsfall rapportert i 20201. Det er for tiden fem parasittiske arter som kan forårsake malaria hos mennesker, hvorav Plasmodium falciparum og Plasmodium vivax er de to mest utbredte artene. Under Plasmodium-infeksjon er leveren eller pre-erytrocytisk stadium asymptomatisk, og symptomer oppstår bare under parasittenes aseksuelle syklus i erytrocytisk stadium. På dette infeksjonsstadiet frigjøres tusenvis av merozoitter avledet fra leverstadiet i blodet og infiserer røde blodlegemer (RBC). I RBC skiller parasittene seg ut i trofozoitter og schizonter ved schizogoni, til schizonter brister erytrocyten, frigjør nydannede merozoitter, gjentar denne blodsyklusen. Gjentatte sykluser av invasjon, replikasjon og merozoittfrigivelse resulterer i en eksponentiell vekst av parasittpopulasjonen og utløser til slutt sykdomssymptomer2.
En viktig utfordring i å studere immunresponsen mot malaria er at Plasmodium spp. som smitter mennesker infiserer ikke forsøksdyrmodeller. Dermed må Plasmodium-infiserte pasientprøver samles ferske og umiddelbart behandles og analyseres. I malariaendemiske områder er imidlertid ressursene for å få tilgang til immunologiske og molekylære mekanismer begrenset. På grunn av disse begrensningene er gnagere mye brukt som eksperimentelle modeller for å undersøke immunresponsen mot Plasmodium-infeksjon. Mens P. berghei og P. chabaudi ofte brukes som surrogater for P. falciparum-infeksjon, har den ikke-dødelige stammen av P. yoelii 17XNL også mange funksjoner til felles med P. vivax, for eksempel retikulocyttbegrenset infeksjon 3,4. Utviklingen av Plasmodium in vitro-analyser, som kan brukes til prøver fra mennesker eller dyr, er verdifull for å få en bedre forståelse av patogenesen av malaria og sammenligne den immunologiske responsen fremkalt av forskjellige arter av parasitten.
Beskyttende antimalarial immunitet er ikke helt forstått enten på pre-erytrocytisk stadium eller blodstadiet. Det er kjent at eksponering for gjentatte infeksjoner gir delvis ervervet immunitet, men steril immunitet utvikles sjelden5. I flere tiår var anti-Plasmodium-beskyttende immunitet hovedsakelig assosiert med induksjon av nøytraliserende eller opsoniserende antistoffer som forhindrer parasittinvasjon av vertsceller eller fører til fagocytose av antigenpresenterende celler, henholdsvis6. Som et resultat har de fleste anstrengelser for å produsere antimalariavaksiner hittil vært avhengig av å indusere beskyttende og langvarige antistoffer 7,8. Den sterile beskyttelsen indusert ved vaksinasjon med en svekket sporozoitt korrelerer imidlertid direkte med aktivering og ekspansjon av cytotoksiske T-lymfocytter 8,9.
Nylig har noen studier av ferskt isolerte pasientprøver og in vitro-kulturer vist at medfødte eller adaptative cytotoksiske immunceller som CD8 + T10, γδ T 11 og NK-celler12 direkte kan eliminere Plasmodium-infiserte RBC og dets intracellulære parasitt på en effektor: målforhold måte. Disse banebrytende funnene definerte en helt ny immuneffektormekanisme i sammenheng med malaria. For å dissekere denne nye antimalariaimmuniteten er det viktig å utforske cytotoksiske effektormekanismer av morderceller mot infiserte RBC (iRBC) i naturlig infeksjon eller vaksinasjon.
Her presenterer vi en in vitro-analyse som måler lymfocytters cytotoksiske aktivitet mot malaria i blodstadiet. Denne analysen kan da bidra til å belyse mekanismene for den cellulære immunresponsen mot Plasmodium erytrocyttstadiet. Målcellene, iRBC, er merket med karboksyfluorescein succinimidylester (CFSE) for å evaluere cellelevedyktighet, og blir deretter kokulturert med effektorceller som cytotoksiske lymfocytter (CTL). Denne kokulturen evalueres deretter ved hjelp av flowcytometri, ved hjelp av fluorescerende markører for spesifikke celletyper. Endelig beregnes prosentandelen av iRBC-lyse ved CTL ved å dele den eksperimentelle tilstanden med spontan ruptur av RBC og spontan lysiskontroll, som oppstår under inkubasjon uten effektorcellen. Samlet sett kan denne drepende analysemetoden bidra til en bedre forståelse av cellemediert malariaimmunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til retningslinjene til Oswaldo Cruz Foundation og National Ethical Council (CAAE: 59902816.7.0000.5091). De menneskelige protokollene ble utviklet i samarbeid med den kliniske forskningsgruppen fra Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM), som hadde ansvaret for å registrere pasienter i studien. Det ble innhentet informert samtykke fra alle pasientene.
For dyrestudien ble det utført prosedyrer i henhold til prinsippene for gjennomføring av den brasilianske praksisveiledningen for omsorg og bruk av dyr til vitenskapelige og didaktiske formål fra Nasjonalt råd for kontroll av dyreforsøk (CONCEA). Protokollene ble godkjent av Fiocruz Animal Experimentation Council (CEUA-protokoll LW15/20-2).
1. Innsamling av humane blodprøver og PBMC-isolasjon
- Samle blod fra Plasmodium-infiserte pasienter i et 10 ml evakuert blodoppsamlingsrør med natriumheparin. Som malariapasienter viser lymfopeni, er det et område på 5-9 x 106 mononukleære celler i perifert blod (PBMC) i en 10 ml blodprøve. Siden CD8 + T-celler eller γδ T-celler utgjør ~ 10% av PBMC, samler du helst 50-100 ml blod / pasient.
MERK: Minimum 1 x 105 effektorceller/tilstand bør vurderes. - Beregn prosentandelen iRBC ved blodutstryk som beskrevet nedenfor.
- Tilsett 5 μL totalt blod til et klart lysbilde og lag et blodsmør. Utfør Romanowsky-type panoptisk rask flekk eller May-Günwald-Giemsa flekk. Her brukes det panoptiske hurtigflekksettet, som består av tre reagenser: reagens A (fiksering), reagens B (cytoplasmatisk flekk) og reagens C (nukleær og cytoplasmatisk differensialflekk).
- Dypp lysbildet sakte i løsning A 10x, deretter 4x i løsning B og til slutt 10x i løsning C. Tøm ut overflødig reagens fra lysbildene mellom løsningene. Etter dypping i løsning C, skyll lysbildet i rennende vann fra springen og la det tørke.
- Under et oppreist lysmikroskop med et 100x oljenedsenkingsmål, telle 1000 RBC i sekvensielle firkanter og beregne prosentandelen parasittemi ved hjelp av følgende ligning:
- Fortynn 15 ml blod i en 1: 1-andel i sterilt fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 15 ml lymfocyttseparasjonsmedium (tetthet på 1,077 g / ml) til et 50 ml rør. Legg forsiktig 30 ml fortynnet blodprøve på sentrifugeringsmediet. Når du legger prøven lagvis, må du ikke la blodprøven og lymfocyttseparasjonsmediet blandes.
- Sentrifuger rørene ved 400 x g i 40 minutter ved 22 °C, med lav akselerasjon og ingen bruddinnstilling.
- Trekk av det øvre laget som inneholder plasma ved hjelp av en steril pipette, slik at det mononukleære cellelaget forblir uforstyrret. Overfør laget av mononukleære celler (PBMC) til et sterilt rør ved hjelp av en steril pipette.
- Ikke kast slangen som inneholder blodpelleten, da den vil bli brukt senere for infisert RBC-isolasjon. Fra dette trinnet må du huske å holde RBC-ene ved romtemperatur (RT). La dem aldri kjøle seg ned.
- Vask cellene to ganger ved å tilsette PBS og sentrifuge ved 350 x g i 10 minutter, med pauseinnstilling. Resuspender cellepelleten i 5 ml RPMI-medium tilsatt penicillin/streptomycin og 10 % føtal bovint serum (FBS; komplett medium).
- Telle PBMCs i nærvær av trypan blå løsning for å kontrollere cellens levedyktighet, ved hjelp av et hemacytometer (Neubauer kammer) eller automatisert celleteller. Ikke tell de blåfargede cellene, da disse representerer døende celler, som absorberer trypanblått.
- Juster cellekonsentrasjonen til 107 celler/ml ved bruk av komplett medium. Rens de ønskede cytotoksiske lymfocyttpopulasjonene (CD8 + T-celler, NK-celler, γδ T-celler) ved hjelp av magnetisk perleisolasjon i henhold til reagensprodusentens protokoll.
2. Menneskelig RBC-isolasjon
MERK: For human-infisert RBC-isolasjon anbefales det å starte med blodprøver som har minimum 2% parasittemi, fortrinnsvis med flere i trofozoitt / tidlig schizont parasittstadium.
- Klargjør PERCOLL (heretter kalt separasjonsmedium for tetthetsgradient) ved anbefalt konsentrasjon som beskrevet nedenfor.
- Tilsett 90 ml separasjonsmedium med 100 % tetthetsgradient og 10 ml 10x PBS for å oppnå 90 % separasjonsmedium for isoton tetthetsgradient.
- For P. vivax-infisert retikulocyttseparasjon, lag45% tetthetsgradientseparasjonsmedier. Tilsett 50 ml 90% isotonisk tetthetsgradientseparasjonsmedium og 50 ml 1x PBS for å oppnå 45% tetthetsgradientseparasjonsmedium.
- For P. falciparum-infisert erytrocytseparasjon, forberede 65% tetthet gradient separasjonsmedier. Tilsett 72 ml 90% isoton tetthet gradient separasjonsmedium og 28 ml 1x PBS for å oppnå 65% tetthet gradient separasjonsmedium.
- For uinfisert retikulocyttseparasjon, klargjør 70% tetthetsgradientseparasjonsmedier. Tilsett 78 ml 90% isoton tetthetsgradientseparasjonsmedium og 22 ml 1x PBS for å oppnå 70% tetthetsgradientseparasjonsmedium.
- Varm tetthetsgradientseparasjonsmediet til 37 °C i vannbad.
- Etter fjerning av PBMC-laget, fjern forsiktig så mye av det øverste laget av sentrifugeringsmediet som mulig uten å berøre cellene. Fjern forsiktig det øvre nøytrofile laget med en glasspasteurpipette uten å forstyrre RBC-pelleten og estimere pelletsvolumet. Tilsett 4x RBC-pelletsvolumet til RT komplett medium og resuspender.
- I et andre 50 ml konisk rør, tilsett 5x pelletsvolumet på 45%, 65% eller 70% tetthet gradient separasjonsmedium avhengig av celletypen som skal isoleres. Legg RBC-suspensjonen forsiktig oppå separasjonsmiddellaget for tetthetsgradient.
- Spinn i 15 minutter ved 850 x g, med lav akselerasjon og ingen pauseinnstilling. Samle det uklare røde/brune laget som ligger mellom separasjonsmediet supernatant og tetthetsgradient med en 5 ml pipette. Overfør til et sterilt 15 ml rør.
- Vask cellene ved å legge til RT komplett medium opp til 15 ml og spinn ned i 10 minutter ved 860 x g. Gjenta vasken ved å tilsette 10 ml RT komplett medium og spinn ned. Kast supernatanten og klargjør et blodutstryk fra pelleten for å se etter iRBC-anrikning i henhold til trinn 1.2.
- Resuspender pelleten i 1 ml RT komplett medium og la den sitte ved romtemperatur mens du teller cellene. Tilsett 10 μL cellesuspensjon i et hemocytometer (Neubauer-kammer) og telle RBCene i det sentrale området delt inn i 25 mellomstore firkanter. Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 107 iRBC-er/ml i RT-komplette medier.
3. Eksperimentell malariainfeksjon hos mus
- Tine en alikot av kryopreservert P. yoelii 17XNL: PyGFP (MRA-817), en GFP-uttrykkende stamme oppnådd fra MR4 / ATCC, og injiser 100 μL intraperitonealt (i.p.) i en 8 uker gammel kvinnelig C57BL/6-mus.
- Følg parasitemi byrden hver 3. dag ved hale vene lancing blod samling.
- Punkter fartøyet med nålen skrått opp, inn i venen i en grunne vinkel som begynner i den distale enden av halen.
- Samle blodprøven med en pipette eller kapillærrør opp til 5 eller 10 ml, og bruk deretter manuelt trykk for å stoppe blødningen.
- Forbered et blodutstryk (som beskrevet i trinn 1.2) til parasitemi når 10% -15% av infiserte RBC.
- Samle 10 μL blod ved halevenelancing og fortynn til 100 μL PBS for å injisere i den andre donormusen.
MERK: Kryopreserverte parasitter skal tines og passeres i mus to ganger før de brukes til eksperimentelle infeksjoner. - Når den andre passasjen når 15% av parasitemi, samle fem dråper blod ved haleklippingsmetoden og fortynn i 1 ml PBS. Forbered en infeksjonsløsning ved å justere konsentrasjonen til 1 x 106 iRBC / ml i steril PBS og injiser i.p. 100 μL (1 x 105 iRBC) av løsningen i hver mus som kreves for eksperimentet.
- Overvåk parasitemi hver 2-3 dag til den når ~ 30% iRBC, som oppstår omtrent 12 dager etter infeksjon. Når musene når ønsket parasitemi, samles blod ved hjertepunktering som beskrevet nedenfor.
- Aspirer 100 mikrol heparinoppløsning (30 E/ml) til en 1 ml sprøyte med en 26 G kanyle.
- Bedøv musen ved innånding med 5% isofluran og bekreft fraværet av reflekser. Plasser musen på siden og vinkelrett inn nålen rett under albuen, gjennom ribbeina og inn i hjertet. Trekk sprøytestempelet langsomt ut og roter nålen til 0,5-1 ml blod oppnås.
- Utfør human eutanasi ved cervikal dislokasjon under anestesi. Rengjør venstre side av musen aseptisk med 70% etanol. Med kirurgisk saks, gjør et kutt på venstre side av musen som passerer gjennom huden og bukhinnen. Finn milten og fjern den.
- Plasser musemilten i en petriskål med 5 ml komplett medium for å rense ønsket effektorcellepopulasjon (f.eks. CD8+ T-celler).
4. Innhenting av ferske hele musens miltocytter
- I petriskålen kutter du milten forsiktig i små biter ved hjelp av saks eller en barberhøvel.
- Plasser en 100 μM cellesil over et 50 ml konisk rør og overfør den utskårne milten til cellesilen med en pipette. Mos milten gjennom silen med et sprøytestempel.
- Vask cellene gjennom silen med 10 ml komplette medier. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 2 ml kald 1x RBC lysisbuffer. Inkuber suspensjonen i 5 min på is.
- Vask cellesuspensjonen med 10 ml 4 °C i hele mediet. Gjenta vasketrinnet tre ganger og fjern eventuelle cellepropper mellom vasker for milt fra Plasmodium-infiserte mus.
- Sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C, og kast deretter supernatanten.
MERK: Plasmodiuminfiserte milter er forstørret og fylt med fagocytiske celler som inneholder nedbrutt hemoglobin og hemozoin. - For å unngå problemer under magnetisk perleisolering av effektorceller, bruk følgende trinn for å fjerne hemozoinberikede fagocytiske celler og hemozoin. Resuspender miltcellene med MACS-buffer og juster konsentrasjonen til 1 x 108 celler/ml. Plasser en LS- eller LD-kolonne i magnetfeltet. Forbered kolonnen ved å skylle med 3 ml MACS-buffer.
- Påfør cellesuspensjon på kolonnen. Vask kolonnen tre ganger med 3 ml MACS-buffer. Samle gjennomstrømning som inneholder miltcellene.
- Telle miltocyttene i en trypan blå løsning og kontroller cellens levedyktighet i et hemacytometer (Neubauer kammer) eller automatisert celleteller. Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 107 celler/ml i RT-komplette medier.
5. Cytotoksisk effektorcellerensing (CD8a + T-cellenegativ seleksjon)
MERK: Det er mange positive og negative seleksjonsreagenser som kan rense cytotoksiske effektorceller (CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-celler). I denne protokollen bruker vi et negativt utvalg av milt CD8a + T-celler og følger produsentens instruksjoner.
- Sentrifuger alle splenocytter ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °C og kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 40 μL MACS-buffer.
- Tilsett 10 μL av en biotin-antistoffcocktail. Bland godt og rug i 5 min på is.
- Legg til 30 μL MACS-buffer. Tilsett 20 μL anti-biotin mikroperler. Bland godt og rug i 10 min på is.
- Legg til 400 μL MACS-buffer og fortsett til magnetisk celleseparasjon. Plasser MACS LS-kolonnen i magnetfeltstøtten. Forbered kolonnen ved å skylle med 3 ml MACS-buffer.
- Påfør cellesuspensjon på kolonnen. Vask kolonnen tre ganger med 3 ml MACS-buffer. Samle gjennomstrømningen som inneholder alle umerkede celler, som er de berikede CD8a + T-cellene.
- Tell CD8a + T-cellene i en trypanblå løsning og kontroller cellens levedyktighet i et hemacytometer (Neubauer-kammer) eller automatisert celleteller. Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 107 celler/ml i RT complete-medier.
6. P. yoelii infisert RBC isolasjon
- Sentrifuge det oppsamlede blodet i et 1,5 ml rør ved 850 x g i 3 minutter. Kast serumet og resuspender blodet i 1 ml 1x RPMI uten FBS.
- Plasser LS-kolonnen i magnetfeltstøtten og skyll med 3 ml 1x RPMI. Før RBC-suspensjonen gjennom kolonnen. For å isolere flere iRBC, påfør gjennomstrømningen (3 ml RPMI og 1 ml fortynnet blod) på nytt i kolonnen.
- Vask to ganger med 5 ml 1x RPMI. Utfør vasketrinn ved å legge til bufferalikoter så snart kolonnereservoaret er tomt. Ikke la noen kolonner tørke opp.
- Tilsett 5 ml RPMI, fjern kolonnen og rens iRBC-ene i et nytt 15 ml rør. Tell iRBC og juster konsentrasjonen til 1 x 107 RBC / ml.
7. CFSE-merking av RBC og forberedelse til flowcytometri
MERK: Start RBC-merkingsprotokollen med dobbelt så mange celler som skal brukes til eksperimentet, siden ~ 50% av cellene vanligvis går tapt i vasketrinnene etter CFSE-merkingstrinnet. For å etablere autofluorescens av RBC / iRBC, inkludere en kontrollprøve av umerkede celler.
- Fortynn CFSE til en endelig konsentrasjon på 10 mM i 1x RPMI uten FBS. Vask cellene en gang med 1x RPMI uten FBS i et 15 ml rør.
- Resuspender RBCene i 500 μL 1x RPMI uten FBS og tilsett 500 μL av den fortynnede CFSE. Inkuber i 8 min ved RT, beskyttet mot lys.
- Vask tre ganger ved å tilsette 14 ml komplett medium (10% FBS RPMI), etterfulgt av sentrifugering ved 850 x g i 10 minutter. Resuspender cellene i komplett medium til en konsentrasjon på 1-5 x 106 / ml. Inkubere i 1 time ved RT.
8. Cytotoksisk lymfocytt/RBC kokultur og forberedelse til flowcytometri
MERK: Hvis involvering av spesifikke reseptorer eller molekyler skal måles, inkuber de spesifikke blokkerings- og isotypekontrollantistoffene (10 mg / ml) med effektorcellene i 30 minutter før kokultur.
- Plate cellene i en 96-brønns rundbunnsplate. Legg til de rensede lymfocytter og CFSE-merkede iRBC i ønsket effektor-målcelleforhold til et endelig volum på 200 μL og homogeniser. Forbered hver tilstand i tre eksemplarer.
MERK: Vi foreslår at du justerer iRBC-konsentrasjonen til 1-5 x 104 celler/ml og velger forholdet basert på det rensede cellenummeret (f.eks. 0,5:1, 2,5:1 og 5:1). - Inkluder spontan lysiskontroll, som er målet iRBC uten effektoren, for å evaluere enhver spontan lysis, da dette vil bli brukt til å representere en 100% celle levedyktighetstilstand.
- Spinn ned tallerkenen i 1 min ved 360 x g for å maksimere cellekontakten. Inkuber ved 37 °C og 5 %CO2 i 4 timer.
MERK: Hypoksitilstander (lavO2), systematisk brukt ved dyrkning av P falciparum , bør ikke brukes siden effektorcellene ikke overlever i dette miljøet. I motsetning til dette er Plasmodium-parasitter levedyktige i omgivelsesluft i 5% CO2 i opptil 12 timer. - Spinn i 5 minutter ved 850 x g og snu platen for å fjerne supernatanten.
MERK: Om ønskelig kan supernatanten brukes til å måle eventuelle løselige faktorer som frigjøres i kokulturen. - Merk RBC-ene med anti-mus Ter119 1:200 (eller anti-human CD235 1:100 for humane prøver) og CD8+ T-celler med anti-CD8 1:200 eller anti-CD3 1:200-antistoffer (anti-mus eller menneske) i 30 minutter ved 4 °C i 1x PBS inneholdende 3 % FBS (FACS-buffer).
MERK: Antistofffluoroforen bør velges basert på cellesporeren/celleproliferasjonsreagensen (f.eks. CFSE-merket iRBC, APC-Cy7 anti-Ter119 og PerCP-Cy5.5 anti-CD8a). - Vask cellene med FACS-buffer og spinn ned i 5 minutter ved 850 x g. Overfør prøvene til FACS-rør og tilsett 30 μL tellekuler til individuelle rør . Homogeniser tellekulene ved å virvle i 30 s.
9. Flowcytometri
- Analyser prøver ved hjelp av et 405/488/561/640 laserinstrument.
- For humane celler merket med CFSE (FITC), PE anti-human γδ TCR og PE-Cy7 anti-human CD235a antistoff, bruk 530/30 (FITC), 575/25 (PE) og 780/60 (PE-Cy7) filtre i et tre-laser (blått, rødt, gulgrønt) konfigurasjonscytometer.
- For museceller merket med CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 anti-mus CD8a og APC-Cy7 anti-mus Ter119, bruk 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) og 780/60 (APC-Cy7) filtre i tre-laser cytometeroppsettet.
- Velg telleperlepopulasjonen som stoppeport for å skaffe minst 20 000 hendelser i stoppporten, som skal være identisk for alle forhold. Utfør analyse og kompensasjon ved hjelp av egnet programvare for innsamling/analyse av flowcytometri.
- Angi gating-strategien som beskrevet nedenfor.
- Velg enkeltceller (singleter), unntatt rusk ved hjelp av FSC-topphøyde (H) til areal (A). Velg RBC og ekskluder lymfocyttene fra analyse basert på fluorescens av RBC-markøren (Ter119 eller CD235a) og lymfocyttspesifikt antistoff (CD8a).
- I forrige RBC-gating velger du levedyktige RBC-er basert på CFSE-positiv farging. Analyser dataene med programvare for dataanalyse av flowcytometer.
10. Beregning og statistikk
- For å beregne prosentandelen av iRBC-lysis, følg gating-strategien beskrevet i trinn 9. Prosentandelen av levedyktige RBC er frekvensen av CFSE-positive celler inne i RBC-porten basert på Ter119 (mus) eller CD235a (menneskelig) positiv fluorescens.
- Bruk spontan lysiskontroll, RBC uten effektorceller, tilstand som en kontroll for å estimere RBC spontan ruptur. Denne tilstanden vil bli betraktet som RBC-lyse (100% levedyktighet). Bruk følgende formel til å beregne prosentandelen av RBC-lyse i hver testet tilstand:
MERK: Under kulturinkubasjonen kan noen infiserte RBC spontant lyse eller bli sprukket av parasitten. Bruk CFSE-positiv RBC-frekvens for spontanlysetilstanden, som ikke inneholder effektorceller, som utgangspunkt for lymfocyttcytotoksisitet. - Beregn gjennomsnittet av triplikater for hver tilstand og bestem statistisk signifikans ved hjelp av toveis ANOVA ved flere sammenligninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskrives anvendt metodikk for isolering av CFSE-merkede Plasmodium-infiserte RBC i en kokulturanalyse med cytotoksiske lymfocytter. Først gir vi en skjematisk fremstilling av hvordan protokollen skal utføres, ved hjelp av humane prøver infisert med P. vivax (figur 1). Deretter et illustrert flytskjema om hvordan man går videre med protokollen i en malariaeksperimentell modell ved hjelp av en C57BL/6-mus infisert med P. yoelii (figur 2). I figur 3 vises de forventede resultatene (før og etter) for trinn 6 i protokollen (anrikning av P. yoelii-infiserte RBC ved hjelp av magnetiske kolonner). Til slutt viser figur 4 en representativ flowcytometrianalyse, som beskriver gatingstrategien som trengs for å vurdere prosentandelen av RBC-lysis, som beskrevet i trinn 9. Derfor fremhever denne delen de forskjellige teknikkene som brukes her, og beskriver hele prosessen med oppkjøp, montering og dataanalyse for å vurdere iRBC-drap av cytotoksiske lymfocytter.
Human Plasmodium-infisert RBC lysis av cytotoksiske celler
En skjematisk fremstilling av protokollen for å evaluere drap av humane Plasmodium-infiserte RBC av cytotoksiske celler er vist i figur 1. For å måle cellelyse ble PBMC fra Plasmodium-infiserte pasienter renset ved hjelp av separasjonsmediet, etterfulgt av magnetisk rensing av den cytotoksiske lymfocyttpopulasjonen (CTL) av interesse (f.eks. CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-celler, etc.). RBCs pellet som var igjen fra PBMC-isolasjonen ble brukt til å berike Plasmodium-infiserte RBC ved bruk av tetthetsgradientseparasjonsmedium (65% P. falciparum; 45% P. vivax). iRBC ble merket med CFSE og inkubert med eller uten lymfocytter i 4 timer ved 37 °C, 5 % CO2. Etter kokulturperioden ble alle RBC (infisert eller ikke) merket med anti-humant CD235a-antistoff (for RBC) og CTL-spesifikke antistoffer (f.eks. anti-CD8, anti- γδTCR, etc.) før flowcytometrianalyse. Innsamlingen og analysen av humane prøver var lik de som ble demonstrert for museprøver i figur 4.
P. yoelii-infisert RBC-lyse av cytotoksiske CD8+ T-celler
Et flytskjema over den eksperimentelle prosedyren for å evaluere den cytotoksiske effektormekanismen i den eksperimentelle malariamodellen er vist i figur 2, sammen med representative eksperimentelle data vist i figur 3 og figur 4. C57BL/6 mus ble infisert med 1 x 105P. yoelii (Py) iRBC, og parasittemi ble overvåket til den nådde rundt 30%. Py-iRBC ble isolert fra blod ved hjelp av magnetisk separasjon, da parasitt heme-subproduktet, hemozoin, er jernberiket og fungerer som paramagnetiske partikler i et magnetfelt13. Renheten på den berikede prøven ble analysert med blodutstryk sammenlignet med prekolonneprøven (figur 3). iRBC ble deretter merket med cellesporreagenset CFSE. Parallelt ble cytotoksiske CD8+ T-celler renset fra splenocytter ved hjelp av et magnetisk negativt seleksjonssett. Som en kontroll ble den samme protokollen brukt for CD8 + T-cellerensing fra uinfiserte mus. Effektorceller (CD8+ T) og målceller (CFSE-merket Py-iRBC) ble inkubert ved forskjellige effektor:målforhold (E:T: 0,5:1, 2,5:1 og 5:1) i 4 timer ved 37 °C 5 % CO2. På slutten av kokulturen ble hver tilstand merket med antistoffer anti-mus Ter119 for RBC og anti-CD8a for cytotoksiske celler. Gatingstrategien og utvalgsresultatene er representert i figur 4.
Figur 1. Skjematisk fremstilling av in vitro drapsanalysen. Eksempel på drapsanalyseeksperiment. Plasmodiuminfisert blod samles og behandles ved hjelp av et separasjonsgradientmedium. Etter sentrifugering oppsamles PBMC-laget, og cytotoksiske celler (CTL) ble renset ved hjelp av magnetiske perler. RBC-laget behandles igjen ved hjelp av tetthetsgradientseparasjonsmedier. Etter sentrifugering samles Plasmodium-iRBC-laget og merkes med CFSE. Deretter ble de rensede CTL og iRBC kokulturert i 4 timer ved 37 °C, 5 % CO2, etterfulgt av cellespesifikk merking og analyse i et flowcytometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Eksperimentell malariamodell for drapsanalyse. Først ble C57BL/6 mus infisert med 105 PyX17NL-infiserte røde blodlegemer. Deretter overvåkes parasitemi med blodutstryk, til toppen av infeksjonen (30% -40% iRBC), ca. 12 dager etter infeksjon (dpi). Dagen etter ble mus blødd og avlivet for miltinnsamling. Blodet ble behandlet, og infiserte RBC ble beriket ved magnetisk separasjon, etterfulgt av merking med CFSE (øverst til høyre). Milten ble behandlet for isolering av cytotoksiske lymfocytter, ved negativ seleksjon ved hjelp av magnetiske perler. Deretter ble de rensede cytotoksiske lymfocyttene og iRBC kokulturert i 4 timer ved 37 °C, 5 % CO2, etterfulgt av cellespesifikk merking og analyse i et flowcytometer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. iRBC-berikelse ved hjelp av magnetiske kolonner. iRBC ble renset fra P. yoelii-infiserte mus ved hjelp av LS-kolonner. Rensingen fremheves ved blodutstryk fra blod samlet før ( A ) og etter (B) kolonneanrikning. Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4. Vurdering av cellelyseprosent av P. yoelii-iRBC ved CD8+ lymfocytter. Gating-strategien for cellelyseprosent. (A) Sett stoppporten inn i telleperlepopulasjonen (~ 20 000 hendelser). (B) Kontroller spontan lysering, iRBC uten lymfocytter. Start gating-strategien ved å velge enkeltceller, unntatt rusk, basert på FSC-topphøyde til arealforhold, etterfulgt av valg av RBC-populasjonen i APC-Cy7 Ter119 positiv og PerCP-Cy5.5 CD8 negativ. Velg deretter live iRBC som CFSE (FITC) høy positiv. (C) Eksempel på eksperimentanalyse ved bruk av forskjellige effektorer: målforhold, som viser prosentandelen av levende RBC etter kokulturen. (D) Grafisk fremstilling av RBC-lysisprosenten beregnet basert på formelen beskrevet i avsnitt 10. Signifikanssammenligningen mellom gruppene (cytotoksisk CD8 eller naiv CD8) ble vurdert ved toveis ANOVA med multiple sammenlikninger. P < 0,0001 (****). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en in vitro-analyse for å måle Plasmodium-infiserte røde blodlegemer som dreies av cytotoksiske lymfocytter. Denne analysen kan bidra til å belyse mekanismene for cellulær beskyttende immunitet mot malariaparasittens erytrocytiske stadium. Den største fordelen med denne metoden er at den gir en kvantitativ analyse av cellemediert drap av iRBC som kan brukes til å løse mange spørsmål om hvordan immunceller samhandler med forskjellige Plasmodium spp.
Det er viktig at denne metoden kan brukes til å studere P. vivax og andre Plasmodium-parasitter som ikke opprettholdes in vitro-kultur 14,15. I tillegg kan denne protokollen tilpasses alle Plasmodium-arter og forskjellige verter, for eksempel mennesker, mus og ikke-menneskelige primater. Flowcytometribaserte metoder er mye brukt for å evaluere cytotoksisk celleaktivering, cytokinproduksjon og degranulering10,11,16, men den nåværende metoden er den eneste som utforsker RBC-lyse ved direkte cellekontakt med morderceller.
Det er også mange metoder, for eksempel mikroskopi, polymerasekjedereaksjon (PCR) og flowcytometri, som brukes til å studere malaria ved å måle parasitemi, invasjon og antimalariaaktivitet. For å analysere den cellemedierte cytotoksisiteten til RBC, er imidlertid nåværende metoder som bruker Cr51 eller hemoglobinfrigivelse ikke følsomme nok til å evaluere RBC-lysis. LDH-frigjøring kan også brukes til å evaluere RBC-drap av noen CTLer som CD8 + T-celler, men måling av LDH er ikke en nøyaktig metode, da aktiverte medfødte eller medfødte celler kan drepe hverandre som en reguleringsmekanisme.
CFSE er mye brukt til å spore celler eller utforske celleproliferasjon i flowcytometri eller fluorescerende mikroskopi17. Siden RBC ikke prolifererer18, bør CFSE-fluorescensintensiteten reduseres med cellelyse. Flowcytometri er en veldig nøyaktig teknikk da den kan oppdage svært lave nivåer av spesifikke markører, og den har derfor blitt mye brukt til å spore parasitemi og invasjon ved malariainfeksjon 19,20,21,22,23. Viktigst av alt, flowcytometri kan måle mange parametere i en enkelt celle og sortere ut celler i forskjellige populasjoner. Ved å legge til kvantitative standardreagenser (tellekuler) til hver prøve, kan man normalisere antall ervervede hendelser og oppnå absolutte celletall24. Denne metoden muliggjør en pålitelig kvantitativ sammenligning mellom eksperimentelle forhold, noe som er kritisk for den foreslåtte protokollen.
Noen kritiske trinn for denne protokollen inkluderer å sikre prøvekvaliteten, sikre riktig cellefarging og inkludere kontroller for å normalisere beregninger. En stor mengde ferske blodprøver er nødvendig for å rense infiserte RBC. Rensing av tetthetsgradientseparasjonsmediet bør nærmer seg nøye, da konsentrasjonen er avgjørende for å oppnå de ønskede Plasmodium iRBC-ene. Blodoverlegget på separasjonsmediet for tetthetsgradient må også gjøres så sakte som mulig, og høstingen av ringrødt lag må gjøres nøye for å unngå å miste iRBC. For å gjøre renseprosessen enklere, bør en blodprøve med høy parasittemi brukes, da mengden iRBC vil være høyere. Det skal bemerkes at i RBC-isolasjonsprotokollen ved bruk av magnetfelt, vil bare parasittmodne stadier (midt-sent stadium trofozoitter eller schizonter) som produserer betydelige mengder hemozoin bli renset. Som et resultat vil ikke noe ringtrinn bli samlet inn, og dette kan påvirke sluttresultatet.
Cellefarging bør utføres nøye for å unngå tap eller lysering av celler. Langvarig lagring eller fiksering bør unngås før farging. Det er viktig å merke seg at de eksperimentelle forholdene skal utføres i triplikat ved bruk av seriell effektor: målforhold og passende kontroller, for eksempel en umerket, spontan lystilstand og en hypotesekontroll. Tilsetning av celletellende perler er avgjørende, da det gir en enkel måte å bestemme konsentrasjonen av celler eller absolutte celletall for hver prøve. Under innsamling av flowcytometer må du sørge for å angi antall hendelser som skal samles inn i tellekuleporten for å normalisere antall celler i hver prøve etter kokultur.
Siden minst 1 x 105 effektorceller er nødvendig for konsistente resultater i en kokulturanalyse, er en mulig begrensning av den beskrevne metodikken det begrensede antall celler etter rensing, noe som kan være en bekymring, spesielt når man arbeider med sjeldne cellepopulasjoner. Faktisk gjelder dette for iRBC-rensing, da det krever å ha en meget høy parasittemi som ikke er så lett oppnådd, spesielt når man arbeider med menneskelige prøver i endemiske områder.
En protokollforbedring kan være kokulturinkubasjonstiden. Selv om vi tidligere brukte en 12 timers inkubasjonstid10,11, observerte vi nylig at 4 timer er nok til å skille de eksperimentelle forholdene, og dermed redusere tiden for potensiell spontan lyse og forbedre reproduserbarheten av resultatene.
Mekanismene involvert i direkte drap av Plasmodium-infiserte RBC blir gradvis avdekket. Vår gruppe var den første som viste at CD8 + T-celler kan gjenkjenne og drepe P.vivax-infiserte retikulocytter via HLA-I-presentasjon av den infiserte cellen11. Nylig viste en annen studie at γδ T-celler gjenkjenner P. falciparum-infiserte RBC gjennom fosfoantigengjenkjenning av butyrofyllin, et molekyl tilstede på overflaten av iRBC10. I begge studiene er RBC-lyse avhengig av granulysin og granzym B, og fører til intracellulær parasittdrap.
Selv om mange metoder har blitt utviklet gjennom årene for å måle parasitemi, invasjon, antimalariaaktivitet og bildecelleinteraksjon, har ingen vært i stand til å analysere direkte drap av iRBC av cytotoksiske celler i en kvantitativ flowcytometribasert analyse 19,20,21. Vi brukte en innovativ tilnærming for å evaluere cellelysekapasiteten i malaria ved CFSE-merking av Plasmodium-infiserte RBC og evaluering av iRBC-lyse i en bestemt periode med kokultur med lymfocytter. Derfor presenterer denne in vitro-drapsanalysen en ny strategi for å klargjøre mekanismene for cellemediert immunitet mot malaria i blodstadiet, noe som vil bidra til å fremme studiet av nye terapeutiske mål og utviklingen av malariavaksiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Dhelio Pereira og medlemmene av Research Center for Tropical Medicine of Rondônia (CEPEM) for malariapasientregistrering og blodinnsamling og Felicia Ho for å hjelpe med revisjon av manuskript. Følgende reagens ble oppnådd gjennom BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, stamme 17XNL: PyGFP, MRA- 817, bidratt av Ana Rodriguez. Denne forskningen ble støttet av Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, stipendier (CJ, GC, CG), og Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - fellesskap (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
References
- WHO. Global Technical Strategy for Malaria 2016-2030, 2021 Update. World Health Organization. , (2021).
- Hafalla, J. C., Silvie, O., Matuschewski, K. Cell biology and immunology of malaria. Immunological Reviews. 240 (1), 297-316 (2011).
- Belnoue, E., et al. Vaccination with live Plasmodium yoelii blood stage parasites under chloroquine cover induces cross-stage immunity against malaria liver stage. Journal of Immunology. 181 (12), 8552-8558 (2008).
- Leong, Y. W., Lee, E. Q. H., Rénia, L., Malleret, B. Rodent malaria erythrocyte preference assessment by an ex vivo tropism assay. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 680136 (2021).
- Ladeia-Andrade, S., Ferreira, M. U., De Carvalho, M. E., Curado, I., Coura, J. R. Age-dependent acquisition of protective immunity to malaria in riverine populations of the amazon basin of Brazil. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 80 (3), 452-459 (2009).
- Antonelli, L. R., et al. The immunology of Plasmodium vivax malaria. Immunological Reviews. 293 (1), 163-189 (2020).
- Kazmin, D., et al. Systems analysis of protective immune responses to RTS, S malaria vaccination in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2425-2430 (2017).
- Epstein, J. E., et al. Live attenuated malaria vaccine designed to protect through hepatic CD8+ T cell immunity. Science. 334 (6055), 475-480 (2011).
- Draper, S. J., et al. Malaria vaccines: recent advances and new horizons. Cell Host & Microbe. 24 (1), 43-56 (2018).
- Junqueira, C., et al. γδ T cells suppress Plasmodium falciparum blood-stage infection by direct killing and phagocytosis. Nature Immunology. 22 (3), 347-357 (2021).
- Junqueira, C., et al. Cytotoxic CD8+ T cells recognize and kill Plasmodium vivax-infected reticulocytes. Nature Medicine. 24 (9), 1330-1336 (2018).
- Arora, G., et al. NK cells inhibit Plasmodium falciparum growth in red blood cells via antibody-dependent cellular cytotoxicity. eLife. 7, 36806 (2018).
- Paul, F., Roath, S., Melville, D., Warhurst, D. C., Osisanya, J. O. S. Separation of malaria-infected erythrocytes from whole blood: use of a selective high-gradient magnetic separation technique. Lancet. 2 (8237), 70-71 (1981).
- Shaw-Saliba, K., et al. Insights into an optimization of Plasmodium vivax Sal-1 in vitro culture: the aotus primate model. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (7), 0004870 (2016).
- Mehlotra, R. K., et al. Long-term in vitro culture of Plasmodium vivax isolates from Madagascar maintained in Saimiri boliviensis blood. Malaria Journal. 16 (1), 442 (2017).
- Hojo-Souza, N. S., et al. Contributions of IFN-γ and granulysin to the clearance of Plasmodium yoelii blood stage. PLOS Pathogens. 16 (9), 1008840 (2020).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J. C., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current Protocols in Immunology. 84 (1), 4-9 (2009).
- Migliaccio, A. R.
- Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry Part A:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 73 (6), 546-554 (2008).
- Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 25 (3), 287-294 (1996).
- Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Experimental Parasitology. 62 (2), 275-282 (1986).
- Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry:The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 4 (3), 228-237 (1983).
- Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. American Journal of Hematology. 85 (4), 234 (2010).
- Montes, M., Jaensson, E. A., Orozco, A. F., Lewis, D. E., Corry, D. B. A general method for bead-enhanced quantitation by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 317 (1-2), 45-55 (2006).
