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Immunology and Infection

कोविड-19 से जुड़े मध्य कान पैथोलॉजी के आकलन के लिए हाई-स्पीड ह्यूमन टेम्पोरल बोन सेक्शनिंग

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64012
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

यह लेख तेजी से मानव अस्थायी हड्डी सेक्शनिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है जो तेजी से डिकैल्सीफिकेशन और लौकिक हड्डी इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के विश्लेषण के लिए पतले स्लाइस उत्पन्न करने के लिए जुड़वां हीरे के ब्लेड के साथ एक माइक्रोसॉ का उपयोग करता है।

Abstract

मानव लौकिक हड्डी वर्गों का हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण आंतरिक और मध्य कान विकृति का अध्ययन करने के लिए एक मौलिक तकनीक है। अस्थायी हड्डी वर्गों को पोस्टमॉर्टम अस्थायी हड्डी फसल, निर्धारण, डिकैल्सीफिकेशन, एम्बेडिंग और धुंधला द्वारा तैयार किया जाता है। अस्थायी हड्डी के घनत्व के कारण, डिकैल्सीफिकेशन एक समय लेने वाली और संसाधन-गहन प्रक्रिया है; पूर्ण ऊतक तैयारी में औसतन 9-10 महीने लग सकते हैं। यह ओटोपैथोलॉजी अनुसंधान को धीमा कर देता है और समय-संवेदनशील अध्ययनों में बाधा डालता है, जैसे कि कोविड-19 महामारी के लिए प्रासंगिक। यह पत्र ऊतक प्रसंस्करण को गति देने के लिए अस्थायी हड्डी वर्गों की तेजी से तैयारी और विघटन के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है।

टेम्पोरल हड्डियों को मानक तकनीकों का उपयोग करके पोस्टमॉर्टम काटा गया और 10% फॉर्मलिन में तय किया गया। जुड़वां हीरे के ब्लेड के साथ एक सटीक माइक्रोसॉ का उपयोग प्रत्येक खंड को तीन मोटे वर्गों में काटने के लिए किया गया था। मोटी अस्थायी हड्डी वर्गों को पैराफिन में एम्बेडेड होने से पहले 7-10 दिनों के लिए डिकैल्सीफाइंग समाधान में डिकैल्सीफाइड किया गया था, क्रायोटोम का उपयोग करके पतले (10 μm) वर्गों में विभाजित किया गया था, और अनचार्ज स्लाइड पर घुड़सवार किया गया था। ऊतक के नमूनों को तब एंटीबॉडी धुंधला (एसीई 2, टीएमपीआरएसएस 2, फ्यूरिन) के लिए डिपैराफिनाइज्ड और पुनर्जलीकृत किया गया था और इमेज किया गया था। इस तकनीक ने फसल से ऊतक विश्लेषण तक के समय को 9-10 महीने से घटाकर 10-14 दिन कर दिया। हाई-स्पीड टेम्पोरल बोन सेक्शनिंग ओटोपैथोलॉजी अनुसंधान की गति को बढ़ा सकती है और ऊतक तैयार करने के लिए आवश्यक संसाधनों को कम कर सकती है, जबकि कोविड-19 से संबंधित समय-संवेदनशील अध्ययनों की सुविधा भी प्रदान कर सकती है।

Introduction

मानव अस्थायी हड्डी अनुसंधान आंतरिक और मध्य कान के विकृति विज्ञान और पैथोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य संसाधन प्रदान करता है। 19 वीं शताब्दी से पहले, ओटोलॉजिकल बीमारी 1,2,3 के बारे में बहुत कम जानकारी थी। ओटोलॉजिक बीमारी को बेहतर ढंग से समझने और "नीम हकीमों के हाथों से कर्ण सर्जरी को बचाने के लिए," जोसेफ टॉयनबी (1815-1866) ने मानव लौकिक हड्डी के हिस्टोलॉजिकल वर्गों का अध्ययन करने के तरीके विकसितकिए 3. इस काम को आगे बढ़ाया गया था एडम पोलिट्जर (1835-1920) में वियना और 19 वीं शताब्दी के शेष के दौरान यूरोप भर में अन्य, जिन्होंने कान 2,3,4 को प्रभावित करने वाली कई सामान्य स्थितियों के हिस्टोपैथोलॉजी का वर्णन करने के लिए अस्थायी हड्डी वर्गों का उपयोग किया।

संयुक्त राज्य अमेरिका में पहली मानव लौकिक हड्डी प्रयोगशाला 1927 में जॉन्स हॉपकिन्स अस्पताल में खोली गई थी, जहां स्टेसी गिल्ड (1890-1966) ने अस्थायी हड्डी सेक्शनिंग 5,6 के लिए तरीके विकसितकिए थे। गिल्ड द्वारा विकसित विधियों में 9-10 महीने की प्रक्रिया शामिल थी जिसमें पोस्टमॉर्टम फसल, निर्धारण, नाइट्रिक एसिड में डिकैल्सीफिकेशन, इथेनॉल में निर्जलीकरण, सेलोइडिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, धुंधला और बढ़ते शामिल थे। इस तकनीक में संशोधन बाद में हेरोल्ड शुकनेक्ट (1917-1996)7 द्वारा किए गए थे; हालाँकि, इस प्रक्रिया के मूल घटक अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित रहते हैं।

एक अस्थायी हड्डी प्रयोगशाला को बनाए रखने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण संसाधनों ने अस्थायी हड्डी अनुसंधान के लिए एक चुनौती प्रस्तुत की है और संभवतः पिछले 30 वर्षों में इसकी घटती लोकप्रियता में योगदान दियाहै 4,8। अस्थायी हड्डी प्रयोगशाला संसाधनों का एक महत्वपूर्ण हिस्सा अस्थायी हड्डी की तैयारी की 9-10 महीने की प्रक्रिया के लिए समर्पित होना चाहिए। तैयारी में सबसे अधिक समय लेने वाले चरणों में से एक अस्थायी हड्डी का विघटन है, जो मानव शरीर में सबसे घनी हड्डी है। डिकैल्सीफिकेशन आमतौर पर नाइट्रिक एसिड या एथिलीनडियामाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए) में किया जाता है और समाधान 7,9 के लगातार बदलने की आवश्यकता के दौरान हफ्तों से महीनों तक लगते हैं। इसके अलावा, मानव कान के समय-संवेदनशील अध्ययन, जैसे कि कोविड-19 महामारी से संबंधित, इस धीमी तैयारी प्रक्रिया से बाधित हो सकते हैं। यह पेपर उच्च गति वाले अस्थायी हड्डी सेक्शनिंग के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है जो मोटे वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक हीरे के माइक्रोसॉ का उपयोग करता है जो अस्थायी हड्डी की कटाई के 10-14 दिनों के भीतर तेजी से विघटन और ऊतक विश्लेषण की अनुमति देता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल आईआरबी (आईआरबी00250002) अनुमोदन के साथ और मानव ऊतक और संक्रामक सामग्री के उपयोग के लिए संस्थागत नीतियों के अनुसार विकसित किया गया था। प्रत्येक अस्थायी अस्थि दाता ने मृत्यु से पहले लिखित सहमति प्रदान की, या दाता के परिवार से मरणोपरांत सहमति प्राप्त की गई। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों , उपकरणों और सॉफ़्टवेयर के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. अस्थायी हड्डी फसल

  1. स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) बोर्ड अनुमोदन प्राप्त करें, मानव और संक्रामक सामग्री के उपयोग के लिए संस्थागत नीतियों की समीक्षा करें, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने से पहले ऊतक दान के लिए सहमति प्राप्त करें।
  2. कोविड-19 पॉजिटिव टेम्पोरल बोन डोनर्स के ऊतकों के साथ काम करने से पहले उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) लगाएं। सुनिश्चित करें कि पीपीई में एक एन -95 श्वासयंत्र और फेस शील्ड (या वैकल्पिक रूप से एक सकारात्मक दबाव वायु शोधन प्रणाली), गाउन और दस्ताने के दो जोड़े शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल को शुरू करने से पहले ठीक से दान करने और पीपीई को डोफिंग करने के लिएतकनीकों की समीक्षा करें 10.
  3. दाता मृत्यु के 12-24 घंटे के भीतर अस्थायी हड्डी के ऊतकों को हार्वेस्ट करें। यदि शरीर प्रशीतित नहीं है, तो सुनिश्चित करें कि फसल मृत्यु के 8 घंटे के भीतर होती है।
    1. ऑस्टियोटोम7 द्वारा चार चीरा, ब्लॉक विधि का उपयोग करके शव परीक्षा के दौरान अस्थायी हड्डियों की कटाई करें।
      1. क्रानियोटॉमी के बाद, मस्तिष्क को हटा दें और कपाल तंत्रिकाओं को आंतरिक श्रवण नहर में तेजी से विभाजित करें।
      2. अस्थायी हड्डी के स्क्वैमस भाग के समानांतर और सिर्फ औसत दर्जे का ऑस्टियोटोम के साथ पहला बोनी चीरा बनाएं।
      3. लौकिक हड्डी की औसत दर्जे की सीमा पर पहले के समानांतर दूसरा बोनी चीरा करें।
      4. फिर, तीसरा चीरा 3-4 सेमी पूर्वकाल और पेट्रस रिज के समानांतर बनाएं।
      5. चौथा चीरा मोटे तौर पर तीसरे के समानांतर बनाएं, पेट्रोस रिज के 2 सेमी पीछे।
        नोट: सुनिश्चित करें कि सभी चीरों खोपड़ी के आधार के माध्यम से विस्तार.
      6. फिर, नमूने के अवर किनारे के साथ नरम ऊतक लगाव को मुक्त करने के लिए तेज विच्छेदन का उपयोग करके अस्थायी हड्डी को हटा दें। यदि अस्थायी हड्डी की फसल के बाद एम्बामिंग किया जाना है, तो कैरोटिड धमनी के स्टंप को बांध दें।

2. ऊतक निर्धारण, डिकैल्सीफिकेशन और सेक्शनिंग

  1. तुरंत ऊतक को 10% बफर किए गए फॉर्मलिन (फॉर्मलाडेहाइड) के 200-300 एमएल में रखें ताकि ऊतक पूरी तरह से जलमग्न हो जाए। कमरे के तापमान पर कम से कम 72 घंटे के लिए फॉर्मलाडेहाइड में ऊतक छोड़ दें, दैनिक समाधान बदलते हैं। ऊतक को एक एयर-टाइट कंटेनर में स्टोर करें और वायरस के प्रसार को रोकने के लिए उपयुक्त पीपीई पहनते समय धुएं के हुड के नीचे समाधान परिवर्तन करें।
    नोट: 72 घंटे निर्धारण अवधि के बाद, नमूनों को अब संक्रामक माना जाने की आवश्यकता नहीं है।
  2. अधिक तेजी से ऊतक विघटन की अनुमति देने के लिए प्रत्येक नमूने को तीन "मोटी" वर्गों में काटने के लिए जुड़वां हीरे के ब्लेड के साथ एक सटीक माइक्रोसॉ का उपयोग करें। जुड़वां हीरे के ब्लेड को 5 मिमी की दूरी पर सेट करें, ताकि अस्थायी हड्डी का केंद्रीय खंड 5 मिमी मोटा हो। सुनिश्चित करें कि किसी भी छोर पर ऊतक के वर्ग 3-5 मिमी मोटे हैं।
  3. कमरे के तापमान पर 7-10 दिनों के लिए फॉर्मिक एसिड डिकैल्सीफाइंग समाधान के 200-300 एमएल में मोटे वर्गों को रखें, जब तक कि ऊतक पैराफिन एम्बेडिंग के लिए पर्याप्त नरम न हो। समाधान प्रतिदिन बदलें। नमूने को पैल्पट करके पर्याप्त ऊतक विघटन की जांच करें, जिसे नरम महसूस करना चाहिए।
    नोट: डिकैल्सीफिकेशन को एक्स-रे द्वारा भी सत्यापित किया जा सकता है।
  4. एक चलने वाले नल के नीचे एक बड़े बीकर में रखकर 24 घंटे के लिए बहते नल के पानी में नमूनों को कुल्ला।
  5. बढ़ती एकाग्रता की अल्कोहल की एक श्रृंखला में ऊतक को निर्जलित करें7. 1.5 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के 100-200 एमएल में ऊतक को डुबोएं, इसके बाद क्रमशः 1.5 घंटे के लिए 95% और 100% इथेनॉल में तीन वॉश करें। अगला, जाइलीन में ऊतक 3 x 1.5 घंटे धो लें।
  6. प्रत्येक 45 मिनट के चार उपचार के साथ पैराफिन में मोटी वर्गों को एम्बेड करें।
  7. पतले (10 μm) वर्गों को काटने के लिए एक क्रायोटोम का उपयोग करें। ऊतक को स्थिति दें ताकि ऊतक अक्षीय विमान में कट जाए। यदि वांछित हो तो मोटा (20 μm) वर्गों को काटें।

3. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इमेजिंग

  1. यदि पारंपरिक हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला वांछित है (यहां वर्णित नहीं है), तो ग्लास स्लाइड7 पर वर्गों को बढ़ाने से पहले धुंधला प्रदर्शन करें।
  2. सकारात्मक चार्ज ग्लास स्लाइड पर वर्गों माउंट.
  3. 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर स्लाइड सेंकना।
  4. स्लाइड्स को एक धारक में रखें और उन्हें एक कार्बनिक विलायक (इस मामले में डायथेनोलामाइन) और इथेनॉल युक्त एक वाणिज्यिक प्रीट्रीटमेंट समाधान में डुबोएं ताकि ऊतक को डिपराफिनाइज, पुनर्जलीकरण और अनमास्क किया जा सके।
    नोट: फॉर्मलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए यह कदम आवश्यक है।
  5. 20 मिनट के लिए उच्च दबाव पर प्रेशर कुकर में स्लाइड गरम करें।
  6. एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड रखें और एक वाणिज्यिक अवरुद्ध समाधान के साथ ऊतक को अवरुद्ध करें।
  7. एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एसीई 2; 1: 50), ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीज सेरीन 2 (टीएमपीआरएसएस 2, 1: 1,000), और फ्यूरिन प्रोटीज (1: 250) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक वर्गों की जांच करें।
    नोट: एसीई 2, टीएमपीआरएसएस 2 और फ्यूरिन एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है क्योंकि माना जाता है कि ये प्रोटीन सार्स-सीओवी-2 संक्रामकता11,12 में भूमिका निभाते हैं, और इस प्रोटोकॉल ने संभावित तंत्र की जांच करने की मांग की जिसके द्वारा सार्स-सीओवी-2 मध्य कान13 को संक्रमित कर सकता है।
  8. एचआरपी-संयुग्मित एंटी-खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (एसीई 2, फ्यूरिन; 1: 100 कमजोर पड़ने) या एंटी-बकरी (टीएमपीआरएसएस 2, 1: 100 कमजोर पड़ने) माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इलाज करें।
  9. पानी में 70% हेमटॉक्सिलिन के साथ स्लाइड का काउंटरस्टेन करें।
  10. एक घुड़सवार डिजिटल कैमरा के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर छवियों का अधिग्रहण करें। क्रमशः 20x और 10x आवर्धन पर मध्य कान म्यूकोसा और यूस्टेशियन ट्यूब की छवियां प्राप्त करें।

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Representative Results

मध्य कान म्यूकोसा और यूस्टेशियन ट्यूब के हेमटॉक्सिलिन और इओसिन धुंधला प्रसंस्करण के बाद मध्य कान म्यूकोसा और सबम्यूकोसल मध्य कान ऊतक के संरक्षण से पता चला (चित्रा 1)। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल छवियों ने मध्य कान म्यूकोसा और यूस्टेशियन ट्यूब (चित्रा 1) के भीतर एसीई 2, टीएमपीआरएसएस 2 और फ्यूरिन प्रोटीन की अभिव्यक्ति दिखाई। मध्य कान के भीतर इन प्रोटीनों की उपस्थिति एक संभावित मार्ग प्रदान करती है जिसके द्वारा सार्स-सीओवी-2 मध्य कान11,12,13 के भीतर श्वसन उपकला को संक्रमित कर सकता है। इसके अलावा, यूस्टेशियन ट्यूब के भीतर इन प्रोटीनों की अभिव्यक्ति एक मार्ग की व्याख्या कर सकती है जिसके द्वारा वायरस मध्य कान में प्रवेश करता है, यूस्टेशियन ट्यूब के माध्यम से नासोफैरिनक्स से मध्य कान की यात्रा करता है।

Figure 1
चित्रा 1: दाग मध्य कान के ऊतकों का उदाहरण। यह आंकड़ा हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन, एसीई 2, टीएमपीआरएसएस 2, और मध्य कान म्यूकोसा (शीर्ष पंक्ति, 20 एक्स आवर्धन) और यूस्टेशियन ट्यूब (निचली पंक्ति, 10 एक्स आवर्धन) के फ्यूरिन धुंधला दिखाता है। स्केल सलाखों = 50 μm (शीर्ष पंक्ति); 100 μm (नीचे पंक्ति)। संक्षिप्त नाम: एच एंड ई = हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन; एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2; टीएमपीआरएसएस 2 = ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीज, सेरीन 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

मानव अस्थायी हड्डी अनुसंधान आंतरिक और मध्य कान विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन एक समय और संसाधन-गहन प्रयास बना हुआ है। यह पत्र एक ऐसी तकनीक का वर्णन करता है जो मोटी अस्थायी हड्डी वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक हीरे के माइक्रोसॉ का उपयोग करता है जिसे आगे के सेक्शनिंग से पहले तेजी से डिकैल्सीफाइड किया जा सकता है ताकि ऊतक फसल से अध्ययन करने का समय 9-10 महीने से 10-14 दिनों तक कम किया जा सके। यह तकनीक अस्थायी हड्डी प्रसंस्करण के लिए आवश्यक संसाधनों को कम कर सकती है और समय-संवेदनशील अध्ययनों की सुविधा प्रदान कर सकती है, जैसे कि कोविड-19 मध्य और आंतरिक कान विकृति13 से संबंधित, जो इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए प्रेरणा थी। इस प्रोटोकॉल ने मध्य कान और यूस्टेशियन ट्यूब के भीतर एसीई 2, टीएमपीआरएस 22 और फ्यूरिन अभिव्यक्ति के दृश्य के लिए अनुमति दी, एक संभावित तंत्र प्रदान करता है जिसके द्वारा सार्स-सीओवी -2 यूस्टेशियन ट्यूब के माध्यम से नासोफैरिंक्स से फैलकर मध्य कान को संक्रमित कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल का प्राथमिक नवाचार एक हीरे देखा है कि डिकैल्सीफिकेशन से पहले ऊतक में कटौती का उपयोग है, जो अस्थायी हड्डी के "मोटी" वर्गों को उत्पन्न करता है जिसे डिकैल्सीफाइंग एजेंट के संपर्क में आने वाले ऊतक के सतह क्षेत्र को बढ़ाकर तेजी से डिकैल्सीफाइड किया जा सकता है। यह कदम ऊतक विघटन के लिए 1-2 महीनों के बजाय 7-10 दिनों के भीतर होने की अनुमति देता है जो पारंपरिक प्रोटोकॉल को डिकैल्सीफिकेशन के लिए आवश्यक हो सकता है। हीरे के आरी के साथ बनाए गए ऊतक के "मोटे" वर्गों को अस्थायी हड्डी के ऊतकों के मानक ब्लॉक की तुलना में अधिक तेज़ी से निर्जलित किया जा सकता है, जिससे डिकैल्सीफिकेशन और एम्बेडिंग के बीच का समय कम हो जाता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल सेलोइडिन के बजाय एम्बेडिंग एजेंट के रूप में पैराफिन का उपयोग करता है, जिसे7 को कठोर करने में लगभग 3 महीने लगते हैं। जबकि सेलोइडिन कोक्लियर संरचनाओं का बेहतर संरक्षण प्रदान करता है, पैराफिन बहुत तेजी से कठोर हो जाता है और इम्यूनोस्टेनिंग की सुविधा प्रदान करता है। इन संशोधनों के साथ, अस्थायी हड्डी के ऊतकों को 10-14 दिनों में संसाधित किया जा सकता है क्योंकि अधिक पारंपरिक प्रसंस्करण रणनीतियों 7,9 में आवश्यक 9-10 महीनों के विपरीत।

इस प्रोटोकॉल की कई सीमाएं हैं। एम्बेड करने से पहले हीरे के साथ ऊतक को काटना कॉर्टी (ओओसी) के अंग को नुकसान पहुंचाने का जोखिम उठाता है। इस तकनीक के विकास के दौरान अधिकांश नमूनों में ओओसी गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो गया था, जो उम्र से संबंधित सुनवाई हानि जैसी विकृतियों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक के मूल्य को सीमित कर सकता है, जहां यह महत्वपूर्ण है कि आंतरिक कान की नाजुक संरचनाओं को संरक्षित किया जाए। नमूने को स्थिति देना संभव हो सकता है ताकि हीरा देखा सीधे ओटिक कैप्सूल हड्डी के माध्यम से कटौती न करे और आंतरिक कान संरचनाओं को संरक्षित करे, लेकिन यह सक्रिय जांच का एक क्षेत्र बना हुआ है। पशु मॉडल इस प्रोटोकॉल को और परिष्कृत करने और इन मूल्यवान मानव नमूनों में आंतरिक कान संरचनाओं को संरक्षित करने की संभावना बढ़ाने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में ऊतक की गुणवत्ता अतिरिक्त रूप से पैराफिन-एम्बेडिंग एजेंट के उपयोग से सीमित है, जिसे समय की कमी के कारण चुना गया था। सेलोइडिन एम्बेडिंग बेहतर ओटोपैथोलॉजिकल नमूनों में सेलुलर अखंडता को बनाए रखता है लेकिन7 को कठोर करने में महीनों लगते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल को अभी भी महत्वपूर्ण समय और संसाधन निवेश की आवश्यकता है। हीरे के माइक्रोसॉ का उपयोग पारंपरिक अस्थायी हड्डी की तैयारी के लिए आवश्यक सामग्रियों के लिए एक अतिरिक्त लागत है, और डिकैल्सीफिकेशन के लिए आवश्यक 7-10 दिन अभी भी लंबा है। भविष्य में, प्रसंस्करण के लिए आवश्यक समय को और कम करने के लिए माइक्रोवेव-असिस्टेड डिकैल्सीफिकेशन14 के साथ इन विधियों को संयोजित करना संभव हो सकता है।

इसकी सीमाओं के बावजूद, यहां वर्णित उच्च गति अस्थायी हड्डी प्रसंस्करण के लिए प्रोटोकॉल मध्य कान, और संभावित आंतरिक कान, विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक और उपकरण प्रदान करता है। यह तकनीक कोविड-19 महामारी के दौरान उपयोगी रही है और ऊतक प्रसंस्करण के लिए आवश्यक समय और श्रम को कम करके एक सक्रिय अस्थायी हड्डी प्रयोगशाला को बनाए रखने से जुड़ी लागत को भी कम कर सकती है। संयुक्त राज्य अमेरिका के भीतर अस्थायी हड्डी अनुसंधान की लोकप्रियता में कमी आई है, जो 1980 के दशक में 28 सक्रिय प्रयोगशालाओं से घटकर वर्तमान में केवल 4 सक्रिय प्रयोगशालाओं में आगई है। ऑपरेटिंग अस्थायी हड्डी प्रयोगशालाओं की संख्या में यह गिरावट अस्थायी हड्डियों की कटाई और प्रसंस्करण से जुड़ी महत्वपूर्णलागतों से संबंधित हो सकती है 4,8. नतीजतन, यह महत्वपूर्ण है कि हम ऐसी तकनीकों को विकसित करना चाहते हैं जो अस्थायी हड्डी प्रसंस्करण के लिए आवश्यक संसाधनों को कम करती हैं और उन लोगों को भी जो कोविड-19 महामारी जैसे नए संदर्भों में अस्थायी हड्डी विकृति विज्ञान के अध्ययन की अनुमति देती हैं। इसके अलावा, उच्च गति ऊतक प्रसंस्करण, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित, नई जैविक तकनीकों (जैसे, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स) के उपयोग में सहायता कर सकता है जो आणविक स्तर 15,16,17,18,19 पर मध्य और आंतरिक कान विकृति के मूल्यांकन की अनुमति देता है . हमने ओटोलॉजिकल बीमारी में मानव ऊतक का अध्ययन करने के लिए आणविक तकनीकों का उपयोग करने के मामले में सतह को मुश्किल से खरोंच किया है, और वे महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं जो पशु मॉडल द्वारा प्रदान नहीं किए जा सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम इस परियोजना में उनकी सहायता के लिए मोहम्मद लहर को धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (टी 32डीसी000027, एनएसए) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) Novus Biologicals SN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) Abcam EPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) Novus Biologicals NBP1-20984
BX43 Manual System Microscope Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade Pace Technologies WB-007GP
Collin Mallet - 8'' Surgical Mart SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) Dako S2003
Eaosin Stain Sigma-Aldrich 548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) StatLab 1214-1 GAL
Hematoxylin Stain Sigma-Aldrich H9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) Leica Biosystems PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) Vector Laboratories MP-7405
Lambotte Osteotome Surgical Mart SM1553
Metallographic PICO 155P Precision Saw Pace Technologies PICO 155P microsaw
NIS Elements Software Version 4.6 Nikon
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End Walter Products 1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome New Life Scientific Inc. A78900104 cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) Sigma-Aldrich 920P-05
Xylene Sigma-Aldrich 920P-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 183
कोविड-19 से जुड़े मध्य कान पैथोलॉजी के आकलन के लिए हाई-स्पीड ह्यूमन टेम्पोरल बोन सेक्शनिंग
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Andresen, N. S., Wood, M. K., Čiháková, D., Stewart, C. M. High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology. J. Vis. Exp. (183), e64012, doi:10.3791/64012 (2022).

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