Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Published: July 22, 2022 doi: 10.3791/64027
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Biology, Emory University, 2Department of Physics, Emory University

Summary

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Abstract

De nematode Caenorhabditis elegans is een modelsysteem voor interacties tussen gastheer en microbe en gastheer-microbioom. Veel studies tot nu toe gebruiken batchvergistingen in plaats van individuele wormmonsters om de bacteriële belasting in dit organisme te kwantificeren. Hier wordt betoogd dat de grote interindividuele variabiliteit die wordt gezien bij bacteriële kolonisatie van de C. elegans-darm informatief is en dat batch-digest-methoden informatie weggooien die belangrijk is voor een nauwkeurige vergelijking tussen omstandigheden. Omdat het beschrijven van de variatie die inherent is aan deze monsters grote aantallen individuen vereist, wordt een handig 96-wells plaatprotocol voor verstoring en kolonieplating van individuele wormen vastgesteld.

Introduction

Heterogeniteit in gastheer-microbe associaties wordt alomtegenwoordig waargenomen en variatie tussen individuen wordt steeds meer erkend als een bijdragende factor in processen op populatieniveau van concurrentie en coëxistentie1 tot ziekteoverdracht 2,3,4. In C. elegans is herhaaldelijk "verborgen heterogeniteit" binnen isogene populaties waargenomen, waarbij subpopulaties van individuen verschillende fenotypen vertonen in hitteschokrespons 5,6, veroudering en levensduur 7,8,9,10,11, en vele andere aspecten van fysiologie en ontwikkeling12 . De meeste analyses die proberen de subpopulatiestructuur te identificeren, leveren bewijs voor twee subpopulaties in experimentele populaties van isogene, gesynchroniseerde wormen 5,7,8, hoewel andere gegevens de mogelijkheid suggereren van binnen-populatieverdelingen van eigenschappen in plaats van verschillende groepen 7,12,13 . Van belang hier is dat aanzienlijke heterogeniteit in darmpopulaties wordt waargenomen, zelfs binnen isogene populaties van wormen gekoloniseerd uit een gedeelde bron van microben 13,14,15,16, en deze heterogeniteit kan worden verborgen door de batch digest-metingen die veel worden gebruikt 17,18,19,20 voor bacteriële kwantificering in de worm.

Dit werk presenteert gegevens die suggereren dat er behoefte is aan een grotere afhankelijkheid van metingen met één worm in gastheer-microbe associatie, evenals protocollen voor het verhogen van de nauwkeurigheid en doorvoer bij verstoring van één worm. Deze protocollen zijn ontworpen om mechanische verstoring van grote aantallen individuele C. elegans te vergemakkelijken voor kwantificering van levensvatbare bacteriële belasting, terwijl ze een betere herhaalbaarheid en lagere inspanning per monster bieden dan op stampers gebaseerde verstoring van individuele wormen. Een aanbevolen darmzuiverende stap, waarbij wormen zich mogen voeden met door hitte gedode E. coli voorafgaand aan de voorbereiding op verstoring, is opgenomen om bijdragen van recent ingenomen en andere voorbijgaande (niet-gehechte) bacteriën te minimaliseren. Deze protocollen omvatten een koude-verlammingsmethode voor het reinigen van de nagelriem met een oppervlaktebleekbehandeling met lage concentratie; oppervlaktebleking kan worden gebruikt als een voorbereidende stap in verstoring van één worm of als een methode voor het bereiden van levende, uitwendig kiemvrije wormen. Deze oppervlaktebleekmethode is voldoende om een breed scala aan externe microben te verwijderen en koudebehandeling biedt een alternatief voor conventionele verlamming op basis van levamisol; terwijl levamisol de voorkeur heeft voor koudegevoelige experimenten, minimaliseert koude verlamming de bijdragen aan gevaarlijke afvalstromen en maakt het een snelle hervatting van de normale activiteit mogelijk. Hoewel het volledige protocol een laboratoriumexperiment beschrijft waarbij wormen worden gekoloniseerd met bekende bacteriën, kunnen de procedures voor het reinigen van wormen en verstoring van één worm gemakkelijk worden toegepast op wormen die zijn geïsoleerd uit wilde monsters of worden gekoloniseerd in microkosmosexperimenten. De hier beschreven protocollen produceren levende bacteriën geëxtraheerd uit de wormdarm, geschikt voor plating en kwantificering van kolonievormende eenheden (CFU's) in individuele wormen; voor op sequencing gebaseerde intestinale gemeenschapsanalyse moeten opeenvolgende cellysis- en nucleïnezuurextractiestappen aan deze protocollen worden toegevoegd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Wormen die in deze experimenten werden gebruikt, werden verkregen van het Caenorhabditis Genetic Center, dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Bristol N2 is het wild-type. DAF-2/IGF-mutanten daf-16(mu86) I (CGC CF1038) en daf-2(e1370) III (CGC CB1370) worden gebruikt om verschillen in intestinale bacteriële belasting te illustreren.

HT115(DE3) E. coli met de pos-1 RNAi vector is afkomstig uit de Ahringer bibliotheek21. De MYb-collectie van C. elegans inheemse darmbacteriën22 is verkregen uit het Schulenburg-lab. Salmonella enterica LT2 (ATCC 700720) attB:GFP-KmR is van dit lab23. Pseudomonas mosselii werd in dit lab geïsoleerd. Staphylococcus aureus MSSA Newman pTRKH3-mGFP werd verkregen uit het LaRock-lab aan de Emory University.

Alle wormbuffers en media worden bereid volgens eerder gepubliceerde literatuur24 met kleine wijzigingen (zie Aanvullend dossier 1).

1. Bereiding van gesynchroniseerde steriele C. elegans

OPMERKING: In deze sectie worden stapsgewijze procedures beschreven voor het genereren van een gesynchroniseerde populatie van reproductief steriele volwassen wormen. Voeding op pos-1 RNAi-platen wordt hier gebruikt om de productie van nakomelingen te voorkomen omdat deze interferentie embryonaal dodelijk is; L1-larven die op pos-1 RNAi tot volwassenheid zijn grootgebracht, ontwikkelen zich tot eierleggende hermafrodieten, maar deze eieren zijn niet levensvatbaar25. Het RNAi-voedingsprotocol is zoals in het hoofdstuk "Omgekeerde genetica" van Wormbook26.

  1. Voordat u wormen synchroniseert, moet u ervoor zorgen dat er verse 10 cm NGM + pos-1 RNAi-platen beschikbaar zijn. Platen kunnen vers worden bereid uit geconcentreerde geïnduceerde vloeistofcultuur (+Amp +IPTG) of worden ingeënt als gazons op NGM + 100 μg/ml ampicilline + 1 mM IPTG en gedurende 1 dag27 bij 25 °C in het donker worden laten groeien.
    OPMERKING: Carbenicilline (25 μg / ml) wordt vaak gebruikt in plaats van ampicilline op RNAi-platen. Ampicilline is minder duur maar minder stabiel; bij gebruik van ampicilline moeten platen onmiddellijk na droog worden gezaaid en zo snel mogelijk worden gebruikt (kan <1 week bij 4 °C worden bewaard)27. De hoge antibioticaconcentratie die hier wordt aanbevolen, zal helpen om een adequate selectie te garanderen.
  2. Begin met verschillende (meestal twee tot vier) NGM-platen met grote populaties gravid hermafrodieten. Isoleer eieren met behulp van bleekmiddel-NaOH-synchronisatie24.
    1. Was wormen van agarplaten met 2 ml steriele ddH2O per plaat. Verdeel de vloeistof gelijkmatig in 1,5 ml microcentrifugebuizen (één buis per plaat of hermafrodieten).
    2. Draai ~5 s naar beneden in een benchtop minicentrifuge (2.000 x g) om volwassenen naar de bodem van de buizen te trekken. Pipetteer het supernatant en gooi het weg.
    3. Wassen met 1 ml steriele ddH2O; draai naar beneden zoals voorheen en gooi het supernatant weg.
    4. Herhaal de vorige stap om het resterende bacteriële vuil te verminderen.
    5. Resuspendeer de inhoud van elke buis in 1 ml steriel ddH2O. Voeg aan elke buis 130 μL commercieel bleekmiddel (8,25% natriumhypochloriet) en 130 μL 5 N natriumhydroxide (NaOH, eindconcentratie 0,5 N) toe.
    6. Vortexbuizen krachtig gedurende ten minste 10-15 s elke 2 minuten totdat volwassen lichamen zijn uiteengevallen. Laat de bleek-NaOH-behandeling niet langer dan 5 minuten duren om te voorkomen dat eieren worden gedood.
    7. Draai in een minicentrifuge gedurende 30-60 s bij 2.000 x g om de eieren te pelleteren. Pipetteer het supernatant en gooi het weg. Er kan al dan niet een zichtbare pellet zijn, dit is normaal.
    8. Voeg 1 ml M9-wormbuffer toe en draai gedurende 30-60 s bij 2000 x g. Gooi het supernatant weg.
    9. Herhaal de spoelstap (1.2.8) 5x om het bleek-NaOH-mengsel grondig te verwijderen en zoveel mogelijk van het supernatant te verwijderen zonder de eikorrel te verstoren.
    10. Breng eieren over op 10 ml M9-wormbuffer in een conische buis van 50 ml of een kweekbuis van 30 ml met dop. Als u conische buizen gebruikt, laat u het deksel iets losgeschroefd en gebruikt u een beetje tape om het veilig te houden. Incubeer met schudden 's nachts (16 uur) bij 25 °C en 200 RPM om de larven te laten uitkomen.
  3. Breng gesynchroniseerde L1-larven over naar RNAi-platen om volwassen te worden.
    1. Voeg 2 ml steriele M9-buffer + 0,01% Triton X-100 (voortaan M9TX-01) toe aan elke L1-buis en breng het volledige volume (12 ml) over op een conische buis met schroefdeksel van 15 ml.
    2. Plaats 15 ml buisjes met L1-wormen op 4 °C gedurende 10 minuten om de larvale beweging te vertragen.
    3. Draai 15 ml conische buizen in een grote tafelcentrifuge (1.500 x g bij 4 °C gedurende 3 minuten; versnelling en vertraging mogen niet hoger zijn dan 80% van het maximum).
    4. Pipetteer voorzichtig het supernatant af zonder de L1-pellet te storen. Gooi het supernatant weg.
    5. Voeg 12 ml koude M9TX-01 toe aan elke buis. Herhaal de centrifugatie. Pipetteer voorzichtig en gooi het supernatant weg. Elke buis moet ~200 μL overhouden.
    6. Spoel een pipetpunt van 200 μL in M9TX-01 om te voorkomen dat wormen aan het plastic blijven plakken en gebruik deze tip om de wormkorrel te resuspenderen. Breng geresuspendeerde wormen over naar voorbereide pos-1-platen door druppels vloeistof op het bacteriële gazon te pipetteren.
    7. Incubeer de platen bij 25 °C tot de eerste dag van volwassenheid.
      OPMERKING: Als wormen op pos-1 RNAi-platen groeien, MOETEN wormen ad libitum op de RNAi-bacteriën voeden totdat ze volledig zijn overgegaan naar volwassenheid om een hoge penetrantie van het embryonaal-letale fenotype te garanderen. Controleer de platen op 24 en 48 uur. Als de platen uitgehongerd of bijna uitgehongerd lijken, moeten de wormen worden verplaatst naar verse platen om uit te groeien tot volwassenen op ware grootte. Om te voorkomen dat platen uitgeput raken voordat wormen worden gekweekt, moet u 250-500 L1-larven toevoegen aan elke RNAi-plaat van 10 cm.
  4. Oogst volwassenen en verwijder intestinale E. coli om kiemvrije wormen te maken.
    1. Spoel volwassen wormen van platen met 5 ml M9TX-01 per plaat. Breng buffer + wormen over naar een conische buis van 15 ml en laat volwassenen zich op de bodem van de buis nestelen.
    2. Spoel volwassenen in veranderingen van 10 ml verse M9TX-01-buffer totdat er geen zichtbare bacteriële troebelheid overblijft (meestal 1-2x). Buizen kunnen worden gecentrifugeerd bij 700 x g gedurende 30 s tot pelletwormen, of volwassenen kunnen worden toegestaan om te bezinken door de zwaartekracht.
    3. Voer een extra wasbeurt uit met 10 ml M9TX-01 om externe bacteriën te verminderen.
    4. Breng wormen over naar 50 ml conische buizen of 30 ml kweekbuizen met 5 ml S Medium + 2x door hitte gedood E. coli OP50 (~ 5 x 109 gedode cellen / ml) + 200 μg / ml gentamycine + 50 μg / ml chlooramfenicol. Als u conische buizen gebruikt, laat u het deksel iets losgeschroefd en gebruikt u een beetje tape om het veilig te houden. Gebruik glazen pipetten of spoel plastic pipetten in M9TX-01 om te voorkomen dat de wormen blijven plakken.
    5. Incubeer volwassenen bij 25 °C met schudden bij 200 RPM gedurende 24-48 uur om kiemvrije volwassenen te produceren.
      OPMERKING: Als de wormen >24 uur in antibiotica moeten blijven, moet mogelijk meer door hitte gedode OP50 worden toegevoegd om ervoor te zorgen dat de wormen een adequate voedselbron hebben. Controleer de buizen op 24 uur en vul aan met warmtedode OP50 als de troebelheid zichtbaar is verminderd.
  5. Sucrose was volwassenen volgens de Wormbook-protocollen24 om schone, reproductief steriele, gesynchroniseerde voorraden voor alleen volwassenen te verkrijgen voor bacteriële kolonisatie.
    1. Zorg ervoor dat koude volumes van 60% sucrose, M9-wormbuffer en M9TX-01 klaar zijn voor gebruik. Voor de eenvoud kunnen deze de avond ervoor bij 4 °C worden gelaten.
    2. Maak voor elk te wassen monster een gelabelde conische buis van 15 ml met 8 ml M9TX-01 en zet op ijs. Deze zijn nodig in stap 1.5.10.
    3. Voeg 5 ml M9TX-01 toe aan elke buis van 50 ml met L1-larven. Breng het volledige volume (nu 10 ml) over naar een lege 15 ml schroeftop conische buis en laat volwassenen zich naar de bodem van de buis nestelen.
    4. Pipetteer voorzichtig het supernatant af en gooi het weg.
    5. Voeg 10 ml M9TX-01 toe aan elke buis en verplaats buizen naar een ijsemmer gedurende 5-10 minuten.
      OPMERKING: Vanaf dit punt moeten wormen en alle buffers op ijs worden gehouden.
    6. Gebruik de instelling "snelle temperatuur" om een grote tafelcentrifuge af te koelen tot 4 °C.
    7. Voeg 10 ml koude M9TX-01 toe aan elke buis om het resterende vuil af te spoelen. Laat wormen zich op ijs nestelen; verwijder het supernatant en gooi het weg.
    8. Sucrose float: Voeg 5 ml koude M9-buffer en 5 ml koude 60% sucrose-oplossing toe aan elke buis en meng grondig. Laat vervolgens voorzichtig 1 ml koude M9-buffer op het sucrose-buffermengsel in elke buis drijven. Meng niet nadat de dobber is toegevoegd.
      LET OP: Ga snel over voor de volgende paar stappen - wormen kunnen uitdrogen als ze te lang worden blootgesteld aan hoge concentraties sucrose!
    9. Centrifugeer bij 1500 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Levende volwassen wormen bevinden zich op het grensvlak van de M9 en de sucrose, ongeveer 1 ml van de bovenkant van de buis.
    10. Gebruik een glazen serologische pipet van 5 ml om de wormlaag over te brengen naar voorbereide conische buizen van 15 ml met koude M9TX-01 (vanaf stap 1.5.2). Wees heel voorzichtig om de laag levende wormen te krijgen zonder te veel van de sucrose te pipetteren.
    11. Voeg indien nodig M9TX-01 toe om gelijke volumes van 10-12 ml / buis te krijgen. Centrifugeer bij 1500 x g bij 4 °C gedurende 1 min en pipetteer vervolgens het supernatant. Wormen kunnen op dit punt worden teruggebracht naar kamertemperatuur.
    12. Herhaal de wasstap 1.5.11 tweemaal en verlaag de snelheid tot 700 x g bij 4 °C en de tijd tot 30 s.

2. Wormen voeren op levende bacteriën in vloeibare cultuur

OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt om wormen te koloniseren met in het laboratorium gekweekte bacteriën in goed gemengde omstandigheden in vloeibare cultuur (aanvullende figuur 1). Wormen kunnen worden gekoloniseerd met individuele isolaten uit pure cultuur (bijv. Pathogenen zoals Enterococcus faecium28,29) of mengsels van isolaten (bijv. Minimale microbioomgemeenschappen14).

  1. Begin met sucrose gewassen gesynchroniseerde volwassen wormen uit protocol stap 1.5 in een conische buis van 15 ml. Was de wormen eenmaal in 12 ml S-buffer en gooi het supernatant weg.
  2. Resuspendeer de gewassen wormen in het volume S-medium dat nodig is voor het experiment. Overweeg het volume van experimentele omstandigheden, het aantal omstandigheden waarover wormen zullen worden verdeeld en de uiteindelijke concentraties van wormen en bacteriën.
    OPMERKING: Het voeren in wormen varieert met bacteriële beschikbaarheid30 en wormen kunnen worden gestrest door31 te verdringen. Voor kolonisatie in vloeibare cultuur worden <1000 wormen / ml en >107 CFU / ml aanbevolen; 1011 CFU/ml wordt beschouwd als "ad libitum" voedingsdichtheid op E. coli32.
  3. Spin naar bacterieculturen. Giet het supernatant af; aspiratie of pipettering kan worden gebruikt om het supernatant te verwijderen voor bacteriën die losse pellets vormen.
    OPMERKING: Voor culturen >5 ml, breng over naar buizen van 15 ml en draai met ~ 2800 x g in een grote tafelcentrifuge gedurende 8-10 minuten. Culturen <5 ml kunnen worden overgebracht naar buizen van 1,5 ml en gedurende 1-2 minuten worden gecentrifugeerd bij 9000 x g in een kleine tafelcentrifuge. Zeer beweeglijke bacteriën (bijv. veel soorten Pseudomonas) moeten mogelijk gedurende 10-15 minuten bij 4 °C worden gekoeld om de vorming van een stabiele pellet te vergemakkelijken, en het kan beter zijn om bij 4 °C te centrifugeren.
  4. Resuspendeer bacterieculturen in één volume S-buffer en centrifugeer opnieuw tot pellet. Verwijder en gooi het supernatant weg zoals voorheen.
  5. Resuspend bacterieculturen in S-medium met de gewenste dichtheid voor het experiment, plus eventuele antibiotica voor selectie. De antibiotica die moeten worden gebruikt, indien aanwezig, zijn afhankelijk van het resistentieprofiel van de bacteriën die worden gebruikt voor kolonisatie.
  6. Met behulp van een pipetpunt gecoat in M9TX-01, pipetwormen voorzichtig op en neer totdat wormen grondig worden geresuspendeerd in S-medium en vervolgens overbrengen naar buizen of plaatputten voor bacteriële kolonisatie.
  7. Voeg bacteriële suspensie toe aan elke wormcultuur om de gewenste bacteriële concentratie en het uiteindelijke volume te bereiken.
  8. Als u een multi-well plaat gebruikt voor kolonisatie, bedek de plaat dan met een steriel 96-well gasdoorlatend afdichtingsmembraan.
  9. Incubeer met schudden bij 200 RPM om te voorkomen dat bacteriën zich tijdens de incubatie nestelen.

3. Mechanische verstoring van individuele wormen in een 96-well formaat

OPMERKING: Deze sectie beschrijft een 96-well plaatformaatprotocol voor mechanische verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde C. elegans. De eerste stappen in het protocol (3.1-3.8) beschrijven een methode voor het zuiveren van niet-gehechte bacteriën uit de darm van de worm en het reinigen van de buitenkant van de wormen met behulp van koude verlamming en oppervlaktebleking. Deze stappen zullen schone, levende volwassen wormen produceren die mechanisch kunnen worden verstoord voor kwantificering van bacteriële inhoud (3.8-end) of kunnen worden gebruikt voor verdere experimenten (aanvullende figuur 1). Dit protocol kan worden aangepast om bacteriën te kwantificeren in wormen gekoloniseerd in vloeibare cultuur (sectie 2), op agarplaten of uit natuurlijke of microkosmosgrond.

  1. Leg een aliquot M9TX-01 op ijs om te koelen (4-5x het aantal monsters in ml).
  2. Bereid een aliquot M9TX-01 + bleekmiddel (6% natriumhypochloriet, 1:1000 of 1:2000 v/v, 1 ml per monster + 1 ml extra) en leg op ijs om te koelen. Deze aliquot wordt gebruikt in stap 3.8.
  3. Bereid 96-well platen voor op seriële verdunning van verstoorde wormmonsters.
    1. Verkrijg steriele 300 μL capaciteit 96-well platen met deksels; dit protocol gebruikt één verdunningsplaat per 12 vergiste wormen.
    2. Gebruik een 96-well meerkanaals pipettor om rijen B-D van elke 96 putplaat (300 μL capaciteit) te vullen met 180 μL 1x PBS-buffer. Laat de bovenste rij leeg. Rijen B-D worden 10x seriële verdunningen van de wormverteerbaarheden [0,1x, 0,01x, 0,01x].
    3. Zet borden apart. Verdunningsplaten worden gebruikt in stap 3.13.
  4. Resuspendeer elk wormmonster in 1 ml M9TX-01 in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  5. Draai buizen kort (2-3 s) in een minicentrifuge met lage snelheid (2.000 x g) bij 25 °C tot pelletvolwassenen. Pipetteer het supernatant af en gooi het weg, zorg ervoor dat u de wormpellet niet verstoort.
  6. Gebruik de centrifugatie-instellingen in stap 3.5 om wormen tweemaal te spoelen met 1 ml M9TX-01 en vervolgens eenmaal met 1 ml M9-wormbuffer om externe bacteriën te verminderen.
  7. Zuiver niet-gehechte bacteriën uit de darm van de worm.
    1. Resuspendeer elk monster van wormen in 1 ml S-medium + 2x hittedode OP50 in een kweekbuis.
    2. Incubeer bij 25 °C gedurende 20-30 minuten om de doorgang van niet-gehechte bacteriën uit de darm mogelijk te maken.
      OPMERKING: Dit zal ook elk extracellulair fluorescerend eiwit uit het lumen zuiveren en een duidelijkere visualisatie mogelijk maken van gelabelde bacteriën die zich hechten aan het darmepitheel, vooral wanneer zuurvaste fluoroforen (bijv. mCherry, dsRed) worden gebruikt.
  8. Oppervlaktebleekwormen om externe bacteriën te verwijderen.
    1. Spoel gezuiverde wormen twee keer af met 1 ml koude M9TX-01 en gooi het bovennatuurlijke middel weg.
    2. Laat buizen 10 minuten afkoelen op ijs (bij voorkeur) of bij 4 °C. Dit zal wormen verlammen en de inname van bleekmiddel voorkomen.
      OPMERKING: Andere protocollen gebruiken een chemisch verlammingsmiddel zoals levamisol; dit is een gevestigde aanpak33 die de toevoeging van een gevaarlijke afvalstroom vereist.
    3. Voeg 1 ml ijskoude M9-wormbuffer + ongeparfumeerd bleekmiddel (8,25% natriumhydroxide, 1:1000 of 1:2000 v/v) toe aan elke buis. Laat buizen minstens 10 minuten op ijs zitten (bij voorkeur) of bij 4 °C om externe bacteriën te doden.
      OPMERKING: Niet hoger dan 1:1000 concentratie bleekmiddel. Zelfs bij verlamde wormen kan sterfte het gevolg zijn.
    4. Pipetteer bleekmiddelbuffer en gooi weg; breng buizen terug naar ijs om ervoor te zorgen dat wormen het pompen niet hervatten totdat bleekmiddel is opgeruimd.
    5. Voeg 1 ml koude M9TX-01 toe aan elke buis. Draai gedurende ~ 5 s in een minicentrifuge (2.000 x g bij 25 °C); retourbuizen naar ijs. Verwijder het supernatant en gooi het weg.
    6. Herhaal deze spoelstap met nog eens 1 ml koude M9TX-01, waarbij zoveel mogelijk van het supernatant wordt weggegooid.
      OPMERKING: Als u wormen gebruikt voor verdere experimenten, sla dan de permeabilisatiestap (Protocol 3.9) over en breng in plaats daarvan vers aan het oppervlak gebleekte volwassenen over naar een ijskoude buffer in een petrischaaltje van 6 cm en afzonderlijke wormen in experimentele omstandigheden zoals in Protocol 3.10. Houd wormen koud om te voorkomen dat de beweeglijkheid wordt hervat, maar werk snel - wormen > 30 minuten op ijs houden kan mogelijk resulteren in <100% hervatting van de normale activiteit34.
  9. Chemische permeabilisatie van wormschubben met natriumdodecylsulfaat en dithiothrietol (0,25% SDS + 300 mM DTT) (gebaseerd op35)
    LET OP: DTT is een reductiemiddel en irriterend. Draag PBM's en werk in een zuurkast bij het hanteren van droge voorraden of oplossingen. Een gevaarlijke afvalstroom is vereist.
    1. Bereid in de zuurkast voldoende SDS/DTT-oplossing om 100 μL voor elk monster toe te laten. Voeg voor 1 ml tot 965 μL M9-wormbuffer of M9TX-01 in een microcentrifugebuis van 1,5 ml 5 μL van 5% (w/v) SDS en 30 μL 1M DTT toe.
      OPMERKING: 1 M DTT-oplossing (waterig) moet vers worden bereid of in aliquots bij -20 °C worden bewaard om de potentie te garanderen. Aliquots moeten worden gedimensioneerd om te worden gebruikt in twee tot drie experimenten om overmatige vries-dooicycli te voorkomen.
    2. Verplaats microcentrifugebuizen met oppervlaktegebleekte wormen naar een buizenrek op kamertemperatuur. Elke buis moet wormen bevatten in ~ 20 μL buffer.
    3. Voeg 100 μL SDS/DTT-oplossing toe aan elk wormmonster. Gooi alle resterende SDS/DTT-oplossingen weg in de juiste stroom van gevaarlijk afval.
    4. Laat de behandeling tot 8 minuten op de bank doorgaan om de resistente nagelriem van de volwassen wormen gedeeltelijk af te breken. Wormen zullen gedurende deze tijd sterven en zich op de bodem van de buis nestelen.
    5. Nadat de permeabilisatietijd voorbij is, pipetteert u voorzichtig het SDS/DTT-supernatant en gooit u het in een geschikte SDS/DTT-gevaarlijke afvalstroom.
    6. Voeg 1 ml M9TX-01 toe aan elke buis. Draai kort in een tafelcentrifuge om de wormen te pelleteren of laat wormen door de zwaartekracht naar de bodem van de buizen zakken, trek vervolgens het supernatant af en gooi het in een SDS / DTT gevaarlijke afvalstroom.
    7. Resuspend wormen in 1 ml M9 wormbuffer + 0,1% Triton X-100 totdat ze klaar zijn voor gebruik.
  10. Scheid wormen in een diepe 96-well plaat met siliciumcarbide grit voor mechanische verstoring. Bereid de 96-well verstoringsplaat voor zoals hieronder.
    1. Zorg voor een steriele 2 ml deep-well 96-well plaat en een bijpassende silicium 96-well plaatafdekking.
      OPMERKING: Het is belangrijk om platen te gebruiken die compatibel zijn met de 96-well adapters voor de weefselverstoorder. Kleine verschillen in buitenafmetingen maken het verschil tussen een plaat die uit de adapters kan worden verwijderd en een die dat niet kan.
    2. Voeg met behulp van een steriele schepspatel een kleine hoeveelheid steriel 36-grit siliciumcarbide toe aan elk putje van de plaat dat een worm ontvangt. Gebruik voldoende gruis om de bodem van de put nauwelijks te bedekken (ongeveer 0,2 g per put). Overmatig materiaal maakt het moeilijk om een pipetpunt naar de bodem van de put te krijgen bij het ophalen van de inhoud.
    3. Voeg 180 μL M9-wormbuffer toe aan elk putje.
    4. Label de kolommen of rijen om aan te geven waar elk monster naartoe gaat en bedek de plaat vervolgens losjes met het silicium 96-well plaatdeksel.
  11. Breng individuele wormen over op de 96-well plaat voor verstoring.
    1. Verplaats gepermeabiliseerde wormen voorzichtig naar een kleine (35 of 60 mm) petrischaal met voldoende M9TX-01 om de schaal tot een diepte van ~ 1 cm te vullen.
      OPMERKING: Als er een groot aantal wormen aanwezig is, is het mogelijk niet haalbaar om het hele monster over te brengen, omdat de vloeistof overvol zal raken en het moeilijk zal zijn om individuele wormen te pipetteren.
    2. Pipetteer met behulp van een ontleedmicroscoop of een ander apparaat met lage vergroting individuele wormen in volumes van 20 μL en breng deze wormen over naar individuele putten van de 96-well plaat.
      OPMERKING: Het is het beste om alleen vers gedode wormen te oogsten. Vermijd wormen met een stijve lineaire vorm, omdat deze wormen mogelijk al enige tijd dood zijn. Probeer wormen te nemen die gebogen of S-vormig zijn, met een normale grove fysiologie en een intacte darm.
    3. Controleer na het overbrengen van elk volume of de geselecteerde worm daadwerkelijk in de put is uitgeworpen. Pipetteer hiervoor 20 μL M9TX-01 uit een duidelijk deel van de petrischaal en laat het volledige volume terug in de schaal; dit zal normaal gesproken de worm uitwerpen als deze aan de pipet vastzit. Als de worm vastzat, verwijdert u 20 μL uit het putje en probeert u de overdracht opnieuw.
    4. Zodra alle wormen zijn overgebracht, bedekt u de 96-wellsplaat met een vel in de handel verkrijgbare flexibele afdichtingsfolie met papieren achterkant (2 x 2 vierkanten), waarbij u ervoor zorgt dat de papierzijde van de afdichtingsfilm naar beneden is gericht op de monsterputten. Zorg ervoor dat u de afdichtingsfilm niet te dun uitrekt, anders zal het later erg moeilijk zijn om te verwijderen.
    5. Plaats de siliconen afdichtingsmat lichtjes bovenop de flexibele afdichtingsfolie; druk de afdekking op dit moment niet in de putjes.
    6. Zet de plaat op 4 °C om gedurende 30-60 minuten te koelen. Dit voorkomt oververhitting tijdens verstoring, wat de monsters kan beschadigen.
      OPMERKING: Dit is een breekpunt in het protocol. In de meeste gevallen kan de plaat tot 4 uur op 4°C worden gelaten voordat deze wordt gemalen. Laat de wormen niet 's nachts achter, omdat dit de bacterietellingen zal veranderen.
  12. Laad 96-well platen op een weefselverstoorder om wormweefsels te breken en darmbacteriën vrij te geven.
    OPMERKING: (Optioneel) Als u een oneven aantal 96-well-platen gebruikt voor digesten, is het noodzakelijk om een contragewicht te bereiden voordat u verder gaat. Gebruik een lege diepe plaat met 96 putten en vul putten met water totdat deze hetzelfde weegt als de eerste plaat.
    1. Druk de siliconen afdichtingsmat stevig in de putjes om een afdichting te creëren en zorg ervoor dat het deksel plat over het hele oppervlak van de plaat ligt.
      OPMERKING: Als de flexibele afdichtingsfilm na het uitrekken te dik is, zal het moeilijk zijn om het siliconen deksel zo vast te zetten dat het plat in alle putten ligt. Dit zal resulteren in een onvoldoende afdichting en well-to-well besmetting tijdens het schudden.
    2. Beveilig platen in de weefselverstoorder met behulp van de 96-well plaatadapters. Schud platen gedurende 1 min bij 30 Hz, draai vervolgens platen 180° en schud opnieuw gedurende 1 minuut. Dit zal helpen zorgen voor een gelijkmatige verstoring in alle putten van de plaat.
    3. Tik twee of drie keer stevig op de bank om eventuele gruis van de flexibele afdichtingsfolie los te maken.
    4. Gebruik een grote centrifuge met twee 96-wells plaatadapters om de platen gedurende 2 minuten op 2400 x g te draaien om al het materiaal naar de bodem van de putten te verzamelen.
    5. Verwijder het siliconen deksel en trek voorzichtig de flexibele afdichtingsfolie eraf.
      OPMERKING: Als de flexibele afdichtingsfilm in een van de putjes blijft plakken, gebruik dan een pipetpunt van 200 μL om deze te verwijderen. Dit komt vaak voor wanneer de flexibele afdichtingsfilm te dun is uitgerekt.
  13. Serieel verdunde wormen verteren monsters in 300 μL in 96-well platen.
    1. Gebruik een multi-well pipettor ingesteld op 200 μL, pipet op en neer meerdere keren langzaam en voorzichtig om de inhoud van de putten opnieuw te mengen en vervolgens zoveel mogelijk van de vloeistof af te trekken. Breng deze vloeistof over naar de bovenste rijen van de 96-well platen die in stap 3.3 zijn voorbereid.
    2. Gebruik een 96-well pipettor ingesteld op 20 μL, verwijder dit volume vloeistof uit de bovenste rij en doseer in rij B. Pipetteer 8-10x op en neer om te mengen. Gooi tips weg.
    3. Herhaal stap 3.13.2, uitgaande van de 0,1x monsters in rij B om 0,01x verdunningsmonsters in rij C te maken.
    4. Herhaal stap 3.13.2 nogmaals en ga van rij C naar rij D.
    5. Plaat op vaste agar voor bacteriële kwantificering. Voor mono-gekoloniseerde wormen is het over het algemeen voldoende om 10-20 μL druppels van elke verdunning [1x-0,001x] op agarplaten te plaatsen. Voor kolonisatie van meerdere soorten, plaat elke verdunning afzonderlijk door 100 μL te pipetteren op een agarplaat van 10 cm; onmiddellijk verspreiden met behulp van glasplaatkralen.

4. Reinigen van siliciumcarbide grit voor hergebruik

OPMERKING: Deze procedure wordt gebruikt om het slijpmateriaal, siliciumcarbidegruis, te reinigen en te steriliseren voor hergebruik na experimenten. Dit protocol moet in zijn geheel worden gevolgd voor het eerste gebruik, omdat siliciumcarbidegrit een industrieel product is en niet voorgesteriliseerd is. Si-carbide grit (3,2 g/cc) is een dicht, ruw materiaal dat efficiënt werkt om taaie monsters te verstoren. De deeltjes kunnen echter slijten bij herhaald gebruik en moeten worden vervangen wanneer slijtage zichtbaar wordt. Gelukkig is het materiaal goedkoop en zijn de maten die meestal worden verkocht (~ 1 lb) voldoende voor veel experimenten.

  1. Voeg na het verwijderen van monsters voor plating 10% bleekoplossing toe aan alle putten van de 96-well plaat en laat minstens 10 minuten zitten.
  2. Verwijder het grootste deel van het gruis door de 96-wellsplaat snel om te keren over een kleine hoogzijdige lade of lege P1000 pipetpuntcontainer die groot genoeg is om alle inhoud op te vangen. Het gruis zakt onmiddellijk naar de bodem van de lade. Giet de bleekoplossing in een gootsteen.
  3. Vul de 96-wells plaat opnieuw met kraanwater en keer om in dezelfde bak om het resterende gruis uit te spoelen. Giet het water af in de gootsteen.
  4. Herhaal dit nog een tot drie keer met kraanwater totdat de plaat volledig vrij is van gruis.
  5. Spoel grit 2x af in kraanwater en vul de bak elke keer.
    OPMERKING: De 96-well deep-well plaat kan worden gewassen in een laboratorium vaatwasser, veilig bedekt met folie, en autoclaved met andere herbruikbare kunststoffen. Grit hoeft niet onmiddellijk te worden gewassen en kan op dit punt opzij worden gezet. Gebruikt gruis wordt meestal verzameld uit meerdere experimenten voor het wassen en autoclaveren.
  6. Was grit in een oplossing van laboratoriumwasmiddel gedurende 30 minuten, af en toe roerend door te wervelen of te mengen met een metalen spatel.
  7. Spoel alle sporen van wasmiddel weg in verschillende (8-10) veranderingen van kraanwater en spoel vervolgens 2x af met gedestilleerd water.
  8. Verdeel gruis in een open bak, zoals een ondiepe polypropyleen autoclaafbak, en droog enkele uren bij 40-70 °C.
    OPMERKING: Als het gruis klonterig is wanneer het droog is, is het niet voldoende gereinigd of gespoeld. Herhaal het reinigingsprotocol vanaf stap 4.6 en voeg extra spoelingen toe in stap 4.7.
  9. Verdeel schoon, droog gruis in autoclaveerbare glazen flessen met schroefdeksel tot een maximale diepte van 5-6 cm. Autoclaaf op pre-vacuümcyclus gedurende 30 minuten om te steriliseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bleeksterilisatie van levende wormen
Oppervlaktegebleekte wormen zijn effectief vrij van externe bacteriën totdat de beweeglijkheid terugkeert en de uitscheiding wordt hervat. Onder de hier gebruikte omstandigheden wordt een snelle uitsterving van bacteriën in buffer waargenomen (figuur 1A-C, aanvullende figuur 2, video 1) zonder de darmgeassocieerde bacteriën in koudverlamde wormen te verstoren (figuur 1D-F, video 2). Deze gegevens geven aan dat oppervlaktebleking effectief kan worden gebruikt om wormen extern te ontsmetten zonder de darminhoud in gevaar te brengen (vergelijkingen van oppervlaktegebleekte versus niet-bleekworm-geassocieerde CFU-tellingen zijn niet significant, Wilcoxon rank-sum test p > 0,05).

Variaties op mechanische verstoring met meerdere monsters
De 96-well techniek voor mechanische verstoring van wormen is robuust voor de specifieke gebruikte materialen en praktische overwegingen bepalen de keuze van het slijpmateriaal. Net als bij een eerder rapport33 resulteerde handmatige verstoring (figuur 2A) in meer heterogeniteit dan het standaard 96-well protocol (siliciumcarbide grit, figuur 2B) (var(log10CFU) = 0,499) over alle buffercondities, vergeleken met 0,229 voor Si-carbide, 0,243 voor grote glasparels (figuur 2C) en 0,227 voor kleine glasparels (figuur 2D ). Niettemin waren de meeste verschillen in CFU/wormverdelingen niet significant (Kruskal-Wallace, p = 0,017 met df = 3; significante post-hoc Wilcoxon-tests voor grote kralen versus kleine kralen, p = 0,021, en grote kralen versus siliciumcarbidegrit, p = 0,02). Het gebruik van Triton X-100 als oppervlakteactieve stof was niet geassocieerd met een significant verschil in opbrengst wanneer het als een individuele factor werd beschouwd (Kruskal-Wallace, p = 0,94, df = 3), hoewel er een schijnbare toename van de opbrengst is in no-Triton vs. Triton-bevattende monsters wanneer grote kralen (2,7 mm) werden gebruikt (figuur 2C), mogelijk toe te schrijven aan het overmatige "schuimen" waargenomen in deze putten toen Triton aanwezig was. Deze resultaten geven aan dat grote glaskralen, hoewel ideaal voor gebruik in homogenisatiebuizen33, niet geschikt zijn voor de 96-well-techniek. Terwijl kleine glaskralen redelijke resultaten opleverden (figuur 2D), verstopten ze consequent 200 μL pipetpunten tijdens het mengen en plating. Het standaardmateriaal in deze test, siliciumcarbidegrit, is goedkoop, te groot om standaardtips te verstoppen en kunnen net als glaskralen worden gewassen en hergebruikt na autoclaveren. Het gruis geeft wel een kleine hoeveelheid "stof" af in de buffer, die de beplating niet verstoort, maar moet worden afgefilterd als de producten van verstoring moeten worden gebruikt voor flowcytometrie.

Heterogeniteit bij bacteriële kolonisatie bij volwassen wormen
Succesvolle verstoring van individuele wormen onthult heterogeniteit in bacteriële kolonisatie. Individuen uit isogene gesynchroniseerde populaties van wormen, tegelijkertijd gekoloniseerd op dezelfde pool van bacteriën, vertonen consequent een 100-voudig of groter bereik in intestinale bacteriële belasting. Dit wordt waargenomen voor verschillende bacteriële kolonisten (figuur 3A) en tijdens kolonisatie op multi-species bacteriële gemeenschappen (figuur 3B). Deze heterogeniteit is ook duidelijk in individuele wormmetingen van fluorescentie wanneer wormen worden gekoloniseerd met bacteriën die een fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen (figuur 3C-D). De eigenschappen van de gastheer spelen een rol bij het vormgeven van deze heterogeniteit, zoals te zien is door kolonisatie van wild-type Bristol N2-wormen te vergelijken met kolonisatie door dezelfde bacteriën in DAF-2 / IGF-mutanten; deze daf-16 mutant ondersteunt grotere populaties van veel bacteriën in vergelijking met N2, terwijl daf-2 resistent is tegen kolonisatie door een reeks bacteriën36 (figuur 3B,D). Deze heterogeniteit is kenmerkend en vertoont variatie tussen verschillende combinaties van gastheer en kolonist(en), met behoud van een consistente structuur over verschillende runs van hetzelfde experiment (figuur 3E-F).

Belang van individuele heterogeniteit voor een nauwkeurige vergelijking van groepen
Het belang van individuele heterogeniteit kan gemakkelijk worden gezien door te overwegen hoe batch-digests de verdeling van gegevens kunnen veranderen. Kolonisatie door inheemse microbioombacteriën MYb53 (Rhodococcus erythropolis) en MYb120 (Chryseobacteria spp.) (Figuur 3A, 4A) bij N2 worden volwassenen als voorbeeld gebruikt. De individuele wormgegevens zijn duidelijk vergelijkbaar in verdeling (tweezijdige t-test, p = 0,9, Wilcoxon rank sum, p = 0,59). Bij het opnieuw bemonsteren van deze gegevens om de effecten van batch-digesten te simuleren, trekt de batch geëxtrapoleerde CFU / worm naar de bovenste kwantielen van de gegevens vanwege de positieve scheeftrekking in deze distributies (gemiddelde > mediaan). Aangezien batching effectief gemiddelden over de individuen binnen een batch, zal batch-geëxtrapoleerde CFU / worm zich centreren rond het rekenkundig gemiddelde van de individuele gegevens, met afnemende afstand tot dit gemiddelde naarmate batches groot worden volgens de centrale limietstelling (figuur 4B-D). Dienovereenkomstig gaat het signaal van biologische variatie snel verloren; batch-afgeleide CFU / wormmetingen convergeren naar het gemiddelde, wat geen representatieve metriek is van deze log-scale-gedistribueerde gegevens. Verschillen in afgeleide kolonisatie door MYb53 versus MYb120 worden snel significant in gesimuleerde batch-digesten (t-test batch 5, p = 0,049; batch 10, p = 2,27e-4; batch 20, p = 1,19e-15; Wilcoxon rank sum test batch 5, p = 2.27e-4; partij 10, p = 2.70e-06; batch 20, p = 1.80e-09) omdat het oorspronkelijke signaal wordt verduisterd.

Effecten van individuele heterogeniteit op microbiële transmissie
Aangezien individuele wormen een aanzienlijke heterogeniteit vertonen in bacteriële kolonisatie, is het redelijk om te vragen of deze heterogeniteit stroomafwaartse effecten heeft. Het is bijvoorbeeld redelijk om te verwachten dat overdracht een functie kan zijn van intestinale bacteriële belasting. Door individuele oppervlaktegebleekte wormen over te brengen naar een schone omgeving, is het mogelijk om inenting van de omgeving met uitgescheiden levende bacteriën te observeren. In deze experimenten mochten oppervlaktegebleekte voorgekoloniseerde volwassenen, die over het algemeen aanzienlijke populaties (103-10 5 CFU / worm, figuur 5) van commensale Ochrobactrum MYb14-GFP of pathogene S. aureus-GFP droegen, gedurende 1,5 uur op hittedoden OP50-gazons op NGM-agar zwerven. Wanneer deze wormen opnieuw worden geoogst uit excretieplaten en worden verstoord voor bacteriële kwantificering, is er geen significante relatie tussen bacteriële belasting en uitscheidingssnelheid van levende bacteriën (Pearson-correlaties tussen log-getransformeerde kolonies / uur en CFU / worm: MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9) (figuur 5). Evenmin is er een significant verband tussen de aan-/afwezigheid van kolonies op een plaat en intestinale bacteriële belasting (binomiale logistische regressie met log-getransformeerde CFU/worm als factor: p = 0,15 met df = 53). Een aanzienlijk deel van de platen bleef vrij van nieuwe groei (9/18 platen voor MYb14, 10/36 platen voor S. aureus), wat wijst op lage totale excretiesnelheden.

Wanneer wormen op agarplaten mogen uitscheiden, wordt het werkelijke aantal levend uitgescheiden bacteriën per worm verstoord door "landbouw", waarbij wormen door kolonies gaan en sporen van nieuwe groei creëren (figuur 6)37. Een plaat met n kolonies vertegenwoordigt ten minste één, en hooguit n, gebeurtenissen waarbij levende kolonievormende bacteriën werden uitgescheiden. Uit deze waarneming is het niet mogelijk om te weten hoeveel uitscheidingsgebeurtenissen in (1,n) daadwerkelijk hebben plaatsgevonden, noch is het mogelijk om te weten hoeveel bacteriën bij elke gebeurtenis zijn uitgescheiden. Het is daarom niet mogelijk om de uitscheidingssnelheden van levende bacteriën uit de darm nauwkeurig te schatten met behulp van deze gegevens. Het is echter mogelijk om enkele grenzen af te leiden. Hoewel het aantal kolonies per plaat niet erg informatief is, kunnen aan- en afwezigheidsgegevens worden gebruikt voor ruwe gevolgtrekking van excretiesnelheden. Voor de eenvoud, als wordt aangenomen dat de uitscheidingssnelheid van levende bacteriën geen functie is van bacteriële belasting en dat uitscheiding een Poisson-proces is, is er een kans van ~ 50% om ten minste negen gebeurtenissen in 18 onderzoeken waar te nemen wanneer λ ≈ 0,33 worm-1 uur-1 in MYb14. Voor S. aureus worden vergelijkbare plausibele snelheden van λ ≈ 0,2 worm-1 uur-1 verkregen. Hoewel deze ruwe berekeningen wijzen op lage uitscheidingspercentages van levende bacteriën, zal een nauwkeuriger kwantificering van dit proces over grotere aantallen individuele wormen nodig zijn om betrouwbare schattingen te verkrijgen.

Beschikbaarheid van gegevens:
De hier getoonde gegevens zijn beschikbaar op Dryad (https://doi.org/10.5061/dryad.7wm37pvw2).

Figure 1
Figuur 1. Oppervlaktebleekbehandeling met lage concentratie doodt snel bacteriën in buffer, maar verstoort de darmgemeenschappen niet in koud verlamde wormen. (A-C) Bacteriële KVE/ml in M9-wormbuffer tijdens oppervlaktebleking in drie verschillende concentraties (1:1000, 1:2000, 1:5000 v/v; ongebleekte controle ter vergelijking), gericht op (A) S. aureus Newman, (B) S. enterica LT2 of (C) E. coli OP50. Monsters werden genomen op aangegeven tijdstippen tot 20 minuten na blootstelling en tweemaal gewassen met steriele buffer om te voorkomen dat bleekmiddel kolonies op platen doodt. Gegevens voor de 1:1000 conditie worden iets verschoven zodat deze gegevens zichtbaar zijn op het perceel. (D-F) Darmbacteriën in individuele N2-wormen (n = 24 wormen per experiment, twee of drie onafhankelijke runs op afzonderlijke dagen). Alle vergelijkingen van oppervlakte-gebleekte en no-bleach worm-geassocieerde CFU-tellingen zijn niet-significant (Wilcoxon rank-sum test p > 0,05). Grijze horizontale lijnen vertegenwoordigen de detectiedrempel, gedefinieerd als de dichtheid (40 CFU / worm) waarbij de kans om ten minste één kolonie te observeren ~ 60% is bij het platen van 10 μL aliquots uit 200 μL volumes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2. Het 96-well disruption protocol levert consistente resultaten op en is robuust voor de materiaalkeuze. N2 volwassen wormen gekoloniseerd met een enkele bacteriesoort gedurende 48 uur (P. mosselii) werden aan het oppervlak gebleekt en doorlaatbaar volgens standaardprotocollen, waarna individuele wormen (n = 24 per aandoening) mechanisch werden verstoord voor CFU-beplating met behulp van (A) handmatige verstoring in individuele buizen van 0,5 ml, met behulp van een gemotoriseerde stamper of (B-D) ) variaties op het 96-well disruption protocol dat in detail in het protocol wordt beschreven. Verstoring werd uitgevoerd in M9-wormbuffer met variërende concentraties Triton X-100 (x-as, 0-0,1%, v/v) en een van (B) 36-grit siliciumcarbide, (C) kleine (425-600 μm) glasparels, of (D) grote (2,7 mm) glasparels. Voor alle plots zijn de getoonde gegevens log10 (CFU / worm) en elk punt is één individuele worm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3. Heterogene bacteriële kolonisatie van de C. elegans darm. (A) Eensoortige kolonisatie van N2 volwassen hermafrodieten bereid zoals in Methoden. Bacteriën zijn vier soorten uit de MYb inheemse wormmicrobioomcollectie (Dirksen et al. 2016) (n = 24 wormen, elk één experiment) en twee pathogenen, Staphylococcus aureus MSSA Newman (SA) en Salmonella enterica LT2 (SE) (n = 96-144 wormen over twee / drie onafhankelijke experimenten). Kolonisatie door inheemse microbioomsoorten werd beoordeeld na een incubatie van 48 uur bij 25 °C in vloeibaar S-medium + 108 CFU / ml-bacteriën; kolonisatie door pathogenen werd beoordeeld na incubatie op gazons op NGM-wormagar gedurende 24 (SA) of 48 (SE) h bij 25 °C. (Na 48 uur zijn wormen op S. aureus meestal gestorven.) (B) Totale CFU/worm in N2, daf-16(mu86), en daf-2(e1370) volwassenen gekoloniseerd gedurende 4 dagen in vloeibare media op een minimaal inheems microbioom van acht soorten (gegevens van Taylor en Vega, 2021)14. (C-D) Groene fluorescentie in individuele wormen gekoloniseerd met GFP-tot expressie brengende bacteriën, waargenomen door grote object flow cytometrie. In (C) werden gesynchroniseerde populaties van N2-volwassenen gekoloniseerd met OP50 (niet-fluorescerend, n = 1908 individuele volwassen wormen), S. aureus (GFP, n = 968) of S. enterica (GFP, n = 1153) zoals beschreven in (A); de OP50-controle geeft typische niveaus van groenkanaalautofluorescentie aan bij volwassen N2-wormen van dag 3. In (D) werden gesynchroniseerde populaties van N2 (n = 1165), daf-16(mu86) (n = 1180) en daf-2(e1370) (n = 2267) volwassenen gekoloniseerd met commensaal Ochrobactrum MYb14-GFP gedurende 2 dagen op platen zoals beschreven in (A). (E-F) Dagelijkse variatie in kolonisatie door S. aureus (E) en S. enterica (F) (dezelfde gegevens als in paneel A en figuur 1, n = 48 wormen per experiment). De x-as geeft de dag van bemonstering aan. Grijze horizontale lijnen vertegenwoordigen de detectiedrempel, gedefinieerd als de dichtheid waarbij de kans om ten minste één kolonie waar te nemen ~ 60% is (40 CFU / worm voor kolonisatie van één soort en vier CFU / worm voor kolonisatie van meerdere soorten, als gevolg van verschillende platingvolumes van respectievelijk 10 μL en 100 μL van 200 μL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4. Batching wist biologische variatie in scheve logschaalgegevens. CFU/wormgegevens uit figuur 3 werden opnieuw bemonsterd met vervanging om n = 25 replicatiesets van gesimuleerde gegevens voor elke batchgrootte te maken, waarbij de grootte het aantal individuele wormen per batch is. CFU/worm is de totale CFU in elke gesimuleerde batch verdeeld over het aantal wormen per batch. In de ruwe gegevens (paneel A) is de gemiddelde KVE/worm voor MYb53 4450,8 (103,6) en voor MYb120 1398,3 (103,1); de batch-afgeleide getallen convergeren naar deze waarden naarmate de partijgrootte toeneemt (B, vijf wormen/batch; C, 10 wormen/partij; D, 20 wormen/batch), in overeenstemming met de verwachtingen van de centrale limietstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5. Uitscheiding van levende bacteriën is slecht gecorreleerd met CFU-belasting in de darm van individuele wormen. Hier werden N2-volwassenen gekoloniseerd door respectievelijk 1 of 2 dagen te voeden op gazons van S. aureus-GFP of MYb14-GFP. Wormen met detecteerbare GFP-fluorescentie (totale GFP-> 1,8 logs op grote objectstroomcytometer) werden gesorteerd uit de bulkpopulatie, aan het oppervlak gebleekt zoals beschreven in Methoden en individueel overgebracht naar NGM + warmtegedode OP50-platen. Pearson correlaties tussen log-getransformeerde kolonies/h en CFU/worm zijn niet significant (MYb14 rho = 0,19, p = 0,45; S. aureus rho = 0,02, p = 0,9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6. Bacteriële "landbouw" verdoezelt het aantal uitscheidingsgebeurtenissen op agarplaten. Hier zijn twee platen met MYb14-GFP-kolonies uit wormuitwerpselen. De eerste plaat (A) heeft duidelijk bewijs van "landbouw" langs wormpaden en lijkt ten minste twee afzonderlijke uitscheidingsgebeurtenissen te vertegenwoordigen op basis van verschillen in GFP-expressie (zichtbaar als geelachtige pigmentatie) tussen kolonies. Hoewel de tweede plaat (B) dubbelzinniger is, kan landbouw niet worden uitgesloten op basis van de posities van de koloniën. In deze experimenten werden N2 volwassen wormen gedurende 48 uur voorgekoloniseerd door zich te voeden met agarplaten met gazons van MYb14-GFP. Na kolonisatie werden wormen bereid en aan het oppervlak gebleekt volgens methoden, vervolgens overgebracht in 5 μL aliquots M9-wormbuffer + 0,1% Triton X-100 tot 6 cm NGM + hittedode OP50-platen (bereid door 50 μL-vlekken van 5x geconcentreerde hittedode OP50 op het oppervlak te laten drogen). Wormen mochten 1,5 uur rondzwerven bij 25 °C, vervolgens uit platen worden geplukt en verstoord voor CFU / wormplating (handmatige verstoring in 20 μL-buffer in individuele buizen van 0,5 ml, met behulp van een gemotoriseerde stamper). Platen werden gedurende 2 dagen geïncubeerd bij 25°C voordat ze werden geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Filmpje 1. Visualisatie van N2-wormen gekoloniseerd met GFP fluorescerende S. aureus zonder oppervlaktebleking. Een klein aantal fluorescerende cellen op de cuticula beweegt in en uit focus terwijl het beeld door het lichaam van de worm gaat, en ruimtelijk heterogene kolonisatie van de darm wordt zichtbaar als het gezichtsveld van het lichaamsoppervlak naar de darm beweegt. Z-stack opname werd genomen met 20x vergroting op een omgekeerde fluorescerende microscoop. Bright-field en GFP gefilterde fluorescerende beelden werden over elkaar gelegd en afbeeldingen over de Z-stack aan elkaar genaaid, met behulp van de software van de leverancier. Afbeelding is van dezelfde dia als in aanvullende figuur 2A. Klik hier om deze video te downloaden.

Filmpje 2. Visualisatie van een N2-worm gekoloniseerd met GFP fluorescerende S. aureus met oppervlaktebleking (1:1000 v/v gedurende 20 min). Ruimtelijk heterogene kolonisatie door fluorescerende bacteriën is zichtbaar in de darm van dit individu en bacteriën zijn geïnfiltreerd in de lichaamsweefsels, wat wijst op een geavanceerde infectie. Er zijn geen bacteriën zichtbaar op de nagelriem. Z-stack opname werd genomen met 20x vergroting op een omgekeerde fluorescerende microscoop. Bright-field en GFP gefilterde fluorescerende beelden werden over elkaar gelegd en afbeeldingen over de Z-stack aan elkaar genaaid, met behulp van de software van de leverancier. Afbeelding is van dezelfde dia als in aanvullende figuur 2B. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur 1. Overzicht van het Protocol. Hier worden gesynchroniseerde volwassen wormen mono-gekoloniseerd met rode bacteriën, aan het oppervlak gebleekt en doorlaatbaar voor mechanische verstoring van individuele wormen in een 96-well-formaat. Bacteriën die vrijkomen uit de darm worden verdunningsplaten in 10x-serie voor CFU / wormkwantificering; getoonde platen zijn typerend voor waargenomen heterogeniteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Visualisatie van N2-wormen gekoloniseerd met GFP fluorescerende S. aureus met en zonder oppervlaktebleking (1:1000 v/v gedurende 20 min). (A) In het ongebleekte monster zijn externe bacteriën bij lage vergroting zichtbaar als gebieden van groene fluorescentie die niet geassocieerd zijn met wormen of fragmenten van het wormlichaam. (B) In het aan het oppervlak gebleekte monster is GFP-fluorescentie beperkt tot het inwendige van wormlichamen (één wormlichaamfragment is zichtbaar halverwege het beeld). Alle beelden zijn gemaakt met 4x vergroting op een omgekeerde fluorescerende microscoop. Bright-field en GFP gefilterde fluorescerende beelden werden over elkaar gelegd en afbeeldingen uit aangrenzende gezichtsvelden aan elkaar genaaid, met behulp van de software van de leverancier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Buffer- en oplossingsrecepten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier worden gegevens gepresenteerd over de voordelen van single-worm kwantificering van bacteriële belasting in C. elegans, samen met een 96-well verstoringsprotocol om de snelle en consistente verwerving van grote datasets van dit type mogelijk te maken. In vergelijking met bestaande methoden33 maken deze protocollen een hogere doorvoer van intestinale microbiële gemeenschappen in de worm mogelijk.

Deze aanpak heeft plating als een snelheidsbeperkende stap en is niet echt "high-throughput". Flowcytometrie met grote objecten (figuur 3C,D) is een nuttige high-throughput methode voor het kwantificeren van fluorescerend gelabelde bacteriën in individuele wormen16, hoewel het aantal gelijktijdige fluoroforen een beperking is in gemeenschappen met meerdere soorten. Het koppelen van multi-well plaatverstoring aan community sequencing is een andere manier om de doorvoer te verhogen; de hier beschreven 96-well verstoringsprocedure is echter specifiek geoptimaliseerd om bacteriële cellen intact te laten. Sequencing-gebaseerde analyse, waarbij grondige lysis van cellen wenselijk is, vereist toevoeging van een nucleïnezuurextractiestap of wijziging van het kloppende protocol (Protocol 3.10-3.11) om celinhoud te extraheren in plaats van levende bacteriën. Protocollen voor verstoring van één worm en extractie van nucleïnezuren zijn elders gepubliceerd38,39.

Bacteriële totale abundantie in de wormdarm is heterogeen en de hier getoonde gegevens suggereren dat batchgebaseerde metingen foutieve resultaten kunnen opleveren in vergelijkingen tussen groepen. Andere metingen van bacteriële gemeenschappen in de worm kunnen echter minder gevoelig zijn voor de effecten van batching. Van belang is dat relatieve abundanties in worm-geassocieerde gemeenschappen heel weinig of helemaal niet lijken te variëren met de totale darmpopulatiegrootte, ongeacht of interacties tussen microben neutraal zijn40 of niet14. Het is aannemelijk dat, in vergelijking met telgegevens, relatieve abundantiemetingen minder gevoelig zullen zijn voor het beschreven fout-positieve percentage. Sequencing-gebaseerde gemeenschapsanalyse, die relatieve abundantiegegevens genereert voor de samenstelling van de gemeenschap, vereist daarom mogelijk geen meting van enkele wormen. Op dit punt is nader onderzoek nodig.

Hier gebruiken we koude behandeling om wormen te verlammen voor oppervlaktebleking. Ander werk heeft aangetoond dat wormen de normale activiteit snel hervatten (<15 min) als de tijd op ijs onder de 30 minuten wordt gehouden, waardoor onmiddellijk gebruik in verdere tests mogelijk is, in tegenstelling tot chemische verlammingsmiddelen die langere perioden kunnen vereisen voordat volledig herstel34. Als wormen onmiddellijk moeten worden verstoord voor bacteriële kwantificering, is deze functie overbodig en het belangrijkste voordeel van koelen versus chemische verlamming is het vermijden van de noodzaak van een gecontroleerde afvalstroom. Uitgebreide koudebehandeling moet met voorzichtigheid worden gebruikt bij het onderzoeken van stressreacties, vooral als er een bekend verband is met temperatuur. De hier beschreven koudeverlammingsprotocollen brengen een kortere acute blootstelling aan kou met zich mee dan gebruikt in experimenten voor koude stress (20-30 min versus 2+ h bij 2-4 °C)41,42,43, en een koude schok van 1 uur produceert geen duidelijk fenotype in wild-type wormen 43. Kortdurende incubatie (90 min) bij 4 °C induceert veranderingen in koude-stress genexpressie (gemeten door expressie van een TMEM-135::GFP-verslaggever), maar de expressie keert binnen enkele minuten terug naar ongespannen niveaus zodra wormen zijn teruggekeerd naar kamertemperatuur34. De effecten op stressgevoelige wormgenotypes kunnen echter ernstiger zijn dan bij wild-type. Deze procedure moet worden gevalideerd onder de te gebruiken experimentele omstandigheden.

Het hier beschreven oppervlaktebleekprotocol kan worden gebruikt als een manier om passaging van externe microben in experimenten te beperken of te elimineren. Deze methode is bovendien gebruikt om schimmelverontreinigingen te verwijderen door oppervlaktebleking en het overbrengen van alleen L1 / L2-larven naar verse platen (overdracht van oppervlaktegebleekte volwassenen resulteerde in het niet verwijderen van de verontreiniging, vermoedelijk als gevolg van vervoer in de darmen van de grotere dieren). Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de bleekconcentratie niet hoger is dan 1:1000 v / v, omdat schade aan de wormen en sterfte het gevolg zal zijn. Deze procedure kan nuttig zijn bij experimentele gastheer-microbe evolutie en gastheer-pathogeen interacties. De lage uitscheidingssnelheid van levende bacteriën die hier wordt waargenomen, kan bijvoorbeeld helpen om de zeer variabele snelheden te verklaren die worden waargenomen voor bacteriële overdracht van hermafrodieten naar nakomelingen15. Het gebrek aan correlatie tussen intestinale bacteriële belasting en excretiesnelheid die hier wordt waargenomen, is interessant, maar vereist verder onderzoek; een groter aantal gegevenspunten over een reeks omstandigheden zal nodig zijn om te bepalen waar (of of) deze waarneming zal gelden.

Het is misschien niet altijd nodig om wormen te reinigen in de mate die wordt geboden door oppervlaktebleking. Meerdere wasbeurten in steriele buffer zijn waarschijnlijk voldoende wanneer wormen intern worden gekoloniseerd met een enkele microbe als de minimaal verwachte CFU / worm veel hoger is (10-100-voudig) dan de concentratie bacteriën in buffersupernatant, omdat deze overdracht de tellingen minimaal zal beïnvloeden (zie figuur 1). Bovendien, als de microbe (en) van belang voornamelijk de cuticula koloniseren, moet oppervlaktebleking duidelijk worden vermeden. Grondige reiniging is belangrijker om nauwkeurigheid te garanderen bij het omgaan met gemengde microbiële gemeenschappen (om ervoor te zorgen dat alle kolonies / reads in een monster afkomstig zijn van worm-geassocieerde bacteriën en niet uit de omgeving), wanneer bacteriën die zich aan de cuticula hechten interfereren met het lezen van de geïnternaliseerde populatie, wanneer de verwachte minimale CFU / worm laag is, enz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs willen H. Schulenberg en C. LaRock bedanken voor hun genereuze verdeling van bacteriestammen die in deze experimenten worden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door financiering van Emory University en NSF (PHY2014173).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL Evergreen Labware 290-8350-03F
96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) Axygen AM-2ML-SQ
96-well plates, 2 mL, square wells Axygen P-2ML-SQ-C-S
96-well polypropylene plate lids Evergreen Labware 290-8020-03L
Agar Fisher Scientific 443570050
Bead mill adapter set for 96-well plates QIAGEN 119900 Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II
Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) QIAGEN 85300 Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption
BioSorter Union Biometrica By quotation Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans
Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite Clorox
Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane Diversified Biotech BEM-1 Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box.
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific AC423525000
Cholesterol VWR AAA11470-30
Citric acid monohydrate Fisher Scientific AC124910010
Copper (II) sulfate pentahydrate Fisher Scientific AC197722500
Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge Corning  COR-6765
Disodium EDTA Fisher Scientific 409971000
DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics Fisher Scientific 327190010
Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural Eppendorf
Eppendorf 5424R microcentrifuge Eppendorf 5406000640 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge
Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 Eppendorf 22627040 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates
Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 Eppendorf 22638930
Ethanol 100% Fisher Scientific BP2818500
Glass beads, 2.7 mm Life Science Products LS-79127
Glass beads, acid-washed, 425-600 µm Sigma G877-500G
Glass plating beads VWR 76005-124
Hydrochloric acid VWR BDH7204-1
Iron (II) sulfate heptahydrate Fisher Scientific 423731000
Kimble Kontes pellet pestle motor DWK Life Sciences 749540-0000
Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL DWK Life Sciences 749520-0590
Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage Leica 11889113
Leica LAS X Premium software Leica 11640687
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC124900010
Manganese(II) chloride tetrahydrate VWR 470301-706
PARAFILM M flexible laboratory sealing film Amcor PM996
Peptone Fisher Scientific BP1420-500
Petri dishes, round, 10 cm VWR 25384-094
Petri dishes, round, 6 cm VWR 25384-092
Petri dishes, square, 10 x 10 cm VWR 10799-140
Phospho-buffered saline (1X PBS) Gold Bio P-271-200
Polypropylene autoclave tray, shallow Fisher Scientific 13-361-10
Potassium hydroxide Fisher Scientific AC134062500
Potassium phosphate dibasic Fisher Scientific BP363-1
Potassium phosphate monobasic Fisher Scientific BP362-1
R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 R Foundation n/a
Scoop-type laboratory spatula, metal VWR 470149-438
Silicon carbide 36 grit MJR Tumblers n/a Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor.
Sodium dodecyl sulfate Fisher Scientific BP166-100
Sodium hydroxide VWR BDH7247-1
Sodium phosphate dibasic anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Sodum chloride Fisher Scientific BP358-1
Sucrose Fisher Scientific AC419760010
Tri-potassium citrate monohydrate Fisher Scientific AC611755000
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific AC205982500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
  2. Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
  3. VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
  4. Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
  5. Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
  6. Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
  7. Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  8. Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
  9. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  10. Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
  11. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  12. Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
  13. Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
  14. Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
  15. Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
  16. Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
  17. Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
  18. Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
  19. Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
  20. Scott, E., Holden-Dye, L., O'Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
  21. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
  22. Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
  23. Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
  24. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  25. Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
  26. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
  27. Rual, J. -F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
  28. Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans - Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
  29. Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
  30. Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
  31. Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
  32. Ching, T. -T., Hsu, A. -L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
  33. Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
  34. Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
  35. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
  36. Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), New York, N.Y. 1921 (2003).
  37. Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
  38. Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
  39. Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
  40. Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
  41. Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
  42. Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
  43. Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).

Tags

Biologie Nummer 185 Caenorhabditis elegans microbioom heterogeniteit gastheer-microbe bacteriën transmissie
Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in <em>caenorhabditis elegans-bacteriële</em> interacties te kwantificeren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S.,… More

Taylor, M. N., Spandana Boddu, S., Vega, N. M. Using Single-Worm Data to Quantify Heterogeneity in Caenorhabditis elegans-Bacterial Interactions. J. Vis. Exp. (185), e64027, doi:10.3791/64027 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter