Summary
В эпоху иммунотерапии рака интерес к выяснению динамики микроокружения опухоли резко возрос. Этот протокол детализирует метод масс-спектрометрической визуализации в отношении его этапов окрашивания и визуализации, которые позволяют проводить пространственный анализ с высокой степенью мультиплексирования.
Abstract
Достижения в области иммунотерапии произвели революцию в лечении рака и исследованиях. Это вызвало растущий спрос на характеристику иммунного ландшафта опухоли. Хотя стандартная иммуногистохимия подходит для изучения тканевой архитектуры, она ограничивается анализом небольшого количества маркеров. И наоборот, такие методы, как проточная цитометрия, могут оценивать несколько маркеров одновременно, хотя информация о морфологии тканей теряется. В последние годы мультиплексированные стратегии, которые интегрируют фенотипический и пространственный анализ, появились в качестве комплексных подходов к характеристике иммунного ландшафта опухоли. Здесь мы обсуждаем инновационную технологию, сочетающую металлически меченые антитела и масс-спектрометрию вторичных ионов, уделяя особое внимание техническим этапам разработки и оптимизации анализа, подготовки тканей, а также получения и обработки изображений. Перед окрашиванием должна быть разработана и оптимизирована металлическая панель антител. Эта высокосложная система визуализации поддерживает до 40 металлических антител в одном участке ткани. Следует отметить, что риск помех сигнала увеличивается с количеством маркеров, включенных в панель. После проектирования панели особое внимание следует уделить назначению изотопа металла антителу, чтобы свести к минимуму это вмешательство. Предварительное панельное тестирование проводится с использованием небольшого подмножества антител и последующее тестирование всей панели в контрольных тканях. Закрепленные формалином, парафиновые участки тканей получаются и монтируются на слайды с золотым покрытием и далее окрашиваются. Окрашивание занимает 2 дня и очень напоминает стандартное иммуногистохимическое окрашивание. Как только образцы окрашиваются, они помещаются в инструмент получения изображения. Поля зрения выбираются, а изображения получаются, загружаются и сохраняются. Заключительным этапом является подготовка изображения к фильтрации и устранению помех с помощью программного обеспечения системы для обработки изображений. Недостатком данной платформы является отсутствие аналитического программного обеспечения. Тем не менее, генерируемые изображения поддерживаются различным программным обеспечением вычислительной патологии.
Introduction
Важность многочисленных типов клеток, окружающих популяции клональных опухолей, является решающим элементом в категоризации канцерогенеза. Интерес к выяснению состава и взаимодействий этого микроокружения опухоли (TME) постоянно рос после создания иммунной терапии как части арсенала лечения рака. Поэтому стратегии лечения сместились от опухолецентрического подхода к TME-центричному1.
Усилия по выяснению роли иммунных клеток в эпиднадзоре за опухолями и развитии рака резко возросли в последние годы 2,3. В медицинских исследованиях множество методов, включая методы на основе цитометрии и технологии одноплексной и мультиплексной визуализации, возникло в рамках этой попытки расшифровать уникальные взаимодействия нескольких элементовTME.
Новаторские методы, такие как проточная цитометрия (изобретенная в 1960-х годах), флуоресцентно-активированная сортировка клеток и массовая цитометрия, сосредоточены главным образом на идентификации и количественной оценке компонентовTME 4. Несмотря на то, что количественные методы, основанные на цитометрии, позволяют фенотипировать иммунный ландшафт, определение клеточного пространственного распределения невозможно. И наоборот, такие методы, как стандартная одноплексная иммуногистохимия, сохраняют тканевую архитектуру и позволяют исследователям анализировать клеточное распределение, хотя уменьшенное количество мишеней в одном участке ткани является ограничением этих методов 5,6. За последние несколько лет мультиплексированные технологии визуализации для одноклеточного разрешения, такие как мультиплексная иммунофлуоресценция, флуоресцентная визуализация штрихкодирования и масс-спектрометрия изображений, стали всеобъемлющими стратегиями получения информации об одновременном окрашивании маркеров с использованием одного и того же раздела7 ткани.
Здесь мы представляем технологию, которая соединяет помеченные металлом антитела и масс-спектрометрию вторичных ионов и позволяет количественно определять разрешение одной клетки, коэкспрессию маркеров (фенотипирование) и пространственный анализ с использованием образцов тканей с формалин-фиксированным, парафиновым (FFPE) и свежезамороженной (FF) тканью 8,9. Образцы FFPE являются наиболее широко используемыми материалами для архивирования образцов тканей и представляют собой более доступный ресурс для мультиплексированных технологий визуализации, чем свежезамороженные образцы10. Кроме того, эта технология предлагает возможность повторного получения изображений через несколько месяцев. Здесь мы обсуждаем наши протоколы окрашивания и обработки изображений с использованием образцов тканей FFPE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы тканей были получены для исследовательских целей в соответствии с Институциональным наблюдательным советом Онкологического центра Андерсона при Техасском университете, и образцы были дополнительно деидентифицированы.
1. Выбор антител
- Определите вопросы исследования, чтобы выбрать наилучшие доступные клоны антител. Используйте Атлас белков человека, опубликованные исследования и веб-сайты производителей антител в качестве исследовательских ресурсов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор адекватных средств контроля тканей человека и тех же элементов управления тканями человека, которые должны быть окрашены на разных этапах, имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы маркеры были окрашены правильно, в правильном месте и в правильном клеточном компартменте. Небольшой тканевый микрочип (TMA), включая нормальные ткани и опухолевые ткани, всегда рекомендуется для проверки окрашивания. - Используйте только антитела без носителей для проектирования панели.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование составов антител без носителей требуется, если коммерческие антитела без носителей недоступны; Наборы для очистки могут быть использованы для адаптации антител к правильному составу. Известно, что белковые добавки, такие как бычий сывороточный альбумин, уменьшают конъюгационную способность. - Тестировать и титровать каждое антитело с использованием стандартной хромогенной иммуногистохимии для определения субклеточной картины экспрессии маркера; мембранное, цитоплазматическое или ядерное окрашивание; и экспрессия в специфических клетках контрольных тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Однако каждое антитело должно быть протестировано в рН 6 цитрата и рН 9 этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и должно быть определено, будет ли панель окрашена рН 6 цитратом или рН 9 ЭДТА. Применение рН 9 ЭДТА рекомендуется для получения хороших сигналов, особенно при работе с данной методикой. - Выберите оптимальную концентрацию окрашивания в соответствии с паттерном выражения в положительных элементах управления.
- Назначают каждое антитело к одному из доступных изотопов металлов в соответствии с обилием иммуногистохимических маркеров, субклеточной локализацией и клеточной коэкспрессией с другими мишенями.
- Окрашивают антитело соответствующим назначенным металлом и сравнивают с экспрессией в той же контрольной ткани, применявшейся ранее.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конъюгация металла антител начинается с получения антител, восстановления и последующей конъюгации (Дополнительный файл 1). Каждой металлической полимерной трубки достаточно для маркировки 100 мкг антитела.
2. Конструкция панели антител
- Создавайте небольшие партии окрашивания антителами. Протестируйте до пяти маркеров в коктейле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тестирование антител, уже конъюгированных и проанализированных с использованием иммуногистохимии в партиях, облегчает раннее выявление интерференций каналов и дает возможность повторного сопряжения антител с другим металлом. Это также дает возможность оценить адекватное маркерное выражение. - Окрашивают каждую небольшую партию четырьмя различными концентрациями антител (0,05 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 1 мкг/мл и 4,0 мкг/мл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнивая различные титры, определите концентрацию антител, которая приводит к правильному расположению и наибольшей экспрессии с минимальным фоновым окрашиванием (наилучшее соотношение сигнал/шум).
3. Сечение тканей FFPE
- Выбирайте слайды с золотым покрытием (специально для этой цели) и держите их близко к микротому. Подготовьте микротом, вставив новое лезвие в держатель. Установите толщину сечения 4-5 мкм.
- Положите блоки FFPE на лед перед секционированием. Подготовьте тканевую плавающую ванну, нагревая дистиллированную воду или деионизированную воду (diH2O) до 40-45 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование diH2O или дистиллированной воды снижает вероятность загрязнения. - Начните секционирование. Поместите участок ткани в воду с помощью пинцета и дайте ему сплющиться. Используйте слайды, чтобы удалить участки тканей из воды.
- Поместите горки в подставку для слайдов и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.
4. Окрашивание антител FFPE
ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс окрашивания происходит в течение двух отдельных дней.
ВНИМАНИЕ: Растворы, используемые в этом протоколе, потенциально коррозионны и представляют опасность для кожи и глаз. Ношение перчаток, лабораторного халата и защитного оборудования для глаз и лица является частью политики нашего учреждения в области биобезопасности.
- Подготовка реагентов (день 1)
- Разбавьте 50 мл 20-кратного трис-буферного физиологического раствора с Tween (TBS-T) в 950 мл diH2O, чтобы получить 1 л TBS-T.
- Разбавьте 8 мл 10-кратной трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в 72 мл diH2O, чтобы получить 1-кратный термоиндуцированный раствор для извлечения эпитопа (HIER).
- Разбавьте ослиную сыворотку в 1x TBS-T до конечной концентрации 5%, чтобы сделать блокирующий буфер. Хранить раствор при температуре 4 °C до готовности к использованию.
- Подготовка к HIER: модуль предварительной обработки (PT)
ВНИМАНИЕ: Надевайте химические защитные перчатки при работе с любыми реагентами или деталями, погруженными в любые реагенты, используемые в модуле PT.- Разбавьте 140 мл 10-кратного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в 1 260 мл diH2O, чтобы получить 1,4 л 1x PBS. Альтернативно, развести семь таблеток PBS в 1,4 л diH2O.
- Наполните резервуар 1,4 л PBS и поместите подготовленный контейнер с камерой слайдов со 100 мл 1x раствора HIER в резервуар.
- Разогрейте резервуар в модуле PT до 75 °C.
- Удаление излишков парафина
- Выпекать горки при 70 °C в духовке не менее 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторым тканям или секциям может потребоваться более длительное время выпечки. Рекомендуемое время выпечки для мозговой ткани или ТМА составляет 1 ч. Это может быть продлено до 16 ч (ночью) или в соответствии с лабораторным опытом. - Поместите запеченные горки в держатель для слайдов и выполните следующие шаги мытья на шейкере под вытяжным капюшоном. Промывайте горки в следующем растворе: ксилол 2x в течение 30 с (без металлов), 100% спирт 2x в течение 30 с (без металлов), 95% спирт 2x в течение 30 с (без металлов), 80% спирт в течение 30 с (без металлов), 70% спирт в течение 30 с (без металлов) и diH2O 2x в течение 30 с (без металлов).
- Храните слайды в свежем контейнере diH2O до тех пор, пока они не будут готовы к извлечению антигена.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды не следует сушить до конца процедуры.
- Выпекать горки при 70 °C в духовке не менее 20 минут.
- Извлечение антигена
- Поместите слайды в предварительно нагретую слайдовую камеру, содержащую 1 буфер HIER внутри модуля PT. Поместите крышку на бак. Закройте и зафиксируйте крышку.
- Нажмите кнопку Menu на модуле PT, чтобы открыть главное меню, и нажмите кнопку Setup cycle (время и температура), чтобы создать пользовательскую программу.
- Запустите модуль PT при 97 °C в течение 40 минут. После этого модуль PT автоматически остынет до 65 °C.
- Снимите слайды из модуля PT после достижения температуры 65 °C. Держите горки при комнатной температуре в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль PT не будет открываться до тех пор, пока температура не остынет до 65 °C. Не прикасайтесь к золотистой поверхности горок во время этого процесса, и всегда используйте перчатки.
- Блокирование антител
- Установите шейкер на 70 об/мин.
- Мойте горки, погружая их в 1x TBS-T на 5 мин 2x.
- Используя гидрофобную барьерную ручку, проведите границу вокруг участка ткани на расстоянии не менее 1 мм от краев слайда и дайте ему высохнуть в течение 15-30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы жидкость ручки не касалась участка ткани, чтобы избежать любого вмешательства тканей в окрашивание. Не нажимайте на перо слишком сильно, рисуя барьер, чтобы избежать потенциальных утечек. Для получения оптимальных результатов окрашивания и получения изображения срезы ткани размещаются в середине слайдов с золотым покрытием в рамке размером не более 15 мм х 30 мм, чтобы обеспечить достаточно места для рисования барьера, не касаясь ткани или направляющих точек, размещенных на внешнем краю слайда. - Чтобы удалить остатки пера, окуните слайды в TBS-T.
- В влагокамере при комнатной температуре инкубируют участок ткани со 100-200 мкл блокирующего буфера в течение 20 мин. Оставьте ткань, инкубируемую в блокирующем буфере, пока не будет готова смесь антител.
- Подготовка панели антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем коктейля панели антител варьируется в зависимости от предполагаемой площади поверхности среза ткани. Чтобы покрыть площадь 20 мм х 20 мм, приготовьте 100-200 мкл коктейля.
Сделайте следующее, чтобы приготовить коктейль антител панели из металлических изотоп-конъюгированных антител:- Подтвердите окончательный объем коктейля, равный объему коктейля антител, добавленному к объему блокирующего буфера.
- Подтвердите спецификации для всех антител, разведений и/или концентраций антител в электронной таблице панели для проекта.
- Раскрутите все антителосодержащие пробирки по 10 000 х г в течение 5 мин. Добавьте отдельные антитела в блокирующий буфер и очень хорошо перемешайте. Не нарушайте дно трубки антитела при ее пипетке.
- Фильтруйте панель антител путем предварительного смазывания центробежного фильтрующего устройства 0,1 мкм со 100 мкл блокирующего буфера. Раскрутите фильтр при 10 000 x g в течение 2 минут и удалите блокирующий буфер с помощью пипетки.
- Переместите панель антител в спиновую колонну и вращайте фильтр при 10 000 х г в течение 2 мин. Отбросьте спиновую колонну и используйте проточную панель в качестве фильтрованной панели антител.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните окрашивание сразу после приготовления коктейля, чтобы предотвратить обмен металла. Если требуется хранение коктейля антител в течение длительного времени, его можно подвергнуть лиофилизации.
- Окрашивание антителами
- Осторожно снимите блокирующий буфер со слайдов, опрокинув каждый слайд на бок и осторожно постукивая краями по рабочему стеклоочистителю.
- Поместите слайды во влагоукладку и добавьте в ткань 100-200 мкл смеси антител (избегайте контакта с тканью и создания пузырьков воздуха).
- Добавьте положительные и отрицательные контрольные слайды в пакет окрашивания.
- Инкубировать горки при температуре 4 °C в течение ночи (14-16 ч).
- Подготовка реагентов (день 2)
- Разбавьте 100 мл 10x PBS с низким содержанием бария, рН 7,4, в 900 мл diH2O, чтобы получить 1x PBS.
- Готовят 350 мл рабочего сырья раствора 2% глутаральдегида в низкобариевом ПБС (340 мл низкобариевого ПБС + 10 мл 70% глутарового альдегида).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните разбавление под капотом. Глутаральдегид является очень вязкой жидкостью. Используйте пипетку 1 мл и добавляйте 1 мл PBS с низким содержанием бария в глутаровую альдегидную трубку каждый раз, пока она не станет достаточно жидкой, чтобы вылиться из трубки. - Разбавить 10x Tris, pH 8,5, в 900 мл diH20, чтобы получить 1x Tris.
- Фиксация и обезвоживание
- Удалите смесь антител с каждого слайда, опрокинув зажим на бок и осторожно постукивая краем о стеклоочиститель.
- Промыть слайды легким и умеренным перемешиванием в следующих буферах: 1x TBS-T, 3x по 5 мин каждый (без металлов); фильтрованный 2% глутаровый альдегид в течение 5 мин; фильтрованный 1x трис, рН 8,5, 3х в течение 30 с; фильтрованный diH2O 2x в течение 30 с; 70% спирт на 30 с (без металлов); 80% спирт на 30 с (без металлов); 95% спирт на 30 с (без металлов); и 100% спирт в течение 30 с (без металлов).
- Осторожно постучите краем каждого предмета о стеклоочиститель, чтобы удалить лишний спирт и дать остаточному спирту испариться при комнатной температуре (~ 5-10 мин).
- Сушите горки в адсорбаторе не менее 1 ч до получения изображения или храните слайды в вакуумной камере для длительного хранения.
5. Получение изображений
- Настройка слайдов
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед сканированием с помощью прибора слайды должны быть определены и настроены с помощью веб-приложения для управления изображениями, следуя шагам, описанным ниже.- На странице слайда в веб-приложении для управления изображениями щелкните Присоединение нового слайда и введите нужные сведения (имя, идентификация слайда, расположение и описание).
- Создайте разделы сканирования, нажав кнопку Добавить раздел. Заполните информацию для каждого раздела (название проекта, название слайда, блок и должность). Чтобы сохранить новые созданные слайды/разделы, нажмите кнопку Отправить.
- На вкладке Ресурсы откройте страницу панелей и выберите панель, которая будет использоваться. Для новых панелей нажмите кнопку Создать новую панель.
- После выбора панели нажмите на Разделы. Добавьте разделы, созданные на шаге 2. щелкнув Изменить назначение раздела. Сохраните, нажав кнопку Отправить.
- Настройка приборов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот прибор (см. Таблицу материалов) эксплуатируется с помощью специальной программы управления (см. Таблицу материалов).- Войдите в управляющее программное обеспечение. Нажмите кнопку Пробуждение , если инструмент находится в спящем режиме.
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, за 1 ч до операции рекомендуется прогрев инструмента, что помогает со стабилизацией фокусировки луча. - Чтобы загрузить слайд, щелкните Образец Exchange, а затем нажмите кнопку Продолжить , чтобы открыть дверь. Поместите слайд в загрузочный слот с образцом вверх и этикеткой справа. Нажмите кнопку Продолжить , чтобы закрыть дверь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если слайд загружен неправильно, появится предупреждающий звук и уведомление о настройке слайда. - Выберите проект, а затем выберите имя слайда для загруженного образца.
- Визуализируйте панорамное изображение на панели оптического изображения слайда.
- Войдите в управляющее программное обеспечение. Нажмите кнопку Пробуждение , если инструмент находится в спящем режиме.
- Выбор и получение поля зрения (FOV)
- Нажмите на меню Режим и выберите SED (Вторичный детектор электронов). Нажмите на меню режима изображения и выберите QC −300 мкм.
- Нажмите на Jog Stage , чтобы контролировать местоположение FOV, а затем нажмите на стрелки, чтобы перемещаться и выбирать положение FOV.
- Нажмите кнопку Добавить FOV, установите размер поля 400 мкм x 400 мкм и выберите режим обработки изображений и 1 мс времени ожидания. Нажмите кнопку Подтвердить.
ПРИМЕЧАНИЕ: Установленное время выдержки будет зависеть от желаемого разрешения. Время ожидания увеличивается по мере увеличения разрешения. Время обнаружения может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая период обкатки детектора и продолжительность работы. Наше среднее время сбора для одного FOV составляет около 17 минут. Используйте прибор без остановок в течение 8 ч, что позволяет сканировать около 28 FOV. Качество полученных изображений снижается после многих последовательных часов использования. - После создания списка FOV перейдите к фокусировке изображения и отрегулируйте стигматизацию, переместив луч в область ткани, которая не будет изображена. Настраивайте параметры до получения четкого центрального изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации получения изображения идеально подходит централизованный участок ткани на слайде. При фокусировке можно получить четкое изображение только центральной области. Если срез ткани слишком большой, края окажутся не в фокусе, а изображение будет размытым. - Нажмите кнопку Начать запуск. Полученные изображения будут автоматически загружены и сохранены в веб-приложении для управления изображениями.
6. Подготовка изображения
- Изобарическая коррекция изображения
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью изобарической коррекции является удаление побочного сигнала между каналами, возникающего в результате присутствия изотопов равной или очень похожей массы, различия в массе которых не могут быть обнаружены с помощью анализатора массы.- В веб-приложении для управления изображениями щелкните зеленый значок Загрузить , чтобы сохранить FOV (изображения TIFF).
- Загрузите самую последнюю версию программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалов), доступную на вкладке «О программе» в веб-приложении для управления изображениями, и сохраните ее в файле. Откройте .zip архивный файл и следуйте инструкциям по установке. Откройте программное обеспечение после завершения установки.
- Выберите папку, содержащую изображения, подлежащие исправлению, щелкнув значок Файл на панели ввода программного обеспечения для обработки изображений. Будет загружен список FOV.
- Щелкните значок Фильтр на панели ввода, чтобы применить исправления по умолчанию. Для каждого канала визуализируйте изображения, полученные до и после коррекции в правой части экрана.
- Щелкните значок дискеты на панели вывода, чтобы сохранить исправленный образ.
- Фильтрация изображений: Тесселяция Вороного
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаграммы тесселяции Вороного иллюстрируют разделение пространства, содержащего начальные точки, на ячейки Вороного. Цель состоит в том, чтобы оценить плотность клеток и определить границы ячеек. С помощью расчета тесселяции Вороного сгенерируется маска и применяется к исходному изображению для фильтрации.- Перейдите на вкладку Фильтрация и выберите Voronoi Tesselation в меню параметров фильтрации.
- В области ввода выберите изображение MassCorrected.tiff. Щелкните значок Фильтр на панели ввода.
- Щелкните значок дискеты на панели вывода, чтобы сохранить отфильтрованное изображение. Два результирующих файла будут иметь суффиксы -Filtered.tiff и -Filtered.json.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изображение с именем MassCorrected-Filtered.tiff затем может быть загружено в стороннюю программу цифрового анализа или программу с открытым исходным кодом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Участки тканей ТМА миндалин и аденокарциномы легких (толщиной 5 мм) были получены и размещены на середине слайдов с золотым покрытием в соответствии со спецификациями в отношении размера ткани и надежных краев слайдов. Свободные стеклянные края 5 мм и 10 мм между краем ткани и боковыми и нижними границами стеклянных слайдов соответственно необходимы для оптимального окрашивания. Срезы ткани запекали в течение ночи в печи перед окрашиванием, чтобы обеспечить надлежащее прилипание секции к слайду. Панель антител состояла из 23 маркеров. В одну и ту же партию окрашивания были включены слайд миндалин и слайд TMA, содержащие несколько тканей, для оценки экспрессии маркеров, скудно выраженных в образцах аденокарциномы легких (рисунок 1). Положительный контроль должен быть выбран в соответствии с мишенями антител, используемых в панелях; Например, для оценки экспрессии SOX10 необходимы образцы меланомы, а для оценки экспрессии GAFP необходимы образцы глиобластомы (рисунок 2).
Рисунок 1: Изотопная чистота и перекрестные помехи каналов. Матрица показывает процент перекрестных помех, полученных из чистоты зонда и оксидов (синие коробки, ≥0,5%; прозрачные коробки, <0,5%). Для массовых тегов показаны зонды, которые внесли не менее 0,5% перекрестного разговора в отсутствие каналов (зеленый), один или два канала (желтый) или более двух каналов (оранжевый). Также показаны массовые каналы, принимающие не менее 0,5% перекрестных помех без зондов (зеленый), один или два зонда (желтый) или более двух зондов (оранжевый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения окрашивания в различных тканях. (А) Аденокарцинома легких. (B) Неопущественная почка. с) Миндалины. CD20 показан желтым цветом, Ki67 показан пурпурным, CD3 показан белым, CD11c показан зеленым, CD68 показан красным, цитокератин показан в голубом, а двухцепочечная ДНК (dsDNA) показана синим цветом. Увеличение, 200x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Эта процедура окрашивания очень напоминает стандартное иммуногистохимическое окрашивание и происходит в течение двух дней подряд. Пять основных этапов протокола окрашивания: 1) удаление избыточного парафина, 2) извлечение антигена, 3) блокирование антител, 4) окрашивание антител и 5) фиксация и обезвоживание (рисунок 3). Фундаментальным шагом в процедуре окрашивания является принятие мер предосторожности во избежание металлического загрязнения образцов, включая использование безметалловых реагентов, хранящихся в пластиковой посуде, и тщательное обращение с образцами для ограничения механических повреждений. Рекомендуется готовить коктейль антител непосредственно перед окрашиванием. Это снижает металлообмен. Как только окрашивание было завершено, мы сохранили слайды и отсканировали их на следующий день. Перед получением изображения необходимым шагом является настройка слайдов с помощью веб-приложения для управления изображениями (рисунок 4).
Рисунок 3: Рабочий процесс получения изображений и связанный с ним слайд. (A) Сводка по рабочему процессу получения изображений. 1) Участок ткани FFPE, окрашенный металлоконъюгированными антителами, растрируют с помощью первичного ионного пистолета, высвобождая вторичные ионы. 2) Масс-спектрометр времени пролета отделяет и измеряет ионы на основе их массы на уровне пикселей. 3) Пиксельная количественная оценка вторичных ионов. Ось Y соответствует количеству обнаруженных ионов (пик), а ось X соответствует массе каждого металла. 4) На основе пика каждого масс-спектра реконструируются многомерные изображения. (B) Схема слайда, используемого в этой процедуре. Для оптимального окрашивания ткани срез должен быть расположен не менее чем в 5 мм от бокового края слайда и в 10 мм от его нижнего края. При нанесении гидрофобного барьера вокруг участка ткани его необходимо удерживать внутри прямоугольника не менее чем на 1 мм от края горки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Настройка слайдов в веб-приложении для управления изображениями. Перед сканированием слайдов необходимо настроить каждый слайд. Введите желаемые данные, которые могут помочь с идентификацией слайдов. Нажмите «Добавить раздел» (черная стрелка), чтобы включить информацию о блоке и позиции. Для сохранения нажмите кнопку Отправить (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
В день сканирования включите прибор сбора с помощью управляющего программного обеспечения. Нажатие на Exchange Slide открыло дверцу инструмента, позволив загрузить слайд. Мы расположили слайд на загрузочном слоте лицом вверх с этикеткой с правой стороны. Одновременно можно отсканировать только один слайд. Следующим шагом был выбор FOV и корректировка фокуса и стигматизации в соответствии с шагами, описанными в протоколе. Мы получили изображения, нажав на Start Run. Время сбора варьируется в зависимости от желаемого размера FOV и разрешения. Размер FOV варьируется от 200 мкм x 200 мкм до 800 мкм x 800 мкм, что соответствует диапазону размеров кадра от 128 пикселей x 128 пикселей до 2048 пикселей x 2048 пикселей. Доступны три стандартных разрешения: грубое, тонкое и сверхтонкое. Сканирование больших FOV со сверхтонким разрешением занимает много времени, а окончательное время получения для одного FOV составляет от 25 с до 4,7 ч (рисунок 5).
Рисунок 5: Получение изображений с помощью управляющего программного обеспечения. Настройки сбора данных можно настроить по желанию. Чтобы изменить разрешение сканирования, нажмите на раскрывающееся меню Режим изображения (черная стрелка). Чтобы изменить размер FOV, введите число в поле FOV Size (мкм) (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После завершения сканирования набор изображений, включающий все FOV, автоматически загружался в веб-приложение для управления изображениями. Помимо хранения изображений, это приложение позволяет визуализировать все каналы вместе или по отдельности, корректировать изображения и загружать изображения для дальнейшей подготовки. Стандартное визуализированное изображение сохраняется в виде файла TIFF (рисунок 6).
Рисунок 6: Визуализация изображений с помощью веб-приложения для управления изображениями. Полученные изображения сохраняются и визуализируются с помощью онлайн-платформы. Возможна настройка параметров визуализации и изменение цвета каждого маркера. Нажмите Добавить канал изображения (белая стрелка), чтобы визуализировать другие маркеры. Увеличение, 200x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Металлические помехи присущи методам маркировки металлов, несмотря на использование стратегий для их минимизации. Чтобы удалить избыточные фоновые сигналы из изотопа металла, конъюгированного с антителами, и подготовить изображения к анализу, мы использовали соответствующее программное обеспечение для обработки изображений (см. Таблицу материалов). Процедура подготовки изображения состоит из двух этапов: 1) изобарическая коррекция, которая удаляет сигналы между каналами, и 2) фильтрация, которая удаляет сигналы, вызванные агрегатами на изображении.
Чтобы начать изобарическую коррекцию, файл, содержащий сохраненное изображение TIFF, был выбран путем нажатия на значок Файл на панели ввода. Программа автоматически загружает все архивированные TIFF изображения в файл, что позволяет проводить пакетный анализ. Затем мы исправили изображение, нажав на значок фильтра панели ввода. Два результирующих файла с суффиксом -MassCorrected были сгенерированы автоматически: один заархивирован в формате TIFF, а другой заархивирован в формате JSON. По умолчанию полученные архивы были сохранены в том же файле, из которого было загружено исходное изображение (рисунок 7).
Рисунок 7: Подготовка изображения: этап коррекции. Чтобы загрузить изображение для подготовки в программное обеспечение для обработки изображений, нажмите на значок Файл на панели ввода (черная стрелка) и выберите изображение. Чтобы применить процедуру коррекции по умолчанию, щелкните значок Фильтр на панели ввода (красная стрелка). Чтобы сохранить обновленное, исправленное изображение, нажмите на значок дискеты на панели вывода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Вторым этапом подготовки изображения является фильтрация, которую можно выбрать на верхней вкладке в программном обеспечении. Мы выбрали исправленное изображение на панели ввода. На этом этапе в качестве параметра фильтрации использовалась автоматизированная тесселяция Вороного. Нажатие на значок фильтра на панели ввода автоматически применяет выбранный фильтр ко всем каналам. На обоих этапах подготовки изображения (коррекция и фильтрация) изображения каждого канала до и после обработки и различия сигналов отображаются в правой части экрана.
Аналогично этапу изобарической коррекции, были сгенерированы два новых архива, один в формате TIFF и один в формате JSON. На этом шаге суффикс, следующий за именем файла, был -Filtered. Поэтому полученное окончательное изображение получило название MassCorrected-Filtered.tiff. Выполнив эти шаги, мы подготовили изображение для анализа с помощью предпочтительного программного обеспечения для цифровой патологии (рисунок 8 и рисунок 9). Используя эту методику, мы смогли проанализировать все 23 маркера в панели антител с минимальными помехами между каналами на субклеточном уровне в одном участке ткани.
Рисунок 8: Подготовка изображения: этап фильтрации. Выберите Фильтрация на верхней вкладке (черная стрелка) в программном обеспечении для обработки изображений. В разделе Параметры фильтрации выберите нужный метод (зеленая стрелка). В области ввода выберите Массовая коррекция изображения. Чтобы применить выбранную процедуру к изображению, щелкните значок Фильтр на панели ввода (красная стрелка). Чтобы сохранить обновленное отфильтрованное изображение, щелкните значок дискеты на панели вывода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Репрезентативные изображения окрашивания до и после подготовки изображения. (A) Изображение участка ткани миндалин, окрашенного с использованием этой техники и визуализированного с помощью сторонней программы для анализа цифровых изображений перед фильтрацией и коррекцией. (B) Изображение одного и того же раздела в тех же условиях после этапов фильтрации и исправления. CD20 показан желтым, Ki67 показан пурпурным, CD3 показан белым, CD11c показан зеленым, цитокератин показан в голубом, а двухцепочечная ДНК (dsDNA) показана синим цветом. Увеличение, 200x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Список панелей антител. Каждое антитело конъюгировалось с определенным изотопом металла с другой массой, как указано в списке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Всестороннее выяснение сложных, запутанных взаимодействий между многочисленными компонентами TME остается ключевой целью исследований рака. Производители ввели многочисленные мультиплексированные анализы в рамках этих усилий, особенно за последние 5 лет. Мультиплексированный пространственный анализ является универсальным и мощным инструментом, который облегчает одновременную категоризацию нескольких мишеней при сохранении структурной морфологии в образцах опухолей. Методы пространственного анализа могут быть выполнены с использованием флуоресцентной визуализации или масс-спектрометрии, такой как способ, описанный в настоящем описании 11,12,13.
Перед окрашиванием оптимизация антител с использованием обычного протокола иммуногистохимии с последующим протоколом окрашивания требуется для стандартизации воспроизводимости окрашивания антител. Очень хорошо известным фактом является то, что различные клоны регулярных антител могут иметь оптимальную экспрессию в разных условиях. Однако для сопряжения антител с металлическими метками требуются антитела без носителей, а также определение одного и того же рН для извлечения антигена для всех антител, интегрированных в панель, что является недостатком этого метода. Невыполнение этого шага может привести к получению изображений низкого качества, которые не могут быть успешно проанализированы. Необходимо посвятить время изучению медицинской литературы и веб-сайтов производителей антител для выбора лучших хорошо проверенных, надежных антител из числа коммерчески доступных. При проверке антител и панелей полезно строительство меньших панелей. Это помогает в выявлении возможных помех канала и оценке правильного выражения маркеров.
Одной из отличительных особенностей данной методики является возможность изучения до 40 меченых металлом антител на одном участке ткани. Несмотря на высокую ценность, методы масс-спектрометрии с металлической маркировкой подвержены сложным металлическим интерференциям, таким как изобарические интерференции. Изобарические интерференции характерны для методов масс-спектрометрии с маркировкой металлов и являются результатом существования изотопов равной или очень похожей массы, разница в массе которых меньше, чем способность анализатора массы детектировать. Эти помехи могут быть вызваны изотопным загрязнением или многоатомными видами. Изотопное загрязнение относится к чистоте элемента. В природе большинство элементов присутствует в смеси изотопов. Даже при обогащении 100% чистота не может быть получена. Это приводит к более чем одному элементу с одинаковой массой и производит перекрестные помехи между каналами. Средняя чистота 40 доступных изотопов металлов составляет 98%. Интерференции, вызванные многоатомными видами, возникают из-за связывания свободных металлов с отрицательно заряженными видами, такими как гидриды, карбиды, нитриды, оксиды, гидроксиды и цианиды, добавляя от +1 до +26 к конечной массе метки металла. Разработка стратегий для минимизации возможных источников шума имеет решающее значение для достижения хорошего окрашивания и визуализации. Первым необходимым шагом в конструкции панели является тщательное назначение изотоп-антитело металла. Маркеры, которые обычно широко распространены в срезах тканей, такие как цитокератин и CD45, должны быть сопряжены с изотопами металлов с высокой массой (превышающей массу 160Gd), чтобы свести к минимуму воздействие многоатомных помех, а скудные маркеры должны быть сопряжены с изотопами с массами от 140Ce до 160Gd. Следует иметь в виду, что риск интерференции металлов увеличивается по мере увеличения числа маркеров. Однако при тщательном размещении металла и маркеров влияние остаточных помех может быть уменьшено при дальнейшей обработке изображений с использованием программного обеспечения для обработки изображений.
Дополнительные процедуры также могут быть использованы для уменьшения металлического загрязнения образцов при разрезании и окрашивании тканей. Как описано в протоколе выше, использование дистиллированной воды или diH2Oна водяной бане предотвращает это загрязнение. Аналогичным образом, реагенты, используемые при окрашивании, должны быть безметалловыми. Полезным советом является избегание хранения реагентов в стеклянной таре, так как стеклянная посуда способствует загрязнению металла. Для получения оптимальных общих результатов на этапе окрашивания мы рекомендуем запекать горки в течение ночи, чтобы обеспечить хорошее прилипание участков тканей к слайдам.
В отличие от других мультиплексированных методов, этот метод использует примеры FFPE14. Комбинированная фиксация формалина и встраивание парафина остается наиболее широко используемой формой сохранения и подготовки образцов. Использование архивных блоков позволяет проводить более обширные исследования, чем использование свежезамороженных образцов, включая ретроспективные исследования, и имеет более низкую стоимость. Этот метод также позволяет создавать изображения целых слайдов и сканировать слайды. Это захватывает более широкую область анализа, чем выбор только частей слайда, и позволяет сканировать с несколькими увеличениями.
Этот метод имеет ограничения, связанные с ценой инструмента и требованием покупки материалов, таких как слайды с золотым покрытием, непосредственно у производителей. Попытки использовать слайды без покрытия, слайды, покрытые материалом, отличным от золота, или слайды, полученные от компаний, отличных от производителей, могут привести к отсутствию получения сигнала и обширным помехам сигнала и, в конечном счете, могут повредить инструмент.
Еще одним существенным недостатком данного метода является отсутствие специфического программного обеспечения для анализа. Этот метод генерирует изображения в формате TIFF, который широко используется и может быть легко загружен в стороннее программное обеспечение для цифрового анализа. Программные инструменты вычислительной патологии позволяют проводить комплексный анализ, включая компартментализацию тканей, сегментацию клеток, количественную оценку маркеров в любом клеточном компартменте, а также анализ ближайшего соседа и близости. Приобретение стороннего программного обеспечения для цифрового анализа для использования, увеличивает стоимость и без того дорогостоящей техникина 15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Авторы выражают признательность Дону Норвуду из Службы редактирования, Исследовательской медицинской библиотеки в MD Anderson за редактирование этой статьи и Лаборатории мультиплексной иммунофлуоресценции и анализа изображений в Отделе трансляционной молекулярной патологии в MD Anderson. Эта публикация частично стала результатом исследований, проведенных при содействии научной и финансовой поддержки Центров иммунного мониторинга и анализа рака - Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC), предоставленной через Соглашение о сотрудничестве Национального института рака (NCI) (U24CA224285) Университету Техаса MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T.
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora's box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
