Détection et quantification de nanotubes à effet tunnel à l’aide d’images 3D Volume View

Résumé

Les nanotubes à effet tunnel (TNT) sont principalement des nanotubes à membrane F-actine ouverts qui relient les cellules voisines, facilitant ainsi la communication intercellulaire. La caractéristique notable qui distingue les TNT des autres protubérances cellulaires est la nature planante des nanotubes entre les cellules. Ici, nous caractérisons les TNT en construisant une vue de volume 3D d’images confocales z-stack.

Résumé

Des découvertes récentes ont révélé que les cellules effectuent un transfert intercellulaire direct à longue portée via des conduits actine-membrane à l’échelle nanométrique, à savoir des « nanotubes tunneling » (TNT). Les TNT sont définis comme des extensions membranaires ouvertes et entourées de bicouches lipidiques qui assurent la continuité entre les cellules voisines de diamètres compris entre 50 nm et 1 μm. Les TNT ont été initialement démontrés dans les cellules neuronales, mais des études successives ont révélé l’existence de TNT dans plusieurs types de cellules et maladies, telles que les maladies neurodégénératives, les infections virales et le cancer. Plusieurs études ont fait référence à des nanostructures membranaires à couplage électrique rapproché entre des cellules voisines en tant que TNT ou structures de type TNT.

L’élucidation de l’ultrastructure en termes de continuité membranaire à l’extrémité est techniquement difficile. En outre, les études sur la communication cellule-cellule sont difficiles en termes de caractérisation des TNT à l’aide de méthodes conventionnelles en raison de l’absence de marqueurs spécifiques. Les TNT sont principalement définis comme des protubérances membranaires ouvertes à base de F-actine. Cependant, une limitation majeure est que la F-actine est présente dans tous les types de protubérances, ce qui rend difficile la différenciation des TNT des autres protubérances. L’une des caractéristiques notables des TNT à base de F-actine est que ces structures oscillent entre deux cellules sans toucher le substrat. Par conséquent, les TNT distincts colorés à la F-actine peuvent être distingués d’autres protubérances telles que les filopodies et les neurites en fonction de leur vol stationnaire entre les cellules.

Nous avons récemment montré que l’internalisation de l’amyloïde-β_{oligomère 1-42} (oAβ) via l’endocytose actine-dépendante stimule la kinase-1 activée par p21 (PAK1), qui intervient dans la formation de TNT contenant de la F-actine coexprimée avec phospho-PAK1 entre les cellules neuronales SH-SY5Y. Ce protocole décrit une méthode d’analyse de volume 3D pour identifier et caractériser les TNT à partir des images z-stack capturées des protubérances membranaires immunocolorées F-actine et phospho-PAK1 dans les cellules neuronales traitées oAβ. De plus, les TNT se distinguent du développement de neurites et d’excroissances neuronales basées sur des conduits membranaires immunocolorés par la tubuline F-actine et β-III.

Introduction

Les nanotubes tunneliers (TNT) sont des conduits à membrane à base de F-actine, principalement ouverts, et jouent un rôle essentiel dans le transfert intercellulaire de cargaison et d’organites¹. La caractéristique unique des TNT est qu’ils connectent des cellules voisines sans aucun contact avec le substrat; Ils mesurent plus de 10 à 300 μm de long et leur diamètre varie entre 50 nm et 1 μm ^2,3. Les TNT sont des structures transitoires et leur durée de vie dure de quelques minutes à plusieurs heures. Les TNT ont d’abord été démontrés dans les cellules neuronales PC12^1....

Protocole

REMARQUE : Les cellules SH-SY5Y cultivées en milieu DMEM/F-12 ont été différenciées avec de l’acide rétinoïque 10 μM pendant 7 jours et traitées avec des oligomères oAβ de 1 μM pendant 2 h à 37 °C (5 % de CO₂). Après traitement, les cellules ont été fixées avec la solution fixatrice de Karnovsky et double-immunocolorées avec des anticorps phospho-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) et une phalloïdine liant la F-actine. Plus tard, des images confocales z-stack ont été prises à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les TNT ont été quantifiés par comptage manuel et distingués des autres neurites / protubérances cellulaires en construisant des images de vue....

Résultats

Ici, nous identifions et caractérisons les TNT induits par oAβ dans les cellules neuronales SH-SY5Y en construisant des vues de volume 3D à partir d’images confocales z-stack (Figure 1). Les cellules ont été doublement immunocolorées avec F-actine et phospho-PAK1. Des images confocales de cellules immunocolorées ont été analysées pour identifier les TNT (Figure 2). De plus, les images DIC ont été analysées pour vérifier que les structures TNT colorées F-actine e.......

Discussion

Plusieurs chercheurs au cours des 2 dernières décennies ont essayé de comprendre et de caractériser la structure des TNT¹⁸. L’absence de marqueurs spécifiques entrave les progrès, et il existe une demande croissante pour une méthode pratique et normalisée qui peut être utilisée pour identifier, caractériser et quantifier les TNT. Les TNT sont définis comme des conduits membranaires à base de F-actine qui planent entre deux cellules. Des études ont montré que les β-tubuline positives, fermées et en.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de 35 mm avec puits de 14 mm en lamelle de recouvrement #1.5	Cellvis	D35-14-1.5-N	Boîte d’imagerie utilisée pour l’ensemencement de cellules pour les expériences de coloration
A&beta ; (1-42) 1 mg	AnaSpec	#64129	Oligomères de bêta-amyloïde pour traiter les cellules
Farine Alexa 488 Chèvre Anti-lapin IgG (H+L)	Invitrogen	A11070	Anticorps secondaire pour phospho-PAK1
Armoire de sécurité biologique	Thermo Scientific (MSC Advantage)	51025411	Fournir des conditions asphériques pour la culture cellulaire
CO2 Incubateur	Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240)	51026556	Pour la croissance de cellules à température corporelle ou proche de celle-ci
Microscope confocal à balayage laser	ZEISS (Carl Zeiss)	LSM 880	Capable de générer des images tridimensionnelles de grands échantillons à super-résolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octane]	Merck	8034560100	Réactif anti-blanchiment
DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)	Sigma	D9542-1MG	Neuclear stainer
DMEM média	Gibco	11965092	Utilisé pour la préparation de 100uM de A&beta ; (1-42)
; DMEM/F12 (mélange 1:1 de DMEM et de Jambon' s F12)	Gibco	12500062	Milieu de culture pour SH-SY5Y
DMSO (sulfure de diméthyle) Qualité de culture cellulaire	Cryopur	CP-100	Qualité de culture cellulaire utilisée comme agent de dissolution pour l’acide rétinoïque
DMSO (sulfure de diméthyle) Qualité moléculaire	Himedia	MB058	Utilisé comme l’un des agents dissolvants pour le A&bêta lyophilisé ; (1-42)
Sérum fœtal bovin	Gibco	16000044	; Supplément majeur pour les milieux de culture (origine américaine)
Fixateur de formol (tampon neutre 10 %)	Sigma Aldrich	HT5014-120ML	Composant dans la solution fixatrice de Karnovsky
Glutaraldéhyde (Grade I, 25 % dans H2O)	Sigma	G5882	Composant dans la solution fixatrice de Karnovsky
Solution HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) TCI		H024	Utilisé pour dissoudre A&beta ; (1-42) Logiciel
traitement/analyse d’images 1 mg : FIJI (ImageJ)	National Institute of Health (NIH)		Utilisé pour traiter/analyser les images et différencier les TNT des neurites à l’aide de son plugin nommé « volume viewer ».
Lyophilisateur	Christ, Alpha	2,4 LDplus	0,05 mg aliquotes de A&bêta ; (1-42) peut être stocké en -20 ° ; C après lyophilisation uniquement
Mélange pénicilline-streptomycine-néomycine Thermo	fisher Scientific	Mélange d’antibiotiques
Phalloidin-iFlor 555	Abcam	ab176756	Coloration de liaison à l’actine F
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Lapin]	CST	#2601	Anticorps
primaire Anticorps polyclonal contre la tubuline bêta 3 (TUBb3)	Clone	de nuagePAE711Hu01	Anticorps primaire
Acide rétinoïque	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Réactif différenciateur
Saponine	Merck	8047-15-2	Détergent utilisé dans le tampon d’incubation dans l’immunocoloration
Sonicateur à bain d’eau (Quart, Vanne de vidange Chauffage)	Nettoyeur à ultrasons	3.0 L/3.2	Sonicateur utilisé pour dissoudre A&beta ; (1-42) bouillon, après ajout de DMSO lors de la préparation de 100 µ ; M A&beta ; (1-42)
Logiciel de microscopie ZEN	ZEISS (Carl Zeiss)		Logiciel d’imagerie pour l’acquisition d’images de microscopie confocale avec une automatisation intelligente

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