Summary
Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.
Abstract
Malaria ist mit mehr als 200 Millionen Fällen pro Jahr weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Trotz jahrelanger wissenschaftlicher Bemühungen ist die schützende Immunität gegen Malaria immer noch unzureichend verstanden, was vor allem auf methodische Einschränkungen der Langzeitkultur von Plasmodium, insbesondere für Plasmodium vivax, zurückzuführen ist. Die meisten Studien konzentrierten sich auf den adaptiven Immunschutz gegen Malaria durch Antikörper, die eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle von Malaria spielen. Der sterile Schutz, der durch abgeschwächte Plasmodium-Sporozoiten-Impfstoffe induziert wird, hängt jedoch mit der zellulären Reaktion zusammen, hauptsächlich mit zytotoxischen T-Lymphozyten wie CD8+ und gamma-delta-T-Zellen (γδ T). Daher müssen neue Methoden entwickelt werden, um die Funktionen der zellulären Immunantwort besser zu verstehen und so zukünftige Therapie- und Impfstoffentwicklungen zu unterstützen. Um eine neue Strategie zur Analyse dieser zellvermittelten Immunität gegen eine Infektion im Plasmodium-Blutstadium zu finden, hat unsere Gruppe einen In-vitro-Assay entwickelt, der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen (iRBC) durch zytotoxische Lymphozyten misst. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen verschiedene Plasmodium spp. im Blutstadium zu untersuchen. Angeborene und adaptive zytotoxische Immunzellen können iRBCs und den intrazellulären Parasiten in einem Effektor-Ziel-Mechanismus direkt eliminieren. Ziel-iRBCs werden markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und mit Effektorzellen (CD8+ T, γδ T, NK-Zellen usw.) kokultiviert. Der Lyseprozentsatz wird auf der Grundlage getesteter Bedingungen berechnet, verglichen mit einer spontanen Lysekontrolle in einem durchflusszytometrischen Assay. Letztendlich ist diese Methode des Abtötungstests ein großer Fortschritt im Verständnis der zellvermittelten Immunität gegen Malaria im Blutstadium, der dazu beiträgt, neue potenzielle therapeutische Ziele zu entdecken und die Entwicklung von Malariaimpfstoffen zu beschleunigen.
Introduction
Malaria ist nach wie vor eine globale Gesundheitskrise, mit mehr als 240 Millionen Fällen und 627.000 Todesfällen im Zusammenhang mit Malaria im Jahr 20201. Derzeit gibt es fünf parasitäre Arten, die beim Menschen Malaria verursachen können, von denen Plasmodium falciparum und Plasmodium vivax die beiden am weitesten verbreiteten Arten sind. Während einer Plasmodium-Infektion ist die Leber oder das präerythrozytäre Stadium asymptomatisch, und die Symptome treten nur während des asexuellen Zyklus des Parasiten im erythrozytären Stadium auf. In diesem Infektionsstadium werden Tausende von Merozoiten aus dem Leberstadium in den Blutkreislauf freigesetzt und infizieren rote Blutkörperchen (RBCs). Bei den Erythrozyten differenzieren sich die Parasiten durch Schizogonie in Trophozoiten und Schizonten, bis Schizonten die Erythrozyten aufbrechen und neu gebildete Merozoiten freisetzen, wodurch sich dieser Blutzyklus wiederholt. Wiederholte Zyklen von Invasion, Replikation und Merozoitenfreisetzung führen zu einem exponentiellen Wachstum der Parasitenpopulation und lösen schließlich Krankheitssymptomeaus 2.
Eine wichtige Herausforderung bei der Untersuchung der Immunantwort auf Malaria besteht darin, dass die Plasmodium spp. die den Menschen infiziert, infiziert keine Versuchstiermodelle. Daher müssen Plasmodium-infizierte Patientenproben frisch entnommen und sofort verarbeitet und analysiert werden. In Malaria-endemischen Gebieten sind die Ressourcen für den Zugang zu immunologischen und molekularen Mechanismen jedoch begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen werden Nagetiere häufig als experimentelle Modelle verwendet, um die Immunantwort gegen eine Plasmodium-Infektion zu untersuchen. Während P. berghei und P. chabaudi häufig als Surrogate für eine P. falciparum-Infektion verwendet werden, weist der nicht-letale Stamm von P. yoelii 17XNL auch viele Gemeinsamkeiten mit P. vivax auf, wie z. B. eine retikulozyten-restriktive Infektion 3,4. Die Entwicklung von Plasmodium-In-vitro-Assays, die für Proben aus menschlichen oder tierischen Modellen verwendet werden können, ist wertvoll, um die Pathogenese von Malaria besser zu verstehen und die immunologische Reaktion verschiedener Parasitenarten zu vergleichen.
Die schützende Immunität gegen Malaria ist weder im präerythrozytären noch im Blutstadium vollständig verstanden. Es ist bekannt, dass die Exposition gegenüber wiederholten Infektionen zu einer teilweise erworbenen Immunität führt, aber eine sterile Immunität wird selten entwickelt5. Jahrzehntelang war die Anti-Plasmodium-protektive Immunität hauptsächlich mit der Induktion von neutralisierenden oder opsonisierenden Antikörpern verbunden, die das Eindringen von Parasiten in Wirtszellen verhindernbzw. zu einer Phagozytose durch antigenpräsentierende Zellen führen 6. Infolgedessen beruhten die meisten Bemühungen zur Herstellung von Malariaimpfstoffen bisher auf der Induktion schützender und lang anhaltender Antikörper 7,8. Der sterile Schutz, der durch die Impfung mit einem abgeschwächten Sporozoiten induziert wird, korreliert jedoch direkt mit der Aktivierung und Expansion zytotoxischer T-Lymphozyten 8,9.
In jüngster Zeit haben einige Studien an frisch isolierten Patientenproben und In-vitro-Kulturen gezeigt, dass angeborene oder adaptive zytotoxische Immunzellen wie CD8+ T10, γδ T 11 und NK-Zellen12 Plasmodium-infizierte Erythrozyten und ihren intrazellulären Parasiten direkt in einem Effektor-Ziel-Verhältnis eliminieren können. Diese bahnbrechenden Erkenntnisse definierten einen völlig neuen Immuneffektor-Mechanismus im Zusammenhang mit Malaria. Um diese neuartige Antimalaria-Immunität zu entschlüsseln, ist es wichtig, zytotoxische Effektormechanismen von Killerzellen gegen infizierte Erythrozyten (iRBCs) bei einer natürlichen Infektion oder Impfung zu untersuchen.
Hier stellen wir einen in vitro Assay vor, der die zytotoxische Aktivität von Lymphozyten gegen Malaria im Blutstadium misst. Dieser Assay kann dann helfen, die Mechanismen der zellulären Immunantwort gegen das Plasmodium-Erythrozytenstadium aufzuklären. Die Zielzellen, iRBCs, werden mit Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) markiert, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, und dann mit Effektorzellen wie zytotoxischen Lymphozyten (CTL) kokultiviert. Diese Kokultur wird dann durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Fluoreszenzmarkern für bestimmte Zelltypen bewertet. Schließlich wird der Prozentsatz der iRBC-Lyse durch CTL berechnet, indem die experimentelle Bedingung durch den spontanen Bruch der Erythrozyten und die spontane Lysekontrolle dividiert wird, die während der Inkubation ohne die Effektorzelle auftritt. Insgesamt kann diese Methode des Abtötungstests zu einem besseren Verständnis der zellvermittelten Malariaimmunität beitragen.
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Protocol
Alle Verfahren wurden gemäß den Richtlinien der Oswaldo-Cruz-Stiftung und des Nationalen Ethikrats (CAAE: 59902816.7.0000.5091) durchgeführt. Die Humanprotokolle wurden in Zusammenarbeit mit der klinischen Forschungsgruppe des Forschungszentrums für Tropenmedizin von Rondônia (CEPEM) entwickelt, die für die Aufnahme von Patienten in die Studie zuständig war. Von allen Patienten wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.
Für die Tierstudie wurden die Verfahren nach den Verhaltensgrundsätzen des brasilianischen Praxisleitfadens für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche und didaktische Zwecke des Nationalen Rates für die Kontrolle von Tierversuchen (CONCEA) durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Fiocruz Animal Experimentation Council genehmigt (CEUA-Protokoll LW15/20-2).
1. Entnahme menschlicher Blutproben und PBMC-Isolierung
- Entnahme des Blutes von Plasmodium-infizierten Patienten in einem evakuierten 10-ml-Blutentnahmeröhrchen mit Natriumheparin. Da Malariapatienten eine Lymphopenie aufweisen, gibt es einen Bereich von 5-9 x 106 mononukleären Zellen (PBMCs) des peripheren Blutes in einer 10-ml-Blutprobe. Da CD8+ T-Zellen oder γδ T-Zellen ~10% der PBMCs ausmachen, sollten vorzugsweise 50-100 ml Blut/Patient entnommen werden.
HINWEIS: Es sollte ein Minimum von 1 x 105 Effektorzellen/Bedingung in Betracht gezogen werden. - Berechnen Sie den prozentualen Anteil der iErythrozyten durch Blutausstrich wie unten beschrieben.
- Geben Sie 5 μl Gesamtblut auf einen durchsichtigen Objektträger und bereiten Sie einen Blutausstrich vor. Führen Sie eine panoptische Schnellfärbung vom Romanowsky-Typ oder eine May-Günwald-Giemsa-Färbung durch. Hier kommt das panoptische Fast-Stain-Kit zum Einsatz, das sich aus drei Reagenzien zusammensetzt: Reagenz A (Fixierung), Reagenz B (zytoplasmatische Färbung) und Reagenz C (nukleäre und zytoplasmatische Differentialfärbung).
- Tauchen Sie den Objektträger langsam 10x in Lösung A, dann 4x in Lösung B und schließlich 10x in Lösung C. Lassen Sie überschüssiges Reagenz zwischen den Lösungen aus den Objektträgern ab. Spülen Sie den Objektträger nach dem Eintauchen in Lösung C unter fließendem Leitungswasser ab und lassen Sie ihn trocknen.
- Zählen Sie unter einem aufrechten Lichtmikroskop mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv 1000 Erythrozyten in sequentiellen Quadraten und berechnen Sie den Prozentsatz der Parasitämie mit der folgenden Gleichung:
- 15 ml Blut im Verhältnis 1:1 in steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnen.
- Geben Sie 15 ml Lymphozyten-Trennmedium (Dichte von 1,077 g/ml) in ein 50-ml-Röhrchen. Schichten Sie die 30 ml verdünnte Blutprobe vorsichtig auf die Zentrifugationsmittellösung. Achten Sie beim Schichten der Probe darauf, dass sich Blutprobe und Lymphozyten-Trennmedium nicht vermischen.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 400 x g für 40 min bei 22 °C, mit niedriger Beschleunigung und ohne Pauseneinstellung.
- Die obere Schicht mit dem Plasma wird mit einer sterilen Pipette abgezogen, wobei die mononukleäre Zellschicht ungestört bleibt. Übertragen Sie die Schicht aus mononukleären Zellen (PBMCs) mit einer sterilen Pipette in ein steriles Röhrchen.
- Entsorgen Sie das Röhrchen mit dem Blutpellet nicht, da es später für die Isolierung infizierter Erythrozyten verwendet wird. Achten Sie ab diesem Schritt darauf, die Erythrozyten bei Raumtemperatur (RT) aufzubewahren. Lassen Sie sie niemals abkühlen.
- Waschen Sie die Zellen zweimal unter Zugabe von PBS und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 350 x g mit Pauseneinstellung. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 5 ml RPMI-Medium, das mit Penicillin/Streptomycin und 10 % fetalem Kälberserum (FBS; vollständiges Medium) ergänzt ist.
- Zählen Sie die PBMCs in Gegenwart von Trypanblau-Lösung, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu überprüfen, indem Sie ein Hämazytometer (Neubauer-Kammer) oder einen automatisierten Zellzähler verwenden. Zählen Sie nicht die blau gefärbten Zellen, da es sich um absterbende Zellen handelt, die Trypanblau aufnehmen.
- Stellen Sie die Zellkonzentration auf 10bis 7 Zellen/ml ein, indem Sie ein vollständiges Medium verwenden. Reinigen Sie die gewünschten zytotoxischen Lymphozytenpopulationen (CD8+ T-Zellen, NK-Zellen, γδ T-Zellen) mithilfe der magnetischen Beads-Isolierung gemäß dem Protokoll des Reagenzienherstellers.
2. Menschliche Erythrozyten-Isolation
HINWEIS: Für die Isolierung von humaninfizierten Erythrozyten wird empfohlen, mit Blutproben zu beginnen, die eine Parasitämie von mindestens 2 % aufweisen, vorzugsweise mit mehr im Stadium des Trophozoiten/frühen Schizontenparasiten.
- Bereiten Sie das PERCOLL (im Folgenden als Dichtegradienten-Trennmedium bezeichnet) in der empfohlenen Konzentration wie unten beschrieben vor.
- Fügen Sie 90 ml Trennmedium mit 100 % Dichtegradient und 10 ml 10x PBS hinzu, um ein Trennmedium mit 90 % isotonischer Dichte zu erhalten.
- Für die Trennung von P. vivax-infizierten Retikulozyten werden Trennmedien mit45 % Dichtegradient hergestellt. Fügen Sie 50 ml Trennmedium mit 90 % isotonischer Dichte und 50 ml 1x PBS hinzu, um ein Trennmedium mit einem Dichtegradienten von 45 % zu erhalten.
- Für die P. falciparum-infizierte Erythrozytentrennung werden Trennmedien mit 65 % Dichtegradient hergestellt. Fügen Sie 72 ml Trennmedium mit 90 % isotonischer Dichte und 28 ml 1x PBS hinzu, um ein Trennmedium mit einem Dichtegradienten von 65 % zu erhalten.
- Für die Trennung nicht infizierter Retikulozyten ist ein Trennmedium mit 70 % Dichtegradient herzustellen. Fügen Sie 78 ml Trennmedium mit 90 % isotonischer Dichte und 22 ml 1x PBS hinzu, um ein Trennmedium mit einem Dichtegradienten von 70 % zu erhalten.
- Erwärmen Sie das Dichtegradienten-Trennmedium im Wasserbad auf 37 °C.
- Entfernen Sie nach dem Entfernen der PBMC-Schicht vorsichtig so viel wie möglich von der obersten Schicht des Zentrifugationsmediums, ohne die Zellen zu berühren. Entfernen Sie mit einer Pasteurpipette aus Glas vorsichtig die obere neutrophile Schicht, ohne das Erythrozytenpellet zu stören, und schätzen Sie das Pelletvolumen. Fügen Sie das 4-fache des RBC-Pelletvolumens des RT-Komplettmediums hinzu und resuspendieren Sie.
- Geben Sie in ein zweites konisches 50-ml-Röhrchen das 5-fache des Pelletvolumens von 45 %, 65 % oder 70 % Dichtegradienten-Trennmedium, je nach zu isolierendem Zelltyp. Schichten Sie die Erythrozytensuspension vorsichtig auf die Schicht des Dichtegradienten-Trennmediums.
- 15 Minuten lang bei 850 x g schleudern, mit niedriger Beschleunigung und ohne Pause. Die trübe rot/braune Schicht, die zwischen dem Überstand und dem Dichtegradienten-Trennmedium liegt, wird mit einer 5-ml-Pipette aufgefangen. Transfer in ein steriles 15-ml-Röhrchen.
- Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von RT-Komplettmedium bis zu 15 ml und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 860 x g. Wiederholen Sie den Waschvorgang, indem Sie 10 ml RT-Komplettmedium hinzufügen und abschleudern. Entsorgen Sie den Überstand und bereiten Sie einen Blutausstrich aus dem Pellet vor, um die iRBC-Anreicherung gemäß Schritt 1.2 zu überprüfen.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml RT-Vollmedium und lassen Sie es bei Raumtemperatur ruhen, während Sie die Zellen zählen. Geben Sie 10 μl Zellsuspension in ein Hämozytometer (Neubauer-Kammer) und zählen Sie die Erythrozyten im zentralen Bereich, unterteilt in 25 mittlere Quadrate. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 107 iRBCs/ml in RT-Komplettmedien ein.
3. Experimentelle Malariainfektion bei Mäusen
- Tauen Sie ein Aliquot von kryokonserviertem P. yoelii 17XNL:PyGFP (MRA-817) auf, einem GFP-exprimierenden Stamm, der aus MR4/ATCC gewonnen wurde, und injizieren Sie 100 μl intraperitoneal (i.p.) in eine 8 Wochen alte weibliche C57BL/6-Maus.
- Verfolgen Sie die Parasitenbelastung alle 3 Tage durch Blutentnahme durch Schwanzvenen-Stechung.
- Punktieren Sie das Gefäß mit der Nadelabschrägung nach oben und führen Sie die Vene in einem flachen Winkel ein, beginnend am distalen Ende des Schwanzes.
- Entnahme der Blutprobe mit einer Pipette oder einem Kapillarröhrchen mit bis zu 5 oder 10 ml und üben Sie dann manuellen Druck aus, um die Blutung zu stoppen.
- Bereiten Sie einen Blutausstrich vor (wie in Schritt 1.2 beschrieben), bis die Parasitämie 10%-15% der infizierten Erythrozyten erreicht.
- Sammeln Sie 10 μl Blut durch Stechen der Schwanzvene und verdünnen Sie es auf 100 μl PBS, um es der zweiten Spendermaus zu injizieren.
HINWEIS: Kryokonservierte Parasiten sollten bei Mäusen zweimal aufgetaut und ausgeschieden werden, bevor sie für experimentelle Infektionen verwendet werden. - Wenn die zweite Passage 15 % der Parasitämie erreicht, sammeln Sie fünf Tropfen Blut mit der Schwanz-Clipping-Methode und verdünnen Sie sie in 1 ml PBS. Bereiten Sie eine Infektionslösung vor, indem Sie die Konzentration auf 1 x 106 iRBCs/ml in sterilem PBS einstellen und i.p. 100 μl (1 x 105 iRBCs) der Lösung in jede für das Experiment benötigte Maus injizieren.
- Überwachen Sie die Parasitämie alle 2-3 Tage, bis sie ~30% iRBCs erreicht, was etwa 12 Tage nach der Infektion der Fall ist. Wenn die Mäuse die gewünschte Parasitämie erreicht haben, entnehmen Sie Blut durch Herzpunktion, wie unten beschrieben.
- Aspirieren Sie 100 μl Heparinlösung (30 U/ml) mit einer 26 G-Nadel in eine 1-ml-Spritze.
- Betäuben Sie die Maus durch Inhalation mit 5% Isofluran und bestätigen Sie das Fehlen von Reflexen. Legen Sie die Maus auf die Seite und führen Sie die Nadel senkrecht direkt unter dem Ellbogen durch die Rippen und in das Herz ein. Ziehen Sie den Spritzenkolben langsam heraus und drehen Sie die Nadel, bis 0,5-1 ml Blut gewonnen werden.
- Führen Sie eine humane Euthanasie durch Zervixluxation unter Narkose durch. Reinigen Sie die linke Seite der Maus aseptisch mit 70%igem Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt auf der linken Seite der Maus, der durch die Haut und das Bauchfell verläuft. Suchen Sie die Milz und entfernen Sie sie.
- Legen Sie die Mausmilz in eine Petrischale mit 5 ml Vollmedium, um die gewünschte Effektorzellpopulation (z. B. CD8+ T-Zellen) zu reinigen.
4. Gewinnung frischer ganzer Maus-Milzzellen
- In der Petrischale die Milz vorsichtig mit einer Schere oder einem Rasiermesser in kleine Stücke schneiden.
- Legen Sie ein 100-μM-Zellsieb über ein konisches 50-ml-Röhrchen und übertragen Sie die exzidierte Milz mit einer Pipette in das Zellsieb. Die Milz mit einem Spritzenkolben durch das Sieb zerdrücken.
- Waschen Sie die Zellen durch das Sieb mit 10 ml Komplettmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min bei 4 °C, dann entsorgen Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 2 ml kaltem 1x RBC-Lysepuffer. Die Suspension 5 Minuten auf Eis inkubieren.
- Waschen Sie die Zellsuspension mit 10 ml 4 °C Komplettmedium. Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal und entfernen Sie alle Zellgerinnsel zwischen den Wäschen für Milz von Plasmodium-infizierten Mäusen.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C, dann entsorgen Sie den Überstand.
HINWEIS: Die mit Plasmodium infizierte Milz ist vergrößert und mit phagozytischen Zellen gefüllt, die degradiertes Hämoglobin und Hämozoin enthalten. - Um Probleme bei der magnetischen Bead-Isolierung von Effektorzellen zu vermeiden, führen Sie die folgenden Schritte aus, um mit Hämozoin angereicherte phagozytische Zellen und Hämozoin zu entfernen. Resuspendieren Sie die Milzzellen mit MACS-Puffer und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 108 Zellen/ml ein. Legen Sie eine LS- oder LD-Säule in das Magnetfeld. Bereiten Sie die Säule vor, indem Sie sie mit 3 ml MACS-Puffer spülen.
- Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf. Waschen Sie die Säule dreimal mit 3 ml MACS-Puffer. Sammeln Sie den Durchfluss mit den Milzzellen.
- Zählen Sie die Splenozyten in einer Trypanblau-Lösung und überprüfen Sie die Zellviabilität in einem Hämazytometer (Neubauer-Kammer) oder einem automatisierten Zellzähler. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 107 Zellen/ml in RT-Komplettmedien ein.
5. Zytotoxische Effektorzellreinigung (CD8a+ T-Zell-negative Selektion)
HINWEIS: Es gibt viele Reagenzien mit positiver und negativer Auswahl, die zytotoxische Effektorzellen (CD8+ T-, γδ T-, NK-, iNKT-, MAIT-Zellen) reinigen können. In diesem Protokoll verwenden wir eine Negativselektion von CD8a+ T-Zellen in der Milz und befolgen die Anweisungen des Herstellers.
- Zentrifugieren Sie alle Splenozyten bei 400 x g für 10 min bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 40 μl MACS-Puffer.
- Fügen Sie 10 μl eines Biotin-Antikörper-Cocktails hinzu. Gut mischen und 5 Minuten auf Eis inkubieren.
- Fügen Sie 30 μl MACS-Puffer hinzu. Fügen Sie 20 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzu. Gut mischen und 10 Minuten auf Eis inkubieren.
- Fügen Sie 400 μl MACS-Puffer hinzu und fahren Sie mit der magnetischen Zelltrennung fort. Setzen Sie die MACS LS-Säule in die Magnetfeldhalterung ein. Bereiten Sie die Säule vor, indem Sie sie mit 3 ml MACS-Puffer spülen.
- Tragen Sie die Zellsuspension auf die Säule auf. Waschen Sie die Säule dreimal mit 3 ml MACS-Puffer. Sammeln Sie den Durchfluss mit allen unmarkierten Zellen, bei denen es sich um die angereicherten CD8a+ T-Zellen handelt.
- Zählen Sie die CD8a+ T-Zellen in einer Trypanblau-Lösung und überprüfen Sie die Zellviabilität in einem Hämazytometer (Neubauer-Kammer) oder einem automatisierten Zellzähler. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 1 x 107 Zellen/ml in RT-Komplettmedien ein.
6. Isolierung von P. yoelii-infizierten Erythrozyten
- Zentrifugieren Sie das entnommene Blut in einem 1,5-ml-Röhrchen bei 850 x g für 3 Minuten. Verwerfen Sie das Serum und resuspendieren Sie das Blut in 1 ml 1x RPMI ohne FBS.
- Setzen Sie die LS-Säule in den Magnetfeldträger und spülen Sie sie mit 3 ml 1x RPMI. Führen Sie die RBC-Aufhängung durch die Säule. Um weitere iRBCs zu isolieren, wenden Sie den Durchfluss (3 ml RPMI und 1 ml verdünntes Blut) erneut in die Säule an.
- Zweimal mit 5 ml 1x RPMI waschen. Führen Sie Waschschritte durch, indem Sie Pufferaliquots hinzufügen, sobald das Säulenreservoir leer ist. Lassen Sie keine Säulen austrocknen.
- Fügen Sie 5 ml RPMI hinzu, entfernen Sie die Säule und spülen Sie die iRBCs in ein neues 15-ml-Röhrchen. Zählen Sie die iRBCs und stellen Sie die Konzentration auf 1 x 107 RBCs/ml ein.
7. CFSE-Markierung von Erythrozyten und Vorbereitung für die Durchflusszytometrie
HINWEIS: Beginnen Sie das RBC-Markierungsprotokoll mit der doppelten Anzahl von Zellen, die für das Experiment verwendet werden, da ~50% der Zellen in der Regel in den Waschschritten nach dem CFSE-Markierungsschritt verloren gehen. Um die Autofluoreszenz der Erythrozyten/iRBCs zu bestimmen, wird eine Kontrollprobe von unmarkierten Zellen eingeschlossen.
- CFSE auf eine Endkonzentration von 10 mM in 1x RPMI ohne FBS verdünnen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 1x RPMI ohne FBS in einem 15-ml-Röhrchen.
- Resuspendieren Sie die Erythrozyten in 500 μl 1x RPMI ohne FBS und fügen Sie 500 μl des verdünnten CFSE hinzu. 8 min bei RT lichtgeschützt inkubieren.
- Dreimal waschen, indem 14 ml des vollständigen Mediums (10 % FBS RPMI) hinzugefügt werden, gefolgt von einer Zentrifugation bei 850 x g für 10 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen im vollständigen Medium auf eine Konzentration von 1-5 x 106/ml. 1 h bei RT inkubieren.
8. Zytotoxische Lymphozyten/Erythrozyten-Kokultur und Vorbereitung für die Durchflusszytometrie
HINWEIS: Wenn die Beteiligung spezifischer Rezeptoren oder Moleküle gemessen wird, inkubieren Sie die spezifischen blockierenden und isotypkontrollierenden Antikörper (10 mg/ml) mit den Effektorzellen 30 Minuten lang vor der Kokultur.
- Legen Sie die Zellen in eine 96-Well-Platte mit rundem Boden. Die gereinigten Lymphozyten und CFSE-markierten iRBCs im gewünschten Effektor-Zielzell-Verhältnis auf ein Endvolumen von 200 μl geben und homogenisieren. Bereiten Sie jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung vor.
HINWEIS: Wir empfehlen, die iRBC-Konzentration auf 1-5 x 104 Zellen/ml einzustellen und das Verhältnis basierend auf der gereinigten Zellzahl zu wählen (z. B. 0,5:1, 2,5:1 und 5:1). - Beziehen Sie die Spontanlysekontrolle mit ein, bei der es sich um die Ziel-iRBCs ohne den Effektor handelt, um eine spontane Lyse zu bewerten, da diese verwendet wird, um eine 100%ige Zellviabilitätsbedingung darzustellen.
- Drehen Sie die Platte 1 Minute lang bei 360 x g herunter, um den Zellkontakt zu maximieren. Bei 37 °C und 5 % CO2 für 4 h inkubieren.
HINWEIS: Hypoxie-Bedingungen (niedrigerO2-Wert), die systematisch für die P. falciparum-Kultur verwendet werden, sollten nicht verwendet werden, da die Effektorzellen in dieser Umgebung nicht überleben. Im Gegensatz dazu sind Plasmodium-Parasiten in der Umgebungsluft in 5% CO2 bis zu 12 h lebensfähig. - 5 Minuten bei 850 x g drehen und die Platte umdrehen, um den Überstand zu entfernen.
Anmerkungen: Falls gewünscht, kann der Überstand verwendet werden, um alle löslichen Faktoren zu messen, die in der Kokultur freigesetzt werden. - Markierung der Erythrozyten mit Anti-Maus-Ter119 1:200 (oder Anti-Human-CD235 1:100 für humane Proben) und CD8+ T-Zellen mit Anti-CD8 1:200 oder Anti-CD3 1:200 Antikörpern (Anti-Maus oder Mensch) für 30 min bei 4 °C in 1x PBS mit 3% FBS (FACS-Puffer).
HINWEIS: Der Antikörper-Fluorophor sollte auf der Grundlage des Zelltracers/Zellproliferationsreagenzes ausgewählt werden (z. B. CFSE-markiertes iRBC, APC-Cy7-Anti-Ter119 und PerCP-Cy5.5-Anti-CD8a). - Waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer und schleudern Sie sie 5 Minuten lang bei 850 x g. Übertragen Sie die Proben in FACS-Röhrchen und geben Sie 30 μl Zählperlen in die einzelnen Röhrchen . Homogenisieren Sie die Zählperlen, indem Sie sie 30 s lang vortexen.
9. Durchflusszytometrie
- Analysieren Sie Proben mit einem 405/488/561/640 Lasergerät.
- Verwenden Sie für menschliche Zellen, die mit CFSE (FITC), PE-Anti-Human-γδ-TCR und PE-Cy7-Anti-Human-CD235a-Antikörpern markiert sind, 530/30 (FITC), 575/25 (PE) und 780/60 (PE-Cy7) Filter in einem Zytometer mit drei Lasern (Blau, Rot, Gelb-Grün).
- Verwenden Sie für Mauszellen, die mit CFSE (FITC), PerCP-Cy5.5 Anti-Maus-CD8a und APC-Cy7 Anti-Maus-Ter119 markiert sind, 530/30 (FITC), 695/40 (PerCP-Cy5.5) und 780/60 (APC-Cy7) Filter im Drei-Laser-Zytometer-Aufbau.
- Wählen Sie die Zählperlenpopulation als Stopp-Gate, um mindestens 20.000 Ereignisse im Stop-Gate zu erfassen, die für alle Bedingungen identisch sein sollten. Führen Sie Analysen und Kompensationen mit einer geeigneten Software zur Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie durch.
- Legen Sie die Gating-Strategie wie unten beschrieben fest.
- Wählen Sie einzelne Zellen (Singuletts) aus, ohne Schmutz unter Verwendung des FSC-Verhältnisses von Spitzenhöhe (H) zu Fläche (A). Wählen Sie die Erythrozyten aus und schließen Sie die Lymphozyten von der Analyse aus, basierend auf der Fluoreszenz des Erythrozytenmarkers (Ter119 oder CD235a) und des lymphozytenspezifischen Antikörpers (CD8a).
- Wählen Sie beim vorherigen Erythrozyten-Gating lebensfähige Erythrozyten basierend auf der CFSE-positiven Färbung aus. Analysieren Sie die Daten mit der Datenanalysesoftware für Durchflusszytometer.
10. Berechnung und Statistik
- Um den Prozentsatz der iRBC-Lyse zu berechnen, befolgen Sie die in Schritt 9 beschriebene Gating-Strategie. Der Prozentsatz der lebensfähigen Erythrozyten ist die Häufigkeit der CFSE-positiven Zellen innerhalb des Erythrozytors, basierend auf Ter119 (Maus) oder CD235a (Mensch) positiver Fluoreszenz.
- Verwenden Sie die Spontanlysekontrolle, Erythrozyten ohne Effektorzellen, Bedingung als Kontrolle, um die Spontanruptur der Erythrozyten abzuschätzen. Dieser Zustand wird als Erythrozytenlyse (100% Viabilität) betrachtet. Verwenden Sie die folgende Formel, um den Prozentsatz der Erythrozytenlyse in jeder getesteten Bedingung zu berechnen:
HINWEIS: Während der Inkubation der Kultur können einige infizierte Erythrozyten spontan lysieren oder durch den Parasiten geplatzt werden. Verwenden Sie die CFSE-positive Erythrozytenfrequenz der Spontanlysebedingung, die keine Effektorzellen enthält, als Ausgangswert für die Zytotoxizität von Lymphozyten. - Berechnen Sie den Durchschnitt der Triplikate für jede Bedingung und bestimmen Sie die statistische Signifikanz mithilfe der bidirektionalen ANOVA bei mehreren Vergleichen.
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Representative Results
In dieser Arbeit wird die angewandte Methodik zur Isolierung von CFSE-markierten Plasmodium-infizierten Erythrozyten in einem Kokulturassay mit zytotoxischen Lymphozyten beschrieben. Zunächst stellen wir eine schematische Darstellung der Durchführung des Protokolls unter Verwendung von humanen Proben zur Verfügung, die mit P. vivax infiziert sind (Abbildung 1). Dann ein illustriertes Flussdiagramm zur Vorgehensweise mit dem Protokoll in einem experimentellen Malariamodell mit einer mit P. yoelii infizierten C57BL/6-Maus (Abbildung 2). In Abbildung 3 sind die erwarteten Ergebnisse (vorher und nachher) für Schritt 6 des Protokolls (Anreicherung von P. yoelii-infizierten Erythrozyten mit magnetischen Säulen) dargestellt. Abbildung 4 zeigt schließlich eine repräsentative Durchflusszytometrie-Analyse, die die Gating-Strategie detailliert beschreibt, die zur Bestimmung des Prozentsatzes der Erythrozytenlyse erforderlich ist, wie in Schritt 9 beschrieben. Daher werden in diesem Abschnitt die verschiedenen hier verwendeten Techniken hervorgehoben und der gesamte Prozess der Erfassung, Assemblierung und Datenanalyse beschrieben, um die iRBC-Abtötung durch zytotoxische Lymphozyten zu beurteilen.
Humane Plasmodium-infizierte Erythrozyten werden durch zytotoxische Zellen lysiert
Eine schematische Darstellung des Protokolls zur Bewertung der Abtötung humaner Plasmodium-infizierter Erythrozyten durch zytotoxische Zellen ist in Abbildung 1 dargestellt. Um die Zelllyse zu messen, wurde PBMC von Plasmodium-infizierten Patienten mit dem Trennmedium gereinigt, gefolgt von einer magnetischen Aufreinigung der interessierenden zytotoxischen Lymphozytenpopulation (CTL) (z. B. CD8+ T, γδ T, NK, iNKT, MAIT-Zellen usw.). Das von der PBMC-Isolierung verbleibende Pellet der Erythrozyten wurde zur Anreicherung von Plasmodium-infizierten Erythrozyten mit Dichtegradienten-Trennmedium (65% P. falciparum; 45% P. vivax) verwendet. Die iRBCs wurden mit CFSE markiert und mit oder ohne Lymphozyten für 4 h bei 37 °C, 5% CO2 inkubiert. Nach der Kokulturperiode wurden alle Erythrozyten (infiziert oder nicht) vor der durchflusszytometrischen Analyse mit antihumanen CD235a-Antikörpern (für die Erythrozyten) und CTL-spezifischen Antikörpern (z. B. anti-CD8, anti-γδTCR usw.) markiert. Die Erfassung und Analyse von humanen Proben ähnelte denen, die in Abbildung 4 für Mausproben gezeigt wurden.
P. yoelii-infizierte Erythrozytenlyse durch zytotoxische CD8+ T-Zellen
Ein Flussdiagramm des experimentellen Verfahrens zur Bewertung des zytotoxischen Effektormechanismus im experimentellen Malariamodell ist in Abbildung 2 dargestellt, zusammen mit repräsentativen experimentellen Daten in Abbildung 3 und Abbildung 4. C57BL/6-Mäuse wurden mit 1 x 105P. yoelii (Py) iRBCs infiziert und die Parasitämie wurde überwacht, bis sie etwa 30% erreichte. Py-iRBCs wurden mittels Magnettrennung aus Blut isoliert, da das Häm-Unterprodukt des Parasiten, Hämozoin, mit Eisen angereichert ist und als paramagnetische Partikel in einem Magnetfeld fungiert13. Die Reinheit der angereicherten Probe wurde mittels Blutausstrich im Vergleich zur Vorsäulenprobe analysiert (Abbildung 3). Die iRBCs wurden dann mit dem Zelltracer-Reagenz CFSE markiert. Parallel dazu wurden zytotoxische CD8+ T-Zellen mit Hilfe eines magnetisch-negativen Selektionskits aus Splenozyten aufgereinigt. Als Kontrolle wurde das gleiche Protokoll für die CD8+ T-Zell-Aufreinigung von nicht infizierten Mäusen verwendet. Effektor- (CD8+ T) und Zielzellen (CFSE-markierte Py-iRBC) wurden in unterschiedlichen Effektor-Ziel-Verhältnissen (E:T: 0,5:1, 2,5:1 und 5:1) für 4 h bei 37 °C 5% CO2 inkubiert. Am Ende der Kokultur wurde jede Erkrankung mit den Antikörpern Anti-Maus Ter119 für Erythrozyten und Anti-CD8a für zytotoxische Zellen markiert. Die Gating-Strategie und die Beispielergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des In-vitro-Tötungsassays. Beispiel für ein Tötungs-Assay-Experiment. Plasmodium-infiziertes Blut wird mit einem Trenngradientenmedium gesammelt und verarbeitet. Nach der Zentrifugation wird die PBMC-Schicht entnommen und zytotoxische Zellen (CTLs) wurden mit magnetischen Beads gereinigt. Die RBC-Schicht wird erneut mit Dichtegradienten-Trennmedien verarbeitet. Nach der Zentrifugation wird die Plasmodium-iRBC-Schicht gesammelt und mit CFSE markiert. Danach wurden die gereinigten CTL- und iRBCs für 4 h bei 37 °C, 5% CO2 kokultiviert, gefolgt von einer zellspezifischen Markierung und Analyse in einem Durchflusszytometer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2. Experimentelles Malariamodell für den Tötungstest. Zunächst wurden C57BL/6-Mäuse mit 105 PyX17NL-infizierten roten Blutkörperchen infiziert. Dann wird die Parasitämie durch einen Blutausstrich bis zum Höhepunkt der Infektion (30%-40% iRBCs), etwa 12 Tage nach der Infektion (dpi), überwacht. Am nächsten Tag wurden die Mäuse ausgeblutet und zur Milzentnahme eingeschläfert. Das Blut wurde aufbereitet und infizierte Erythrozyten wurden durch magnetische Trennung angereichert, gefolgt von einer Markierung mit CFSE (oben rechts). Die Milz wurde für die Isolierung zytotoxischer Lymphozyten durch Negativselektion mit magnetischen Beads aufbereitet. Anschließend wurden die gereinigten zytotoxischen Lymphozyten und iRBCs für 4 h bei 37 °C, 5% CO2 kokultiviert, gefolgt von einer zellspezifischen Markierung und Analyse in einem Durchflusszytometer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. iRBC-Anreicherung mit Magnetsäulen. Die iRBCs wurden von P. yoelii-infizierten Mäusen mittels LS-Säulen gereinigt. Die Aufreinigung wird durch Blutausstriche von Blutentnahmen vor ( A ) und nach (B) Säulenanreicherung hervorgehoben. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4. Bestimmung des Zelllyseanteils von P. yoelii-iRBCs durch CD8+-Lymphozyten. Die Gating-Strategie für den Prozentsatz der Zelllyse. (A) Setze das Stopptor in die Zählperlenpopulation (~20.000 Ereignisse). (B) Kontrolle der spontanen Lyse, iRBCs ohne Lymphozyten. Beginnen Sie die Gating-Strategie, indem Sie die einzelnen Zellen ohne Trümmer basierend auf dem Verhältnis von FSC-Spitzenhöhe zu Fläche auswählen, gefolgt von der Auswahl der Erythrozytenpopulation in APC-Cy7 Ter119 positiv und PerCP-Cy5.5 CD8 negativ. Wählen Sie dann Live-iRBCs als CFSE (FITC) high positiv aus. (C) Beispiel für eine experimentelle Analyse unter Verwendung verschiedener Effektor-Ziel-Verhältnisse, die den Prozentsatz der lebenden Erythrozyten nach der Kokultur anzeigen. (D) Grafische Darstellung des Lyseprozentsatzes der Erythrozyten, berechnet auf der Grundlage der in Abschnitt 10 beschriebenen Formel. Der Signifikanzvergleich zwischen den Gruppen (zytotoxisches CD8 oder naives CD8) wurde mittels zweifacher ANOVA mit Mehrfachvergleichen bewertet. P < 0,0001 (****). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Hier beschreiben wir einen in vitro Assay zur Messung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten. Dieser Assay kann dazu beitragen, die Mechanismen der zellulären schützenden Immunität gegen das erythrozytäre Stadium des Malariaparasiten aufzuklären. Der Hauptvorteil dieser Methodik besteht darin, dass sie einen quantitativen Assay der zellvermittelten Abtötung von iRBCs liefert, der verwendet werden kann, um viele Fragen darüber zu beantworten, wie Immunzellen mit verschiedenen Plasmodium spp interagieren.
Wichtig ist, dass diese Methode verwendet werden kann, um P. vivax und andere Plasmodium-Parasiten zu untersuchen, die nicht in vitro kultiviert werden14,15. Darüber hinaus kann dieses Protokoll an jede Plasmodium-Spezies und verschiedene Wirte wie Menschen, Mäuse und nicht-menschliche Primaten angepasst werden. Durchflusszytometrie-basierte Methoden werden häufig verwendet, um die zytotoxische Zellaktivierung, die Zytokinproduktion und die Degranulation zu bewerten10,11,16, aber die aktuelle Methode ist die einzige, die die Erythrozylyse durch direkten Zellkontakt mit Killerzellen untersucht.
Es gibt auch viele Methoden wie Mikroskopie, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Durchflusszytometrie, die zur Untersuchung von Malaria verwendet werden, indem Parasitämie, Invasion und Malariaaktivität gemessen werden. Um die zellvermittelte Zytotoxizität von Erythrozyten zu analysieren, sind die derzeitigen Methoden, die Cr51 oder die Freisetzung von Hämoglobin verwenden, jedoch nicht empfindlich genug, um die Lyse von Erythrozyten zu bewerten. Die LDH-Freisetzung kann auch verwendet werden, um die Abtötung von Erythrozyten durch einige CTLs wie CD8+ T-Zellen zu bewerten, aber die Messung von LDH ist keine genaue Methode, da aktivierte angeborene oder angeborene Zellen sich als Regulationsmechanismus gegenseitig abtöten können.
CFSE wird häufig verwendet, um Zellen zu verfolgen oder die Zellproliferation in der Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen17. Da sich Erythrozyten nicht vermehren18, sollte die CFSE-Fluoreszenzintensität mit der Zelllyse abnehmen. Die Durchflusszytometrie ist eine sehr genaue Technik, da sie sehr geringe Konzentrationen spezifischer Marker nachweisen kann, und wird daher häufig verwendet, um Parasitämie und Invasion bei Malariainfektionen zu verfolgen 19,20,21,22,23. Am wichtigsten ist, dass die Durchflusszytometrie viele Parameter in einer einzelnen Zelle messen und Zellen in verschiedene Populationen einteilen kann. Durch Zugabe von quantitativen Standardreagenzien (Zählkügelchen) zu jeder Probe kann man die Anzahl der erfassten Ereignisse normalisieren und absolute Zellzahlenvon 24 erhalten. Diese Methode ermöglicht einen zuverlässigen quantitativen Vergleich zwischen experimentellen Bedingungen, was für das derzeit vorgeschlagene Protokoll von entscheidender Bedeutung ist.
Zu den wichtigsten Schritten für dieses Protokoll gehören die Sicherstellung der Probenqualität, die Sicherstellung der ordnungsgemäßen Zellfärbung und die Einbeziehung von Kontrollen zur Normalisierung der Berechnungen. Eine große Menge frischer Blutproben ist erforderlich, um infizierte Erythrozyten zu reinigen. Die Reinigung des Dichtegradienten-Trennmediums sollte sorgfältig angegangen werden, da ihre Konzentration entscheidend für die Gewinnung der gewünschten Plasmodium-iRBCs ist. Die Blutauflagerung auf das Trennmedium für den Dichtegradienten muss ebenfalls so langsam wie möglich erfolgen, und die Entnahme der ringroten Schicht muss sorgfältig erfolgen, um den Verlust von iRBCs zu vermeiden. Um den Reinigungsprozess zu erleichtern, sollte eine Blutprobe mit hohem Parasitämiegehalt verwendet werden, da die Menge an iRBCs höher ist. Es ist zu beachten, dass beim Erythrozyten-Isolationsprotokoll mit Magnetfeldern nur die reifen Stadien des Parasiten (Trophozoiten oder Schizonten im mittleren bis späten Stadium) gereinigt werden, die signifikante Mengen an Hämozoin produzieren. Infolgedessen werden keine Ringstufen erfasst, was sich auf das Endergebnis auswirken kann.
Die Zellfärbung sollte sorgfältig durchgeführt werden, um den Verlust oder die Lyse von Zellen zu vermeiden. Eine längere Lagerung oder Fixierung sollte vor dem Färben vermieden werden. Es ist wichtig zu beachten, dass die experimentellen Bedingungen in dreifacher Ausführung unter Verwendung von seriellen Effektor-Ziel-Verhältnissen und geeigneten Kontrollen, wie z. B. einer unmarkierten, spontanen Lysebedingung und einer Hypothesenkontrolle, durchgeführt werden sollten. Die Zugabe von Zellzählkügelchen ist von entscheidender Bedeutung, da sie eine einfache Möglichkeit bieten, die Konzentration der Zellen oder die absolute Zellzahl für jede Probe zu bestimmen. Achten Sie während der Durchflusszytometererfassung darauf, die Anzahl der Ereignisse einzustellen, die im Zählbeads-Gate erfasst werden sollen, um die Anzahl der Zellen in jeder Probe nach der Kokultur zu normalisieren.
Da mindestens 1 x 105 Effektorzellen für konsistente Ergebnisse in einem Kokulturassay benötigt werden, ist eine mögliche Einschränkung der beschriebenen Methodik die begrenzte Anzahl von Zellen nach der Aufreinigung, was insbesondere bei der Arbeit mit seltenen Zellpopulationen ein Problem darstellen kann. Dies gilt in der Tat für die iRBC-Reinigung, da sie eine sehr hohe Parasitämie erfordert, die nicht so leicht zu erhalten ist, insbesondere bei der Arbeit mit menschlichen Proben in endemischen Gebieten.
Eine Verbesserung des Protokolls kann die Inkubationszeit der Kokultur sein. Obwohl wir bisher eine Inkubationszeitvon 12 h 10,11 verwendet haben, haben wir kürzlich beobachtet, dass 4 h ausreichen, um die Versuchsbedingungen zu differenzieren, wodurch die Zeit für eine mögliche Spontanlyse verkürzt und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse verbessert wird.
Die Mechanismen, die an der direkten Abtötung von Plasmodium-infizierten Erythrozyten beteiligt sind, werden nach und nach aufgedeckt. Unsere Gruppe konnte erstmals zeigen, dass CD8+ T-Zellen P.vivax-infizierte Retikulozyten über HLA-I-Präsentation durch die infizierte Zelle erkennen und abtöten können11. Kürzlich zeigte eine andere Studie, dass γδ-T-Zellen P. falciparum-infizierte Erythrozyten durch die Phosphoantigen-Erkennung durch Butyrophylin, ein Molekül, das auf der Oberfläche von Erythrozyten vorhanden ist, erkennen10. In beiden Studien ist die Lyse der Erythrozyme von Granulysin und Granzym B abhängig und führt zur intrazellulären Abtötung von Parasiten.
Obwohl im Laufe der Jahre viele Methoden entwickelt wurden, um Parasitämie, Invasion, Antimalariaaktivität und Bildzellinteraktion zu messen, war keine in der Lage, die direkte Abtötung von iRBCs durch zytotoxische Zellen in einem quantitativen Durchflusszytometrie-basierten Assay zu analysieren 19,20,21. Wir haben einen innovativen Ansatz verwendet, um die Zelllysekapazität bei Malaria durch CFSE-Markierung von Plasmodium-infizierten Erythrozyten und die Evaluierung der iRBC-Lyse in einem bestimmten Zeitraum der Kokultur mit Lymphozyten zu bewerten. Daher stellt dieser In-vitro-Abtötungstest eine neuartige Strategie zur Aufklärung der Mechanismen der zellvermittelten Immunität gegen Malaria im Blutstadium dar, die dazu beitragen wird, die Erforschung neuer therapeutischer Ziele und die Entwicklung von Malariaimpfstoffen voranzutreiben.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Dhelio Pereira und den Mitgliedern des Forschungszentrums für Tropenmedizin von Rondônia (CEPEM) für die Aufnahme von Malariapatienten und die Blutentnahme sowie Felicia Ho für die Hilfe bei der Überarbeitung des Manuskripts. Das folgende Reagenz wurde von BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Plasmodium yoelii subsp. yoelii, Stamm 17XNL:PyGFP, MRA-817, beigesteuert von Ana Rodriguez. Diese Forschung wurde unterstützt durch den Lemann Brazil Research Fund, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) - 437851/2018-4, Stipendien (CJ, GC, CG) und Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) - APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Stipendium (LL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used - APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used - PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used - APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used - PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used - APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used - 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle - 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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