Summary
Ersättning av frisk muskelvävnad med intramuskulärt fett är ett framträdande inslag i mänskliga sjukdomar och tillstånd. Detta protokoll beskriver hur man visualiserar, avbildar och kvantifierar intramuskulärt fett, vilket möjliggör en noggrann studie av mekanismerna som ligger till grund för intramuskulär fettbildning.
Abstract
Fibro-adipogena förfäder (FAPs) är mesenkymala stromaceller som spelar en avgörande roll under skelettmuskelhomeostas och regenerering. FAPs bygger och underhåller den extracellulära matrisen som fungerar som en molekylär myofiberställning. Dessutom är FAP oumbärliga för myofiberregenerering eftersom de utsöndrar en mängd fördelaktiga faktorer som känns av muskelstamcellerna (MuSC). I sjuka tillstånd är dock FAPs det cellulära ursprunget till intramuskulärt fett och fibrotisk ärrvävnad. Denna feta fibros är ett kännetecken för sarkopeni och neuromuskulära sjukdomar, såsom Duchennes muskeldystrofi. En viktig barriär för att bestämma varför och hur FAP skiljer sig åt i intramuskulärt fett är effektiv konservering och efterföljande visualisering av adipocyter, särskilt i frysta vävnadssektioner. Konventionella metoder för bearbetning av skelettmuskelvävnad, såsom snäppfrysning, bevarar inte korrekt morfologin hos enskilda adipocyter, vilket förhindrar noggrann visualisering och kvantifiering. För att övervinna detta hinder utvecklades ett rigoröst protokoll som bevarar adipocytmorfologi i skelettmuskelsektioner som möjliggör visualisering, avbildning och kvantifiering av intramuskulärt fett. Protokollet beskriver också hur man bearbetar en del muskelvävnad för RT-qPCR, vilket gör det möjligt för användare att bekräfta observerade förändringar i fettbildning genom att se skillnader i uttrycket av adipogena gener. Dessutom kan den anpassas för att visualisera adipocyter genom helmonterad immunofluorescens av muskelprover. Slutligen beskriver detta protokoll hur man utför genetisk härstamningsspårning av Pdgfrα-uttryckande FAPs för att studera den adipogena omvandlingen av FAPs. Detta protokoll ger konsekvent högupplösta och morfologiskt exakta immunofluorescerande bilder av adipocyter, tillsammans med bekräftelse av RT-qPCR, vilket möjliggör robust, rigorös och reproducerbar visualisering och kvantifiering av intramuskulärt fett. Tillsammans är analyspipelinen som beskrivs här det första steget för att förbättra vår förståelse för hur FAP skiljer sig åt i intramuskulärt fett och ger ett ramverk för att validera nya interventioner för att förhindra fettbildning.
Introduction
Infiltrationen av frisk muskelvävnad med fet fibros är ett framträdande inslag i Duchennes muskeldystrofi (DMD) och andra neuromuskulära sjukdomar, liksom sarkopeni, fetma och diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Även om ökad fettinfiltration vid dessa tillstånd är starkt förknippad med minskad muskelfunktion, är vår kunskap om varför och hur intramuskulärt fett bildas fortfarande begränsad. FAPs är en multipotent mesenkymal stromalcellpopulation som finns i de flesta vuxna organ, inklusive skelettmuskulatur11,12. Med ålder och kroniska sjukdomar producerar FAP emellertid fibrotisk ärrvävnad och differentieras till adipocyter, som ligger mellan enskilda myofibrer och bildar intramuskulärt fett 13,14,15,16,17,18,19,20.
För att börja bekämpa intramuskulär fettbildning måste mekanismerna för hur FAPs förvandlas till adipocyter definieras. PDGFRα är "guldstandard" -markören i fältet för att identifiera FAP i muskeln hos flera arter 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Som ett resultat har flera murina tamoxifeninducerbara Cre-linjer, under kontroll av Pdgfrα-promotorn, genererats, vilket möjliggör genetiskt manipulering av FAP in vivo med Cre-LoxP-systemet 27,28,29. Till exempel, genom att kombinera denna inducerbara Cre-linje med en genetisk reporter, kan härstamningsspårning av FAP: er utföras, en strategi som vi framgångsrikt har tillämpat för att ödeskarta FAP i muskel- och vit fettvävnad20,30. Förutom härstamningsspårning ger dessa Cre-linjer värdefulla verktyg för att studera FAP-till-fett-omvandlingen.
Ett stort hinder för att definiera mekanismen för den adipogena omvandlingen av FAPs till intramuskulärt fett är förmågan att noggrant och reproducerbart kvantifiera mängden intramuskulärt fett som har bildats under olika förhållanden. Nyckeln är att balansera bevarandet av muskel- och fettvävnad och matcha detta med tillgängliga färgningsmetoder för att visualisera adipocyter. Till exempel är skelettmuskulaturen ofta snäppfrusen utan föregående fixering, vilket bevarar myofibrer men stör adipocytmorfologin (figur 1). Däremot tar fixering följt av paraffininbäddning, samtidigt som den visar den bästa vävnadshistologin, inklusive adipocyter, bort alla lipider, vilket gör de flesta lipofila färgämnen, såsom det vanliga färgämnet Oil Red O, oanvändbart.
Figur 1: Representativa bilder av intramuskulärt fett i snapfrysta kontra fasta muskelvävnader. Immunofluorescerande bilder som visar adipocyter (gul), myofibrer (grå) och kärnor (cyan) inom både (B) snap-frusen och (C) fast TAs vid 21 dagar efter glycerolskada. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protokollet som beskrivs här bevarar myofiber- och adipocytmorfologi och möjliggör visualisering och analys av flera celltyper. Detta tillvägagångssätt är baserat på immunofluorescensfärgning av adipocyter i paraformaldehyd (PFA) -fixerad muskelvävnad, vilket möjliggör samfärgning med flera antikroppar. Det kan också enkelt anpassas för att rumsligt visa intramuskulärt fett i intakt vävnad med hjälp av helmonterad avbildning, vilket ger information om den cellulära mikromiljön av fett i muskeln. Dessutom kan detta protokoll kombineras med vårt nyligen publicerade tillvägagångssätt för att bestämma tvärsnittsarean för myofibrer i fasta muskelvävnader31, en viktig mätning för att bedöma muskelhälsa. Att kombinera detta tillvägagångssätt med genetisk härstamningsspårning för att ödeskarta differentieringen av FAP till adipocyter beskrivs också här. Således möjliggör det mångsidiga protokollet som beskrivs här rigorös och reproducerbar bedömning av FAPs och deras differentiering till intramuskulärt fett i vävnadssektioner och intakta vävnader.
Bild 2: Översikt över schematiskt protokoll. Schematisk översikt över vävnadsbehandling där en tredjedel av TA avlägsnas, snäppfryses och homogeniseras för efterföljande RNA-isolering och transkriptionsanalys via RT-qPCR. De andra två tredjedelarna av TA är PFA-fixerade och bearbetade för immunfärgning på frysta sektioner eller helmonterade fibrer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Protocol
Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Florida.
1. Genetisk härstamningsspårning av FAP
OBS: Om genetisk härstamningsspårning av FAPs inte önskas kan steg 1 hoppas över.
- För att utföra härstamningsspårning av FAP, skaffa nödvändiga musalleler.
OBS: Flera tamoxifeninducerbara Cre-linjer, under kontroll av Pdgfrα-promotorn , har genererats för att framgångsrikt rikta in sig på FAP, inklusive från Hogan29, Rando27 och Bergles32 laboratorier. Som genetisk reporter av Cre-aktivitet finns många Rosa26-reporteralleler tillgängliga som Rosa26EYFP33. Även om det föreslås för varje laboratorium att avgöra vilken Cre-Reporter-kombination som är mest effektiv, genom att korsa PdgfrαCreERT2-möss (29 och Jax # 032770) till Rosa26EYFP (33 och Jax # 006148) reporter, den resulterande PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-mösskan användas för att effektivt och specifikt markera FAPs20. För att spåra ödet för mogna FAPs rekommenderas att vänta tills möss har nått minst ~ 10 veckors ålder innan de administrerar tamoxifen. Härstamningsspårningsexperiment kan utföras på både män och kvinnor. - Administrering av tamoxifen genom oralt födosök
- Förbered 40 mg / ml tamoxifen i majsolja och virvel väl för att blanda 1 dag före sondering. Inkubera O/N vid 37 °C i en roterande hybridiseringsugn.
VARNING: Tamoxifen är cancerframkallande och bör hanteras försiktigt. Använd alltid handskar vid hantering och använd en mask när du väger den som ett pulver, eftersom det finns risk för inandning. - Rengör området enligt protokoll och fäst en gavaging nål på en 1 ml spruta. Dra in 200 μl tamoxifen i sprutan.
- Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP-möss (10 veckor gamla; båda könen används) genom att placera dem på en plan yta och ta ett fast grepp om svansens botten. Använd en fri hand för att ta tag i mitten av musen med tummen och pekfingret och skjut sedan försiktigt och med lätt tryck greppet tills det bara är förbi axlarna.
- Nyp tillbaka huden med tummen och pekfingret, ta upp musen och vänd handen så att musen är vänd mot användaren och stoppa svansen mellan det rosa och ringfingret på handen som håller musen.
- Se nu till att musen är väl immobiliserad och inte kan röra huvudet eller armarna. Sätt in gavagenålen i munnen och använd den för att luta musens huvud något tillbaka; detta gör att matstrupen kan vara bättre tillgänglig.
- Sätt försiktigt och långsamt in nålen i matstrupen. Tvinga inte nålen om något motstånd är uppfyllt; nålen ska glida ner lätt. Injicera långsamt tamoxifen. Övervaka mössen i 15-20 minuter för att säkerställa att inga problem uppstår under sondering.
OBS: Administrering av tamoxifen på 2 på varandra följande dagar resulterar vanligtvis i ~ 75% -85% rekombinationseffektivitet av FAPs utan att orsaka några negativa effekter. Det rekommenderas att användaren väntar i 1-2 veckor innan han inducerar skada, vilket gör att det återstående tamoxifenet kan tas bort från systemet och eventuellt återstående protein vändas.
- Förbered 40 mg / ml tamoxifen i majsolja och virvel väl för att blanda 1 dag före sondering. Inkubera O/N vid 37 °C i en roterande hybridiseringsugn.
2. Skada på tibialis främre (TA) muskel
OBS: För att studera intramuskulärt fett rekommenderas det att använda en glycerolbaserad skademodell (50% glycerol i steril saltlösning), vilket resulterar i massiv intramuskulär fettbildning 34,35,36,37.
- Förbered bedövningsmaskinen genom att tillsätta isofluran och se till att rören till både muskammaren och noskonen är öppna. Rengör kammaren och arbetsområdet med antingen 70% etanol eller peroxidlösning (beroende på protokoll).
- Ställ in syreflödet på 2,5 l/min och isoflurankoncentrationen på 2,5 %. Placera en mus i anestesikammaren och vänta ~ 5 min tills den sövs.
- Placera musen i rygg på en ren värmedyna och sätt in näsan i noskonen. Applicera försiktigt vet oftalmisk salva på ögonen med en bomullsspetsad applikator för att förhindra torrhet under anestesi. Övervaka kontinuerligt anestesi och utför en tånypning på musen före skadan för att säkerställa att musen är helt sövd.
- Rengör benet som ska injiceras med en ny alkoholservett för att desinficera.
- Dra upp 30-50 μl 50% glycerol (beroende på mössens storlek) i insulinsprutan. Borsta försiktigt upp håret på skenbenet för att exponera platsen för TA.
OBS: Det är lättare att flytta håret och uppnå bättre visualisering när det fortfarande är vått från alkoholservetten. - Efter att ha lokaliserat TA (precis i sidled till skenbenet, sticker det något ut genom huden och kan kännas med mild palpation), sätt in nålen i TA distalt, nära fotleden. Sätt in nålen helt i muskeln och injicera långsamt glycerol medan du gradvis drar tillbaka nålen, vilket hjälper till att skada det mesta av muskeln.
OBS: Det är bäst att sätta in nålen parallellt med benet, med bara en något förhöjd vinkel. En bra skada orsakar vanligtvis dorsiflexion eftersom TA drar ihop sig efter att nålen har dragits tillbaka. Om musens tår sprids ut är det troligt att extensor digitorum longus (EDL) -muskeln injicerades. - Placera tillbaka musen i buren och övervaka i ca 15-20 min för att säkerställa anestesiåterhämtning.
- Kasta nålen i en behållare för vassa föremål. Sätt aldrig tillbaka en nål.
OBS: Analgesi efter glycerol injektion ska tillhandahållas som godkänts av institutional animal care and use committee. Adipocyter kan observeras så snart som 5 dagar efter skada (dpi). Med 7 dpi har alla adipocyter bildats, och med 21 dpi har de mognat fullt ut.
3. Vävnadsskörd
- Förbered 4% PFA i 1x PBS och lägg på is innan skörden påbörjas.
- Placera alla plattor (12- eller 24-brunnar) som används för muskelfixering på is och tillsätt 4% PFA till varje brunn, se till att varje brunn har 10-20 gånger mer volym PFA än vävnaden som fixeras.
- Mellan 7 och 21 dagar efter glycerolskada, avliva musen enligt institutionella riktlinjer (dvs. isofluranöverdos följt av cervikal dislokation).
- Börja skörda alla vävnader som ska användas för histologi eller RNA-isolering.
OBS: Vävnader ska snäppfrysas eller placeras i PFA inom 10-15 minuter efter offrasättning (figur 2). - Spraya liberalt alla delar av musen som ska skäras in med 70% etanol för att hålla håret borta från dissekeringsområdet och instrumenten.
- Använd sax för att klippa huden runt toppen av benet, nära bäckenet (figur 3A).
- Dra försiktigt benets hud från toppen ner till fotleden (figur 3B).
OBS: TA är en droppformad muskel med en tydligt definierad distal sena som fäster vid den mediala kilformen och det första metatarsala benet. Det är lateralt mot skenbenet och sträcker sig upp till underknäet. - Ta först bort det yttre bindvävsskiktet (epimysium) med en pincett med skarp spets innan du skördar TA (figur 3C). Använd ett dissekerande mikroskop för att visualisera epimysium bättre.
- Skjut pincetten under TA från muskelns botten, börja vid den distala senan och dra försiktigt uppåt mot knäet (figur 3D). Sluta i slutet av muskeln; tryck inte förbi motståndet som känns vid underknäet.
- Om det finns betydande motstånd innan du når det nedre knäet, stoppa och fortsätt att ta bort kvarvarande lager av bindväv.
OBS: Det finns en annan distal sena precis i sidled till TA-senan som fäster vid EDL, som är en smal muskel i sidled till TA. Att vara noga med att bara skjuta pincetten under TA-senan förhindrar oavsiktlig skörd av EDL, men den kan också enkelt tas bort efter fixering. - När TA har lyfts delvis från benet med pincetten, använd samma rörelse med en skalpell för att bryta anslutningen av TA till det nedre knäet (figur 3E). Skär senan vid fotleden med sax för att helt ta bort TA. Hantera endast muskeln vid senan för att undvika att skada fibrerna.
- Skär 1/3 av TA i slutet mittemot senan (figur 3F), lägg den i ett mikrocentrifugrör och snäppfrys genom att släppa den i flytande kväve (figur 3H).
- Sänk ner de andra 2/3 av vävnaden i en märkt brunn med 4% PFA för histologi (figur 3I). Var noga med att hålla reda på när den första och sista vävnaden placerades i fixativ. Placera på en shaker i 2-2,5 timmar vid 4 °C.
- Varaktigheten av fixeringen är beroende av vävnaden och dess storlek. Bestäm den varaktighet som krävs för att fixera vävnaderna. Fixering av TAs i 2-2,5 timmar vid 4 ° C bevarar vanligtvis adipocytmorfologi väl utan att orsaka överfixering av vävnaden.
OBS: Om du planerar att använda TA för helmonterad immunofluorescerande färgning, hoppa över resten av detta protokoll tills du når avsnitt 7: "Helmonterad immunofluorescerande färgning". - Efter fixering, ta bort PFA från brunnarna, skölj vävnaderna med kall 1x PBS 2-3 gånger och tvätta sedan 2-3 gånger med kall 1x PBS i 5 min per tvätt.
- Ta bort PBS från brunnarna och tillsätt tillräckligt med 30% sackaros i 1x PBS så att vävnaden kan flyta. Placera den på shakern vid 4 °C över natten.
Figur 3: Sammanfattning av vävnadsskörden (A) Huden skärs vid benets botten och (B) bakbensmusklerna exponeras. (C) När epimysium har tagits bort från TA används (D) pincett för att delvis separera muskeln och säkerställa att epimysium har tagits bort helt. (E) TA skärs från benet med en skalpell och avlägsnas efter skärning av senan. (G) Efter att ha skurit ta i en tredjedels och två tredjedelars bit, (H) är en tredjedel snäppfryst i flytande kväve för RT-qPCR-analys och (I) den andra två tredjedelen fixeras i 4% PFA för histologi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Inbäddning
- Förbered provformarna som ska användas för inbäddning genom att märka och fylla med tillräckligt med inbäddningsmedium för att helt sänka ner vävnaderna.
- Ta bort vävnader från brunnarna, torka av överflödig sackaros på en pappershandduk och flytta till de frysande medelfyllda provformarna.
OBS: Det är bra att veta i vilken riktning formen med delas på kryostaten. På så sätt kan användaren orientera vävnaderna i formen på ett sätt som gör att intresseområdet är lättillgängligt. För TA skulle detta uppnås genom att sätta den tjockaste änden (mittemot senansidan) mot ytan som kommer att sektioneras. Detta gör att TA lätt kan sektioneras vid sin tjockaste del (mage) och möjliggör tvärsnittsskärning av muskelfibrerna. - Förbered en isopenuppslamning genom att delvis sänka ner en behållare som innehåller isopentan i flytande kväve. Se till att det finns tillräckligt med flytande isopentan i behållaren för att sänka ner ungefär hälften av provformen som ska användas för att bädda in vävnaderna.
- Börja frysa formarna genom att försiktigt lägga dem i isopenanuppslamningen och se till att ungefär hälften av formen är nedsänkt. Se också till att formen fryser lika från alla fyra sidor.
- Ta formen ur isopanten precis innan hela formen är synligt frusen över från toppen. Hur lång tid det tar beror på vilka formar som används.
- Förvara de frysta formarna i en behållare med torris medan du fryser resten av blocken och förvara dem sedan vid -80 °C.
OBS: Isopentan för frysning kan återanvändas. Sätt i en glasflaska men dra inte åt locket förrän isopentan når rumstemperatur (RT). Annars kan tryckförändringen krossa flaskan.
5. Sektionering
- Ställ in kryostaten på -22 till -24 °C, tillsätt formar som innehåller TAs i kryostaten och vänta i minst 30 minuter på temperaturacklimatisering. Under tiden märker du en serie positivt laddade mikroskopglas.
- Sätt i en krängningsplatta och rikta in den mot kryostaten så att det finns minimala hack i plattan där den kommer i kontakt med provblocket. Säkert på plats.
- Sätt i ett nytt kryostatblad i bladhållaren och säkra det på plats.
VARNING: Bladet är vasst. Täck bladet när du manipulerar andra delar av kryostaten eller frysta formar. - Ta bort det frusna blocket från formen. Lägg till ett enhetligt lager av inbäddningsmedium till kryostatchucken och placera blocket i mediet. Låt det sitta i 1-3 minuter tills inbäddningsmediet är helt fruset (ogenomskinligt vitt).
OBS: För TAs bör det tjockaste området (magen) vara synligt när du är på chucken. - Placera kryostatchucken med vävnadsblocket i kryostaten. Avtäck bladet och för kryostaten framåt tills den precis kommer i kontakt med bladet. Sektion genom blocket vid 25 μm sektioner tills vävnaden inte längre döljs av inbäddningsmediet.
OBS: Justera kryostatens vinkel och / eller scenens position under sektionering så att sektionerna har en jämn tjocklek. Det kan vara bra att samla några sektioner för att säkerställa enhetlighet i sektionstjockleken. Det rekommenderas att användaren hittar rätt krängningsplattposition innan han eller hon går vidare till det intressanta området inom TA (magen), eftersom detta gör att användaren kan prova flera positioner på krängningsplattan tills sektionerna lossnar rakt utan att slösa bort vävnad. - Ändra sektionstjockleken till 10-12 μm och samla sektionerna på märkta mikroskopglas. Seriell sektionering rekommenderas genom att samla intilliggande sektioner på 6-10 bilder (märkta 1-x), vilket möjliggör färgning för flera markörer. Om det behövs, använd en tunn borste för att lossa sektioner innan du samlar dem på bilden.
OBS: Om sektionerna krullar, kontrollera att temperaturen håller sig stadigt inom intervallet -22 till -24 °C. Om det finns vertikala strimmor i sektioner kan detta bero på ett nick i krängningsplattan eller bladet; Detta kan åtgärdas genom att justera krängningshämmarens läge och/eller byta till ett nytt blad. - Efter att ha samlat intilliggande sektioner av samma sektionsplan på varje bild, justera tjockleken tillbaka till 25 μm för att avancera 150-200 μm genom blocket, justera sedan tjockleken tillbaka till 10-12 μm och börja sektionera igen.
OBS: Denna seriella sektionering gör det möjligt för användaren att visualisera, avbilda och kvantifiera på olika djup genom TA; tre till fyra serieavsnitt per bild räcker. - Förvara objektglasen och vävnadsblocken vid -80 °C.
6. Immunofluorescerande (IF) färgning av vävnadssektioner
OBS: Eftersom antikroppskoncentrationer kan variera mellan partier och tillverkare rekommenderas optimering genom att utvärdera flera olika koncentrationer av antikropparna på testglas innan färgning av de intressanta bilderna färgas.
- Tina/torka objektsglas antingen vid RT eller på en varm platta vid 37 °C i 10-20 min.
- Använd en hydrofob penna för att rita en linje vid kanten av bildens pappersyta, där den möter glaset.
- Lägg bilderna i en Coplin-burk och tvätta med 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x på en shaker i minst 5 minuter per tvätt för att rehydrera vävnadssektionerna.
OBS: Vid denna tidpunkt är det viktigt att inte låta bilderna sitta utan att vara nedsänkta i PBST (upp till den hydrofoba linjen), annars torkar vävnadssektionerna ut. - Placera bilderna på hyllan i en befuktningskammare och överlagra bilderna med 310-350 μl blockerande lösning (5% åsneserum och 0,3% Triton X-100 i 1x PBS) i 1-2 timmar vid RT.
OBS: Inget extra permeabiliseringssteg behövs, eftersom blockeringslösningen innehåller 0,3% Triton X-100 vilket möjliggör tillräcklig permeabilisering av vävnadssektionerna. Vid användning av primära antikroppar härledda från möss (dvs. PAX7 och MYOD1 som anges nedan) rekommenderas att inkludera ett mus-mot-mus-blockeringssteg med Fab-fragment (1:50) i blockeringslösningen för blockeringssteget. Detta kommer att bidra till att minska bakgrunden på grund av ospecifik bindning av musens sekundära antikropp till andra antikroppar än den primära. - Späd de primära antikropparna som ska användas i blockeringslösningen strax innan du fortsätter till nästa steg enligt följande:
- Primära antikroppar för adipocytfärgning och hel sektionsavbildning: Utspädd kanin-anti-Perilipin vid en utspädningsförhållande på 1:1000.
- Primära antikroppar för härstamningsspårning av adipocyter: Späd kyckling anti-GFP i förhållandet 1:1000 och kanin-anti-Perilipin vid 1:1000.
- Primära antikroppar för härstamningsspårning av FAPs: Späd kyckling anti-GFP i förhållandet 1: 1000 och get anti-PDGFRα vid 1:250.
- Primära antikroppar för myogena markörer: Späd mus anti-PAX7 i förhållandet 1:25 eller mus anti-MYOD1 vid 1:250 och kanin-anti-LAMININ vid 1:1000.
OBS: Även om antikropparna som anges ovan framgångsrikt har utvärderats med detta protokoll, är det troligt att andra markörer och antikroppar för att märka FAPs, adipocyter och / eller andra celltyper också är kompatibla med detta protokoll. Det rekommenderas starkt vid användning av primära antikroppar för första gången att användaren inkluderar en negativ kontrollglas, där primära antikroppar utelämnas. Detta kommer att styra för antikropparnas specificitet. Alla andra steg i protokollet följs, inklusive tillsats av sekundära antikroppar, men blockeringslösningen används ensam i nästa steg istället för den primära antikroppen i blockeringslösningen.
- Dumpa blockeringslösningen från objektglasen och lägg över med 310–350 μl blockerande lösning med primära antikroppar och inkubera över natten vid 4 °C i befuktningskammaren.
- Nästa dag dumpar du blockeringslösningen/primära antikroppar från bilderna och lägger dem i en Coplin-burk. Skölj bilderna 2-3 gånger med PBST och tvätta 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 minuter per tvätt.
- Under den sista tvätten, förbered de sekundära antikropparna eller eventuella direkta konjugat som ska användas i blockeringslösningen. Minimera den tid dessa antikroppar spenderar i ljuset för att undvika fotoblekning.
- Späd sekundära antikroppar/direkta konjugat: 488 nm åsna anti-kyckling (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller anti-mus (1:1000), 568 nm åsna anti-get (1:1000) eller anti-kanin (1:1000) eller falloidin (myofibrer; 1:100), DAPI-fläck (kärnor; 1:500).
- Överlägg objektglasen med 310-350 μL av blockeringslösningen med sekundära antikroppar och/eller direkta konjugat i befuktningskammaren. Inkubera vid RT i 1-2 timmar. Skydda prover från ljus från och med nu.
- Dumpa blockeringslösningen/sekundära antikroppar och lägg dem i en Coplin-burk. Skölj med PBST en gång och tvätta 3-5x med PBST på en shaker i minst 5 min per tvätt. Håll Coplin-burken täckt för att förhindra ljusexponering.
- Torka bilderna så bra som möjligt genom att knacka på kanterna och torka av ryggen mot en pappershandduk, men låt inte vävnadssektionerna torka ut.
- Tillsätt tre eller fyra droppar vattenhaltigt monteringsmedium till den övre horisontella kanten av bilden och lägg försiktigt till ett täckglas. Tryck inte ner eller rör dig om luftbubblor bildas under täckglaset. varje tryck eller rörelse kan snedvrida den bräckliga cellulära arkitekturen hos adipocyter.
- Låt monteringsmediet stelna i mörker över natten före avbildning.
7. Helmonterad immunofluorescerande färgning
- Efter ~ 1 timmars fixering (se steg 3.14), använd pincett med skarp spets för att skala bort myofibrer från den fasta TA.
- Placera de separerade fibrerna i en 24-brunnsplatta och tvätta 3x i 3 minuter vardera med PBST. För alla efterföljande inkubationer, se till att tillsätta locket för att förhindra avdunstning.
- Inkubera i 1 h i 1% Triton X-100 i 1x PBS vid RT (200-300 μL) på en shaker för att möjliggöra bättre penetration av antikroppar.
- Efter sköljning några gånger med PBST, täck över med blockerande lösning (200-300 μL) och blockera på en mutter eller shaker över natten vid 4 °C.
- Späd de primära antikropparna vid önskad koncentration (fördubbling av koncentrationen tenderar att vara en bra utgångspunkt) i blockeringslösningen. Inkubera proverna (200–300 μl) på en nutator eller shaker över natten vid 4 °C.
- Tvätta proverna noggrant med PBST hela dagen med frekventa byten vid RT på shakern, ca 4-6x i 30-60 min varje tvätt.
- Späd de sekundära antikropparna i blockeringslösningen vid önskad koncentration (1:500 tenderar att fungera bra) plus kärnfärgning och inkubera proverna (200-300 μl) på en mutter eller shaker över natten vid 4 °C.
- Tvätta proverna noggrant med PBST under hela dagen med frekventa byten vid RT på shakern, cirka 4-6 gånger i 30-60 minuter varje tvätt eller tvätt över natten vid 4 °C.
- För montering, torka försiktigt bort överflödig PBST och placera sedan fibrerna i en eller två droppar monteringsmedium på en glasskiva (figur 4A). För att höja täckglaset (18 mm x 18 mm), lägg till små lerfötter; detta förhindrar att fibrerna kläms och säkrar täckglaset till bilden. Modelleringsföreningar fungerar bra för detta. När täckglaset är säkrat, lägg till mer medium i kanten tills området under täckglaset är fullt.
OBS: Istället för att använda ett monteringsmedium som innehåller anti-blekningsmedel kan vävnaden också flyttas genom en stigande serie glycerol (30% till 80% glycerol i PBS). - Vänta i 1-2 dagar före avbildning för att möjliggöra härdning av monteringsmediet.
8. Avbildning av intramuskulärt fett
- Slå på mikroskopet och starta bildprogramvaran. Säkra bilden på scenen.
OBS: För avbildning av adipocyter i muskelsektioner är ett 5x eller 10x mål i kombination med widefieldmikroskopi ofta tillräckligt. För visualisering av WM-IF krävs ett konfokalmikroskop. - Använd valfri kanal för att identifiera det område som ska avbildas.
- I bildprogramvaran justerar du förstärknings- och exponeringstiden för varje kanal.
- Ta bilder av hela vävnaden i varje kanal (automatisk eller manuell enligt mikroskop och programvara som används) och slå samman enskilda plattor för att göra en komposit av hela TA-tvärsnittet.
OBS: Det rekommenderas att ta bilder av två eller tre olika sektioner av samma TA på olika djup. Genom att kvantifiera adipocyterna i varje sektion och sedan rapportera medelvärdet undviks lokaliserade skillnader i mängden intramuskulärt fett på grund av exempelvis injektionsfel.
9. Kvantifiering av adipocyter
- Om det inte är installerat tidigare lägger du till plugin-programmet Cell Counter i ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
- Importera bilderna till ImageJ som TIF-filer eller ursprungliga mikroskopfiler. Visa varje kanal i ImageJ som en separat TIF-fil.
Om du använder LIF eller liknande mikroskopfiltyper, under Alternativ för import av bioformat , välj Hyperstack för Visa stack med och markera rutan för Delade kanaler. Klicka på OK för att öppna filen. Se också till att rutan Autoskalning är avmarkerad. - Se till att bilderna för varje kanal är i 8-bitarsformat (och grå): Bild > Typ > 8-bitars.
- Slå samman DAPI -bilder (blå), GFP (grön), PERILIPIN (röd) och PHALLOIDIN (grå): Bild > färg > slå samman kanaler.
- Kontrollera att skalan (Analysera > Ange skala) är i mikron. Använd verktyget för frihandsval, skissera den skadade och oskadade delen av varje tvärsnitt, mät sedan (Analysera > mått) och registrera det skadade kontra oskadade området i ett kalkylblad.
OBS: Skadad muskel kan identifieras som områden utan myofibrer eller områden befolkade av myofibrer som innehåller centralt belägna kärnor. - Starta cellräknare: Plugins > CellCounter > initiera.
- Välj en räknartyp och räkna sedan varje adipocyt. Registrera det totala antalet adipocyter i ett kalkylblad och beräkna sedan antalet adipocyter per 1 mm2 av det skadade området.
10. Adipogen genuttrycksanalys med RT-qPCR
- RNA-isolering
- Innan du börjar, förvärm RNase-fritt vatten till 45 ° C och förbered färskt 70% EtOH (350 μL per prov).
- Tillsätt 1 000 μl guanidiumtiocyanat till varje rör som innehåller provet (se steg 3.12). Det är viktigt att pärlvispgodkända rör används.
VARNING: Guanidiumtiocyanat är giftigt. Använd lämplig personlig skyddsutrustning och hantera i en dragskåp. - Lägg till tre medelstora pärlor eller en stor och en liten pärla till varje rör.
- Homogenisera vävnaden vid 50 Hz i 2-4 min med en pärlvispare. Beroende på vävnadstyp och provstorlek kan det ta upp till 10 minuter.
- Tillsätt 200 μl kloroform.
VARNING: Kloroform är giftigt. Använd personlig skyddsutrustning och hantera i en dragskåp. - Skaka proverna i 15 s. Inkubera i 2-3 min vid RT.
- Centrifugera i 15 min vid 12 000 x g. Pipettera ut 350 μL av den klara supernatanten (övre lagret som innehåller RNA) och tillsätt till ett nytt mikrocentrifugrör innehållande 350 μL 70% etanol. Var försiktig så att du inte suger på de lägre protein- och /eller DNA-skikten
- Överför upp till 700 μl av blandningen till en minispinnkolonn placerad i ett 2 ml uppsamlingsrör. Fortsätt med RNA-isolering enligt tillverkarens instruktioner.
- Eluera med 30-50 μL RNase-fritt vatten, beroende på förväntat utbyte. Håll RNA på is och mät utbytet med en spektrofotometer. Förvara RNA vid -80 °C
OBS: Det är möjligt att utelämna DNase-behandlingssteget, eftersom det är tillräckligt att försiktigt ta av bara den övre 350 μL av RNA-skiktet för att förhindra DNA-kontaminering. Förutom RT-qPCR-analys kan det isolerade RNA också användas för RNA-sekvensering, i vilket fall ett DNase-behandlingssteg rekommenderas starkt.
- cDNA-syntes
- Använd upp till 1 μg RNA för att syntetisera cDNA med ett cDNA-synteskit, enligt tillverkarens instruktioner.
- När körningen är klar, tillsätt 80 μL RNase-fritt vatten. Förvara proverna vid -20 °C.
- RT-qPCR av adipocytselektiva gener.
- Använd ett 384-brunnsformat, tillsätt 1 μL primer (~ 1 μM slutlig koncentration) till botten av varje brunn. Förtorkningsprimrar resulterar i tätare tekniska replikat. Låt stå täckt tills grundfärgerna har avdunstat helt (plattan kan placeras på ett värmeblock inställt på 37 °C för att påskynda avdunstningen).
- Ställ in provreaktioner med fyra till åtta tekniska replikat enligt följande: 2,5 μL färgämnesbaserad RT-PCR-masterblandning, 2,1 μl RNasfritt vatten och 0,4 μL cDNA (~1 ng) med 5 μl total volym per brunn. Följande termiska cykelförhållanden användes: denatur vid 95 °C i 15 s och glödgning/sträckning vid 60 °C i 25 s i 40 cykler.
- Normalisera råa CT-värden (cykeltröskel) till hushållningsgener (dvs . Hprt - och Pde12) -nivåer genom att beräkna ΔΔCT enligt beskrivningen här38. Se20 för primersekvenser.
OBS: Standardpraxis för RT-qPCR-analys bör följas, såsom användning av en minus omvänd transkriptionskontroll (-RT), PCR-reaktion och primervalidering.
Representative Results
Immunofluorescerande visualisering av intramuskulärt fett
Efter stegen ovan och visning av figur 1A samlades TA-vävnadssektioner från en 21-dagars post glycerolskada som antingen snäppfrystes omedelbart efter skörd i LN2-kyld isopentan eller fixerades i 4% PFA i 2,5 timmar. Efter kryosektion och färgning av båda proverna togs bilder i mitten av magen, det största området i TA. PERILIPIN + adipocyter från de ofixerade TAs (figur 1B) har signifikant förändrat morfologin jämfört med fasta sektioner (figur 1C), vilket gör deras identifiering, visualisering och efterföljande kvantifiering mycket svårare och potentiellt felaktig. Att notera, de första PERILIPIN + lipiddropparna upptäcktes cirka 5 dagar efter skada, med de flesta adipocyter som bildades vid dag 7. Vid 21 dagar efter skada hade adipocyter mognat fullt ut.
Eftersom mängden fett per TA starkt korrelerar med svårighetsgraden av den inducerade skadan måste TAs skadas avsevärt för att effektivt observera och studera intramuskulär fettbildning. Att öva injektioner med bläck i kadaver-TAs är ett utmärkt sätt att förbättra skadans svårighetsgrad. Framgångsrika skador tenderar att vara över 50% av muskeln. Att notera representerar skadade områden i muskeln områden utan muskelfibrer eller områden som är befolkade av muskelfibrer som innehåller minst en centralt belägen kärna, ett känt kännetecken för en regenererande muskelfiber.
Detta protokoll kan lätt anpassas till fläckar för FAPs och fett i 3D. För detta separerades flera myofibrer från TA-efterfixeringen noggrant, följt av helmonterad immunofluorescens. Nyckeln är att ordentligt säkra fibrerna i glasskivan och samtidigt undvika överkomprimering av vävnaden. Genom att använda formbara lerfötter kan användaren justera önskad tjocklek och fästa täckglaset på bilden, till och med tillåta användning av ett inverterat mikroskop (figur 4A). Denna metod användes framgångsrikt för att märka PDGFRα+ FAPs, Phalloidin+ myofibrer och PERILIPIN-uttryckande adipocyter (Figur 4B, Kompletterande Video 1 och Kompletterande Video 2). Efter att ha fått bilder på flera z-plan som sträckte sig upp till 150 μm i tjocklek användes 3D-renderingsmodulen i mikroskopprogramvaran för att skapa en 3D-rekonstruktion.
Figur 4: Helmonterad immunofluorescerande färgning. (B) Representativa 3D-rekonstruktioner av FAP (grön; vänster) och adipocyter (röd; höger) tillsammans med myofibrer (grå) och kärnor (blå). Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kvantifiering av intramuskulärt fett
När bilder har tagits av intramuskulärt fett användes cellräknarfunktionen i ImageJ/FIJI för att manuellt räkna antalet PERLIPIN+ -adipocyter (figur 5A). Därefter bestämdes den totala ytan av muskelsektionen såväl som det skadade området, definierat av centralt belägna kärnor i myofibrer. För att kontrollera skadans svårighetsgrad dividerades det totala antalet adipocyter med det skadade området vilket resulterade i antalet fettceller per 1 mm2 skadad muskel. Vanligtvis utesluts TAs som uppvisar <30% skada från kvantifieringarna. Att notera, även om adipocyter är sällsynta utan skada, allt från noll till åtta per tvärsnittsarea, normaliseras det totala antalet adipocyter fortfarande med total yta. Som framhävs i figur 5B orsakar en glycerolskada enorma mängder intramuskulärt fett jämfört med en oskadad TA-muskel. Alternativt, eftersom Perilipin-färgning är mycket ren med ett högt signal-brusförhållande, är det också möjligt att använda funktionen Analysera partikel för att bestämma den totala ytan som perilipin upptar. Denna metod kommer emellertid inte att kunna skilja mellan mindre kontra färre adipocyter. Upp till tre sektioner från minst fyra enskilda djur avbildades och kvantifierades, och det genomsnittliga antalet närvarande fettceller per mus rapporterades.
Figur 5: Kvantifieringar av intramuskulärt fett (A) Representativ bild av hur man räknar PERILIPIN+ adipocyter (vita) med hjälp av cellräknarfunktionen i ImageJ. Skalstreck: 50 μm. (B) Hela TA adipocytkvantifieringar 21 dagar efter glycerolinjektion normaliserad till 1 mm2 av det skadade området. Varje punkt representerar genomsnittet av en mus. **** = p < 0,0001. (C) RNA-skikt efter homogenisering och efterföljande fasseparation med kloroform används för RT-qPCR-analys. (D) Vik förändringar i uttrycksnivåer av Pparg och Cepbα, tidiga adipogena gener och Plin1 och Adipoq, två mogna adipocytmarkörer, vid olika tidpunkter efter glycerolskada. Varje punkt representerar genomsnittet av en mus. Klicka här för att se en större version av den här siffran.
För att självständigt bekräfta mängden intramuskulärt fett närvarande kan genuttrycksnivåer av olika adipogena markörer bestämmas. För detta kan RNA isoleras från en del av samma TA-muskel som används för immunofluorescens (se steg ovan) vid olika punkter efter skada. En pärlvisp användes i kombination med guanidiumtiocyanat för att homogenisera vävnaden. Efter tillsats av kloroform följt av centrifugering extraherades det övre RNA-innehållande skiktet noggrant och minispinnkolonner användes för RNA-rengöring (figur 5C). Denna metod producerar rutinmässigt hög kvalitet och kvantitet av RNA som är lämplig för alla nedströmsanalyser såsom RT-qPCR och RNAseq. För RT-qPCR bestämdes de relativa uttrycksnivåerna för adipogena till hushållningsgener, och eventuella relativa förändringar bedömdes enligt ΔΔCT-metoden38. Som beskrivs i figur 5D, jämfört med oskadad TA-muskel, inducerar glycerolskada uttryck av tidiga adipogena markörer som Pparg och Cebpα så snart som 3 dagar efter skada. Mogna markörer, såsom Adiponectin (Adipoq) och Perilipin (Plin1), kan detekteras så tidigt som 5 dagar efter glycerolskada.
Genetisk härstamning spårning av adipocyter
Adipocytfärgningsprotokollet som presenteras här kan enkelt anpassas för att inkludera genetisk härstamningsspårning av FAP för att kartlägga och följa deras öde till adipocyter. Vi har till exempel tidigare visat att rekombination kan induceras via tamoxifenadministrering i PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-möss 2 veckor före skadan, vilket effektivt tar bort den floxade stoppkodningen och indeplånligt aktiverar EYFP-uttryck i FAPs (figur 6A). Vi uppnådde hög rekombinationseffektivitet med tamoxifenregimen som presenteras här, med ~ 75% av PDGFRα + FAPs som uttrycker EYFP20, liknande vad andra laboratorier har rapporterat 27,39,40. För att visa att FAPs verkligen är det cellulära ursprunget till intramuskulärt fett, har majoriteten av FAPs förvandlats till EYFP + PERILIPIN-uttryckande adipocyter 7 dagar efter glycerolskada (Figur 6B).
Figur 6: Härstamningsspårning av FAPs. (B) Representativa immunofluorescerande bilder som visar framgångsrik rekombination och aktivering av EYFP (gul) inom PDGFRα+ FAPs (röd, pilspetsar) och PERILIPIN+ adipocyter (röd, asterisker). Skalstreck: 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Detektion av flera celltyper
Detta protokoll kan också användas för att visualisera det myogena facket. Med hjälp av antikroppar mot PAX7 och MYOD1 kan muskelstamceller (MuSC) respektive myoblaster lätt detekteras 5 dagar efter glycerolskada även i PFA-fixerad muskelvävnadssektion (figur 7). Således är det presenterade protokollet mångsidigt och anpassningsbart till inte bara etikett- och bildadipocyter och FAP utan också andra celltyper av den myogena härstamningen.
Figur 7: Muskelstamcells- och myoblastimmunfluorescerande färgning. (B) Representativa immunofluorescerande bilder som visar framgångsrik färgning av muskelstamceller (MuSC) (gul, vänster) med PAX7 och myoblaster (gul, höger) med MYOD1. LAMININ skisserar myofibrerna (vita) och kärnorna är i cyan. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video 1: 3D-rendering av FAP: er. Tredimensionell rekonstruktion av myofibrer, FAP och kärnor färgade för PHALLOIDIN (grå), PDGFRα (grön) respektive DAPI (blå) 21 dagar efter skada. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande video 2: 3D-rendering av intramuskulärt fett. Volumetrisk återgivning av myofiberbuntar (grå, PHALLOIDIN) och intramuskulärt fett (rött, PERILIPIN), som har ersatt en myofiber 21 dagar efter glycerolskada. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Discussion
Detta protokoll beskriver ett omfattande och detaljerat protokoll som möjliggör effektiv visualisering och rigorös kvantifiering av intramuskulärt fett. Genom att dela upp samma muskel i två delar, en används för immunofluorescens och den andra för RT-qPCR-analys, är detta protokoll också mycket mångsidigt. Det kan också kombineras med genetisk härstamningsspårning av FAPs för att studera deras omvandling till adipocyter under vissa förhållanden och är mycket anpassningsbar för att märka och avbilda flera ytterligare celltyper.
De vanligaste sätten att visualisera intramuskulärt fett är paraffinsektioner följt av hematoxylin- och eosinfärgning eller frysta sektioner färgade för lipofila färgämnen som Oil Red O (ORO). Men medan paraffinbehandlade vävnader upprätthåller den bästa histologin, extraherar samma process också alla lipider som förhindrar användning av lipofila färgämnen. Även om lipofila färgningsmetoder kommer att fungera på både PFA-fixerade och ofixerade vävnadssektioner, förskjuts lipiddroppar lätt genom att applicera tryck på täckglaset och därigenom snedvrida den rumsliga fördelningen av intramuskulärt fett. För att kringgå detta upprättade en nyligen genomförd studie ett rigoröst protokoll för att visualisera ORO + adipocyter med hjälp av en helmonteringsmetod. För detta decellulariserade författarna TA för att visualisera den rumsliga fördelningen av intramuskulärt fett genom hela TA41. Så kraftfull som denna teknik är, förhindrar den också användning av andra samfläckar för att markera ytterligare cellulära strukturer. Hela mount immunofluorescensmetoden som presenteras här kan användas för att samfärga adipocyter med en mängd olika markörer som möjliggör fin kartläggning av den cellulära miljön. En stor utmaning är dock vävnadspenetrationen av antikropparna. Ju fler fibrer som hålls ihop, desto svårare blir det för antikropparna att lika penetrera och binda alla tillgängliga antigener. Således är denna metod mest effektiv när man tittar på små grupper av fibrer. Samtidigt är detta också en begränsning eftersom den övergripande anatomiska platsen för intramuskulärt fett går förlorad när man fokuserar på endast små, avskalade fiberbuntar. Men med den nuvarande utvecklingen av nya vävnadsrensningsmetoder plus ny bildteknik kommer större vävnadspenetration och visualisering att vara möjlig i framtiden 42,43,44.
Medan tidigare fixering av muskelvävnad bevarar adipocytmorfologi, skapar det också en utmaning att bedöma storleken på myofibrer, ett viktigt mått på muskelhälsa. Myofiberstorlek bestäms genom att mäta myofibrernas tvärsnittsarea. Vi har tidigare rapporterat att tidigare fixering av muskelvävnad kommer att orsaka att de flesta markörer som är tillgängliga för att beskriva myofibrer misslyckas31. För att övervinna detta hinder har vi utvecklat en ny bildsegmenteringspipeline, som möjliggör mätning av myofiberstorlek även i fasta muskelsektioner31. Således har vi etablerat en robust och effektiv vävnadsbehandlingsrörledning som, i kombination med detta protokoll, övervinner de flesta nackdelar orsakade av tidigare fixering av muskelvävnad.
En annan stor fördel med detta tillvägagångssätt är mångsidighet. Genom att dela upp TA i två delar maximeras mängden information som kan erhållas från en muskel. Detta minskar inte bara djurantalet utan lägger också till ett extra lager av kontroll genom att bekräfta histologi genom genuttryck och vice versa. Dessutom kan många olika gener undersökas bortom adipogena gener. Det isolerade RNA kan också användas för ett helt muskel RNAseq-experiment. Slutligen kan den snap-frysta muskelbiten också användas för proteinarbete. En begränsning i detta protokoll är risken för att skadan inte är konsekvent över hela den totala tillåtna fångstmängden. Detta kan leda till ett scenario där de två muskeldelarna avviker i mängden intramuskulärt fett de innehåller och kan motivera att ett sådant prov utesluts från någon nedströmsanalys. Det rekommenderas därför att inte bara förlita sig på RT-qPCR för att dra viktiga slutsatser om mängden intramuskulärt fett, utan snarare som stödjande data till de histologiska kvantifieringarna.
Tillsammans beskriver detta protokoll en robust, effektiv och rigorös vävnadsbehandlingspipeline som möjliggör visualisering och kvantifiering av intramuskulärt fett, det första steget i att utveckla nya behandlingsalternativ för att bekämpa fettfibros. Samtidigt är den mångsidig och kan anpassas till många olika celltyper i muskeln samt adipocyter i andra vävnader.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmarna i Kopinke-laboratoriet för att de hjälpte till med datainsamlingar och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också medlemmarna i Myology Institute vid University of Florida för deras värdefulla bidrag till manuskriptet. Arbetet stöddes av NIH-anslaget 1R01AR079449. Figur 2 skapades med Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
| 2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
| Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
| BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
| Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
| Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
| Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
| DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
| Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
| Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
| Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
| Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
| Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
| mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
| mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
| MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
| Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
| QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
| Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
| Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
| Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
| Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
| Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
| Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
| Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
| Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
| Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
| Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
| TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
| TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
| Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
| VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
| Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
References
- Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19 (2017).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
- Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
- Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
- Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
- Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
- Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16 (2021).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
- Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496 (2012).
- Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424 (2017).
- Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750 (2021).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
- Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186 (2014).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
- Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
- Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
- Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793 (2021).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084 (2013).
- Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
- Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
- Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617 (2021).
- Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371 (2021).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
- Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
