Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Modeller af murin vaginal kolonisering af anaerob dyrkede bakterier

Published: May 25, 2022 doi: 10.3791/64032
Automatic Translation
1,2,3, 2,3, 2,3, 2,3, 4, 2,3
1Division of Biology and Biomedical Sciences, Washington University School of Medicine, 2Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, University of California, 3Glycobiology Research and Training Center, UCSD, 4Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine

Summary

Protokollen præsenterer en musemodel for vaginal kolonisering med anaerob dyrkede humane vaginale bakterier. Vi fokuserer på Gardnerella vaginalis, mens vi inkluderer forslag til Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum. Denne protokol kan også bruges som vejledning til vaginale podninger og levedygtig genopretning af andre anaerob dyrkede bakterier.

Abstract

Pattedyrets vagina kan koloniseres af mange bakterielle taxa. Det menneskelige vaginale mikrobiom domineres ofte af Lactobacillus-arter, men en ud af fire kvinder oplever bakteriel vaginose, hvor et lavt niveau af lactobaciller ledsages af en overvækst af forskellige anaerobe bakterier. Denne tilstand har været forbundet med mange sundhedsmæssige komplikationer, herunder risici for reproduktiv og seksuel sundhed. Mens der er voksende beviser, der viser den komplekse karakter af mikrobielle interaktioner i menneskers vaginale sundhed, forstås de individuelle roller af disse forskellige anaerobe bakterier ikke fuldt ud. Dette kompliceres af manglen på passende modeller til at studere anaerob dyrkede vaginale bakterier. Musemodeller giver os mulighed for at undersøge biologien og virulensen af disse organismer in vivo. Andre musemodeller af vaginal bakteriel podning er tidligere blevet beskrevet. Her beskriver vi metoder til podning af anaerob dyrkede bakterier og deres levedygtige genopretning i konventionelt opdrættede C57Bl/6-mus. En ny, mindre stressende proceduremetode til vaginal podning og vask beskrives også. Inokulation og levedygtig genopretning af Gardnerella er skitseret detaljeret, og strategier for yderligere anaerober såsom Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum diskuteres.

Introduction

Hos pattedyr er vagina hjemsted for et konsortium af bakteriearter. Det humane vaginale mikrobiom er unikt blandt pattedyr i sin overflod af medlemmer af slægten Lactobacillus og tilsvarende lav vaginal pH (3,8-4,5)1,2,3,4. Forstyrrelse af denne Lactobacillus dominans er forbundet med en række negative sundhedsmæssige resultater.

I bakteriel vaginose (BV) er der færre lactobaciller og en øget overflod af forskellige anaerobe bakterier, såsom Gardnerella vaginalis og Prevotella bivia 5,6. Kvinder med BV har øget risiko for seksuelt overførte infektioner 7,8,9, infertilitet 10, graviditetstab 11, for tidlig fødsel 12,13,14, intrauterin infektioner 15, livmoderhalsinfektioner 16 og kræft 16,17,18 . BV er også forbundet med en højere sandsynlighed for vaginal kolonisering af potentielt patogene bakterier, såsom Fusobacterium nucleatum 1,19,20, et almindeligt isolat fra fostervandsinfektioner 21.

På grund af betydningen af anaerobe bakterier i menneskers vaginale sundhed er der behov for dyremodeller, der kan bruges til at undersøge biologien og patogenesen af disse organismer. Her beskriver vi metoder til vaginal podning og levedygtig genopretning af Gardnerella vaginalis i østrogeniserede mus og foreslår yderligere strategier for Prevotella bivia og Fusobacterium nucleatum. Andre modeller af murin vaginal kolonisering er tidligere blevet beskrevet, men disse har fokuseret på podning og genopretning af fakultative anaerobe bakterier såsom gruppe B Streptococcus22 og Neisseria gonorrhoeae23 , der blev dyrket aerobt. Inokulation og genopretning af obligatoriske anaerober kan opnås med succes med passende eksperimentelle strategier. Vi diskuterer tilgange til levedygtig genopretning af flere bakterietaxa og foreslår empirisk evaluering af betingelserne for levedygtigheden af yderligere arter / stammer af interesse.

Den klassiske metode til estimering af kolonisering af levende bakterier er genopretning af kolonidannende enheder (CFU'er). I konventionelt opdrættede mus med deres egen endogene mikrobiota kræver dette genopretning på agarmedier, der vælger mod medlemmer af den endogene vaginale mikrobiota, mens den stadig tillader den inokulerede bakteriestamme at vokse. Her bruger vi et streptomycinresistent isolat af G. vaginalis24 , der selektivt kan genvindes på et streptomycinholdigt agarmedium. For at sikre, at mediet er tilstrækkeligt selektivt, og omvendt, at streptomycinresistente bakterier ikke er til stede i det endogene mikrobiom, bør vaginale skylninger indsamlet lige før podning belægges på selektiv (streptomycinholdigt) agar.

Den bedste metode til podning forberedelse kan variere mellem arter og stammer af bakterier. Før forsøg med mus påbegyndes, bør der udføres indledende arbejde for at bestemme de foretrukne betingelser for dyrkningsmediet, vækstendepunktet og tilberedning af podning samt modtageligheden for ilt og levedygtighed i PBS. I tilfælde af mere iltfølsomme bakterier kan alternative præparater af podestoffet overvejes (f.eks. i et anaerob dyrkningsmedium med en passende køretøjskontrolgruppe)25,26.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og vejledningen til pleje og brug af forsøgsdyr fra University of California San Diego (UCSD, protokolnummer: S20057, 2020-fremefter) og før det ved Washington University, St. Louis (protokol 20110149, frem til 2020).

BEMÆRK: Protokollen nedenfor anvender konventionelt opdrættede kvindelige C57Bl / mus, alder 6-11 uger på podningstidspunktet. Bemærk leverandøroplysninger og specifikke aldersgrupper, der tidligere er brugt i det relevante citerede arbejde.

1. Forberedelse og administration af β-østradiol-17-valerat

BEMÆRK: β-østradiol-17-valerat er kræftfremkaldende og reproduktionstoksin, der kan absorberes gennem huden27,28. Brug korrekt PPE under håndtering af pulver og flydende opløsning. Det er også et akvatisk toksin29; Bortskaf det korrekt i en passende forseglet og mærket beholder.

  1. Filtersteriliser op til 50 ml sesamolie gennem et 0,22 μm filter ved hjælp af et 50 ml konisk rørvakuumfiltersystem. Åbn kun i et biosikkerhedsskab for at opretholde sterilitet.
  2. Beregn mængden af β-østradiolvaleratopløsning, der er nødvendig til eksperimentet: 200 μL pr. mus plus 2-3 ml ekstra for at tage højde for prøvetab under sprøjtfyldning (f.eks. kræver et 10-museforsøg 4 ml i alt). Beregn mængden af β-østradiolvalerat, der er nødvendig for at fremstille en 5 mg / ml opløsning, og vej den direkte i et 14 ml rundbundet rør.
  3. Sæt 14 ml røret tæt og hvirvel for at bryde klumper i pulveret (dette gør det muligt for β-østradiolvaleratet at opløses hurtigere). Tilsæt sterilfiltreret sesamolie til 14 ml røret, så den endelige koncentration af β-østradiolvalerat er 5 mg / ml.
  4. Anbring det tætkappede 14 ml rør på en rotator ved 37 °C i 30-40 minutter, indtil det faste pulver er helt opløst. Bekræft visuelt opløsningens homogenitet før injektion i musene. Inkubation ved 37 °C nedsætter sesamoliens viskositet, hvilket gør det lettere at injicere.
  5. Træk β-østradiolvaleratopløsning op i en 1 ml sprøjte (uden nål). For at gøre dette uden at indføre bobler skal du først trække lidt af opløsningen op og derefter udvise forsigtigt, mens du holder spidsen af sprøjten i sesamolien. Træk opløsningen langsomt op igen, lidt forbi 100 μL-mærket.
  6. Anbring en kanyle på 25 G x 5/8 i sprøjten. Prim derefter nålen ved langsomt at skubbe sesamolieopløsningen, indtil den begynder at komme ud af nålespidsen. Fjern opløsningen, indtil sprøjten er ved 100 μL-mærket. Klargør én sprøjte pr. mus.
  7. β-estradiol-17-valeratet administreres ved intraperitoneal injektion 48 timer eller 72 timer før podning. Hver mus injiceres med 100 μL af 5 mg/ml β-østradiolvaleratopløsningen (0,5 mg β-østradiolvalerat/mus) som tidligere beskrevet22,30. Den resterende opløsning opbevares ved 4 °C i 72 timer indtil næste injektion.
  8. Administrer β-østradiolvaleratopløsningen igen på podningsdagen, umiddelbart før vaginal podning af musene. Opløsningen fjernes fra 4 °C og anbringes på en rotator ved 37 °C i 30 minutter før injektion for at lade sesamolien varme op og blive mindre tyktflydende. Fortsæt med injektionerne som beskrevet i trin 1.7.

2. Fremstilling af inokulum

BEMÆRK: Dette afsnit indeholder de generelle trin til fremstilling af inokula fra anaerob dyrket streptomycinresistent Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Alle trin i dette afsnit skal udføres i et anaerob kammer.

  1. Cyklus eventuelle reagenser, herunder tilberedt NYC III bouillon, agar og PBS, ind i et anaerob kammer for at ekvilibrere mindst 24 timer før brug.
    BEMÆRK: Her blev der anvendt et vinylanaerob kammer ekvilibreret med 5% hydrogengasblanding. Den indre iltkoncentration ligger typisk på 0 ppm, selvom der kan være transiente stigninger på lavt niveau (10-25 ppm), når materialer flyttes ind i kammeret.
  2. To dage før vaginal podning skal du stribe Gardnerella ud af en frossen glycerolbestand på en NYC III agarplade i det anaerobe kammer. Brug en lille beholder (f.eks. en tom pipettespidsboks) fyldt med tøris til at holde glycerolstammen frossen under transport ind og ud af kammeret.
  3. 1 dag før vaginal podning skal du bruge 5-10 individuelle Gardnerella-kolonier fra pladen til at inokulere 10 ml NYC III bouillon. Lad den flydende kultur vokse natten over i 16 timer ved 37 °C. Inkluder en anden 1 ml alikvote af det kulturmedium, der efterlades uinokuleret, og inkuber det sammen med den podede kultur for at bekræfte, at mediet er uforurenet.
  4. Forbered inokulumet fra flydende kultur som beskrevet nedenfor. Udfør inokulumpræparatet i det anaerobe kammer så meget som muligt.
    1. Den optiske tæthed (OD) bestemmes ved at tilsætte 200 μL kultur til 800 μL friske medier i en 1,5 ml kuvette (1:5 fortynding). Brug et spektrofotometer til at måle densiteten (OD) af den fortyndede kultur ved en bølgelængde på 600 nm (brug en separat kuvette med friske medier alene som blindprøve). Multiplicer OD-aflæsningen med 5 for at få den faktiske OD600 af 16 timers kulturen.
    2. Beregn mængden af inokulum, der er nødvendig til eksperimentet. For eksempel at inficere 15 mus med et inokulum på 20 μL pr. Mus, er der brug for 15 x 20 μL = 300 μL podning. Forbered ca. 25% mere podning end nødvendigt, så for 15 mus skal du forberede 300 μL + (0,25 x 300 μL) = 375 μL podning.
    3. Ved hjælp af OD 600 bestemt i trin 2.4.1. beregnes volumenet af den 16 timers kultur, der skal spindes ned og resuspenderes for at få et OD600 = 5,0 podemateriale i volumenet beregnet i trin 2.4.2. For eksempel, hvis kulturens OD600 er 1,5, og det nødvendige inokulumvolumen er 375 μL, er kulturvolumenet, der skal spindes ned, (375 μL x 5) / 1,5 = 1250 μL.
    4. Kulsyremængden beregnet i trin 2.4.3 afpipetteres. i et sterilt mikrocentrifugerør. Pille bakterierne ved centrifugering ved 16.000 x g i 1-3 min.
    5. Supernatanten fjernes og pellets resuspenderes i anaerob PBS i det volumen, der er beregnet i trin 2.4.2. Inokulumet vil nu være på en beregnet OD600 på 5,0. Hvis det er relevant, skal du også forberede et rør PBS til at fungere som køretøjskontrol for mus i den ikke-inficerede kontrolgruppe.
  5. Før poderøret fjernes fra det anaerobe kammer, fremstilles en seriel fortyndingsserie fra 1:10 til 1:10 x 106 i PBS. Spotplade 5 replikerer af hver fortynding på en agarplade ved hjælp af en flerkanalpipet til bestemmelse af podeudstyrets CFU. Dette er CFU før podning.

3. Vaginal præ-skylning og podning med Gardnerella

  1. Forbered vaginale skylning / vaskerør i det anaerobe kammer (dette kan gøres samtidig med podningspræparation i trin 2.4.). Pipette 70 μL steril, anaerob PBS i 1,5 ml mikrocentrifugeglas mærket med musenumre. Forbered et vaskerør pr. Mus. Luk rørene tæt og cykl dem ud af det anaerobe kammer.
  2. Der udføres vaginal skylning på hver mus med 50 μL anaerob PBS fra de enkelte reagensglas, der er fremstillet i trin 3.1. Disse vaginale skylninger er præ-podningsvaske og kan bruges til nedstrøms målinger og assays.
    1. Efter administration af den anden β-østradiolvaleratinjektion (trin 1.8) skal du placere hver mus oven på et bur eller en ren hård overflade, som den kan gribe med sine forpoter. Tag forsigtigt fat i den midterste del af halen og løft, så bagfjerdingerne er let hævede, og vaginalåbningen er blottet.
    2. Ved hjælp af en pipette og p-200 filterspids trækkes 50 μL PBS op fra vaskerøret svarende til den relevante mus. Sæt forsigtigt pipettespidsen ind i vaginallumen ~2-3 mm, og pipetter forsigtigt 50 μL volumen ind og ud, 3x-4x.
    3. Overfør det opsamlede vaskemateriale (~50 μL) tilbage i det samme vaskerør, som det kom fra, og pipetter op og ned i vaskerøret, der stadig indeholder de resterende 20 μL PBS. Hvis der er overdreven slim, og spidsen bliver tilstoppet, skal du bruge en ren p-200-spids til at samle det resterende materiale og placere det i det samme vaskerør.
  3. Vaginalt administreres 20 μL af den koncentrerede bakterieopslæmning eller køretøjskontrol i vagina på hver mus. Pod hver mus umiddelbart efter vaginal skylning for den mus (dvs. udfør skylning og podning i rækkefølge for hver mus, før du går videre til den næste). For at forenkle denne proces skal du bruge to p200-pipetter - den ene indstillet til 50 μL til skylninger og den anden til 20 μL til podninger.
    1. Fastgør musen som beskrevet i trin 3.2.1. Ved hjælp af en p-200 spids, pipette 20 μL bakteriel suspension i vagina. Til co-podningsforsøg med to forskellige bakteriearter / stammer skal du bruge 10 μL af hver bakteriel suspension og undgå at blande de to stammer før podning.
      BEMÆRK: Det samlede podningsvolumen bør ikke overstige 20 μL for at undgå spild ud af vagina.
    2. Fortsæt med at holde bagenden af hver mus op i 10-20 s for at forhindre, at det administrerede volumen straks samler sig ved vaginal introitus. Placer derefter musen i et nyt bur/beholder eller hos burkammerater, der allerede er blevet podet.
    3. Gentag trin 3.2. og trin 3.3. for hver mus. Placer aldrig mus tilbage i et bur med dyr, der endnu ikke er blevet podet. Dette forhindrer utilsigtet eksponering af mus for streptomycinresistente bakterier før podning.
  4. Når alle musene er blevet podet, skal du cykle poderøret tilbage i det anaerobe kammer. Forbered og plade endnu en seriel fortynding som beskrevet i trin 2.5. Dette er CFU efter podning. Sammenlign CFU'erne fra pladerne efter podning og præpodning for at afgøre, om podningens levedygtighed faldt, mens den var uden for det anaerobe kammer under podningen af dyrene.
  5. Plade vaginale skylninger opsamlet i trin 3.2. på selektiv agar (i dette tilfælde 1 mg/ml streptomycin). Pladerne inkuberes i 1-2 dage i et anaerob kammer ved 37 °C og undersøges for vækst.
    BEMÆRK: Vækst indikerer, at endogene medlemmer af mikrobiomet er resistente over for selektionsmarkøren og derfor kan skjule CFU-optælling af målorganismen.

4. Indsamling af vaginale skylninger for at bestemme levedygtig Gardnerella-kolonisering

  1. Saml vaginale vaske på udvalgte tidspunkter for at analysere vaginal kolonisering. Indsaml som beskrevet i trin 3.2.
  2. Umiddelbart efter opsamling cykles vaginale skylninger ind i et anaerob kammer. Der anvendes 10 μL af hver skylning til seriel fortynding og plettering på selektiv agar som beskrevet i trin 2.5. Brug CFU-tællingerne som et mål for vaginal kolonisering af Gardnerella (eller en anden anaerobe af interesse).

5. Offer, dissektion og vævshomogenisering

  1. Forbered et 5 ml rør til hvert organ, der indsamles fra hver mus (for eksempel, hvis vagina, livmoderhalsen og livmoderen alle opsamles, skal du forberede tre rør pr. Mus). Fyld hvert rør med sterilt anaerob 1x PBS (eller andre homogeniseringsmedier) i det anaerobe kammer. Brug 1 ml PBS til rør, der bruges til at opsamle vaginaer og cervices og 750 μL til rør, der bruges til at opsamle livmoderhorn.
  2. Når PBS er tilsat, vejes hvert enkelt rør (dette er vægten før opsamling og vil blive brugt til at bestemme den samlede vægt af hvert høstet væv). Hvis der ikke findes en vægt i det anaerobe kammer, skal du lukke rørene tæt og cykle dem ud af kammeret, der skal vejes, og derefter cykle dem ind igen.
    BEMÆRK: Rørforberedelse og vægtopsamling kan udføres 1 dag før ofring, men rør skal opbevares i det anaerobe kammer med hætter tæt forseglet for at forhindre fordampning.
  3. Forbered et sæt vaginale skyllerør som beskrevet i trin 3.1. at indsamle den endelige skylning ved offer. Forbered også et 50 ml bægerglas deioniseret (DI) vand og et andet 50 ml bægerglas med 70% -90% ethanol til brug til skylning og sterilisering af standard ståldissektionsinstrumenter under ofringen.
  4. Cyklus de PBS-fyldte organopsamlingsrør ud af det anaerobe kammer. Hold rørene tæt lukket, indtil vævene er klar til at blive tilsat.
  5. Ofre hver mus ved hjælp af IACUC-godkendte metoder. Udfør den endelige skylning som beskrevet i trin 3.2.2. og 3.2.3. enten umiddelbart før ofringen eller umiddelbart derefter.
  6. Begynd dissektion og vævsindsamling. Spray maven og bagsiden af hver mus ned med 70% ethanol. Steriliser saksen i et bægerglas ethanol, lad dem tørre, og lav derefter en enkelt lodret skæring af musens abdominopelvic hulrum.
  7. Brug sterile tang til at trække huden tilbage og forsigtigt skubbe tarmene ud af kropshulrummet og til siden af det åbne felt, hvilket vil udsætte reproduktionskanalen.
    BEMÆRK: Vær forsigtig med ikke at punktere eller gennembore tarmene, da de kan rumme streptomycinresistente bakterier, der kan forvirre de eksperimentelle resultater.
  8. For at samle det maksimale vaginale væv skal du bryde skambenet under obduktionen. Brug en steril saks til at klippe midten af skambenet (skamsymfysen), mens du er forsigtig med ikke at skære ind i skeden. Brug to sæt sterile tang til at tage fat i hver side af bækkenet og trække bækkenet åbent sideværts og udsætte den nederste del af vagina nedenunder.
  9. Brug tang til forsigtigt at gribe livmoderhalsen (en hårdere struktur sammenlignet med det omgivende væv). Træk forsigtigt op på livmoderhalsen for at udsætte tyktarmen, skjult bag og tæt forbundet med vagina.
  10. Brug en lille saks til at frigøre vagina fra det ydre bindevæv. Adskil forsigtigt vagina fra tyktarmen og undgå punktering af tarmkanalen. Når den er helt frigivet, flankeres vagina ved introitus med saks og klip for at frigøre fra musekroppen.
  11. Hold et blidt greb om livmoderhalsen, mens du trækker lidt op for at gøre livmoderhornene mere synlige. Med den anden hånd skæres direkte under æggestokkene på højre og venstre side for at frigøre livmoderhornene. Fjern den nu frakoblede reproduktive kanal fra kropshulrummet og læg den i en steril petriplade.
  12. Brug en barbermaskine til at adskille livmoderhornene, livmoderhalsen og vagina. Placer hvert væv i dets respektive mærkede opsamlingsrør. Hvis cytokiner skal opsamles, skal du placere rørene på is efter tilsætning af væv.
  13. Hvert glas vejes igen, når vævet er tilsat. Dette er vægten efter indsamling. Træk vægten før opsamling fra vægten efter opsamling for at få vævets samlede vægt.
  14. Brug en håndholdt homogenisator til at homogenisere organerne i deres opsamlingsrør. For Gardnerella JCP8151B skal du udføre dette trin i biosikkerhedsskabet (aerobt) eller det anaerobe kammer.
    1. Forbered flere sæt rør til vask og aseptisk behandling af den håndholdte homogenisator mellem prøverne. Sørg for, at hvert sæt har tre 50 ml koniske rør: et fyldt med DI-vand, et med 70% ethanol og det tredje med 1x PBS. Forbered et separat sæt vaskerør til hver musebehandlingsgruppe.
    2. For at rengøre homogenisatoren skal du sænke knivene ned i væsken i hvert vaskerør og dreje instrumentet til maksimal hastighed. Hold homogenisatoren i hvert af de tre rør i ca. 3 s. Rækkefølgen af vask er DI-vand (for at fjerne fysisk affald), derefter ethanol (for at desinficere) og endelig 1x PBS (for at neutralisere). Ryst sonden på et køkkenrulle eller engangsbænkpude for at fjerne overskydende væske mellem hver skylning.
    3. Efter indledende skylning homogeniseres vævene ved at sænke homogenisatorsonden til bunden af opsamlingsrøret og fange vævet nedenunder. Tænd homogenisatoren for at male vævet, bevæg forsigtigt sonden op og ned ca. 5x, mens den forbliver nedsænket. Homogeniser hvert organ i ca. 15-30 s.
    4. Når du har slukket og fjernet homogenisatoren fra røret, skal du visuelt inspicere indholdet for at sikre fuldstændig vævsforstyrrelse. Dette er især vigtigt for livmoderhalsen og vagina, som undertiden ikke bliver fanget af sonden.
      BEMÆRK: Det er okay, hvis noget overskydende fedt på livmoderhornene ikke homogeniseres fuldt ud.
    5. Trin 5.14.1.-5.14.4 gentages, idet sonden vaskes og steriliseres mellem hver prøve. Skift til et nyt sæt vaskerør til hver forsøgsgruppe.
  15. Flyt rørene med homogeniserede prøver ind i det anaerobe kammer. For at bestemme bakteriebyrden for hvert væv udføres kort, forsigtig hvirvelstrøm af prøven, der skal blandes, og derefter fjernes 100 μL vævshomogenat til seriel fortynding og plettering på selektiv agar til CFU-bestemmelse (den første fortynding er 1 x 100). Hvis der kræves en nedre detektionsgrænse, udføres spredebelægning på 200-250 μL ufortyndet homogenat.

Representative Results

En skematisk gengivelse af et eksempeleksperiment viser nogle af de måder, man kan udføre den beskrevne protokol på (figur 1).

Nogle dyr vil bære endogene mikrober i deres vaginale mikrobiomer, der vil vokse på ikke-selektive medier. De her beskrevne metoder er afhængige af streptomycinresistente isolater af de undersøgte bakteriestammer sammen med selektive medier indeholdende streptomycin for at selektere mod endogene bakterier (figur 2A, B). Det er muligt for streptomycinresistens at udvikle sig spontant, så kontrol af mus før infektion (dag 0 vask) kan hjælpe med at fastslå, om dette kan være et problem.

Genvinding af levedygtige bakterier fra vaginale vaske opnås ved seriel fortynding og plettering på agarmedier. En standard petriskål kan rumme op til en 6 x 6 array af 5 μL pletter, hvilket tillader tælling af bakterielle titere fra seks replika pletter på tværs af seks størrelsesordener for hver prøve, hvis der anvendes 10 gange serielle fortyndinger (figur 3A). Denne metode kan bruges til at opregne titere af bakterier lige fra Gardnerella til Prevotella og Fusobacterium (figur 3B-D).

Sammen giver disse metoder mulighed for at teste hypoteser og foretage fortolkninger om bakteriel kolonisering / infektion af den kvindelige reproduktive kanal. For eksempel viste en sammenligning af Gardnerella-titere i vaginale vaske og vaginale vævshomogenater overensstemmelse mellem disse metoder (figur 4A). På samme måde var titere af Prevotella i livmodervæv signifikant højere (ca. 20 gange) under Gardnerella-coinfektion sammenlignet med Prevotella monoinfektion (figur 4B) i en vaginal co-podningsmodel. Endelig kan vildtype versus mutante bakteriestammer sammenlignes i disse modeller for at fastslå de roller, som specifikke gener og deres produkter spiller i processerne for kolonisering / infektion i reproduktive kanaler. For eksempel førte en mutant stamme af Fusobacterium, der manglede evnen til at transportere og forbruge kulhydratsialinsyre, til lavere niveauer af kolonisering 3 dage efter podning (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over et eksempel på eksperiment33. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Vækst af endogene murin vaginale mikrober på selektiv versus ikke-selektiv agar. Vaginale skylninger fra fem kvindelige C57Bl/6 mus (1-5) blev stribet på to forskellige NYC III agarplader og inkuberet anaerobt. (A) Pladen til venstre indeholder ingen antibiotika og tillader vækst af endogene anaerobe bakterier fra murinskedekanalen. (B) Pladen til højre indeholder 1 mg/ml streptomycin og selekterer mod væksten af endogene bakterier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Genopretning af levedygtige G. vaginalis, P. bivia og F. nucleatum CFU'er fra vaginale vask. (A) CFU'er af G. vaginalis JCP8151B-SmR-inokulum, replika belagt som en fortyndingsserie på NYC III agar. (B-D) Genvinding af levedygtig (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 og (D) F. nucleatum26 fra vaginale skylninger af monoinficerede dyr. For hver graf (B-D) kombineres dataene fra to uafhængige eksperimenter med 10-15 mus pr. eksperiment24,25,26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Yderligere analyse af anaerob bakteriekolonisering i en murin vaginal podningsmodel. (A) G. vaginalis titere i vaginale vaske korrelerer med G. vaginalis titere genvundet fra vaginale væv homogenater ved 24 timer og 72 timer efter podning (kombination af to uafhængige forsøg, n = 10 hver. Signifikans bestemt af Spearmans rangkorrelationstest)24. (B) Samtidig infektion med G. vaginalis fører til øgede P. bivia-titere i livmoderhornvæv sammenlignet med P. bivia monoinficerede dyr 48 timer efter podning (kombination af to uafhængige forsøg, hver med 6-10 mus pr. Gruppe. Signifikans bestemt af Mann-Whitney U-test, **p = 0,0017)25. (C) F. nucleatum mutant med forstyrret sialinsyre transportør (Ω SiaT) har nedsat titere i vaginale skylninger af mono-inficerede mus sammenlignet med F. nucleatum vildtype ved 72 timer efter podning (kombination af to uafhængige forsøg, hver med 10 mus pr. gruppe. Signifikans bestemt af Mann-Whitney U-test, **p < 0,01)26. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Eksempler på metoder, der anvendes til forskellige vaginale bakterier dyrket under anaerobe forhold. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Den mest betydningsfulde måde, hvorpå modellen beskrevet her adskiller sig fra tidligere offentliggjorte vaginale podningsmodeller, er brugen af anaerob dyrkede bakterier, som kræver særlige overvejelser til fremstilling af levedygtigt podemateriale og genopretning af bakterier fra musene. Specifikke trin i protokollen ovenfor kan variere lidt afhængigt af den anvendte bakterieart/stamme, som foreslået i supplerende fil 1. Derudover beskriver dette manuskript en ny proceduremetode til administration af bakterier og vaginalvask, der kræver mindre erfaring fra efterforskerens side og mindre tilbageholdenhed for musene. Hvis eksperimentatoren ikke er fortrolig med den form for fastholdelse, der er beskrevet i trin 3.2. og trin 3.3., kan musene i stedet skrubbes som tidligere beskrevet34 med eller uden bedøvelse i henhold til de eksperimentelle design og institutionelle IACUC-retningslinjer.

En vigtig advarsel til brugen af anaerob dyrkede bakterier i murinmodeller er, at visse trin (såsom enhver involvering af levende dyr) skal udføres uden for det anaerobe kammer. Derfor er de mest kritiske trin i denne protokol dem, hvor bakterierne af interesse vil blive udsat for et aerob miljø, såsom under podning af musene. Anvendelsen af enhver ny anaerob i denne model vil kræve indledende undersøgelser af dens evne til at opretholde levedygtighed ved udsættelse for ilt (såsom sammenligning af CFU'er før og efter podning som beskrevet i trin 2.5 og trin 3.4.). Afhængigt af graden af ilt og PBS-følsomhed hos organismen bør forskellige metoder til podepræparation overvejes (supplerende fil 1, trin 2.4.5.). Ved podning med G. vaginalis JCP8151B har vi fundet ud af, at et enkelt rør podning kan fremstilles i PBS og bruges til at inficere alle musene. Hvis der anvendes en anden anaerob bakterie, der er mere følsom over for ilt, kan podningen i stedet fremstilles i separate rør til hver mus, så gentagen åbning / lukning af røret ikke er påkrævet. Ligeledes, hvis bakteriearterne af interesse er mere kræsne / mindre i stand til at overleve i PBS end G. vaginalis, kan podning i stedet fremstilles i kulturmedier. Hvis det anvendte medium indeholder reduktionsmidler, såsom CDC anaerobe-mediet, der bruges til dyrkning af Prevotella bivia (supplerende fil 1, trin 2.1. og trin 2.2.), vil bakterierne også have øget beskyttelse mod ilteksponering.

Alternative metoder til homogenisering kan også overvejes, såsom perleslag22,35, hvilket gøres med rørhætten lukket og derfor kan indføre mindre ilt end den håndholdte homogenisator. Derudover kan mere iltfølsomme organismer kræve en længere ligevægtstid for medier. En iltindikator som resazurin kan bruges til at kontrollere, at anaerobe forhold er nået (trin 2.1.). Alternative metoder såsom anaerobe krukker kan påvirke resultaterne og bør undersøges for bakteriel levedygtighed før brug.

Forsøgsorganismens iltfølsomhed og hurtighed kan også spille en rolle for en vellykket genopretning af levedygtige bakterier fra musen under skylning/homogenisering (supplerende fil 1, trin 3.2. og trin 5.1.). For meget følsomme organismer kan tiden mellem skylningen tages og belægges føre til tab af levedygtighed og forårsage et kunstigt lavt skøn over bakteriel vaginal kolonisering. For at afbøde denne effekt kan opsamlede skylninger straks fortyndes i friske anaerobe kulturmedier (med reduktionsmiddel). Tilsvarende kan organhomogenisering udføres i friske kulturmedier snarere end PBS for at øge bakteriel levedygtighed og kan også gøres i selve det anaerobe kammer for at minimere ilteksponering.

Afhængigt af formålet med et givet eksperiment skal eksperimentatoren være opmærksom på kontrolgrupper. For at teste hypoteser vil baseline-målinger af uinficerede kontrolmus, der er mock-behandlet med køretøj alene, hjælpe med at fastslå, om der er induktion af kemokiner / cytokiner eller andre specifikke resultater af infektion. Det anvendte kontrolkøretøj skal være det samme som det køretøj, der anvendes til podning, så hvis bakterierne podes i dyrkningsmedier, skal ikke-inokulerede kulturmedier anvendes som kontrol (supplerende fil 1, trin 2.4.5.).

De metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan også anvendes på fakultative bakterier, der er i stand til at vokse anaerobt, men som traditionelt studeres under anvendelse af aerobe dyrkningsbetingelser (såsom Escherichia coli eller gruppe B Streptococcus). Dette kan især være relevant for infektioner af disse organismer på kropssteder, der menes at indeholde lave niveauer af ilt, såsom livmoderhalsen. Det kan være, at en fakultativ organisme mere succesfuldt inficerer steder med mindre ilt, når inokulumet fremstilles anaerobt sammenlignet med aerobt. I et sådant eksperiment kræver genopretning af levedygtige bakterier til CFU-optælling muligvis ikke anaerobe forhold.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi anerkender Lynne Foster for teknisk assistance under udviklingen af disse modeller. Vi sætter pris på opstartsmidler fra Institut for Molekylær Mikrobiologi og Center for Women's Infectious Disease Research (til AL) og March of Dimes (Basil O'Connor-prisen til AL), som hjalp med at støtte tidlige eksperimenter. National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01 AI114635) støttede også udviklingen af disse modeller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-estradiol 17-valerate Sigma E1631 estrogenization of mice
0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter Fisher  SCGP00525 sterile filtering sesame oil
14 mL tube Falcon 352059 estrogenization of mice
190-proof ethanol Koptec  V1105M dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media
1x PBS Fisher MT21040CM vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization
25 G × 5/8 -in needle BD 305122 estrogenization of mice
5 mL tube Falcon 352063 Tissue collection and homogenization
Anaerobic chamber Coy 7200000 Growth of anaerobic bacteria
Bacto agar Fisher DF0140074 G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates
Bacto peptone Fisher DF0118170 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Columbia broth Fisher DF0944170 Columbia media for F. nucleatum growth
Defibrinated sheep blood Hemostat DSB500 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Forceps Fine Science Tools  11008-13 mouse/tissue dissection
Glucose Sigma G7528 NYCIII media for G. vaginalis growth
Handheld homogenizer ISC Bio 3305500 Tissue homogenization
Hemin Sigma 51280 CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth
HEPES Cellgro 25-060-Cl NYCIII media for G. vaginalis growth
Horse serum Hemostat SHS500 NYCIII media for G. vaginalis growth
Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) Matheson Gas for anaerobic chamber
Isofluorane VetOne 502017 mouse anaethesia at sacrifice
L-cysteine Sigma C1276 CDC anaerobic media for P. bivia growth
L-glutamate Sigma G1626 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 for making media and homogenization
NaCl Sigma S3014 NYCIII media for G. vaginalis growth
NaOH tablets Sigma S5881 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Nitrogen gas  Airgas  Gas for anaerobic chamber
p-200 filter tips ISC Bio  P-1237-200 vaginal lavages and bacterial inoculations
pancreatic digest of casein Sigma 70169 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Proteose peptone #3 Fisher DF-122-17-4 NYCIII media for G. vaginalis growth
Scissors Fine Science Tools  14084-08 mouse/tissue dissection
Sesame oil Fisher  ICN15662191 estrogenization of mice
Single edge surgical carbon steel razor blades VWR 55411-050 tissue dissection
Sodium chloride Sigma S3014 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
Streptomycin Gibco 11860038 add to agar media to make selective plates
Tuberculin slip tip 1ml syringe BD 309659 estrogenization of mice
Vitaim K3 Sigma M5625 Columbia media for F. nucleatum growth
Vitamin K1 Sigma 95271 CDC anaerobic media for P. bivia growth
Yeast extract Fisher DF0127-17-9 NYCIII media for G. vaginalis growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hillier, S. L., Krohn, M. A., Rabe, L. K., Klebanoff, S. J., Eschenbach, D. A. The normal vaginal flora, H2O2-producing lactobacilli, and bacterial vaginosis in pregnant women. Clinical Infectious Diseases. 16, Suppl 4 273-281 (1993).
  2. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Supplement_1 4680-4687 (2011).
  3. Hill, G. B., Eschenbach, D. A., Holmes, K. K. Bacteriology of the vagina. Scandinavian Journal of Urology and Nephrology. 86, 23-39 (1984).
  4. van de Wijgert, J. The vaginal microbiome and sexually transmitted infections are interlinked: Consequences for treatment and prevention. PLoS Medicine. 14 (12), 1002478 (2017).
  5. Srinivasan, S., et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria. PLoS One. 7 (6), 37818 (2012).
  6. Shipitsyna, E., et al. Composition of the vaginal microbiota in women of reproductive age-sensitive and specific molecular diagnosis of bacterial vaginosis is possible. PLoS One. 8 (4), 60670 (2013).
  7. Brotman, R. M., et al. Bacterial vaginosis assessed by gram stain and diminished colonization resistance to incident gonococcal, chlamydial, and trichomonal genital infection. The Journal of Infectious Diseases. 202 (12), 1907-1915 (2010).
  8. Peipert, J. F., et al. Bacterial vaginosis, race, and sexually transmitted infections: does race modify the association. Sexually Transmitted Diseases. 35 (4), 363-367 (2008).
  9. Wiesenfeld, H. C., Hillier, S. L., Krohn, M. A., Landers, D. V., Sweet, R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. Clinical Infectious Diseases. 36 (5), 663-668 (2003).
  10. Spandorfer, S. D., Neuer, A., Giraldo, P. C., Rosenwaks, Z., Witkin, S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. The Journal of Reproductive Medicine. 46 (9), 806-810 (2001).
  11. Ralph, S. G., Rutherford, A. J., Wilson, J. D. Influence of bacterial vaginosis on conception and miscarriage in the first trimester: cohort study. BMJ. 319 (7204), 220-223 (1999).
  12. Holst, E., Goffeng, A. R., Andersch, B. Bacterial vaginosis and vaginal microorganisms in idiopathic premature labor and association with pregnancy outcome. Journal of Clinical Microbiology. 32 (1), 176-186 (1994).
  13. DiGiulio, D. B., et al. Microbial prevalence, diversity and abundance in amniotic fluid during preterm labor: a molecular and culture-based investigation. PLoS One. 3 (8), 3056 (2008).
  14. Svare, J. A., Schmidt, H., Hansen, B. B., Lose, G. Bacterial vaginosis in a cohort of Danish pregnant women: Prevalence and relationship with preterm delivery, low birthweight and perinatal infections. British Journal of Obstetrics and Gynaecology. 113 (12), 1419-1425 (2006).
  15. Ádám, A., et al. Culture- and PCR-based detection of BV associated microbiological profile of the removed IUDs and correlation with the time period of IUD in place and the presence of the symptoms of genital tract infection. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 17 (1), 40 (2018).
  16. Di Paola, M., et al. Characterization of cervico-vaginal microbiota in women developing persistent high-risk Human Papillomavirus infection. Scientific Reports. 7 (1), 10200 (2017).
  17. Bullman, S., et al. Analysis of Fusobacterium persistence and antibiotic response in colorectal cancer. Science. 358 (6369), 1443-1448 (2017).
  18. Brennan, C. A., Garrett, W. S. Gut microbiota, inflammation, and colorectal cancer. Annual Review of Microbiology. 70, 395-411 (2016).
  19. Hill, G. B. Preterm birth: associations with genital and possibly oral microflora. Annals of Periodontology. 3 (1), 222-232 (1998).
  20. Hitti, J., et al. Vaginal indicators of amniotic fluid infection in preterm labor. Obstetrics & Gynecology. 97 (2), 211-219 (2001).
  21. DiGiulio, D. B. Diversity of microbes in amniotic fluid. Seminars in Fetal and Neonatal. 17 (1), 2-11 (2012).
  22. Patras, K. A., Doran, K. S. A murine model of Group B Streptococcus vaginal colonization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54708 (2016).
  23. Jerse, A. E., et al. Estradiol-treated female mice as surrogate hosts for Neisseria gonorrhoeae genital tract infections. Frontiers in Microbiology. 2, 107 (2011).
  24. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  25. Gilbert, N. M., et al. Gardnerella vaginalis and Prevotella bivia trigger distinct and overlapping phenotypes in a mouse model of bacterial vaginosis. The Journal of Infectious Diseases. 220 (7), 1099-1108 (2019).
  26. Agarwal, K., et al. Glycan cross-feeding supports mutualism between Fusobacterium and the vaginal microbiota. PLOS Biology. 18 (8), 3000788 (2020).
  27. Liehr, J. G. Is estradiol a genotoxic mutagenic carcinogen. Endocrine Reviews. 21 (1), 40-54 (2000).
  28. Yager, J. D., Davidson, N. E. Estrogen carcinogenesis in breast cancer. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 270-282 (2006).
  29. Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
  30. Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Journal of Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
  31. Lewis, W. G., Robinson, L. S., Gilbert, N. M., Perry, J. C., Lewis, A. L. Degradation, foraging, and depletion of mucus sialoglycans by the vagina-adapted Actinobacterium Gardnerella vaginalis. Journal of Biological Chemistry. 288 (17), 12067-12079 (2013).
  32. Robinson, L. S., et al. Genome sequences of 15 Gardnerella vaginalis strains isolated from the vaginas of women with and without bacterial vaginosis. Genome Announcements. 4 (5), 00879 (2016).
  33. Adapted from "mouse posterior turn" by BioRender.com. BioRender.com. , Available from: https://app.biorender.com/biorender-templates (2022).
  34. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  35. Verollet, R. A major step towards efficient sample preparation with bead-beating. Biotechniques. 44 (6), 832-833 (2008).

Tags

Immunologi og infektion Vagina mikrobiom mikrobiota bakterier kolonisering bakteriel vaginose Gardnerella vaginalis Prevotella bivia Fusobacterium nucleatum infektion musemodel
Modeller af murin vaginal kolonisering af anaerob dyrkede bakterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha,… More

Morrill, S. R., Agarwal, K., Saha, S., Lewis, W. G., Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria. J. Vis. Exp. (183), e64032, doi:10.3791/64032 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter