Summary
Il presente protocollo descrive come innestare la pelle umana su topi del recettore della catena gamma (NSG) diabetici non obesi (NOD)-scid. Una descrizione dettagliata della preparazione della pelle umana per il trapianto, la preparazione di topi per il trapianto, il trapianto di pelle umana a spessore diviso e la procedura di recupero post-trapianto sono inclusi nella relazione.
Abstract
Il modello di xenotrapianto di pelle umana, in cui la pelle di un donatore umano viene trapiantata su un ospite di topo immunodeficiente, è un'opzione importante per la ricerca traslazionale in immunologia cutanea. La pelle murina e umana differiscono sostanzialmente nell'anatomia e nella composizione delle cellule immunitarie. Pertanto, i modelli murini tradizionali hanno limitazioni per la ricerca dermatologica e la scoperta di farmaci. Tuttavia, gli xenotrapianti di successo sono tecnicamente impegnativi e richiedono una preparazione ottimale del campione e del sito di innesto di topo per la sopravvivenza dell'innesto e dell'ospite. Il presente protocollo fornisce una tecnica ottimizzata per il trapianto di pelle umana sui topi e discute le considerazioni necessarie per gli obiettivi sperimentali a valle. Questo rapporto descrive la preparazione appropriata di un campione di pelle di donatore umano, l'assemblaggio di una configurazione chirurgica, la preparazione del topo e del sito chirurgico, il trapianto di pelle e il monitoraggio post-chirurgico. L'aderenza a questi metodi consente il mantenimento degli xenotrapianti per oltre 6 settimane dopo l'intervento. Le tecniche descritte di seguito consentono la massima efficienza dell'innesto grazie allo sviluppo di controlli ingegneristici, tecniche sterili e condizionamento pre e post-chirurgico. L'esecuzione appropriata del modello di xenotrapianto si traduce in campioni di innesto di pelle umana di lunga durata per la caratterizzazione sperimentale della pelle umana e test preclinici di composti in vivo.
Introduction
I modelli murini sono spesso usati per fare inferenze sulla biologia umana e sulle malattie, in parte a causa della loro riproducibilità sperimentale e della capacità di manipolazione genetica. Tuttavia, la fisiologia del topo non ricapitola completamente i sistemi di organi umani, in particolare la pelle, e quindi ha limitazioni per l'uso come modello preclinico nello sviluppo di farmaci1. Le differenze anatomiche tra la pelle del topo e quella umana includono differenze negli spessori epiteliali e nell'architettura, mancanza di ghiandole sudoripare eccrine murine e variazioni nel ciclo dei capelli2. Inoltre, sia il braccio innato che quello adattativo del sistema immunitario sono divergenti tra le due specie3. La pelle di topo contiene una popolazione immunitaria unica di cellule T epidermiche dendritiche (DETC), ha una maggiore abbondanza di cellule T γδ dermiche e varia nella localizzazione del sottogruppo di cellule immunitarie rispetto al tessuto umano4. Pertanto, i risultati sperimentali riguardanti la biologia della pelle umana e l'infiammazione beneficiano della convalida con tessuto umano. Mentre i sistemi di coltura in vitro e organoidi sono strumenti ampiamente utilizzati per studiare il tessuto umano, questi sistemi sono limitati dalla ricostituzione immunitaria assente o incompleta e dalla mancanza di connessione con la vascolarizzazione periferica5. Il modello umanizzato di trapianto di pelle di xenotrapianto mira a consentire la manipolazione terapeutica o biologica di percorsi immunitari e non immunitari nei tessuti umani in vivo.
Il modello di xenotrapianto di pelle umana è stato utilizzato per studiare la fisiologia e la farmacologia della pelle, analizzare il rigetto immunitario e le risposte, analizzare i meccanismi del cancro della pelle umana e comprendere le malattie della pelle e la guarigione delle ferite6. Sebbene applicabile a più campi della ricerca sulla pelle, il modello di xenotrapianto ha un rendimento inferiore rispetto agli studi in vitro e manca della facilità di manipolazione genetica impiegata nei modelli murini. I punti temporali all'interno di questo modello possono variare da settimane a mesi e l'innesto di successo richiede strutture e attrezzature adeguate per eseguire questi interventi chirurgici. Tuttavia, il modello di xenotrapianto fornisce un contesto biologico e fisiologico agli esperimenti, mentre i sistemi di coltura organoide, come gli espianti di tessuto, spesso richiedono la replica di una miriade di parti mobili, come i segnali esogeni, a specifici intervalli di tempo7. Pertanto, questo modello è meglio utilizzato per convalidare ulteriormente i risultati osservati in vitro e all'interno di modelli murini, o per lavori che non sono altrimenti biologicamente fattibili. L'uso appropriato del modello di xenotrapianto offre un'opportunità unica per studiare e manipolare il tessuto umano intatto in vivo.
L'ottimizzazione del modello di trapianto di pelle di xenotrapianto si è basata su decenni di ricerca per preservare l'integrità dell'innesto nel tempo. Fondamentale per questo processo è l'utilizzo del topo del recettore della catena gamma (NSG) del diabete non obeso (NOD)-scid, che manca di cellule immunitarie adattative B e T, cellule NK funzionali e ha carenze nei macrofagi e nelle cellule dendritiche8. La natura immunodeficiente di questi ospiti NSG consente il trapianto di cellule ematopoietiche umane, tumori derivati dal paziente e pelle 8,9,10. Nonostante questo ambiente ospite immunosoppressivo, è necessaria un'ulteriore soppressione delle risposte immunitarie neutrofile del topo mediante somministrazione di anti-GR1 per il successo del trapianto10. I principali ostacoli nel trapianto di tessuto intatto sono l'infezione, il rigetto e la difficoltà di ristabilire il flusso sanguigno all'innesto, che a volte porta alla perdita dell'integrità dermica ed epidermica11. Le tecniche che includono la somministrazione di anti-FR1 e l'uso di un'appropriata profondità di innesto migliorano la sopravvivenza del trapianto10. L'ottimizzazione meticolosa consente di eseguire trapianti di pelle di xenotrapianto umano su topi NSG con alti tassi di efficienza e sopravvivenza, compresi tra il 90% e il 100%.
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Protocol
Il presente studio è stato approvato ed eseguito in conformità con i protocolli UCSF IACUC (AN191105-01H) e IRB (13-11307). Campioni di pelle, scartati come parte di procedure chirurgiche elettive di routine, come la riparazione dell'ernia, sono stati utilizzati per la presente ricerca. I campioni di pelle sono de-identificati e certificati come Not Human Subjects Research o, se sono richieste informazioni clinicamente identificative per le analisi a valle, i pazienti hanno fornito il consenso scritto ai sensi del protocollo IRB 13-11307. Non sono stati utilizzati altri criteri di inclusione o esclusione. Topi NSG di entrambi i sessi, 8-10 settimane di età, sono stati impiegati nello studio. I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali).
1. Trattamento del campione di pelle umana del donatore
NOTA: Il campione di pelle umana utilizzato in questo trapianto era un grande campione raccolto dall'addome di un paziente sano. Il campione deve essere di almeno 15 cm x 7,5 cm. Le limitazioni delle dimensioni possono influenzare il numero di topi per i quali la pelle è disponibile e la scelta della dimensione dell'innesto.
- Mantenere il campione di pelle a basse temperature (su ghiaccio; 4°C) prima della preparazione e dell'innesto. Mantenere il campione umido in una tazza di raccolta del campione chiusa con la garza imbevuta di soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
NOTA: Non è consigliabile conservare il campione cutaneo a 4 °C per più di 2 giorni. Tuttavia, esistono rapporti in cui i campioni di pelle vengono conservati per un tempo più lungo12.
ATTENZIONE: Trattare tutti i tessuti umani con le precauzioni standard di rischio biologico. - Preparare a dermatomare il campione di pelle umana in un cappuccio di coltura tissutale sterilizzato a pressione negativa su un pannello di dissezione sterilizzato.
- Posizionare il campione di pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sul bordo di dissezione. Pulire l'epidermide con un tampone sterile per la preparazione dell'alcool e poi con PBS.
- Appuntare il bordo più vicino della pelle in posizione con un perno a T da 1,5 pollici (vedere la tabella dei materiali).
- Dermatoma il campione di pelle con uno spessore di 400 μm, applicando una pressione costante mentre si taglia in avanti con un angolo di 30 ° -45 °. Seguire tutte le istruzioni specifiche dello strumento e le misure di sicurezza (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Per i dettagli sulla tecnica del dermatoma, consultare un rapporto precedentemente pubblicato13. - Preparare una capsula di Petri da 100 mm x 20 mm posizionando una garza sterile imbevuta di PBS sterile sul fondo del piatto. Posizionare la pelle, con l'epidermide rivolta verso l'alto, sulla garza bagnata.
- Sigillare e coprire i bordi della piastra con una pellicola sigillante semitrasparente (vedere Tabella dei materiali) per garantire che il campione non sia contaminato. Conservare il campione a 4°C prima dell'innesto.
2. Condizionamento e preparazione pre-operatoria
- Preparare gli strumenti sterili e una stazione chirurgica sterile per l'innesto. Utilizzare asciugamani di carta autoclavati come superfici sterili per il posizionamento di strumenti e mouse.
NOTA: I topi possono essere innestati dopo lo svezzamento, ma sono preferibilmente innestati tra le 8-10 settimane di età. I topi di entrambi i sessi possono essere innestati. - Eseguire la preparazione chirurgica, come la depilazione, in un'area fisicamente separata dalla stazione chirurgica.
- Preparare l'anti-GR1 (vedere Tabella dei materiali) diluendolo a 1 mg/ml in soluzione salina sterile. Dosare ogni topo con 100 μg/100 μL della soluzione anti-GR1 per via intraperitoneale dopo l'induzione dell'anestesia.
- Anestetizzare i topi, uno alla volta, con isoflurano o altri anestetici istituzionalmente approvati.
NOTA: L'isoflurano deve essere somministrato ad una concentrazione del 3%-5% durante l'induzione. Una volta che il topo è immobile, abbassare la concentrazione di isoflurano all'1% -3% per effetto per tutta la durata dell'intervento chirurgico.- Monitorare il mouse per un'adeguata profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria, l'assenza di risposta del pizzico e la colorazione rosa appropriata delle orecchie e della bocca.
ATTENZIONE: Utilizzare macchinari anestetici appropriati e metodi di scavenging ed evitare l'esposizione a vapori di isoflurano.
- Monitorare il mouse per un'adeguata profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria, l'assenza di risposta del pizzico e la colorazione rosa appropriata delle orecchie e della bocca.
- Trasferire il mouse su una piastra elettrica o su un'altra fonte di calore (vedere Tabella dei materiali).
- Somministrare l'unguento oftalmico tamponando una piccola goccia di unguento sull'occhio con un dito guantato.
- Somministrare analgesici Buprenorfina (0,08 mg/kg) e Carprofen (5 mg/kg) (vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea pizzicando la pelle e iniettando con un angolo parallelo al corpo.
NOTA: Preparare l'analgesia pre-trattamento seguendo i protocolli istituzionali. Seguire le linee guida istituzionali per la selezione e la somministrazione di analgesici. Il metodo di analgesia utilizzato in questo studio è descritto nella fase 2.7 e nella Figura supplementare 1. - Somministrare l'anti-GR1 (preparato al punto 2.4) per via intraperitoneale sollevando leggermente il topo per la coda, esponendo l'addome e iniettando con un angolo di 30° utilizzando una siringa da insulina da 1 mL (12,7 mm).
- Utilizzare tagliatrici elettriche sicure per gli animali (vedere la tabella dei materiali) per radere le porzioni centrale e superiore del lato dorsale del mouse.
- Cancellare tutti i capelli e applicare una generosa quantità di unguento depilatorio sulla pelle rasata per 30 secondi a 1 minuto.
- Pulire completamente l'unguento per la depilazione con un tovagliolo di carta e PBS.
3. Procedura di trapianto
- Trasferire il mouse in una posizione chirurgica secondaria, lontano dalla stazione di depilazione.
- Sterilizzare il sito chirurgico con il bastoncino di tampone di iodio con un movimento circolare, iniziando dal centro e lavorando verso il bordo dell'area depilata.
- Posizionare un pezzo di pellicola sterile sopra il mouse e tagliare una finestra nella plastica leggermente più grande della dimensione dell'area da innestare.
- Tagliare una porzione rettangolare di 10 mm x 10 mm di pelle del donatore da innestare con un bisturi. Fallo tenendo saldamente la pelle del donatore in posizione con il retro della pinza e tagliando accanto alla pinza con il bisturi.
- Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare un'area rettangolare di pelle di topo corrispondente alle dimensioni del pezzo di pelle del donatore, creando un letto di innesto. Usa una pinza per allontanare la pelle dal corpo e taglia la pelle con le forbici inclinate lontano dal corpo per evitare di tagliare profondamente nella faccia.
- Posizionare il pezzo di pelle del donatore, con il lato dell'epidermide rivolto verso l'alto, sul letto di innesto preparato.
- Usando la parte posteriore della pinza, manipolare la pelle, scivolando avanti e indietro fino a quando la pelle del donatore si trova completamente piatta contro il letto di innesto.
- Aggiungere gocce di colla chirurgica adesivo per tessuti (vedi Tabella dei materiali) dove la pelle del donatore incontra la pelle del topo e tenere la pelle del topo e del donatore insieme con una pinza per 1-2 secondi in modo che la colla aderisca ai tessuti. Sigillare completamente il bordo dell'innesto e lasciare asciugare completamente la colla.
- Bendare i topi (Figura 1) seguendo i passaggi seguenti.
- Tagliare un pezzo di garza di petrolato (vedi Tabella dei materiali) abbastanza grande da coprire completamente l'area dell'innesto.
- Coprire l'innesto con la garza di petrolato e premere leggermente la garza contro la pelle usando una pinza.
- Tagliare una striscia di una pellicola trasparente medicata longitudinalmente in modo che la larghezza sia abbastanza grande da coprire la ferita del topo.
- Premere con decisione la medicazione del film trasparente, con il lato adesivo verso il basso, sulla garza. Ruota rapidamente il mouse per avvolgere completamente la medicazione attorno al busto, assicurandoti che si adatti perfettamente senza ostacolare la respirazione e che tutti gli arti siano liberi di movimento.
- Posizionare il mouse in una gabbia di recupero e monitorarlo fino a quando non è vigile e si muove. Fornire una fonte di calore su una parte della gabbia per almeno 15 minuti dopo il recupero.
NOTA: Gli animali dovrebbero riprendersi entro 1-5 minuti dopo averli messi nella gabbia di recupero.
- Ospitare singolarmente i topi dopo l'innesto.
- Somministrare l'analgesia post-chirurgica come previsto dai protocolli istituzionali.
NOTA: La buprenorfina (0,08 mg/kg) è stata somministrata per via sottocutanea 4-6 ore dopo durante il presente studio.
4. Procedure post-chirurgiche
- Iniettare 100 μL (100 μg) di anti-GR1 per via intraperitoneale a 4 giorni, 7 giorni e 11 giorni dopo l'innesto per prevenire il rigetto dell'innesto (Figura supplementare 1).
- Sostituire le bende se necessario e se rimosse dai topi.
- Bendare tutti i topi il giorno 7.
- Rimuovere le bende il giorno 14.
- Monitorare i topi per segni di rigetto del trapianto e infiammazione sistemica (perdita di peso, perdita di capelli, letargia estrema).
- Raccogliere i topi tra 3 e 6 settimane dopo l'innesto.
- Eutanasia dei topi tramite somministrazione di anidride carbonica (CO2) controllata dal regolatore seguita da dislocazione cervicale.
NOTA: Seguire le linee guida istituzionali per l'eutanasia. - Sezionare gli innesti di pelle dai topi14. Posizionare una porzione dell'innesto in formalina al 10% per 24 ore prima dell'incorporazione della paraffina e del sezionamento per la colorazione istologica9.
- Tritare gli innesti cutanei con le forbici e digerire enzimaticamente con 250 UI/ml di collagenasi IV e 0,02 mg/ml di DNasi nei terreni di coltura cellulare durante la notte. Colorare le cellule per marcatori superficiali e intracellulari seguendo la procedura precedentemente descritta14.
- Eutanasia dei topi tramite somministrazione di anidride carbonica (CO2) controllata dal regolatore seguita da dislocazione cervicale.
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Representative Results
Gli xenotrapianti di pelle umana sono stati eseguiti su topi NSG all'interno di una struttura animale super-barriera. Il successo è stato definito dalla prolungata sopravvivenza del trapianto e del topo e dalla salute comportamentale dei topi post-trapianto. La scarsa sopravvivenza durante la settimana successiva all'intervento chirurgico è stata inizialmente osservata come la più grande barriera al successo sperimentale, con fino al 50% dei topi che richiedono l'eutanasia. Il miglioramento della tecnica sterile e un migliore supporto della temperatura corporea del topo durante e immediatamente dopo l'intervento chirurgico hanno aumentato la sopravvivenza chirurgica costantemente a oltre l'80% e spesso al 90% -100% di sopravvivenza. Mentre l'aggiunta di antibiotici nell'acqua potabile del topo è stata sperimentata, non è stata determinata a migliorare i risultati ed è stata interrotta come potenziale confondente dei risultati. I topi innestati con successo dovrebbero apparire attivi e sani nei giorni successivi al trapianto. I topi si muovevano intorno alla loro gabbia, esploravano, costruivano nidi e mangiavano e bevevano come al solito. Un topo malato può sembrare pigro, non reattivo e potrebbe non mangiare o bere abbastanza per mantenere il suo peso. L'integrazione di topi letargici con opzioni di alimentazione morbida e idratazione orale può aiutare il recupero post-chirurgico.
Uno xenotrapianto che sta guarendo correttamente prima crosta e poi recupera entro circa 50 giorni dall'intervento. Gli innesti possono contrarsi nel tempo, ma rimangono aderenti attorno ai bordi in cui la pelle del donatore incontra la pelle del topo (Figura 2). Mentre la crosta dell'innesto dovrebbe diminuire, gli innesti rimarranno più spessi e più infiammati della pelle umana sana (Figura 2). Può verificarsi un'eccessiva contrazione degli innesti, riducendo il tessuto disponibile per l'analisi degli endpoint. L'utilizzo di innesti di dimensioni coerenti e il posizionamento appropriato dell'innesto dovrebbero mitigare tali problemi. Tutti gli innesti durante cinque esperimenti indipendenti sono sopravvissuti al momento del raccolto, fino a 50 giorni dopo il trapianto.
L'analisi dei tessuti può includere l'immunoistochimica e le analisi a singola cellula dopo la digestione enzimatica. Una porzione di pelle è stata trattata mediante digestione durante la notte in 250 UI/ml di collagenasi di tipo IV e 0,02 mg/ml di DNasi in terreni di coltura cellulare (vedere Tabella dei materiali) e colorata per marcatori superficiali e intracellulari come descritto in precedenza14. L'analisi mediante citometria a flusso ha rivelato la presenza sostenuta di cellule immunitarie umane nella maggior parte degli innesti, ma la conta variava tra gli xenotrapianti (Figura 3A). La Figura 3B mostra i risultati rappresentativi di un innesto riuscito (a sinistra) e uno che non è riuscito a mantenere le cellule immunitarie umane (a destra). L'analisi delle sezioni di ematossilina ed eosina (H & E) prelevate dal centro dell'innesto ha rivelato una pelle intatta e non devitalizzato, composta da derma ed epidermide umani per entrambi i punti temporali di 35 e 50 giorni (Figura 4).
Figura 1: Metodo per bendare il topo dopo l'intervento chirurgico. Il topo è avvolto strettamente in una garza di petrolato e una pellicola trasparente mentre è sotto anestesia. (A) La garza petrolata viene posta su un'area leggermente più grande della ferita chirurgica. (B) Si prepara la medicazione con pellicola trasparente: una lunga striscia viene tagliata leggermente più larga della garza di petrolato. Il supporto che copre il lato adesivo della medicazione trasparente viene parzialmente rimosso. (C) Il lato adesivo della pellicola è premuto saldamente contro il dorso del mouse, lasciando un pollice di spazio sulla parte anteriore della pellicola. (D) Il mouse è girato sul dorso. La parte anteriore sporgente del film viene premuta sul mouse e il supporto viene rimosso. (E) Il mouse è ben avvolto nella pellicola e il supporto rimanente viene rimosso mentre il mouse viene avvolto. (F) Il topo è avvolto con successo nella medicazione e le sue braccia e gambe non sono vincolate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative di animali trapiantati dal giorno 10 al giorno 21 dopo il trapianto. (A-C) Tre diversi topi con trapianti ottimali al giorno 10. (D-E) Due diversi topi con trapianti il giorno 21. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Chimerismo delle cellule immunitarie nella pelle trapiantata. Dati di citometria a flusso del recupero di cellule immunitarie umane da xenotrapianti. I dati sono controllati sugli eventi di singoletto, vivo, mouse umano CD45 + CD45-. (A) Numero di cellule (eventi CD45+ umani vivi) recuperate da due esperimenti indipendenti. (B) Grafici rappresentativi della colorazione delle cellule immunitarie CD45+ umane e di topo in un innesto riuscito (a sinistra) rispetto all'innesto con mantenimento non riuscito del compartimento immunitario umano (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Istologia della pelle umana innestata ai giorni 35 e 50. La pelle innestata è stata raccolta dai topi il giorno 35 (A) o 50 (B), conservata in formalina al 10% e incorporata in paraffina e colorata per l'ematossilina e l'eosina (H & E). (A) L'epidermide mostra iperplasia moderata (acantosi), lieve ipergranulosi e ortocheratosi compatta. Nel derma papillare, ci sono occasionali capillari dilatati e congestionati. I melanociti e il pigmento di melanina sono presenti nello strato basale dell'epidermide. Il derma è moderatamente cellulare ed è composto da fibroblasti ovali paffuti con citoplasma sinciziale pallido e linfociti sparsi. (B) L'epidermide comprende epitelio squamoso stratificato, ortocheratosi a cesto nello strato cornificato ed è di spessore normale. I melanociti e il pigmento di melanina sono presenti nello strato basale dell'epidermide. Il derma mostra fibroblasti ovali e deposizione di matrice extracellulare leggermente migliorata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Cronologia del protocollo adottato per lo studio sullo xenotrapianto. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto di topo è una tecnica chiave per sezionare meccanicamente le risposte immunitarie della pelle umana in un ambiente in vivo 14. Il successo dei trapianti di xenotrapianto cutaneo si basa su un'adeguata preparazione di topi e campioni di pelle e topi e sull'aderenza ai metodi di chirurgia asettica dei roditori15. Il raffreddamento rapido e la corretta conservazione dei campioni di pelle a basse temperature in terreni (come soluzione salina sterile) sono importanti per garantire la salute continua dei tessuti prima del trapianto12. La raccolta di campioni a spessore diviso, utilizzando uno strumento come un dermatoma, consente la coerenza nella profondità del campione tra i topi e aumenta l'apporto di nutrienti dall'ospite per migliorare la sopravvivenza dell'innesto10. Si può osservare una perdita dell'integrità del trapianto con desquamazione epidermica, in particolare negli innesti a tutto spessore con interruzione dell'afflusso di sangue16. La sopravvivenza del topo attraverso e dopo l'intervento chirurgico è aiutata dalla tecnica sterile, dalla fornitura di calore durante e dopo l'intervento chirurgico e da tecniche che riducono al minimo i tempi chirurgici, come l'utilizzo della colla chirurgica15. La somministrazione di anti-GR1 dopo il trapianto consente la soppressione delle restanti risposte immunitarie del topo nell'ospite immunodeficiente per promuovere la sopravvivenza del trapianto10. Questi metodi aumentano la probabilità di sopravvivenza del topo e del trapianto durante il modello di trapianto di xenotrapianto e migliorano i numeri sperimentali e la riproducibilità da un esperimento all'altro.
Sebbene estremamente utile, ci sono alcune limitazioni chiave al modello di trapianto di pelle di xenotrapianto, come dimostrato. In primo luogo, l'innesto esiste in un ambiente infiammatorio, molto probabilmente secondario a ischemia transitoria e infiltrazione di tessuto umano innestato con cellule mieloidi murine. Pertanto, non riflette la pelle umana in uno stato stazionario e potrebbe non riflettere pienamente tutte le malattie infiammatorie della pelle umana10,14. Studiare i disturbi infiammatori umani innestando biopsie cliniche dalla pelle lesionale è una strategia alternativa, ma le limitazioni nel numero di biopsie disponibili e il controllo incoerente della profondità dell'innesto rendono questa opzione meno favorevole. Inoltre, i trapianti di xenotrapianto non ricapitolano l'architettura immunitaria periferica umana. Ricostituire la periferia del topo con cellule umane può anche portare avvertimenti, poiché la struttura linfoide del topo NSG è atrofica prima dell'attecchimento delle cellule umane; Ciò può portare alla selezione preferenziale delle celle in alcune impostazioni10,17. Inoltre, l'attecchimento cutaneo e il recupero delle cellule immunitarie dai campioni di pelle possono variare da topo a topo, anche in assenza di trattamento. Si raccomandano almeno 10 repliche per condizione affinché questo modello osservi differenze consistenti tra i gruppi. Potrebbe essere necessario aggiustare la durata appropriata del test per la domanda sperimentale, poiché la guarigione e la rivascolarizzazione dell'innesto avvengono nelle prime settimane successive al trapianto e l'effetto degli interventi può dipendere dallo stadio dell'attecchimento.
Nonostante questi inconvenienti, il modello di trapianto di pelle di xenotrapianto umano rimane uno dei pochi test per studiare le risposte immunitarie della pelle umana nell'organo intatto in vivo. Mentre i modelli murini transgenici possono consentire la dissezione meccanicistica del percorso, le differenze nell'anatomia, nella composizione delle cellule immunitarie e nelle vie immunitarie dominanti limitano la traduzione nella malattia umana1. La coltura ex vivo di cellule di derivazione umana, i modelli di organoidi cutanei e gli studi sugli espianti di tessuti umani possono essere utilizzati in alternativa, ma sono anche soggetti a limitazioni, tra cui l'interruzione delle reti di cellule immunitarie e l'uscita di cellule immunitarie dal tessuto intatto18,19. Pertanto, i modelli di trapianto di pelle di xenotrapianto rimangono un metodo chiave per studiare i candidati terapeutici e le risposte cutanee umane all'infiammazione in un ambiente preclinico in vivo.
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Disclosures
MDR è uno dei fondatori di TRex Bio e Sitryx. MDR e MML ricevono finanziamenti per la ricerca da Sitryx, Q32 e TRex Bio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato in parte da accordi di ricerca sponsorizzati da TRex Bio e sovvenzioni dal NIH (1R01AR075864-01A1). JMM è sostenuto dalla Cancer Research Society (sovvenzione 26005). Riconosciamo il Parnassus Flow Cytometry Core supportato in parte dalle sovvenzioni NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 e S10 1S10OD018040-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
References
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