Summary
Bu protokol, fare yağ depolarının diseksiyonu ve endotel hücre popülasyonunu serbest bırakmak ve daha sonra tanımlamak için ilgili arterlerin izolasyonu ve sindirimi için bir yöntemi detaylandırır. Aşağı akış uygulamalarında kullanılan taze izole edilmiş hücreler, vasküler hücre biyolojisinin ve vasküler disfonksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletecektir.
Abstract
Vasküler sistemin duvarını kaplayan vasküler endotel hücreleri, vasküler ton regülasyonu, bariyer fonksiyonları ve anjiyogenez dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Endotel hücre disfonksiyonu, ciddi kardiyovasküler hastalıkların ilerlemesi için ayırt edici bir belirleyici ve ana itici güçtür, ancak altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Endotel hücrelerini çeşitli vasküler yataklardan doğal formlarında izole etme ve analiz yapma yeteneği, kardiyovasküler hastalık süreçleri hakkında fikir verecektir. Bu protokol, fare subkutan ve mezenterik yağ dokularının diseksiyonu ve ardından ilgili arteriyel vaskülatürlerinin izolasyonu için prosedürü sunar. İzole arterler daha sonra fonksiyonel olarak canlı endotel hücrelerini serbest bırakmaya odaklanan belirli bir sindirim enzimi kokteyli kullanılarak sindirilir. Sindirilen doku, pozitif endotel hücre tanımlaması için belirteçler olarak CD31 + / CD45 hücreleri kullanılarak akış sitometrisi analizi ile değerlendirilir. Hücreler hemen aşağı akış fonksiyonel tahlilleri için sıralanabilir veya birincil hücre hatları oluşturmak için kullanılabilir. Arterleri farklı vasküler yataklardan izole etme ve sindirme tekniği, araştırmacıların yeni izole edilmiş vasküler hücreleri ilgilendikleri arterlerden değerlendirmeleri ve belirli hücre tipleri üzerinde çok çeşitli fonksiyonel testler yapmalarına izin vermesi için seçenekler sağlayacaktır.
Introduction
Endotel hücreleri, bariyer fonksiyonları, anjiyogenez ve vasküler ton regülasyonu 1,2 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerdeki önemli rolleri ile iyi tanınmaktadır. Endotel hücre disfonksiyonu ateroskleroz, hipertansiyon, diyabet vb. yönde iyi belgelenmiş olmasına rağmen, endotel disfonksiyonunu tetikleyen altta yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır ve muhtemelen farklı vasküler yataklar arasında farklılık göstermektedir 2,3,4. Endotel hücre disfonksiyonunun bu patolojik mekanizmalarını çözme çabası, dokulardan saf bir endotel hücresi popülasyonuna sınırlı erişim ve / veya kültürdeki endotel hücrelerinin fenotipik değişiklikleri 5,6 ile karşı karşıya kalmaktadır. Bu nedenle, endotel hücrelerini çeşitli vasküler yataklardan doğal formlarında izole edebilmek ve analiz yapabilmek, kardiyovasküler hastalık süreçleri hakkında fikir verecektir.
Bu protokol, subkutan ve mezenterik yağ dokularını farelerden diseke etme prosedürünü ve ardından ilgili arteriyel vaskülatürlerinin izolasyonunu sunar. Arteriyel duvarları kaplayan fonksiyonel olarak canlı endotel hücreleri, spesifik bir enzim kokteyli kullanılarak serbest bırakılır. Analiz için biyomoleküler belirteçleri sağlam tutarken, <1 mg başlangıç dokusundan yeterli endotel hücresi verimi elde etmek için sindirim protokolünün koşullarını optimize etmek için özel dikkat gösterilmiştir. İzole endotel hücreleri daha sonra akış sitometrisi kullanılarak tanımlanır. CD31 (PECAM) varlığı öncelikle endotel hücrelerini tanımlamak için kullanılır. CD45'i de eksprese eden hematopoetik kökenli birkaç kişi de dahil olmak üzere diğer hücre tiplerinde CD31'in ekspresyonu nedeniyle, izole endotel hücrelerinin saflığı, hem CD31 hem de CD45 5,6,7,8'i eksprese eden hücrelerin dışlanmasıyla daha da artmıştır. Ayrıca, araştırma sorusuna ve kullanılacak aşağı akış uygulamalarına bağlı olarak, araştırmacılar, ilgilenilen hücre popülasyonunun saflığını optimize etmek için pozitif ve negatif seçim belirteçlerinden oluşan kapsamlı bir panel seçmeyi düşünmelidir.
Yağ deposu arterlerinin diseksiyonu ve izole edilmesi tekniği önceki yayınlarda 9,10,11,12,13 kullanılmış olmasına rağmen, gömülü arterlerin izolasyonunu tanımlayan ayrıntılı bir protokol henüz sunulmamıştır. Belirli bir ilgi türünden farklı vasküler yataklardan arterlerin izolasyonu ve sindirimi için tekniğin gösterilmesi, araştırmacıların ilgilenilen arterlerden taze izole edilmiş vasküler hücreleri değerlendirmeleri ve belirli hücre tipleri üzerinde çok çeşitli fonksiyonel testler yapmalarına izin vermesi için seçenekler sunacaktır. Testler, hücre sıralama ve membran protein ekspresyonu5,8 için akış sitometrisi, iyon kanalı aktivitesi için elektrofizyoloji9, moleküler profilleme (proteomik / genomik analizler, vb.) içerebilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. 14,15 ve in vitro ilaç taraması için birincil hücre hatlarının oluşturulması 16,17.
Protocol
Bu çalışmalarda hayvanların kullanımı Delaware Üniversitesi, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#1372) tarafından onaylanmıştır.
1. Doku diseksiyonu ve temizliği
NOT: Video protokolünde 10 ila 12 haftalık C57BL/6J fareler kullanılır. Doku diseksiyonu ve temizlik arterlerinin şematik ve istenen sonucu için lütfen Şekil 1'e bakın ve sarf malzemelerinin listesi ve üretici bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın.
- Fareyi CO2 boğulması ve ardından servikal çıkık ile ötenazileştirin.
- Diseksiyon pimlerini kullanarak fareyi sabitleyin ve ventral yüzeye% 70 etanol püskürtün.
- Her bir arka bacak tarafından yerleştirilen deri altı yağ dokularının izolasyonu
NOT: Diseksiyon aletleri gereklidir: düz Bonn makası (9 cm) ve künt, kavisli Graefe forsepsleri.- Cildi cinsel organların hemen üstüne kaldırmak için forseps kullanın ve ciltte küçük (2 mm) bir kesi yapın.
- Makasın ucunu insizyon bölgesine yerleştirin ve ilk kesiden başlayarak sternumun tabanına kraniyal olarak diseke ederek 4-5 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Karın boşluğuna nüfuz etmemek için dikkatli olun.
- Ön ayağın hemen altındaki orta çizgiden lateral olarak uzanan 1 cm'lik bir lateral kesi yapın.
- Arka bacak ve cinsel organlar arasında diyagonal 1 cm'lik bir kesi yapın.
- İlişkili bağ dokusunu soymak ve deri altı yağ deposunu açığa çıkarmak için orta hat cilt kesileri boyunca küçük kesikler yapın. Cildi aşağı doğru sabitleyin.
- Karın boşluğuna dik çalışan "C şeklindeki" deri altı yağ dokusunu ve arter / veni tanımlayın.
- C şeklinin altından cinsel organların yakınından başlayın ve bağ dokularını açığa çıkarmak için yağ dokusunu yavaşça kavrayın. Yağı deriden ayırmak için bağ dokusunda küçük kesikler yapın. Maruz kalan vaskülatürü rahatsız etmekten kaçının.
- Subkutan yağ dokusu sağlam bir şekilde çıkarılana kadar bağ dokusunu diseksiyona devam edin. Maruz kalan arteri çevreleyen bağ dokusundan dikkatlice ayırın.
- İzole edilmiş deri altı yağını, ilgilenilen vasküler yatağı izole etmeye hazır olana kadar buz üzerinde HEPES tamponunda saklayın.
- 1.3.3.-1.3.5 arasındaki adımları yineleyin. kalan posterior subkutan yağ deposu için.
- Mezenterik yağ deposunun izolasyonu
NOT: Diseksiyon aletleri gereklidir: düz Bonn makası (9 cm), Graefe forseps, bir çift #5 forseps, düz iris makası ve kavisli Bonn makası (9 cm).- İdrar kesesinin üzerindeki ince periton boşluğu duvarını kaldırmak için Graefe forsepslerini kullanın ve düz makas kullanarak küçük bir kesi yapın.
- Delinmiş periton boşluğu duvarını yavaşça kaldırın, düz iris makasını dikkatlice kesi bölgesine yerleştirin ve idrar kesesinden sternuma 4-5 cm'lik bir kesi yapın.
- Düz iris makası ile 1 cm uzunluğunda iki yatay kesi yapın, orta hattan arka bacağın hemen üstüne ve ön ayağın altına yanal olarak uzanın. Karın kas sistemini soymak ve periton visserasını açığa çıkarmak için Graefe forsepslerini kullanın.
- 1.4.3 adımını yineleyin. karşı tarafta.
- Mezenterik adipozu ortaya çıkarmak için bağırsakları viseral boşluktan çıkarmak için #5 forseps çiftini kullanın.
- Kavisli makası ve #5 forsepsleri kullanarak yağ yağını kolon boyunca ayırın, caecumdan başlayarak kolonun görüşten indiği yere kadar.
- Caecum'a geri dönün ve ince bağırsak boyunca yağları pankreasa ayırmak için kavisli makas ve # 5 forseps kullanın. Mezenterik adipozu tamamen izole etmek için pankreasın küçük bir kısmını çıkarın.
NOT: Mezenterik yağ ile birlikte pankreasın küçük bir kısmının çıkarılması, temizlik sırasında stabilite sağladığı için arterlerin temizlenmesinde yardımcı olabilir. - İzole mezenterik yağ, mezenterik arterleri izole etmeye hazır olana kadar buz üzerindeki HEPES tamponunda saklayın.
- İlgili arterlerin subkutan ve mezenterik yağ dokularından izolasyonu
NOT: Gerekli diseksiyon araçları: ışık kaynağı olan bir diseksiyon çanağı ve stereoskop, bir çift #55 forseps ve bir çift #5 forseps.- Diseksiyon kabına ~ 10 mL soğuk HEPES tamponu yerleştirin ve # 5 forseps kullanarak yağ dokusunu yemeğe aktarın.
- Arter / ven çiftlerini açığa çıkarmak için yağ dokusunu görüntülemek ve konumlandırmak için stereoskopu 1x büyütmede kullanın (Şekil 2).
- Parankimal yağın arterden dikkatlice çıkarılması için #55 forsepsleri kullanın. Bir seferde küçük yağ parçalarını çıkarın ve ilgilenilen vaskülatürü tanımlamak ve zarar görmekten kaçınmak için stereoskop altındaki arter / ven çiftlerini dikkatlice gözlemleyin.
NOT: Arterleri temizlemek için büyütmeyi ve ışık kaynağını buna göre ayarlayın. Yağ uzaklaştırıldıkça arterleri daha iyi görmek için büyütmeyi ve ışık yoğunluğunu artırın. Arterlerin ince temizliği 4x-5x büyütme altında yapılmalıdır. Bağ dokuları (kollajenler), damarlar ve arterler arasında ayrım yapmak önemlidir. Bağ dokuları ve kollajen lifleri dalsız ip benzeri bir görünüme sahiptir, çizgilidir ve beyazımsı bir renge sahiptir. Kollajen liflerinin ve bağ dokularının aksine, arterler ve damarlar şeffaftır ve tanımlanmış bir lümenle birden fazla dala sahiptir. Küçük arterler ve damarlar, parankimal dokudan arındırıldığında görünüşte benzer görünebilir. Lümendeki kanın varlığı, arterleri damarlardan tanımlamaya yardımcı olabilir. Damarlar daha ince kan damarı duvarlarına ve daha büyük bir lümene sahiptir ve karşılaştırılabilir büyüklükteki arterlere kıyasla daha fazla kan içerir. - 1.5.3 adımını yineleyin. arterler parankimal yağ dokusundan tamamen boşalana kadar.
- Temizlenen arterleri taze HEPES tamponlu yeni bir tüpe aktarmak için #5 forseps kullanın ve sindirime hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
2. Endotel hücrelerinin izolasyonu için izole arterlerin sindirimi
NOT: Doku sindirimi ve endotel hücrelerinin izolasyonu şeması için lütfen Şekil 2'ye ve protokol için gerekli malzemelerin tam listesi için Malzeme Tablosuna bakınız.
- Her 2 mL mikrosantrifüj tüpüne her biri 1 mg dispaz ve elastaz ekleyin. Her tüpe 2 mL ayrışma çözeltisi ekleyin. Vorteks yapın ve tamamen çözünene kadar 37 ° C'de inkübe edin. Temizlenen arterleri (adım 1.5.5.) ilgili numune tüplerine aktarmak için #5 forseps kullanın. Her enzimin nihai konsantrasyonu 0.5 mg / mL'dir.
- Her 10-15 dakikada bir inversiyon ile nazik ajitasyonla 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin, böylece arterler enzimler ve arterler arasında tutarlı ve homojen teması korumak için çözelti içinde askıya alınır.
- Örnek başına 1 mg kollajenaz tip I tartın ve yeni tüplere ekleyin.
- Arterlerin tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Tamponun 500 μL'sini arterleri rahatsız etmeden üstten çıkarın ve kollajenaz içeren belirlenmiş tüplere aktarın. Vorteks yapın ve çözeltiyi orijinal numune tüplerindeki ilgili numunelere geri gönderin. Kollajenaz tip I'in son konsantrasyonu 0.5 mg / mL'dir.
- 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Numune tüpünün kısa bir süre sallanmasını takiben arterlerin parçalara ayrıldığından emin olun. Arterler pertürbasyondan sonra parçalara ayrılmazsa, arteriyel bozulma görünene kadar 5 dakikalık artışlarla inkübe edin.
- Bir cam pipet kullanarak, hücreleri mekanik olarak ayırmak için sindirilmiş dokuyu 10x-15x'e kuvvetlice tritüre edin.
- Tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için çözeltiyi ve sindirilmiş dokuyu 70 μm hücre süzgecinden veya bir akış sitometri tüp süzgecinden geçirin.
3. Akım sitometrisinden önce endotel hücrelerinin boyanması
NOT: Endotel hücrelerinin boyanması ve işlenmesi, talimat verilmedikçe, hücre canlılığını artırmak için buz üzerinde gerçekleştirilir. 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı borular, oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 1.163 x g'de santrifüj edilir.
- Tek hücreli süspansiyonları RT'de 3 dakika boyunca 1.163 x g'de santrifüj yapın.
- Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini RT'de 30 dakika boyunca 1 mL PBS +% 5 BSA'da yeniden askıya alın.
NOT: Araştırmacılar, hücre tipine, ilgilenilen hedefe ve kullanılan antikora bağlı olarak FC reseptörlerini bloke etmeyi düşünmelidir18,19. - 1 μL hücre canlılığı boyası (405 nm uyarım) (Malzeme Tablosu) ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin.
- RT'de 3 dakika boyunca hücre süspansiyonunu 1.163 x g'de santrifüj edin. hücre peletini 200 μL PBS +% 1 BSA'da yeniden askıya alın.
- Numunelere, CD31 (CD31-PE, 0.75 μg / sample) ve CD45'e (CD45-FITC, 2.5 μg / sample) konjuge edilmiş birincil antikorları ekleyin ve numuneleri alüminyum folyo ile kapladıktan sonra buzdolabında 15 dakika boyunca bir rocker üzerinde inkübe edin.
NOT : Endotel hücrelerinin saf bir popülasyonunu tanımlamak ve/veya elde etmek için, farklı uyarma/emisyon floresansına sahip CD31- ve CD45-konjuge primer antikorlar ve CD31+CD45− ekspresyon profiline sahip kapı/sıralama hücreleri kullanılarak hem CD31 hem de CD45 için problayın. Kullanılan floroforlara bağlı olarak tazminat gerekebilir 18,20,21. - Doğrudan hücre süspansiyonuna 1 mL PBS +% 1 BSA ekleyerek hücreleri yıkayın.
- RT'de 3 dakika boyunca hücre süspansiyonunu 1.163 x g'de santrifüj yapın. süpernatantı çıkarın ve% 0.1 BSA ile% 1 formaldehitin 200 μL'sinde yeniden askıya alın. Akış sitometrisine hazır olana kadar alüminyum folyo ile kaplı buzdolabında saklayın.
NOT: Yıkama ve santrifüjleme adımları azaltılarak hücre verimi artırılır. Bunların sonuç yaklaşımına bağlı olarak değiştirilmesi gerekebilir. Fiksatif numune 24 saat içinde analiz edilmelidir.
Representative Results
İş akışının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Şema, protokol metninde daha ayrıntılı olarak açıklanan protokol adımlarını vurgular. Şekil 2'de diseksiyon sonrası subkutan yağ (Şekil 2A, sol) ve parankimal dokunun temizlenmesini takiben deri altı arter pasajeri (Şekil 2A, sağda) resimleri görülmektedir. Şekil 2'de ayrıca diseksiyon sonrası mezenterik yağ (Şekil 2B, sol) ve parankimal dokunun temizlenmesini takiben mezenterik arteriyel paskalite (Şekil 2B, sağ) gösterilmektedir.
Burada sunulan protokol, a) temel bilim yaklaşımlarında ve / veya hastalık modellerinde farklı yağ deposu vaskülatür yataklarının karşılaştırılması, b) aşağı akış uygulaması için ilgilenilen vasküler hücrelerin izolasyonundan önce vasküler yatakların sindirimi ve c) ilgilenilen vasküler hücreleri tanımlamak için akış sitometrisinin kullanılması ile potansiyel olarak ilgilenen araştırmacılara yardımcı olmak için tasarlanmıştır (Şekil 3 ) burada gerçekleştirilen protein ekspresyon analizleri dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli uygulamalar için (Şekil 4). Şekil 3, akış sitometrisi kullanarak sindirilmiş fare arterlerinden endotel hücrelerini tanımlama yaklaşımımızın bir örneğini detaylandırmaktadır. Sindirilmiş subkutan (Şekil 3A) veya mezenterik (Şekil 3B) adipoz arterlerden elde edilen hücre preparatları, başka bir yerde benzer şekilde uygulandığı gibi, akış sitometrisi kullanılarak canlı CD31 + CD45− endotel hücrelerinin fiksasyonu ve tanımlanmasından önce CD31-PE, CD45-FITC ve bir hücre canlılığı boyası ile boyanmıştır8. Hücre canlılığı boyası, sadece fiksasyondan önce izolasyon ve sindirim protokolünden kurtulan canlı hücrelerin tanımlanmasına izin verdi. Bu yöntemin kullanılması, araştırmacıların ilgilendikleri canlı vasküler hücrelerin ekspresyonunu veya işlevini değerlendirmelerine izin verecektir.
Farklı yağ deposu vaskülatüründen izole edilen endotel hücrelerinin membran protein ekspresyonunda farklılıklar gösterip göstermediğini belirlemek için, izole hücreler yağ asidi translokazı, CD36 (Şekil 4) için araştırıldı (Şekil 4), çünkü bu membran proteininin yakın zamanda yağ asitlerinin dokulara endotel aracılı dağılımında gerekli olduğu gösterilmiştir22 . Bu nedenle, örneğin farklı vasküler yataklarda membran CD36 arasındaki nispi ekspresyon farklılıklarının belirlenmesi, a) farklı dokular arasında yağ asidi kullanımının farklı tercihi ile ilgili mevcut verileri destekleyebilir ve / veya b) sağlık ve hastalıkta yağ asitlerinin doku dağılımında potansiyel yeni farklılıklar ortaya çıkarabilir. Şekil 3'te örneklenen sindirilmiş vasküler hücrelerin aynı preparatlarından, deri altı (Şekil 4A) ve mezenterik (Şekil 4B) adipozda CD31+CD45−CD36+ endotel hücreleri tanımlanmış ve CD36 ekspresyonu her vasküler yatakta bu popülasyonda ölçülmüştür. Şekil 4C ve Şekil 4D, CD36 eksprese eden endotel hücrelerinin yüzdesinin ve CD36 ekspresyonunun yoğunluğunun, mezenterik endotel hücrelerinde gözlenenlere kıyasla deri altı endotel hücrelerinde daha fazla olduğunu ortaya koymaktadır. Bu ön bulgular, vasküler yataklar arasındaki belirgin farklılıkları belirlemek için metodolojimizin kullanımını desteklemektedir.
Şekil 1: Endotel hücrelerini subkutan ve viseral yağ dokularından aşağı akış uygulamaları için izole etmek için çalışma şeması . (A)10-12 haftalık C57BL/6J fareler ötenazi yapıldı ve bu prosedürü göstermek için kullanıldı. (Bi) İlk olarak, deri altı yağ çıkarılır. (Bii) Daha sonra, mezenterik (visseral) yağ dokusu daha sonra çıkarılır. Beyaz kesikli çizgiler, diseksiyon ve çıkarmayı takiben deri altı (sol) ve mezenterik (sağ) yağ depolarının yerlerini gösterir. İlgili arterler aşağı akış uygulamaları için izole edilir. (C) Bu protokolde, izole arterler, fonksiyonel olarak canlı endotel hücrelerinin serbest bırakılmasında ilk adım olarak spesifik bir enzim kokteyli kullanılarak sindirilir. (D) İzole endotel hücreleri, akış sitometri analizinden önce konjuge antikorlar kullanılarak CD31 + ve CD45 hücreleri için problama ile tanımlanır. CD31+/CD45− ekspresyon profiline sahip hücreler, ek analizler için ilgi çekici endotel hücreleridir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzole subkutan ve viseral yağ dokuları ve ilgili arterler. (A) Sol: Arka bacaklardan izole "C şeklinde" subkutan yağ dokusu. Subkutan adipoz arterin ok (1) ile gösterilen ana dalı, parankimal adipoz çıkarıldığında ortaya çıkar. Sağ: İzole subkutan adipoz arterler. (B) Sol: Mezenterik (visseral) yağ dokusu bağırsaktan izole edilir. Sağ: İlgili arteriyel palardo parankimal doku çıkarılarak izole edilir. Yağ (5 mm) ve arter (1 mm) resimleri arasında farklı ölçekler kullanılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Arteriyel doku sindirimini takiben endotel hücrelerinin akım sitometrisi ile tanımlanması. İzole (A) subkutan veya (B) mezenterik adipoz arterlerden serbest bırakılan hücreleri gösteren temsili grafikler. Hücreler, fiksasyondan önce CD31 (PE) ve CD45 (FITC) hücre dışı epitoplarını hedef alan konjuge antikorlara maruz bırakıldı. CD31+CD45− endotel hücre popülasyonunu tanımlamak için akım sitometrisi kullanıldı. Bir hücre canlılığı boyası, sonraki analizler için sadece izolasyon ve sindirim protokollerinden kurtulan hücreleri seçmek için kullanıldı. Ek olarak, bu aşamada uygun geçitleme, amaçlanan bir hücre popülasyonunu, ilgilenilen hücre tipinin büyüklüğünün bilinmesi durumunda, kirletici hücrelerden daha da ayıracaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Subkutan ve mezenterik adipoz arter endotel hücrelerinde CD36 membran ekspresyonunun akım sitometrisi ile analizi. (A) subkutan veya (B) mezenterik adipoz arterlerde endotel CD36 (APC) membran ekspresyonunu gösteren temsili popülasyon grafikleri ve histogramlar. (C) Subkutan ve mezenterik EC'lerde CD36 eksprese eden endotel hücrelerinin (ECs) yüzdesi (n = 5, 3 erkek, 2 kadın; * p < Öğrencinin t-testini takiben 0.05). (D) Subkutan ve mezenterik yağ arterlerinde normalize edilmiş EC membran CD36 ekspresyonu (n = 5, 3 erkek, 2 kadın; * p < Student'ın t-testini takiben 0.05). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Endotel disfonksiyonu, muhtemelen ateroskleroz, hipertansiyon ve inme gelişimini tetikleyen ciddi hastalık durumlarının öncüsüdür 3,23. Belirli bir patolojik durumda endotel disfonksiyonunun altında yatan tanımlanmış mekanizmalar çok sayıda olmakla birlikte, farklı vasküler yatakların patolojik durumlardan farklı şekilde etkilenmesi muhtemeldir 4,24. Ayrıca, farklı kardiyovasküler risk faktörleri (örneğin, obezite, hipertansiyon, dislipidemi, sigara, diyabet) çeşitli farklı mekanizmalarla disfonksiyona neden olur23,25. Bu nedenle, endotel hücre popülasyonlarını yerleşik hayvan hastalık modellerinden veya erişilebilir insan dokusundan izole etmek ve in vivo ortamdan derhal çıkarılan hücreler üzerinde tahliller yapmak çok önemlidir. Hücreleri bu şekilde izole etmek, kültürdeki hücreleri incelemeye göre benzersiz bir avantaja sahiptir, çünkü kültür kaynaklı fenotipik değişikliklerden yoksundurlar 5,6. Dahası, in vivo 26,27'de gözlendiği gibi heterojen bir endotel hücre popülasyonu da dahil olmak üzere (ve akış destekli hücre sıralama kullanılarak daha da ayrılabilir), canlı bir organizmadan in vivo ortamı daha iyi bilgilendirir. Son olarak, bu yöntem çok sayıda hayvan modelinin ve potansiyel olarak insan dokusunun araştırılması için geçerlidir ve böyle bir ihtiyaç garanti edilirse, birincil hücre kültürü hatları oluşturmak için kullanılabilir.
Bu protokoldeki kritik adım ve burada sunulmayan farklı vasküler yataklar veya hücre tipleri için en çok ayarlanması gereken adım, vasküler dokunun sindirimidir. Bu adım, hücre verimini azaltmadan hücre sağlığı için optimize edilmelidir. Kullanılan spesifik enzimler ve sindirim süresi, hücre sağlığını optimize etmek ve aşağı akış tahlillerini yeterince gerçekleştirebilmek için verim sağlamak için kritik öneme sahiptir. Subkutan ve mezenterik endotel hücrelerinde akış sitometrisi ile saptanan CD36'nın membran ekspresyonunun tanımlanması için (Şekil 4), başlangıçta yama-kelepçeli elektrofizyoloji28 için tasarlanmış sindirim protokolünün modifiye edilmiş bir versiyonu geliştirilmiştir. Bu, akış sitometrisinin taleplerini daha iyi karşılamak için hücre verimini artırmak için kollajenaz I sindirim süresinin 30 dakikaya uzatılmasını ve yama-kelepçe çalışmaları için gerekenleri içeriyordu. Bu modifikasyon hücre sağlığını bir dereceye kadar etkileyebileceğinden, bu protokolü takiben sadece canlı endotel hücrelerinin değerlendirilmesini sağlamak için akış sitometri analizlerinde bir hücre canlılığı boyası kullanılmıştır (Şekil 3). Hücreleri vasküler dokudan izole etmeyi amaçlayan çalışmaların, istenen yaklaşımı değerlendirmeden önce hücre canlılığı için bir belirteç içermesi önerilir.
Tanımlanan protokol, farelerden türetilen ≤1 mg arteriyel örneklerden analiz ve aşağı akış uygulamaları için canlı endotel hücrelerini serbest bırakmak için yeterlidir; Bununla birlikte, ilgilenilen arterler, önemli ölçüde farklı arteriyel kitlelerle sonuçlanacak farklı dokulardan veya organizmalardan (örneğin, insanlar) izole edilecekse, ilgilenilen hücre popülasyonunu verimli bir şekilde izole etmek için sindirim enzimi içeriğini ve kuluçka süresini optimize etmek gerekir. Burada sunulan deri altı ve mezenterik yataklardan (örneğin, koroner arterler) daha az miktarda başlangıç dokusu ile başlayan bazı vasküler yataklar için, örnek başına birkaç fareden arterlerin havuzlanması gerekli olabilir. Aslında, sonuç yaklaşımının nispeten yüksek bir hücre verimi gerektirdiği göz önüne alındığında, bu herhangi bir vasküler yatak için gerekli bir adım olabilir. Önemli bir sınırlama, numune sindirimi başına varyasyonların doğası gereği, hücre verimlerinin bazen aynı vasküler yataktan bile partiler arasında önemli ölçüde farklı olabilmesidir. Bu, verileri analiz ederken sorunlara neden olabilir ve uygun olduğunda normalleştirme yoluyla hesaba katılmalıdır. Örneğin, CD36 ekspresyonu, deri altı ve mezenterik adipoz arterlerin bireysel örneklerinde hücre verimindeki değişiklikler nedeniyle ham verilerde son derece değişkendi. Bu nedenle, ham veriler, bu yöntemin parti farkları için düzelteceği varsayımıyla CD31 + CD45− ortalama floresan yoğunluğuna normalleştirildi (Şekil 4). Tabii ki, yaklaşıma bağlı olarak, daha sofistike istatistiksel analizler ve normalleştirme yöntemleri gerekebilir.
Özetle, bu yazıda endotel hedeflerinin ekspresyonu ve/veya fonksiyonunu araştırmak için farelerden subkutan ve mezenterik arterleri disseke etmek, izole etmek ve sindirmek için bir yöntem sunulmaktadır. Sunulan protokolde yapılan değişikliklerle, farklı vasküler yataklar ve hücre tipleri (örneğin, düz kas hücreleri) araştırılabilir. Bu protokol, mevcut deneysel yaklaşımların bolluğunun temeli olarak, vasküler hücre biyolojisinin ve vasküler disfonksiyon mekanizmalarının anlaşılmasını ilerletme potansiyeline sahiptir.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Parlak bir bilim adamı, meslektaşı ve sevgili arkadaşı olan Rich West'in sevgi dolu anısına. Delaware Biyoteknoloji Enstitüsü'nün bir parçası olarak Delaware Üniversitesi Akış Sitometrisi ve BiyoGörüntüleme Çekirdeği'ne çalışmalarımıza devam eden katkıları için teşekkür ederiz. Ayrıca Emma Hudgins'e makalenin dikkatli bir şekilde gözden geçirilmesi ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalarımız Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü P20GM113125-6564 (I.S. Fancher) tarafından desteklenmektedir. Bu proje aynı zamanda Delaware INBRE programı tarafından, Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti'nden (I.S. Fancher) NIGMS'den (P20GM103446) bir hibe ve Delaware Üniversitesi Genel Üniversitesi Araştırma hibesi (I.S. Fancher) ile desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue dissection tools | |||
| 5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
| 55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
| Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
| Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
| Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
| Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
| Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
| Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
| Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
| Solutions Recipes | |||
| HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
| Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
| Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
| Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
| Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
| Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
| Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
| Flow Cytometry Analyses | |||
| 5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
| CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
| CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
| Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |
References
- Krüger-Genge, A., Blocki, A., Franke, R. P., Jung, F. Vascular endothelial cell biology: An update. International Journal of Molecular Sciences. 20 (18), 4411 (2019).
- Choi, S., Kim, J. A., Kim, K. C., Suh, S. H. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 19 (1), 35-42 (2015).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: Testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
- Nunan, E., et al. Obesity as a premature aging phenotype - Implications for sarcopenic obesity. Geroscience. , (2022).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17 (8), 1599-1604 (1997).
- Amici, S. A., Dong, J., Guerau-de-Arellano, M. Molecular mechanisms modulating the phenotype of macrophages and microglia. Frontiers in Immunology. 8, 1520 (2017).
- Patel, J., et al. Functional definition of progenitors versus mature endothelial cells reveals key SoxF-dependent differentiation process. Circulation. 135 (8), 786-805 (2017).
- Ahn, S. J., et al. Inwardly rectifying K+ channels are major contributors to flow-induced vasodilatation in resistance arteries. The Journal of Physiology. 595 (7), 2339-2364 (2017).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and dissection of diverse mouse adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Ahn, S. J., et al. Cholesterol-induced suppression of endothelial Kir channels is a driver of impairment of arteriolar flow-induced vasodilation in humans. Hypertension. 79 (1), 126-138 (2022).
- Ahn, S. J., et al. Differential effects of obesity on visceral versus subcutaneous adipose arteries: Role of shear-activated Kir2.1 and alterations to the glycocalyx. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (2), 156-166 (2022).
- Fancher, I. S., et al. Impairment of flow-sensitive inwardly rectifying K(+) channels via disruption of glycocalyx mediates obesity-induced endothelial dysfunction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (9), 240-255 (2020).
- van Beijnum, J. R., et al. Gene expression of tumor angiogenesis dissected: Specific targeting of colon cancer angiogenic vasculature. Blood. 108 (7), 2339-2348 (2006).
- Hida, K., et al. Tumor-associated endothelial cells with cytogenetic abnormalities. Cancer Research. 64 (22), 8249-8255 (2004).
- Ades, E. W., et al. HMEC-1: Establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line. Journal of Investigative Dermatology. 99 (6), 683-690 (1992).
- Grange, C., et al. Isolation and characterization of human breast tumor-derived endothelial cells. Oncology Reports. 15 (2), 381-386 (2006).
- Liao, X., Makris, M., Luo, X. M. Fluorescence-activated cell sorting for purification of plasmacytoid dendritic cells from the mouse bone marrow. Journal of Visualized Experiments. (117), e54641 (2016).
- De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating and immunostaining lymphocytes and dendritic cells from murine Peyer's patches. Journal of Visualized Experiments. (73), e50167 (2013).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. Analysis of cell suspensions isolated from solid tissues by spectral flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546 (2010).
- Son, N. -H., et al. Endothelial cell CD36 optimizes tissue fatty acid uptake. The Journal of Clinical Investigation. 128 (10), 4329-4342 (2018).
- Bakker, W., Eringa, E. C., Sipkema, P., van Hinsbergh, V. W. M. Endothelial dysfunction and diabetes: roles of hyperglycemia, impaired insulin signaling and obesity. Cell and Tissue Research. 335 (1), 165-189 (2008).
- Farb, M. G., Gokce, N. Visceral adiposopathy: A vascular perspective. Hormone Molecular Biology and Clinical Investigation. 21 (2), 125-136 (2015).
- Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. International Journal of Obesity. 26 (6), 754-764 (2002).
- Cleuren, A. C. A., et al. The in vivo endothelial cell translatome is highly heterogeneous across vascular beds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (47), 23618-23624 (2019).
- Aird, W. C.
- Sonkusare, S. K., Dalsgaard, T., Bonev, A. D., Nelson, M. T. Inward rectifier potassium (Kir2.1) channels as end-stage boosters of endothelium-dependent vasodilators. The Journal of Physiology. 594 (12), 3271-3285 (2016).
