Summary
Здесь представлен протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, которые опосредуют эффективный перенос вирусных генов для использования в генной инженерии Т-клеток, включая Т-клетки для терапии CAR-T-клетками. Было показано, что каркасы трансдуцируют активированные первичные Т-клетки с трансдукцией >85%.
Abstract
Генная инженерия Т-клеток для терапии CAR-T-клетками вышла на передний план лечения рака за последние несколько лет. CAR-T-клетки продуцируются путем переноса вирусных генов в Т-клетки. Нынешний золотой стандарт переноса вирусных генов включает в себя спинокуляцию пластин с ретронектиновым покрытием, что является дорогостоящим и трудоемким. Существует значительная потребность в эффективных и экономичных методах получения CAR-T-клеток. Здесь описан метод изготовления недорогих, сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые эффективно способствуют вирусной трансдукции активированных Т-клеток. Каркасы предназначены для использования вместо золотого стандарта спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием, засеянных вирусом, и упрощают процесс преобразования клеток. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь для создания каркасов. Замороженные каркасы лиофилизируют в лиофилизаторе в течение 72 ч, чтобы завершить формирование сухих макропористых каркасов. Каркасы опосредуют перенос вирусных генов, когда вирусные и активированные Т-клетки сеются вместе поверх каркаса для производства генетически модифицированных клеток. Каркасы производят >85% первичной трансдукции Т-клеток, что сопоставимо с эффективностью трансдукции спинокуляции на пластинах, покрытых ретронектином. Эти результаты демонстрируют, что сухие макропористые альгинатные каркасы служат более дешевой и удобной альтернативой традиционному методу трансдукции.
Introduction
Иммунотерапия стала революционной парадигмой лечения рака из-за ее способности специфически нацеливаться на опухоли, ограничивать нецелевую цитотоксичность и предотвращать рецидив. В частности, клеточная терапия химерным антигенным рецептором Т (CAR-T) приобрела популярность благодаря ее успеху в лечении лимфом и лейкемий. FDA одобрило первую терапию CAR-T-клетками в 2017 году, и с тех пор одобрило еще четыре CAR-T клеточныетерапии 1,2,3,4,5. CARs имеют домен распознавания антигена, обычно состоящий из одного цепного переменного фрагмента моноклонального антитела, который является специфическим для опухолевого ассоциированного антигена 3,4. Когда CAR взаимодействует со своим опухолеассоциированным антигеном, CAR-T-клетки активируются, что приводит к противоопухолевому ответу, включающему высвобождение цитокинов, цитолитическую дегрануляцию, экспрессию фактора транскрипции и пролиферацию Т-клеток. Для производства CAR-T-клеток кровь собирается у пациента для получения их Т-клеток. CARs генетически добавляются к Т-клеткам пациента с помощью вируса. CAR-T-клетки выращивают in vitro и вводят обратно пациенту 2,3,4,6. Успешная генерация CAR-T-клеток определяется эффективностью трансдукции, которая описывает количество Т-клеток, которые генетически модифицированы в CAR-T-клетки.
В настоящее время золотым стандартом генерации CAR-T-клеток является спинокуляция активированных Т-клеток и вируса на пластинахс ретронектиновым покрытием 7,8. Трансдукция начинается, когда вирусные частицы взаимодействуют с поверхностью Т-клеток. Ретронектин способствует колокализации вируса и клеток за счет повышения эффективности связывания между вирусными частицами и клетками, усиливая трансдукцию 7,8. Ретронектин плохо работает сам по себе и должен сопровождаться спинокуляцией, которая усиливает перенос генов путем концентрации вирусных частиц и увеличения поверхностной проницаемости Т-клеток, что облегчает вирусную инфекцию8. Несмотря на успех спинокуляции на пластинах с ретронектиновым покрытием, это сложный процесс, который требует нескольких циклов вращения и дорогостоящих реагентов. Поэтому альтернативные методы переноса вирусных генов, которые являются более быстрыми и дешевыми, очень желательны.
Альгинат является природным анионным полисахаридом, широко используемым в биомедицинской промышленности из-за его низкой стоимости, хорошего профиля безопасности и способности образовывать гидрогели при смешивании с двухвалентными катионами 9,10,11,12. Альгинат является GMP-совместимым полимером и в целом признан безопасным (GRAS) FDA13. Сшивание альгината с катионами создает стабильные гидрогели, часто используемые для заживления ран, доставки небольших химических препаратов и белков и транспортировки клеток 9,10,11,12,14,15,16. Благодаря своим превосходным гелеобразующим свойствам, альгинат является предпочтительным материалом для создания пористых каркасов путем сублимационной сушки10,17. Эти характеристики альгината делают его привлекательным кандидатом для производства каркаса, который может опосредуть перенос вирусных генов активированных клеток.
Здесь описан протокол для создания сухих макропористых альгинатных каркасов, известных как каркасы Drydux, которые статически трансдуцируют Т-клетки путем переноса вирусных генов17,18. Процесс изготовления этих каркасов показан на рисунке 1. Эти каркасы устраняют необходимость в спинокуляции пластин с ретронектиновым покрытием. Макропористые альгинатные каркасы стимулируют взаимодействие вирусных частиц и Т-клеток, чтобы обеспечить эффективный перенос генов за один этап, не влияя на функциональность и жизнеспособность инженерных Т-клеток17. При правильном следовании эти макропористые альгинатные каркасы имеют эффективность трансдукции не менее 80%, упрощая и укорачивая процесс вирусной трансдукции.
Рисунок 1: Схема и временная шкала протокола. (A) Временная шкала для создания сухих макропористых альгинатных каркасов. Альгинат сшивается с кальцием-D-глюконатом и замораживается на ночь. Замороженные каркасы лиофилизируются в течение 72 ч, чтобы создать каркасы Drydux. (B) Временная шкала для вирусной трансдукции активированных клеток. Активированные клетки и вирус (MOI 2) высеивают поверх каркаса и инкубируют в полной среде, дополненной IL-7 и IL-15. Каркасы поглощают смесь и способствуют переносу вирусных генов. ЭДТА используется для растворения каркасов и изоляции трансдуцированных клеток. После двойной промывки PBS гранулу ячейки можно использовать для анализа. Сокращения: PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; PBMCs = мононуклеарные клетки периферической крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием клеток первенства человека и ретровирусных векторов были выполнены в соответствии с руководящими принципами биологической безопасности Университета штата Северная Каролина и одобрены Управлением по охране окружающей среды и технике безопасности. Мононуклеарные клетки периферической крови человека были приобретены в качестве пухлых пальто из коммерческих источников. Первичные клетки человека должны быть выделены из фракций человеческой шерсти и требуют разрешения уровня биобезопасности 2 и подробных стандартных операционных процедур и одобрения со стороны учреждения, в котором должна проводиться работа. Вирусные векторы, включая ретровирусные векторные супернатанты, используемые для трансдукции, приготовленные, какописано ранее 19, могут быть классифицированы либо как уровень биобезопасности 1, либо как уровень биобезопасности 2 в зависимости от кодированного белка и требуют одобрения соответствующего институционального комитета по биобезопасности.
1. Изготовление макропористых альгинатных каркасов
- Приготовьте запасной раствор 0,4% (вес на объем) глюконата кальция D путем добавления стерильно-фильтрованной деионизированной воды к глюконату кальция D в стакане. Перемешайте на средней скорости до растворения глюконата кальция (~1,5 ч), стерильный фильтр и храните при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости проверять рН раствора. - Приготовьте раствор 2% (массы на объем) альгината в завинчивающемся колпачке флакона или стакана. Осторожно добавьте ультрачистый альгинат в сосуд и добавьте стерильно-фильтрованную деионизированную воду в альгинат. Выберите самый большой перемешивание, который не будет препятствовать смешиванию, и добавьте его в сосуд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о типе ультрачистого альгината, используемого для этого протокола, можно найти в Таблице материалов и на веб-сайте Novamatrix20. Различные альгинаты не были исследованы для этих каркасов, так как они могут привести к нежелательным изменениям пористости и биосовместимости каркасов 9,10,11. - Перемешивайте раствор на высокой скорости до тех пор, пока альгинат не растворится (~1 ч). Если на бортах судна имеются большие скопления, наклоните судно, чтобы выбить их. Небольшие количества альгината на боках будут растворяться при перемешивании и не являются поводом для беспокойства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости проверять рН раствора. - Когда альгинат растворится, уменьшите скорость перемешивания, медленно добавьте равный объем 0,4% глюконата кальция D в раствор альгината, чтобы предотвратить образование сшивающихся сгустков, и энергично перемешайте в течение 15 минут.
- Наклоните стакан или флакон в сторону, чтобы удалить любые комочки, которые могли образоваться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать гомогенизатор. Окончательное решение должно быть оптически прозрачным. - Пипетка нужного объема раствора в каждую скважину из 48-луночной плиты или 24-луночной плиты. Используйте 300 мкл/лунку для плиты с 48 лунками и 1 мл/лунку для плиты с 24 скважинами. Отливайте медленно и часто меняйте наконечники, так как раствор будет вязким и будет прилипать к кончику.
- Накройте пластины крышками и заморозьте на ночь при -20 °C.
- Подготовьте тарелку для лиофилизатора, сняв крышку и закрепив верхнюю часть салфетками и резинками. Поместите пластины в колбы лиофилайзера объемом от 750 мл до 2000 мл и поместите на лиофилизатор на 72 ч.
- Через 72 ч снимите пластину с лиофилизатора и замените крышку. Запечатайте пластину и храните при температуре 4 °C. Для длительного хранения вакуумная герметизация пластины перед хранением при температуре 4 °C. Держите сухим до тех пор, пока это не понадобится.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте дополнительный раствор кальция-альгината из-за погрешности объема (некоторые прилипают к стенкам флакона, кончики пипетки). Например, для изготовления четырех каркасов в 24-луночной плите требуется 4 мл комбинированного раствора (2 мл альгината + 2 мл глюконата кальция D), но рекомендуется приготовить 2,5 мл 2% раствора альгината и 2,5 мл 0,4% раствора глюконата кальция D.
2. Трансдукция
- Концентрация вирусного супернатанта с помощью фильтров 100 кДа
- Гидратируйте центробежный фильтр в течение 2 мин с 1 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Отбросьте PBS.
- Концентрируют вирусную суспензию, добавляя 2 мл вирусной суспензии (1 × 106 TU/мл) и центрифугируя ее через центробежный фильтр при 1 500 × г в течение 10 мин в качающемся роторе ведра.
ПРИМЕЧАНИЕ: На каркас необходимо от одного до двухсот микролитров концентрированного вируса. - Вращайтесь в течение нескольких дополнительных минут, если объем концентрированной суспензии вируса превышает 200 мкл.
- Повторите шаги 2.1.1-2.1.3 для каждого каркаса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также допустимо концентрировать большой запас вируса и брать 100-200 мкл аликвот из концентрированного запаса.
- Семена активированных клеток и вируса вместе.
- Для каждого каркаса готовят аликвоту, суспендируя 1 × 106 активированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) в 50 мкл полной клеточной культуральной среды (250 мл среды Click + 250 мл RPMI 1640 среды + 50 мл фетальной бычьей сыворотки + 5 мл заменителя глутамина + 5 мл пенициллина/стрептомицина).
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Дополнительный файл 1 для протокола о том, как активировать BBMC. - Добавьте концентрированный вирусный супернатант (~2 × 106 TU, MOI 2) в клеточную суспензию. Общий объем клеточно-вирусной суспензии не должен превышать 200 мкл для 48-луночного каркаса или 350 мкл для 24-луночного каркаса.
- Добавьте клеточно-вирусную смесь по каплям в верхнюю часть сухого каркаса. Для экспериментов с отрицательным контролем используйте полную клеточную культуральную среду вместо концентрированного вируса. Добавьте клеточную суспензию в верхнюю часть сухого каркаса.
- Повторите шаги 2.2.1-2.2.3 для каждого каркаса.
- Инкубируют каркасы в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C в течение 45-60 мин. Снимите каркасы из инкубатора; каркасы будут полностью впитывать раствор в течение этого времени.
- Чтобы индуцировать пролиферацию, добавляйте полную среду клеточного культивирования, дополненную IL-15 (5 нг/мл) и IL-7 (10 нг/мл) в каждую лунку; Также может использоваться Ил-2. Добавьте 500 мкл к каждому 48-луночному каркасу или 1 мл к каждому 24-луночному каркасу.
- Высиживать строительные леса при температуре 37 °C в течение 72 ч. По мере пролиферации клеток среда становится оранжевой.
- Для каждого каркаса готовят аликвоту, суспендируя 1 × 106 активированных мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) в 50 мкл полной клеточной культуральной среды (250 мл среды Click + 250 мл RPMI 1640 среды + 50 мл фетальной бычьей сыворотки + 5 мл заменителя глутамина + 5 мл пенициллина/стрептомицина).
- Изолируйте клетки из каркасов для анализа.
- Разбавить от 0,5 М ЭДТА до 0,25 М ЭДТА в 1x PBS.
- Удалите лишнюю среду из каждой лунки и соберите в отдельные трубки центрифуги объемом 15 мл.
- Чтобы изолировать ячейки от каркаса, добавьте 0,25 М ЭДТА к каждому каркасу. Добавьте 300 мкл к 48-луночным лесам или 1 мл к 24-луночным лесам. Дайте тарелке постоять или осторожно перемешайте в течение 3-4 мин.
- Как только каркас в основном растворен, пипетка осторожно входит и выходит внутрь колодца. Для полного растворения каркаса может потребоваться несколько этапов пипетки. Если он не растворяется в течение 10 мин, добавляют еще 200 мкл 0,25 М ЭДТА.
- Как только каркас полностью растворится, перенесите раствор в центрифужную трубку объемом 15 мл.
- Повторите шаги 2.3.4 и 2.3.5 для каждого каркаса.
- Промыть ячейки дважды, добавив 12 мл PBS в каждую трубку центрифуги и центрифугируя при 400 × г в течение 5 мин. Ячейка гранулы будет формироваться в нижней части каждой трубки. Аспирировать надосадочную утварь и повторить стирку. Будьте осторожны, чтобы полностью аспирировать супернатант с каждой стиркой, так как крайне важно удалить все ЭДТА.
- После второй промывки PBS гранула ячейки теперь готова к анализу. Следуйте соответствующему протоколу, необходимому для анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эти макропористые альгинатные каркасы легко сделать и должны выходить из лиофилизатора в виде пористых, пушистых и белых дисков. Хотя раствор кальция-альгината не изучен в этом эксперименте, он может быть отлит в различные формы для создания каркасов различной формы, в зависимости от потребностей пользователя 9,10. Каркасы являются электростатическими и могут прилипать к крышке пластины колодца или к пальцу в перчатке. На рисунке 2 показано, как должны выглядеть строительные леса после завершения. Примерные размеры 24- и 48-луночных строительных лесов также показаны на рисунке.
Рисунок 2: Изображения сухих макропористых альгинатных каркасов. (A) Плита из 48 скважин, полная лесов. (B) Плита из 24 скважин, полная строительных лесов. (C) Сравнение 48-луночного каркаса с 24-луночным каркасом. Размеры строительных лесов также показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Пористость каркасов очень важна для успешной трансдукции, и мы ранее экспериментировали с пористостью лесов. Для получения дополнительной информации о пористости, включая изображения строительных лесов SEM, пожалуйста, обратитесь к статьям Agarwalla et. al. в ссылках17,18.
Эффективность трансдукции была проанализирована с помощью проточной цитометрии, и результаты показаны на рисунке 3. Замороженные PBMC от одного и того же донора были активированы и использовались для всех экспериментальных групп. Протокол активации НБМК можно найти в Дополнительном файле 1, а любой стандартный метод активации Т-клеток и проверки активации можно использовать 21,22,23. Активированные НБМК были посеяны либо на эшафоте с ретровирусом, кодирующим GFP, либо на каркасе без вируса, называемом «пустым» каркасом. Активированные НБМК также были посеяны на пластинах, спинокулированных ретровирусом, кодирующим ретронектин и GFP, чтобы сравнить эффективность трансдукции альгинатных каркасов с обычным методом. В качестве отрицательной контрольной группы использовались нетрансдуцированные (NT) клетки, активированные PBMCs, засеянные в непокрытых скважинах пластины с 24 скважинами. Как и ожидалось, нетрансдуцированные клетки и клетки, выделенные из пустого каркаса, не показали никакой трансдукции. Клетки, выделенные из каркаса, засеянного активированными PBMCs и ретровирусом GFP, показали сопоставимую эффективность трансдукции с пластинами, покрытыми ретронектином. Каркас имел среднюю эффективность трансдукции 85%, чуть ниже группы ретронектина. Эти результаты показывают, что эти альгинатные каркасы служат более простой и дешевой альтернативой вирусно трансдуцированным Т-клеткам без необходимости спинокуляции ретронектина.
Рисунок 3: Квантовая оценка эффективности трансдукции FACS. (A) Графики FACS, показывающие выражение GFP. Клетки были закрыты жизнеспособными клетками, синглетами FSC и положительными клетками GFP. (B) Количественная оценка GFP-позитивных клеток СУИМ. В качестве положительного контроля использовалась обычная спинокуляция пластин с ретронектиновым покрытием (фиолетовый перевернутый треугольник). В качестве отрицательных контрольных элементов использовались нетрансдуцированные клетки (синий круг) и активированные клетки, посеянные на альгинатных каркасах без вируса (красный квадрат). Каркасы, засеянные активированными клетками и ретровирусом GFP (зеленый треугольник), имели эффективность трансдукции 85%, сравнимую с ретронектином. Данные, представленные в виде среднего ± стандартного отклонения с n = 4. Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; FACS = флуоресцентно-активированная сортировка клеток; SSC-A = площадь бокового рассеяния-пика; FSC = прямой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Протокол для активации клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S1: Изображения сухих макропористых альгинатных каркасов, изготовленных при -80 °C. Замораживание строительных лесов при -80 °C приводит к менее стабильному внешнему виду и функционированию строительных лесов, чем при замораживании при -20 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CAR-T-клеточная терапия продолжает вызывать интерес как для исследований, так и для коммерческих применений. Несмотря на успех CAR-T-клеточной терапии в лечении рака крови, высокая стоимость процедуры ограничивает ее использование. Представленный здесь протокол вводит новый метод переноса вирусных генов Т-клеток без необходимости спинокуляции пластин, покрытых ретронектином. Производство сухих макропористых альгинатных каркасов для опосредования трансдукции относительно просто и является подходящей недорогой заменой традиционному методу.
Иногда внешний вид каркаса может отличаться от показанного на рисунке 2 и вместо этого может казаться прозрачным и кристаллическим, а не белым и пушистым. Это может произойти из-за непоследовательного замораживания при -20 ° C из-за повторного открытия дверцы морозильной камеры или если пластина, подлежащая замораживанию, изолирована, находясь рядом или поверх громоздких предметов в морозильной камере. Несмотря на разницу во внешнем виде, наша лаборатория не испытала никакой разницы в эффективности трансдукции с кристаллическими каркасами. Хотя в предыдущих работах по криогелированию использовались более низкие температуры замерзания24,25, мы обнаружили, что замораживание при более низких температурах приводит к менее последовательному внешнему виду и функции каркаса, чем при замораживании при -20 ° C. Изображения каркаса, созданного путем замерзания при -80 °C, можно найти на дополнительном рисунке S1. Поэтому по-прежнему рекомендуется, чтобы строительные леса были заморожены при -20 ° C с минимальными нарушениями, а пластина должна быть размещена на полке в стиле стойки, которая позволяет потоку воздуха под плитой.
Хотя эти каркасы показали отличную эффективность трансдукции, следует отметить несколько ограничений. Во-первых, необходимо соблюдать осторожность при работе с ЭДТА, которая может ограничить жизнеспособность клеток даже в небольших количествах. Следовательно, ЭДТА должна быть полностью удалена. Кроме того, размер каркаса ограничит количество жидкости, которая может быть поглощена, и, таким образом, количество клеток, которые могут быть трансдуцированы. Наконец, этот протокол не может быть использован для передачи неактивированных Т-клеток. Будущая работа будет сосредоточена на сообщении о создании каркасов, способных одновременно опосредовывать активацию и пролиферацию клеток, способствуя колокализации клеток и вирусных частиц для трансдукции и высвобождая полностью функциональные трансдуцированные клетки in vivo18.
Опубликованные исследования нашей лаборатории сообщают о фенотипическом анализе и функциональности CAR-T-клеток, полученных с использованием этих каркасов. CD19-специфические CAR-T-клетки, продуцируемые этими каркасами, сохранили эффекторный фенотип и смогли устранить cd19 + daudi клетки in vitro при совместной культивации при соотношении эффектора к цели17 1: 5. CAR-T-клетки, культивируемые совместно с клетками Daudi, также высвобождают IL-2 и IFN-γ, которые являются провоспалительными цитокинами, указывающими на то, что Т-клетки активированы. Эти результаты показывают, что эти каркасы производят высокофункциональные CAR-T-клетки in vitro. CAR-T-клетки, генерируемые этими каркасами, показали отличную противоопухолевую функцию in vivo против клеток CD19 + Daudi, помеченных люциферазой светлячка. CAR-T-клетки эффективно контролировали рост опухоли, улучшали общую выживаемость и не проявляли каких-либо существенных признаков токсичности17. Эти результаты показывают, что эти каркасы могут быть использованы для генетической модификации клеток для терапии CAR-T-клетками, не влияя на функциональность и противоопухолевую активность клеток. Будущие исследования с этими альгинатными каркасами включают оптимизацию эффективности трансдукции путем корректировки макропористости, а также концентраций альгината и кальция.
В заключение, эти макропористые альгинатные каркасы имеют сопоставимую эффективность трансдукции с ретронектином, обеспечивая альтернативный метод трансдукции клеток для терапии CAR-T-клетками. Эти каркасы также производят полностью функциональные CAR-T-клетки с противоопухолевой активностью как in vitro , так и in vivo17. Каркасы Drydux предлагают альтернативный метод, который является простым и недорогим для преобразования Т-клеток для использования в терапии CAR-T-клетками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
P.A. и Y.B. являются изобретателями патентов, связанных с использованием биоматериалов для генерации CAR-T-клеточной терапии. Y.B. получает спонсируемый промышленностью исследовательский грант, связанный с терапевтической технологией CAR-T-клеток (не связанной с этой работой). Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения через номера грантов R37-CA260223, R21CA246414. Мы благодарим ядро проточной цитометрии NCSU за обучение и руководство по анализу проточной цитометрии. Схемы были созданы с помощью Biorender.com
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575-038 | UltraPure, pH 8.0 |
| 1x DPBS | Gibco | 14190-144 | No calcium chloride or magnesium chloride |
| 3% Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies Inc | 07060 | |
| Activated Periphreal Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| Calcium-D-Gluconate | Alfa Aesar | A11649 | |
| CD28.2 Antibody | BD | 555725 | 1 mg/mL |
| CD3 Antibody | Miltenyi | 130-093-387 | 100 μg/mL |
| Click's Media | FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC MS | 9195 | |
| DI Water | - | - | |
| Glutamax | Gibco | 35-050-061 | |
| HyClone FBS | Cytvia | SH3039603 | |
| HyClone RPMI 1640 Media | Cytvia | SH3009601 | |
| Penicillin-streptomycin (P/S) | Gibco | 15-140-122 | |
| Peripheral Blood Mononuclear Cells | - | - | Fresh or frozen |
| PRONOVA UP MVG | NovaMatrix | 4200101 | Sodium alginate |
| Recombinant Human IL-15 | Peprotech | 200-15 | 5 ng/mL |
| Recombinant Human IL-7 | Peprotech | 200-07 | 10 ng/mL |
| Retrovirus | - | - | 1 x 106 TU/mL |
References
- Prinzing, B. L., Gottschalk, S. M., Krenciute, G. C. A. R. T-cell therapy for glioblastoma: ready for the next round of clinical testing. Expert Review of Anticancer Therapy. 18 (5), 451-461 (2018).
- Bagley, S. J., Desai, A. S., Linette, G. P., June, C. H., O'Rourke, D. M. CAR T-cell therapy for glioblastoma: recent clinical advances and future challenges. Neuro-oncology. 20 (11), 1429-1438 (2018).
- Nair, R., Westin, J.
- Jackson, H. J., Rafiq, S., Brentjens, R. J.
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Miliotou, A. N., Papadopoulou, L. C. CAR T-cell therapy: A new era in cancer immunotherapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19 (1), 5-18 (2018).
- Lee, H. -J., et al. Retronectin enhances lentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization. 37 (4), 203-209 (2009).
- Rajabzadeh, A., Hamidieh, A. A., Rahbarizadeh, F. Spinoculation and retronectin highly enhance the gene transduction efficiency of Mucin-1-specific chimeric antigen receptor (CAR) in human primary T cells. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 57 (2021).
- Sun, J., Tan, H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials. 6 (4), 1285-1309 (2013).
- Nayak, A. K., Mohanta, B. C., Hasnain, M. S., Hoda, M. N., Tripathi, G. Chapter 14 - Alginate-based scaffolds for drug delivery in tissue engineering. Alginates in Drug Delivery. , 359-386 (2020).
- Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
- Kuo, C. K., Ma, P. X. Ionically crosslinked alginate hydrogels as scaffolds for tissue engineering: part 1. Structure, gelation rate and mechanical properties. Biomaterials. 22 (6), 511-521 (2001).
- Soccol, C., et al.
- Moody, C. T., et al. Restoring carboxylates on highly modified alginates improves gelation, tissue retention and systemic capture. Acta Biomaterialia. 138, 208-217 (2022).
- Brudno, Y., et al. Replenishable drug depot to combat post-resection cancer recurrence. Biomaterials. 178, 373-382 (2018).
- Moody, C. T., Palvai, S., Brudno, Y. Click cross-linking improves retention and targeting of refillable alginate depots. Acta Biomaterialia. 112, 112-121 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Scaffold-mediated static transduction of T Cells for CAR-T Cell therapy. Advanced Healthcare Materials. 9 (14), 2000275 (2020).
- Agarwalla, P., et al. Bioinstructive implantable scaffolds for rapid in vivo manufacture and release of CAR-T cells. Nature Biotechnology. 40 (8), 1250-1258 (2022).
- Vera, J., et al. T lymphocytes redirected against the kappa light chain of human immunoglobulin efficiently kill mature B lymphocyte-derived malignant cells. Blood. 108 (12), 3890-3897 (2006).
- PRONOVA UP MVG. IFF Nutrition Norge AS. , Available from: https://novamatrix.biz/store/pronova-up-mvg/ (2022).
- Zappasodi, R., Budhu, S., Abu-Akeel, M., Merghoub, T. In vitro assays for effector T cell functions and activity of immunomodulatory antibodies. Methods in Enzymology. 631, 43-59 (2020).
- Kong, B. S., Lee, C., Cho, Y. M. Protocol for the assessment of human T cell activation by real-time metabolic flux analysis. STAR Protocols. 3 (1), 101084 (2022).
- Bio-Rad cell activation protocols. Bio-Rad. , Available from: https://www.bio-rad-antibodies.com/cell-activation.html?JSESSIONID_STERLING=D6E538F76818E53C29884D6CC7334F24. ecommerce2&evCntryLang=US-en&cntry= US&thirdPartyCookieEnabled=true (2022).
- Lin, H. -R., Yeh, Y. -J. Porous alginate/hydroxyapatite composite scaffolds for bone tissue engineering: Preparation, characterization, andin vitro studies. Journal of Biomedical Materials Research. 71 (1), 52-65 (2004).
- Wu, J., Zhao, Q., Sun, J., Zhou, Q. Preparation of poly(ethylene glycol) aligned porous cryogels using a unidirectional freezing technique. Soft Matter. 8 (13), 3620 (2012).
