Summary
このプロトコルは、極性が逆の小腸炎を利用し、頂端表面へのアクセスを可能にする頂端外壊死性腸炎(NEC)-in-a-dishモデルを記述する。NEC関連上皮破壊を検出するための免疫蛍光染色プロトコールと、NECインディッシュプロトコルに供するアピカルアウトエンテロイドの生存率を決定する方法を提供します。
Abstract
壊死性腸炎(NEC)は、腸の炎症および壊死を特徴とする早産児に影響を及ぼす壊滅的な疾患である。エンテロイドは最近、胃腸病理をモデル化する有望なシステムとして浮上している。しかし、腸内障操作のために現在利用されている方法は、上皮の頂端表面へのアクセスを欠いているか(3次元[3D])、または時間がかかり、リソースを大量に消費する(2次元[2D]単分子層)。これらの方法は、モデルが生理学的に翻訳可能になるために、マイクロインジェクションなどの追加のステップを必要とすることが多い。ここでは、腸突起極性を反転させることによってNECを in vitroで 研究するための生理学的関連性のある安価なプロトコルを記載し、頂端表面が外側を向く(apical-out)。正常酸素または低酸素条件下での腫瘍壊死因子アルファ(TNF−α)またはリポ多糖(LPS)への曝露後のエンテロイドバリア完全性および接合タンパク質発現を調べるための免疫蛍光染色プロトコルも提供される。正常酸素性または低酸素性のLPSまたはTNF-αに24時間曝露された3D頂端アウト腸ロイドの生存率も評価される。LPSまたはTNF-αのいずれかに曝露されたエンテロイドは、低酸素症と組み合わせて、上皮構造の破壊、接着接合タンパク質発現の喪失、および細胞生存率の低下を示した。このプロトコルは、NEC療法の潜在的な上皮標的を特定し、治療薬に対する早産腸応答を研究するための生理学的関連性と費用対効果の高いプラットフォームを提示する新しい頂端アウトNECインディッシュモデルを記述しています。
Introduction
壊死性腸炎(NEC)は、早産児の最大10%に発生する小腸の重篤な炎症性疾患であり、一般的に高い罹患率および死亡率と関連している1,2。外科的介入を必要とする超低出生体重(<1500g)乳児の死亡率が50%に近づくことは珍しくありません3。NECの正確な病因は現在解明されていませんが、フォーミュラフィーディングなどの危険因子は、この疾患の発症において、ジスバイオシス、未熟な腸上皮、機能不全の腸障壁などの生理学的異常と化合物化すると考えられています2,4。多大な努力にもかかわらず、NECの予防や治療は過去10年間にほとんど進展していません5。NECおよび関連する腸上皮バリア機能障害を研究するための新規なin vitro法は、動物モデルからの所見がこれまでのところベッドサイドにうまく翻訳されていないため、疾患の病因の理解を進めるために必要である6。
NEC中に作用するメカニズムを調査するために、多くのin vitroモデルが利用されている。ヒト腸管上皮細胞株であるCaco-2は、NEC 7,8の最も一般的に利用されているインビトロモデルの1つです。Caco-2細胞は、小腸のブラシボーダー形態学的特徴をエミュレートするが、細胞株として、高度に翻訳可能なモデルに必要な粘液産生杯細胞を含む多種多様なin vivo細胞型に分化しない。HT−29−MTXは、ヒト結腸腺癌細胞、混合腸細胞および杯細胞表現型を含むが、腸上皮の陰窩ベースの細胞型を依然として欠いている9。IEC-6およびIEC-18は、未熟な回腸陰窩様形態を有する非形質転換細胞株であるが、ヒト組織に由来するものではなく、それらの翻訳能力を制限する。FHs74-IntおよびH4腸細胞株は、ヒト胎児組織に由来し、タイトジャンクションまたは分極単層10,11を形成しないため、NECの影響を受けやすい最も未熟児と比較して未熟である。典型的には、NECインビトロモデルは、NEC12における腸の炎症を開始する主要な受容体であるtoll様受容体4(TLR4)を誘導するために、リポ多糖(LPS)治療を利用する。活性酸素種(ROS)処理を介して媒介される損傷は、典型的には過酸化水素を介して、NEC様酸化的損傷およびアポトーシスを誘導するためにしばしば使用される13、14。腸内炎症の主な駆動因子として、炎症性TLR4シグナル伝達の下流成分である腫瘍壊死因子−α(TNF−α)もまた、インビボ病因を模倣するためにこれらのインビトロモデルにおいて一般的に利用されている15。
誘導性多能性幹細胞(iPSC)から生成されたオルガノイドは、それらが由来する組織の複雑なin vivoアーキテクチャおよび細胞型組成を再現する能力のために、腸のin vitroモデルとして人気が高まっている16,17。関連するin vitro系であるエンテロイドは、切除された腸陰窩に由来するオルガノイドであり、iPSC由来オルガノイドよりも容易に確立および維持される。エンエロイドは、典型的には、基底側細胞表面への実験的アクセスが制限された三次元(3D)細胞外マトリックス(ECM)中で増殖される。マイクロインジェクション18,19などの方法は、頂端表面に対するこの障壁を克服するために開発されてきたが、内腔内のスラウド細胞破片および粘液の蓄積は、マイクロインジェクションを技術的に困難かつ一貫性のないものにする。カスタムロボットマイクロインジェクションプラットフォームは広くアクセスできないため、技術能力と一般的な技術におけるラボ間のばらつきは、マイクロインジェクションプロトコルで克服すべき重要な変数になります。解離した3D腸突起に由来する2次元(2D)単層は、依然として腸上皮のすべての主要な細胞型を含み、頂端表面へのアクセスを可能にするが、間葉系筋線維芽細胞21のフィーダー層なしで維持することは伝統的に困難であった。細胞培養透過性支持体は、根底にある筋線維芽細胞を使用せずにエンテロイド単層の頂端側および基底側の両方にアクセスするために使用することができるが、これらの挿入物は、共焦点顕微鏡法などのモダリティで使用する前に膜の切除および取り付けを必要とし、従来の顕微鏡法22を使用する場合、より技術的に要求の厳しい困難なプロセスをもたらす。NECは、従来の3Dエンテロイド23,24,25および透過性サポート26,27を使用してインビトロでモデル化されており、腸の炎症は最近、腸内オンチップモデル28,29で再現されている。マイクロフルイディクスを組み込んだガット・オン・ア・チップ・モデルは、群を抜いて最も先進的で翻訳可能なモデルですが、この技術は高価で複雑で、ほとんどの研究者にとってアクセスできません30。
頂端アウト腸突起技術の最近の進歩は、in vitro上皮の構造的完全性への損傷を危険にさらすことなく、3D腸ロイドの頂端表面への容易なアクセスを可能にした31,32,33。頂端外腸ロイドは、in vivo腸上皮の細胞型組成およびバリア機能を共有するが、典型的な3D腸状腸炎とは異なり、これらの細胞の頂端表面は培養培地に面しており、栄養素の吸収、微生物感染、および管腔分泌に関するより生理学的に関連性のある研究を可能にする31。頂端アウトエンテロイドのさらなる利点は、実験薬剤をエンテロイドに均質に分配する能力である。マイクロインジェクションの場合のように、エンテロイドサイズに基づいて治療量を変えることは必要なく、浮遊培養においてこれらのエンテロイドを維持する能力は、実験薬剤拡散32に対するECM干渉を否定する。
壊死性腸炎は、複数の腸上皮細胞型および様々な環境的および病態生理学的因子を含む多因子疾患である34。腸管腸薬の多様な細胞組成は、NECなどの複雑な疾患をモデル化する上での単一培養に対する明らかな改善である。興味深いことに、単一の炎症性曝露がin vitro単培養において損傷を誘発するのに十分であることが多いが、エンテロイドは、マウスモデル23と同様に、NEC様損傷を誘発するために少なくとも2つの炎症性成分を必要とするようである6。ここでは、NEC様炎症に対する上皮応答を研究し、潜在的に治療標的を特定するための改良された生理学的関連性の高いin vitroモデルとして、頂端アウト腸ロイドを低酸素症(NEC6の重要な臨床的特徴)およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて使用する頂端アウトNECインディッシュモデルを提示する。我々は、小腸3Dエンテロイドの極性を逆転させるためのプロトコル、ならびに上皮バリア破壊および接合タンパク質発現変化を同定するための免疫蛍光染色プロトコルについて記載する。最後に、我々はさらに、我々のデュアルヒット、アディッシュ内のNECインディッシュモデルの影響を決定するために、単純な腸突起生存率アッセイを実証した。
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Protocol
この研究におけるすべての動物処置は、オクラホマ大学健康科学センター施設動物ケアおよび使用委員会によって承認された。早産非ヒト霊長類(NHP、妊娠90%、オリーブヒヒ、 パピオアヌビス)からの小腸便宜サンプルは、別の研究(プロトコル#101523-16-039-I)のために安楽死後に得られた。
1. 頂端外腸科NECインディッシュモデルの構築
- 培地およびエンエロイド治療の調製
注:標準的な無菌技術に従って調製されると、メディアは4°Cで最大1週間保存することができます。- 抗生物質非含有培地(AFM)は、50 mLのヒトオルガノイド増殖培地と50 mLのオルガノイドサプリメントを混合することによって調製する( 材料表を参照)。9,900 μL の PBS に 0.5 M EDTA を 100 μL 加えて、5 mM エチレンジアミン四酢酸/1x リン酸緩衝生理食塩水 (EDTA/PBS) を調製します。
- ダルベッコの改変イーグルの培地/栄養素ハムの混合物F12 + 15 mM HEPESバッファー(DMEM/F12)を2-8°Cでチルします。
- 100μgのTNF-α粉末を1mLの1x PBSに懸濁してTNF-α原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として用いて、TNF-αストックを20ng/mLおよび50ng/mL濃度に希釈する。1mLの1x PBSに2mgのLPSを懸濁してLPS原液を調製する。さらに、AFMを溶媒として使用して、LPSのストックを100μg/mLおよび200μg/mLに希釈する。
- 3Dエンテロイドの極性を反転させる
注: 以下の手順は、単一の 24 ウェル平底組織培養プレートを 2 つの 24 ウェル超低付着組織培養プレートに反転させることを目的としています。組織培養プレートは、使用前に少なくとも30分間37°Cに加温する必要があります。側底アウト3Dエンテロイドの誘導は、多くのグループ35,36によって以前に説明したように、培地(上記で詳述)に対してわずかな修正を加えて達成された。一般的な腸突起誘導手順は、ヒトのそれと変わらない。簡単に言えば、摘出した組織は洗浄され、小さな断片に切断され、そして細胞破壊緩衝液中でインキュベートされる。次に、細胞溶液を70μMのセルストレーナーに通し、陰窩を高密度でメッキします。- 確立された3D側底外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。
- 500 μL の 5 mM 氷冷 EDTA/PBS を 24 ウェルプレートの各ウェルに加え、p200 ピペットで最低 5x-6x のピペッティングを行い、基底膜抽出液/ECM ドームを穏やかに機械的に破壊します。
- 4つのウェルの内容物を15mLの円錐形チューブに移し、8mLの氷冷EDTA/PBSを円錐形チューブに加える。残りの20ウェルを同様に移す。
- 15 mLの円錐形チューブを4°Cで330 rpmの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。1時間のインキュベーションの後、円錐管を300 x g で4°Cで3分間遠心分離する。 各チューブから上清を取り出して廃棄します。
- 細胞ペレットを5 mLのDMEM/F12で結合して洗浄し、細胞懸濁液を2本の15 mL円錐管に分配します。
- 4°Cで3分間300 x g で遠心分離することにより細胞をペレット化する。 上清を除去し、各チューブに12mLのAFMを加え、細胞ペレットが再懸濁されていることを確認する。
- 500 μLのエンテロイド懸濁液を2つの24ウェル超低付着プレートの各ウェルにピペットで入れる。
- プレートを37°Cおよび5%CO2で2 〜5日間、またはエンエロイドの極性が逆になるまでインキュベートする。
- 腸溶性反転を確認するには、まず確認免疫蛍光染色と反転までの平均時間(〜3日)を確立し、次に基本的な光学顕微鏡可視化を用いて極性反転を確認する。頂端アウトエンテロイドは外観が非常に細胞的であるが、側底外側エンテロイドはしばしば大きな中央内腔の存在または出芽によって支配される( 補足図1を参照)。
注:手順が標準化されると、頂端アウトへの変換率は通常95%を超えます。頂端アウトエンテロイドの使用は終末実験として意図されているが、理論的にはアピカルアウトエンテロイドを少数の側底外側アウトエンテロイドに通過させることは可能である。
- アピカルアウトNECインディッシュ
注:エンテロイドの極性が逆になったら、頂端アウトコンフォメーションの寿命が3〜4日を超えて確認されていないため、その後の実験で培養物を素早く使用してください。以下のNECインディッシュモデルでは、エンテロイドを24時間処理し、その後すぐに回収し、下流の実験のために保存した。- エンテロイドが少なくとも95%の効率で視覚的に極性が逆転したら、プレートをインキュベーターから取り出し、24ウェルプレートの8ウェルを15mL円錐管に集めます。頂端アウトエンテロイドは懸濁液中であるため、エンテロイド/培地溶液をピペットでピペットするだけです。15 mLチューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- 細胞がペレット化されたら、上清を除去し、細胞ペレットを1x PBS(対照)の所望の容量(ここでは最大処理量と一致するように10μL)と混合した4mLのAFMに再懸濁する(ここでは10μLを加えた)。
- 500 μL のエンテロイド/PBS/AFM 懸濁液を 24 ウェル超低付着プレートの 8 ウェルにピペットで入れ、プレートを 37 °Cおよび 5%CO2 で 24 時間インキュベートします。
- 手順 1.3.1.-1.3.3 を繰り返します。正常酸素でのTNF-α(20 ng/mLおよび50 ng/mL)およびLPS(100 μg/mLおよび200 μg/mL)処理用。すべての低酸素治療について、ステップ1.3.1.-1.3.3を繰り返しますが、プレートを37°C、5%CO2、および1%O2の別のインキュベーターに24時間置きます。
メモ: ステップ 1.3.4.ステップ1.3.1.-1.3.3と同時に行うことができますが、わかりやすくするために、上記の手順は複雑さを軽減するために処理によって分離されています。
2. 免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡
- 染色液の調製
- 1 μL の Triton X-100 を 1x PBS 中で 7 mL の最終容量に混合して、0.1% Triton X-100 を調製します。PBST(PBS-Tween)を30 μLのTween-20を1x PBSに30 mLの最終容量に加えることによって調製する。
- 6.3 mL の PBST に 700 μL の NDS を加えて、10% 正常ロバ血清 (NDS)/PBST を調製します。PBSTに70 μLのNDSを最終容量7 mL となるように添加して、1% NDS/PBST を調製します。
注:ロバ血清は、二次抗体宿主と相関させるためにここで使用された。しかしながら、ブロッキング血清種は、非特異的結合を適切にブロックするために二次抗体種と一致するべきである。
- 染色(1日目)
- 24ウェルプレートの4ウェルの内容物を1.5mL微量遠心チューブに移す。すべての所望のウェル/治療について、各処理を別々のチューブに入れて繰り返します。チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 腸ロイドがペレット化されたら、上清を除去する。
- 細胞ペレットを300 μLの4%ホルムアルデヒド固定液に室温(RT)で30分間再懸濁します。30分後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去し、ペレットを500μLの滅菌RT 1x PBSで洗浄した。
- チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 上清を除去し、0.1% Triton X-100 を 500 μL 加え、RT で 1 時間放置します。
- 1時間後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去する。500 μL の 1x PBS で洗浄し、チューブを回転子またはシェーカーに 200 rpm で 2 ~ 8 °C で 15 分間置きます。 これを合計4倍繰り返します。
- チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。500 μL の 10% NDS/PBST を加え、RT で 45 分間インキュベートします。インキュベーション中、24ウェルプレートの8ウェルに、組換え抗ビリン抗体20 μL、E-カドヘリン抗体10 μL、および1% NDS/PBST1970 μLを組み合わせて一次抗体溶液を調製します。
- 45分間のインキュベーションの後、チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離する。 チューブを氷の上に置きます。上清を除去し、250 μLの一次抗体溶液と交換する。チューブを2〜8°Cで一晩インキュベートする。
- 染色(2日目)
- チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離し、上清を除去します。ペレットのサイズに応じて、PBSTを各チューブに250〜500μL加え、2〜8°Cで1時間200rpmで回転子またはシェーカーの上に置く。 PBST洗浄を4回繰り返します。
- 50%グリセロールに52 μLのCy3ロバ抗ウサギIgG(H + L)を、5.2 μLのロバ抗マウス蛍光緑色488二次抗体を5142.8 μLの1% NDS/PBSTに添加して、二次抗体溶液を調製する。
- 最後のPBST洗浄および遠心分離に続いて、上清をチューブから取り除いた。各チューブに200 μLの二次抗体溶液を分注し、暗所で2〜8°Cで一晩インキュベートする。
- 染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(1日目)
- 青色核色素を含むグリセロールベースのマウント剤を1時間かけてRTに持ち込みます。
- チューブを300 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 100 μLの上清を除去し、残りの〜100 μLの上清に細胞を再懸濁する。細胞懸濁液を0.5 mLチューブに移す。
- チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの遠赤色核酸染色剤に再懸濁した。チューブをRTで10分間インキュベートする。
- チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去し、細胞ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁する。2回目の洗浄を繰り返します。
- チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離して細胞をペレット化し、上清70μLを除去する。PBSの残りの容量に細胞を再懸濁し、内容物をラベル付きカバースリップ(24 mm x 60 mm)に移します。
- 75 μLのマウント剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を除去します。カバースリップが暗闇の中でRTで一晩(18-24時間)硬化するのを待ちます。
- 染色された頂端アウトエンテロイドの取り付け(2日目)
- 一晩硬化させた後、グリセロールの薄い層(〜15μL)をカバースリップに塗布する。カバースリップをスライドガラスに取り付け、所定の位置に静かに押し込みます。カバースリップとスライドの間にある泡をタップして取り除きます。
- カバースリップを暗闇の中でRTに最低2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でイメージングします。様々な共焦点取得法を用いたエンテロイドの顕微鏡的可視化については、Lallemantら37を参照されたい。
- 免疫蛍光定量
注:この方法は、ImageJソフトウェア(https://imagej.nih.gov/ij/)を使用してバックグラウンドシグナルを除去することによって、補正された総蛍光を決定します。- ImageJで共焦点画像を開き、関心領域(ROI)ツールを使用して目的の領域を概説します。
- ユーザー定義のパラメータを設定するには、[ 分析]>[測定値の設定]に移動します。[設定]タブで[ 面積>積分密度]>[平均グレー値 ]を選択します。
- [ 分析とメジャー] に移動>ます。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。これらの測定値をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
- 背景信号を減算するには、画像の小さな非蛍光領域を選択します。その地域の [分析>メジャー] に移動します。測定値を含むポップアップウィンドウが表示されます。出力をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。
- 選択した細胞の面積にバックグラウンド読み取り値の平均蛍光を乗算し、積分密度から合計を減算して、補正された総細胞蛍光(CTCF)を計算する。スプレッドシートまたは統計ソフトウェアパッケージに記録を保持しながら、関心のあるすべての画像について上記の手順を繰り返します( 材料表を参照)。
3. アディッシュ内のNEC細胞生存率
- 腸科治療
- ステップ1のように、24時間にわたって頂端出力NECインディッシュモデルを確立します。
- 細胞生存率測定試薬を4°Cで一晩解凍する。 アッセイ当日、使用の30分前に試薬をRTに持参してください。試薬を反転させて混合します。
- アッセイを実行する前に、各ウェルから100 μLの培地を除去し、残りの400 μLを残します。
- 内容物をプレートシェーカー上でRTで200rpmで5分間激しくよく混合し、細胞溶解を誘導した。振盪後、プレートをRTでさらに25分間インキュベートする。
- 25分間のインキュベーション後、ピペッティングを介して1ウェルの内容物を混合し、800μLの200μLを96ウェルの不透明なポリスチレン製透明底プレートのシングルウェルに移します。残りの600 μLについて繰り返し、ウェルあたり4回のテクニカルレプリケートを作成します。このようにして24ウェルプレートの各ウェルの残りの内容物を96ウェルプレートに移す。
- 発光可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、治療間の相対値を比較します。あるいは、処理発光をアデノシン三リン酸(ATP)標準と比較する。
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Representative Results
腸の炎症をモデル化するための腸溶の使用は、壊死性腸炎の文脈の中でも、現在一般的である。しかしながら、現在利用されているほとんどの方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを欠いているか、経口治療薬としての最終的な使用を意図した化合物の生理学的関連性を否定するか、またはエンテロイド由来単分子層と同様に技術的に困難で時間がかかる。NECの現在のin vitroエンテロイドモデルの有用性を高めるために、我々はエンテロイドの極性を逆転させ、24時間低酸素症およびLPSまたはTNF-αと組み合わせて、頂端アウトNECインディッシュモデルを生成した。免疫蛍光染色により、内腔に向かう核(青色)の頂端局在と、上皮の外縁における絨毛32(赤色、頂端マーカー)の検出が確認された(図1A)。200μg/mL LPS、50ng/mL TNF-α、または低酸素症のみへの曝露は、総細胞形態、E-カドヘリン38(緑色)、または対照と比較してビリン局在または蛍光強度の明白な変化を誘導しなかった(図1A-D; 図2)。低酸素症と組み合わせてLPSまたはTNF-αによる治療は、上皮構造を破壊し、E-カドヘリンおよびビリン染色の喪失によって示されるアドヒレン接合部およびブラシ境界タンパク質発現の有意な喪失を引き起こした(図1E-F;図2)。腸細胞ブラシ境界および接着接合タンパク質発現におけるこれらの減少は、上皮バリア完全性の低下を示す可能性が高く、疾患のヒト外科的NECおよびインビトロモデリングの両方に共通の特徴である23。
3Dアピカルアウト腸溶化の生存率に対するNECインディッシュ成分の影響を決定するために、細胞溶解後のATP定量を中心とした3D培養用に設計された細胞生存率アッセイを用いて細胞生存率を評価した。腸溶質をLPS(200μg/mL)またはTNF-α(50ng/mL)で正常酸素または低酸素条件下で24時間処理した。LPSまたはTNF−α単独では、対照と比較して細胞生存率に有意に影響しなかった(図3A)。しかし、頂端外エンテロイドを低酸素単独と比較して低酸素(****p α 0.0001)と組み合わせて200 μg/mL LPSまたは50 ng/mL TNF-<で処理した場合、生存率の有意な低下が生じた(図3B)。これらの実験は、費用対効果が高く、簡単なNECイン・ア・ディッシュ・モデルにおいて、頂端アウトエンテロイドを利用することの汎用性と生理学的関連性を実証している。
図1:リポ多糖(LPS)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、および低酸素症の頂端アウト表現型および形態学的効果の確認。 (A)コントロール、(B)低酸素症、(C)LPS(200 μg/mL)、(D)TNF-α(50 ng/mL)、(E)LPS(200 μg/mL)+低酸素症、(F)TNF-α(50 ng/mL)+低酸素症。スケールバー = 各画像に対して50μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:24時間以下のリポ多糖(LPS)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、および低酸素治療後のブラシ境界および接着接合タンパク質に対する染色強度の定量化。a = p < 0.0001 対照と比較した;b = p <対照と比較して0.05;c = p < 0.0001 低酸素症と比較して;d = p < 0.05 低酸素症と比較して;e = p < 0.001 TNF-αと比較して;f = p < 0.01 LPS + 低酸素症と比較して;g = p < 0.0001 対比 LPS;(B)治療間で比較されたE-カドヘリン(緑色)レベル;a = p <対照と比較して0.0001;b = p <低酸素症と比較して0.0001;c = p < 0.01 対比 LPS;d=p
図3:頂端外細胞生存率に対するリポ多糖(LPS)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、および低酸素の影響。 LPS(200 μg/mL)またはTNF-α(50 ng/mL)で処理した3Dアピカルアウト腸ロイドの生存率を、(A)正常酸素または(B)低酸素条件下で24時間、発光を介して測定した。統計的有意性は、一元配置分散分析(ANOVA)とポストホック分析のTukey検定を使用して計算されました。低酸素症と組み合わせてLPS(200μg/mL)およびTNF-α(50ng/mL)で処理したエンテロイドは、低酸素単独と比較して有意に生存率が低く、ここでは発光の増加が見られた。正常酸素条件下でのLPS(200μg/mL)またはTNF-α(50ng/mL)は、対照と異ならなかった。データは、平均±平均の標準誤差(SEM)、 n = 8/グループ、****p <0.0001として提示されます。コントロールは、PBSを車両コントロールとして使用して正常酸素を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:3次元エンテロイドの形態。 (A)側底外側の腸内膜は、出芽の有無にかかわらず、大きくて開いた中央内腔の外観によって支配されるが、(B)頂端外側の腸内膜は、緻密で細胞的な外観によって特徴付けられる。スケールバー = 各画像に対して100μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
腸上皮陰窩に由来する腸様モデルの最近の開発は、壊死性腸炎の病因を研究するためのより生理学的に関連する in vitro 組織を可能にする。腸上皮のすべての主要な分化細胞型を含むにもかかわらず、3Dエンテロイドは依然としていくつかの重要な制限を受ける。従来の、側底外側エンテロイドは、3D ECMヒドロゲルドームに懸濁されており、その組成および密度は、組織培養環境39内での正常な拡散を制限し得る。重要なことに、これらのエンエロイドは、細胞の頂端表面への限られたアクセスを提供し、これは、 インビボで、LPSの腸細胞TLR4結合などの管腔細菌および抗原と相互作用する表面である。
NECの病態生理は不明のままであるが、早産腸上皮における頂端TLR4の発現増加および活性化が顕著な役割を果たすと考えられている40。TLR4活性化の下流では、腸透過性の増加、上皮修復の低下、および細菌転座が機能不全の腸障壁をもたらし、腸の壊死につながる2。未熟児の遠位腸におけるこの炎症周期は、腸管腔に由来し、腸細胞の頂端表面で開始すると考えられている。したがって、腸上皮の細菌転座を含む機構的研究において頭蓋外側3Dエンテロイドを利用するモデルは、現在理解されているような インビボ 病因を再現せず、最適ではない情報をもたらす可能性が高い。
ここでは、腸内細胞の頂端表面への容易なアクセスを可能にし、おそらく、従来の3D側底外側外腸ロイドと比較して、より生理学的に関連性の高いモデルをもたらす、頂端アウトNECインディッシュモデルの確立について説明する。これらのエンエロイドにおける極性の逆転は、潜在的な経口投与された治療薬を単に培地に添加し、 インビボで起こるように腸細胞によって自然に取り込まれることを可能にする。このアプローチは、マイクロインジェクションなどの高価で技術的に困難な技術を必要とせず、2D単層またはガットオンチップモデルの確立よりもリソースにやさしいです。
我々の代表的な結果は、LPSまたはTNF−αに施された頂端アウト腸ロイドを、低酸素症と組み合わせて、生存率の低下、上皮構造の破壊、および接着接合部タンパク質発現の減少に苦しむ対照と比較して、または低酸素または炎症メディエーター治療単独と比較して、in vivo NECの既知の特徴を模倣することを示す。接着接合部の破壊は、腸上皮バリア機能に重要な41、NEC42、43において報告されている。NEC44でも重要なタイトジャンクションアーキテクチャの混乱も発生した可能性が高いが、これらの変更は今後の研究で評価される予定である。生理学的に翻訳可能な組織において、このデュアルヒットモデルは、NECに固有の因子に対する早産腸応答の研究を可能にし、潜在的に新規な治療標的を同定できるプラットフォームを提供する。将来の研究は、NECを超えて頂端アウトエンテロイドの適用を、寄生性、細菌性、またはウイルス性感染症31,32、宿主-マイクロバイオーム相互作用45、および胃腸吸収機能46に焦点を当てた研究に拡張することができるが、早産児の生理学的文脈内である。
NEC-in-a-dishの頂端出力のためのこのプロトコルには、強調を保証するいくつかの重要なステップが含まれています。細胞培養培地の組成および鮮度は、実験における過度の縦方向の変動を回避し、実験治療前にエンテロイドが健康であることを保証する上で重要である。同様に、TNF-αおよびLPSのストック溶液は、過度の凍結/融解サイクルを回避し、最適な活性を維持するために、-80°Cで小分けして保存する必要があります。最後に、EDTA/PBSインキュベーション中にすべてのECMが可溶化されるように注意する必要があります。ECMの不完全な除去は、エンエロイドが極性を逆転させることができないという結果をもたらす可能性がある。必要に応じて、インキュベーション期間を1.5時間に延長して、マトリックスを完全に除去することができます。
このアピカルアウトNECインディッシュモデルは費用対効果が高く簡単ですが、この方法にはいくつかの制限があります。Apical-out NEC-in-a-dishは、ガット・オン・ア・チップ・モデル28,29ほど生理学的に関連性はありませんが、チップ・オプションにアクセスできない中間オプションを表します。さらに、浮遊培養として、培地交換のためにエンテロイドを回収、ペレット化、および再懸濁し、そうでなければ単純なプロセスに遠心分離ステップを追加する必要があります。もう1つの制限は、一般にエンドポイント分析にのみ適していると考えられているため、頂端アウトエンテロイドの寿命です。側底側成長因子受容体が培地成長因子と絶えず接触しなくなるにつれて、頂端アウト腸ロイドは、側底外側エンテロイドと比較して増殖の減少を特徴とし、その結果、頂端外培養物を通過させるのが相対的に不可能である31,32。さらに、細胞型の正確な組成が、相対的割合を含めて、in vivo組織と比較してエンテロイドで表されるかどうかは不明であるが、研究は一般に、わずかな違いを示唆している31,32。最後に、この頂端アウトNECインディッシュモデルの24時間の開発は、便利ではあるが、in vivo式ベースのNECモデル47と比較して比較的短い可能性があり、より長い期間の介入が必要な場合、追加の標準化を必要とする可能性がある。
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Disclosures
著者は開示するものは何もなく、利益相反もありません。
Acknowledgments
このコンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。HCは、国立衛生研究所からの助成金P20GM134973によってサポートされています。KBは、小児病院財団(CHF)と長老派健康財団(PHF)の助成金によって支援されています。OUHSCの分子生物学・サイトメトリー研究研究所には、共焦点イメージングを提供するコア施設の使用に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Fisher Scientific | 15575-020 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| Cover Glass 24 mm x 60 mm | Thermo Scientific | 102460 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-21202 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate | Sigma-Aldrich | AP182C | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| E-cadherin antibody (7H12) | Novus Biologicals | NBP2-19051 | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Millipore Sigma | 1004960700 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| ImageJ | Fiji | N/A | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | |
| Leica SP8 Confocal Microscope | Leica Biosystems | ||
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | 566460 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue | Fisher Scientific | P36983 | |
| Recombinant Anti-Villin antibody [SP145] | Abcam | ab130751 | |
| Recombinant Human TNF-α protein 100 µg | Bio-Techne | 210-TA-100/CF | |
| SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader | Molecular Devices | ||
| Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L | Fisher Scientific | 3140 | |
| TO-PRO-3 Iodide (642/661) | Thermo Scientific | T3605 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | Thermo Scientific | AB0350 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 |
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