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Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/64076
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo ilustra un ensayo de transcitosis de células endoteliales in vitro como modelo para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina midiendo la capacidad de las células endoteliales microvasculares de la retina humana para transportar peroxidasa de rábano picante a través de las células en procesos de transporte transcelular mediados por caveolas.

Abstract

La disfunción de la barrera hemato-retiniana (BRB) contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, lo que a menudo resulta en edema retiniano y posterior pérdida de visión. La barrera hemato-retiniana interna (BIB) está compuesta principalmente por endotelio vascular retiniano con baja permeabilidad en condiciones fisiológicas. Esta característica de baja permeabilidad está estrechamente regulada y mantenida por bajas tasas de transporte paracelular entre células endoteliales microvasculares retinianas adyacentes, así como el transporte transcelular (transcitosis) a través de ellas. La evaluación de la permeabilidad de la barrera transcelular retiniana puede proporcionar información fundamental sobre la integridad de iBRB en la salud y la enfermedad. En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis de células endoteliales (CE), como un modelo in vitro para evaluar la permeabilidad de iBRB, utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC). Este ensayo evalúa la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina y peroxidasa de rábano picante (HRP) en procesos de transporte transcelular mediados por receptores y caveolas, respectivamente. Los HRMEC totalmente confluentes cultivados en membrana porosa se incubaron con transferrina marcada con fluorescencia (transcitosis dependiente de clatrina) o HRP (transcitosis mediada por caveolas) para medir los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior, indicativos de los niveles de transcitosis a través de la monocapa de CE. La señalización Wnt, una vía conocida que regula iBRB, se moduló para demostrar el método de ensayo de transcitosis basado en HRP mediado por caveolas. El ensayo de transcitosis EC descrito aquí puede proporcionar una herramienta útil para investigar los reguladores moleculares de la permeabilidad EC y la integridad de iBRB en patologías vasculares y para los sistemas de administración de fármacos.

Introduction

La retina humana es uno de los tejidos más exigentes de energía en el cuerpo. El buen funcionamiento de la retina neural requiere un suministro eficiente de oxígeno y nutrientes junto con un flujo restringido de otras moléculas potencialmente dañinas para proteger el ambiente retiniano, que está mediado a través de la barrera hematoretiniana (BRB)1. Similar a la barrera hematoencefálica (BBB) en el sistema nervioso central, el BRB actúa como una barrera selectiva en el ojo, regulando el movimiento de iones, agua, aminoácidos y azúcar dentro y fuera de la retina. BRB también mantiene la homeostasis retiniana y su privilegio inmunológico al prevenir la exposición a factores circulatorios como células inmunes, anticuerpos y patógenos dañinos2. La disfunción BRB contribuye a la fisiopatología de varias enfermedades oculares vasculares, como la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE), la retinopatía del prematuro (RP), la oclusión de la vena retiniana y la uveítis, lo que resulta en edema vasogénico y posterior pérdida de visión 3,4,5.

El BRB consiste en dos barreras separadas para dos redes vasculares oculares distintas, respectivamente: la vasculatura retiniana y el coriocapilar fenestrado debajo de la retina. El BRB interno (iBRB) está compuesto principalmente por células endoteliales microvasculares de la retina (RMEC) que recubren la microvasculatura retiniana, que nutre las capas neuronales internas de la retina. Por otro lado, el epitelio pigmentario de la retina forma el componente principal del BRB externo, que se encuentra entre la retina neurosensorial y el coriocapilar2. Para el iBRB, el transporte molecular a través de RMEC tiene lugar a través de rutas paracelulares y transcelulares (Figura 1). El alto grado de selectividad de sustancias a través del iBRB se basa en (i) la presencia de complejos de proteínas de unión que restringen el transporte paracelular entre células endoteliales adyacentes (CE), y (ii) bajos niveles de expresión de mediadores, transportadores y receptores de caveolas dentro de las células endoteliales que mantienen bajas tasas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Los complejos de unión que regulan el flujo paracelular están compuestos por uniones estrechas (claudinas, ocludinas), uniones adherentes (cadherinas EV) y uniones gap (conexinas), que permiten el paso de agua y pequeños compuestos solubles en agua. Mientras que las moléculas lipofílicas pequeñas se difunden pasivamente a través del interior de los RMEC, el movimiento de moléculas lipofílicas e hidrófilas más grandes está regulado por vías transendoteliales impulsadas por ATP, incluyendo el transporte vesicular y los transportadores de membrana 5,9.

La transcitosis vesicular se puede clasificar como transcitosis caveolina mediada por caveolina, transcitosis dependiente de clatrina (y mediada por receptores) y macropinocitosis independiente de clatrina (Figura 2). Estos procesos de transporte vesicular involucran vesículas de diferentes tamaños, siendo los macropinosomas los más grandes (que van desde 200-500 nm) y las caveolas las más pequeñas (con un promedio de 50-100 nm), mientras que las vesículas recubiertas de clatrina varían de 70-150 nm10. Las caveolas son invaginaciones de membrana plasmática ricas en lípidos en forma de matraz con una capa de proteína, compuesta principalmente de caveolina-1 que se une al colesterol de la membrana lipídica y otras proteínas estructurales y de señalización a través de su dominio de andamiaje de caveolina11. Las caveolinas trabajan junto con cavina unida periféricamente para promover la estabilización de las caveolas en la membrana plasmática12. Las membranas caveolares también pueden transportar receptores para otras moléculas como insulina, albúmina y lipoproteínas circulantes, incluidas las lipoproteínas de alta densidad (HDL) y las lipoproteínas de baja densidad (LDL) para ayudar a su movimiento a través de las células endoteliales13. Durante el desarrollo, la formación de BRB funcional depende de la supresión de la transcitosis EC8. El endotelio retiniano maduro, por lo tanto, tiene niveles relativamente bajos de caveolas, caveolina-1 y receptores de albúmina con respecto a otras células endoteliales en condiciones fisiológicas, contribuyendo a sus propiedades de barrera 4,9.

Debido a que la descomposición de iBRB es un sello distintivo importante de muchas afecciones oculares patológicas, es esencial desarrollar métodos para evaluar la permeabilidad vascular retiniana in vivo e in vitro. Estos métodos ayudan a proporcionar información probable sobre los mecanismos de la integridad del BRB comprometida y evaluar la eficacia de los posibles objetivos terapéuticos. Las imágenes in vivo actuales o los ensayos cuantitativos de fuga vascular suelen emplear fluorescentes (fluoresceína de sodio y dextrano), colorimétricos (colorante azul de Evans y sustrato de peroxidasa de rábano picante [HRP]) o trazadores radiactivos14 para detectar extravasación de la vasculatura a los tejidos retinianos circundantes con imágenes de microscopio o en lisado tisular aislado. Un trazador ideal para cuantificar la integridad vascular debe ser inerte y lo suficientemente grande como para penetrar libremente los vasos comprometidos mientras están confinados dentro de capilares sanos e intactos. Los métodos que emplean fluoresceína de sodio o dextrano conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) en angiografía con fluoresceína de fondo de ojo vivo (FFA) o montajes planos retinianos aislados se utilizan ampliamente para cuantificar la extravasación retiniana in vivo o ex vivo. FITC-dextrano tiene la ventaja de estar disponible en diferentes pesos moleculares que van desde 4-70 kDa para estudios selectivos de tamaño15,16,17. La FITC-albúmina (~68 kDa) es un trazador alternativo de proteínas de gran tamaño de relevancia biológica para estudios de fugas vasculares18. El colorante Evans Blue, inyectado intracárdicamente19, retroorbitalmente, o a través de la vena de la cola 20, también se basa en su unión con albúmina endógena para formar una molécula grande que puede cuantificarse principalmente mediante detección espectrofotométrica o, menos comúnmente, microscopía de fluorescencia en montajes planos20,21. Sin embargo, estas metodologías cuantitativas o de imágenes de luz a menudo no distinguen el transporte paracelular del transporte transendotelial. Para el análisis específico de la transcitosis con visualización ultraestructural de vesículas transcitadas, se utilizan típicamente moléculas trazadoras como HRP para localizar vesículas transcitadas dentro de las células endoteliales que se pueden observar bajo un microscopio electrónico22,23,24 (Figura 3A-C).

El desarrollo y uso de modelos iBRB in vitro para evaluar la permeabilidad de las células endoteliales podría proporcionar una evaluación robusta y de alto rendimiento para complementar los experimentos in vivo y ayudar a la investigación de reguladores moleculares de la fuga vascular. Los ensayos comúnmente utilizados para evaluar el transporte paracelular y la integridad de las uniones estrechas incluyen la resistencia eléctrica transendotelial (TEER), una medida de conductancia iónica (Figura 4)2,25, y el ensayo de fuga vascular in vitro utilizando trazadores fluorescentes de peso molecular pequeño26. Además, se han utilizado ensayos de transcitosis basados en transferrina que modelan la BHE para explorar la transcitosis dependiente de clatrina27. A pesar de esto, los ensayos para evaluar BRB y, más específicamente, la transcitosis caveolar retiniana EC in vitro son limitados.

En este estudio, describimos un ensayo de transcitosis EC utilizando células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) como modelo in vitro para determinar la permeabilidad iBRB y la transcitosis EC. Este ensayo se basa en la capacidad de los HRMEC para transportar transferrina o HRP a través de las vías de transcitosis mediadas por receptores o dependientes de caveolas, respectivamente (Figura 2). Los HRMEC cultivados a confluencia completa en la cámara apical (es decir, inserto de filtro) se incubaron con transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) o HRP para medir la intensidad de fluorescencia correspondiente a los niveles de transferrina o HRP transferidos a la cámara inferior a través de la transcitosis EC únicamente. La confluencia de la monocapa celular puede confirmarse midiendo TEER, indicando la integridad de la unión estrecha25. Para demostrar la técnica de ensayo TEER y transcitosis, se utilizaron moduladores moleculares conocidos de la permeabilidad vascular y la transcitosis CE, incluyendo el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)28 y los de señalización Wnt (ligandos Wnt: Wnt3a y Norrin)29.

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Protocol

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Boston Children's Hospital para la generación de microscopía óptica e imágenes EM (Figura 3). Los protocolos para los estudios in vivo pueden obtenerse de Wang et al.24. Todos los experimentos con células endoteliales microvasculares de la retina humana (HRMEC) fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Boston Children's Hospital.

1. Preparación de reactivos

  1. Solución para recubrir la placa de cultivo de tejidos: Prepare una solución de gelatina al 0,1% disolviendo 1 ml de solución madre de gelatina (40%-50%) en 500 ml de cultivo de tejido estéril grado 1x PBS (pH = 7.4). Filtrar la solución a través de un filtro de 0,22 μm. Conservar la solución de gelatina al 0,1% a 2-8°C. Se puede almacenar a dicha temperatura por un tiempo indefinido en condiciones estériles.
  2. Medio de crecimiento: Prepare 500 ml de medio completo de crecimiento celular endotelial (EGM) disolviendo los suplementos de EGM en el medio basal de crecimiento celular endotelial (EBM) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Medio de cultivo alícuota en tubos de 50 ml y conservar los tubos a 4 °C. La vida útil del medio de cultivo es de 12 meses a 4 °C.
  3. Solución de tripsina: Para una solución de tripsina-EDTA al 0,25%, alícuota del vial madre en tubos de 50 ml y conservar a 4 °C (hasta 2 semanas) o -20 °C (hasta 24 meses).

2. Cultivo de HRMECs

  1. Cultivo celular inicial
    1. Cubra las placas de Petri de cultivo celular (100 mm de diámetro x 20 mm de altura) con 5 ml de solución de gelatina al 0,1% bajo una campana de flujo laminar y manténgalas intactas en la campana durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT) para un recubrimiento uniforme.
      NOTA: El recubrimiento de gelatina de los platos mejora la unión celular. Alternativamente, también se pueden utilizar matraces de cultivo T75 recubiertos de gelatina.
    2. Antes de sembrar las células, aspire la solución de gelatina con una bomba de vacío. La presión de vacío del aspirador utilizado fue de hasta 724 mmHg.
      NOTA: La aspiración debe hacerse inmediatamente antes de sembrar las células para evitar que se seque la solución de recubrimiento.
    3. Descongele un vial congelado de HRMEC (del almacenamiento en nitrógeno líquido) utilizando un baño de agua a 37 °C o añadiendo un medio de crecimiento caliente en el vial. Una vez descongelado, transfiera la suspensión celular a 9 ml de medio de crecimiento (suponiendo que el vial descongelado de HRMEC es de 1 ml).
      NOTA: Los HRMEC se obtuvieron comercialmente (Tabla de materiales). El medio de crecimiento añadido a las células siempre debe precalentarse a 37 °C antes de su uso.
    4. Gire las células a 200 x g durante 5 minutos a RT y aspire cuidadosamente el sobrenadante para evitar extraer el pellet celular.
    5. Resuspender el pellet celular en 10 ml de medio de crecimiento y transferir la suspensión resultante a una placa de Petri recubierta de gelatina. Mantener las células en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Por lo general, los HRMEC son 70% -80% confluentes después de 72 h.
      NOTA: El medio de crecimiento cambia cada dos días.
  2. Subcultivo de HRMECs en insertos de membrana permeable
    1. Preparar insertos filtrantes de cultivo celular (insertos de 6,5 mm con membrana de policarbonato de 0,4 μm de tamaño de poro, colocados en una placa de 24 pocillos) para sembrar HRMEC recubriendo cada inserto (cámara apical) con 200 μL de solución de gelatina al 0,1% durante 30 minutos bajo una campana de flujo laminar. Asegúrese de que la solución cubra toda la superficie inferior del inserto del filtro.
      NOTA: Cada pocillo tiene una cámara apical y basolateral separada por una membrana porosa.
    2. Saque la placa de Petri con HRMEC cultivados (paso 2.1.5.) de la incubadora y aspire los medios de crecimiento. Enjuague suavemente las células 2x con 10 ml de 1x PBS bajo una campana de flujo laminar para eliminar las posibles células flotantes / muertas.
    3. Disociar las células con 0,5-1 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% y colocar la placa de Petri en la incubadora (37 °C y 5%CO2) durante 5 min.
    4. Apague la actividad de la tripsina agregando 4.5-9 ml de medios de crecimiento y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml usando una pipeta de 10 ml.
    5. Gire las células a 200 x g durante 5 minutos en RT, retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de medios de crecimiento.
    6. Contar el número de células usando un hemocitómetro manual o un contador celular automatizado y semilla a una densidad de 4 x 104 células por inserto de filtro (es decir, 1.25 x 105 células/cm2). El volumen de suspensión celular para cada inserto es de 250 μL.
    7. Aspirar la solución de recubrimiento de los pocillos que contienen insertos permeables y transferir 250 μL de la suspensión celular por inserto (cámara apical). Agregue solo medio (es decir, sin celdas) a uno de los insertos, que se utilizará como un "control en blanco" para la medición de TEER. Simultáneamente, también añadir 750 μL de medio por pocillo, en las cámaras basolaterales.
    8. Mantener la placa de 24 pocillos con insertos permeables en la incubadora (37 °C y 5% de CO2) durante 7-12 días hasta que las células cultivadas sean completamente confluentes y se alcance el valor TEER deseado de ~20 Ω·cm2.
    9. Cambie el medio de crecimiento cada dos días. Durante el cambio de medio, aspire cuidadosamente el medio para minimizar la interrupción de la monocapa celular y agregue 250 μL y 750 μL de medios frescos por pocillo a las cámaras apical y basolateral, respectivamente.
      NOTA: El medio de crecimiento se cambia para las cámaras apical y basolateral de los pocillos.

3. Mediciones TEER (Figura 4)

  1. En el día 14 después de la siembra celular (paso 2.2.9.), mida el TEER para HRMEC utilizando un sistema epitelial de voltímetro de ohmios (EVOM) (ER) (Tabla de materiales) de la siguiente manera.
  2. Precargue el sistema ER y compruebe la funcionalidad del medidor con el electrodo de prueba STX04. Camar, si es necesario.
  3. Conecte el electrodo al medidor y equilibre el electrodo empapándolo primero en etanol al 70% durante 15-20 minutos y luego sumergiéndolo brevemente en el medio de crecimiento EGM de cultivo celular.
  4. Mientras tanto, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene celdas en la campana de flujo laminar a RT durante 15-20 minutos para equilibrar la temperatura.
    NOTA: Las mediciones TEER se ven afectadas por la temperatura, por lo que el paso de equilibrio es esencial.
  5. Para la medición TEER, agregue medio de crecimiento fresco a las cámaras apicales (250 μL) y basolaterales (750 μL) de los pocillos.
  6. Realice la medición TEER sumergiendo cuidadosamente el electrodo de modo que la punta más corta esté en el inserto y la punta más larga toque el fondo del pozo. Mida primero la resistencia en el control en blanco. Para cada inserto, mida TEER por triplicado.
    NOTA: Para enjuagar el electrodo entre las mediciones, se utilizan medios de cultivo. Asegúrese de que el electrodo se mantenga en un ángulo de 90° con respecto a la parte inferior del inserto para obtener lecturas estables.
  7. Calcule la resistencia eléctrica (en Ω · cm 2) a través de la monocapa utilizando la fórmula, TEER = resistencia neta (Ω) x área superficial del inserto del filtro (cm2); Aquí, la resistencia neta es la diferencia entre la resistencia de cada pocillo (medio de crecimiento con células) y el pozo en blanco (solo medio de crecimiento).
  8. Llevar a cabo un tratamiento adicional de las células solo después de que el valor TEER alcance ~ 20 Ω · cm2. Si no se alcanza el nivel TEER deseado, mantenga la placa en la incubadora y mida la TEER al día siguiente.
    NOTA: La confluencia HRMEC también puede validarse mediante el examen morfológico de la forma celular (bajo un microscopio) con la morfología típica de adoquines y / o por la presencia de proteínas de unión celular con tinción inmunohistoquímica por separado.

4. Ensayo de transcitosis

  1. Ensayo de transcitosis in vitro mediado por clatrina utilizando transferrina marcada con Cy3 (Figura 5)
    1. Al alcanzar la confluencia con valores de TEER alrededor de 20 Ω·cm2, el suero priva a las células durante 24 h a 37 °C y 5% deCO2 utilizando FBS al 0,5% en EBM (medio reducido en suero) en ambas cámaras (cámara apical: 250 μL y cámara basolateral: 750 μL) antes del tratamiento con el ligando. Se utilizó MBE reducida en suero durante todo el ensayo.
    2. Incubar las células (utilizando el medio reducido en suero en el paso 4.1.1.) en la cámara apical con ligando de transferrina (Cy3-Tf) marcado con fluorescencia (cianina 3) (concentración final de 40 μg/ml) durante 60 min a 37 °C.
      NOTA: Las placas que contienen Cy3-Tf deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueo de Cy3-Tf envolviendo en ellas papel de aluminio y realizando el experimento en una campana de cultivo celular con las luces apagadas.
    3. Después de 1 h, coloque la placa en hielo y lave la monocapa apical y basolateralmente 4x (3-5 min por lavado) con el medio reducido en suero a RT para eliminar el Cy3-Tf libre no unido.
      NOTA: El lavado es esencial para eliminar las moléculas trazadoras libres y permitir una lectura precisa de la transcitosis sin posibles fugas de la ruta paracelular.
    4. Añadir un medio fresco reducido en suero (como en el paso 4.1.1.) a los insertos filtrantes bien lavados que contengan células y transferir los insertos a los pocillos frescos de la placa de 24 pocillos que contenga medio reducido en suero precalentado.
    5. Incubar las células durante otros 90 minutos en la incubadora (37 °C y 5% deCO2), y luego recoger el medio de la cámara basolateral.
    6. Registre la intensidad de fluorescencia de la solución desde la cámara basolateral utilizando un detector de fluorescencia. Los niveles de intensidad de fluorescencia, medidos como unidades fluorescentes relativas (RFU), indican la cantidad de complejo Cy3-Tf transcitado a través de la monocapa HRMEC a través de la transcitosis dependiente de clatrina.
  2. Ensayo de transcitosis in vitro mediado por caveolas utilizando HRP (Figura 6)
    1. Al alcanzar la confluencia completa con valores de TEER alrededor de 20 Ω·cm2, el suero priva a las células durante 24 h a 37 °C y al 5% deCO2 utilizando un medio de MBE que contiene FBS al 0,5% (medio reducido en suero) antes del tratamiento (como en el paso 4.1.1.). Se utilizó medio de MBE reducido en suero durante todo el ensayo.
    2. Tratar las células en la cámara apical con los tratamientos deseados y controles del vehículo.
      NOTA: Aquí, hemos utilizado moduladores Wnt como ejemplo para demostrar la regulación de la transcitosis mediada por caveolas por la vía de señalización Wnt en HRMECs: Norrina recombinante humana e inhibidor de Wnt XAV939. En un experimento típico, las células fueron tratadas durante 24 h en una incubadora (37 °C y 5% deCO2) con las siguientes concentraciones: Norrin (125 ng/mL), Norrin (125 ng/mL) + XAV939 (10 μM), y solución de control del vehículo. Además, también se utilizó medio acondicionado con Wnt3a (producido a partir de células L Wnt-3A).
    3. Incubar las células en la cámara apical con HRP (5 mg/ml) durante 15 min a 37 °C.
    4. Después, coloque la placa de 24 pocillos en hielo y lave las cámaras apical y basolateral intensamente 6x con tampón P (10 mM HEPES pH = 7.4, 1 mM piruvato de sodio, 10 mM glucosa, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) para eliminar el HRP extracelular libre.
      NOTA: El lavado es esencial para eliminar las moléculas trazadoras libres y permitir una lectura precisa de la transcitosis sin posibles fugas de la ruta paracelular.
    5. Añadir un medio fresco reducido en suero (como en el paso 4.1.1.) a la cámara apical y transferir los insertos a un pocillo fresco que contenga medios precalentados.
    6. Incubar la monocapa durante 90 minutos adicionales en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2 antes de recoger el medio de la cámara basolateral.
    7. Al medio recogido, añadir 100 μL de sustrato de peroxidasa fluorogénica HRP (Tabla de materiales) según las instrucciones del fabricante, e incubar a RT durante 10 minutos antes de detener la reacción con 100 μL de solución Stop.
    8. Detecte los niveles de producto de reacción de sustrato HRP en los medios utilizando un lector de placas de fluorescencia. Mida la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de emisión de 420 nm (con excitación de 325 nm) y como unidades fluorescentes relativas (RFU). Los valores indican el nivel de HRP transcitado a través de la capa HRMEC a través de la transcitosis mediada por caveolas.
      NOTA: El producto fluorescente utilizado aquí (Tabla de materiales) no fotoblanquea. No se necesita protección contra la fotoblanqueo.

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Representative Results

Las imágenes EM del endotelio vascular retiniano muestran transporte vesicular transcitótico y vesículas caveolistas en células endoteliales in vivo.
La transcitosis EC se puede visualizar in vivo dentro de secciones transversales retinianas con precipitado marrón oscuro que refleja vasos sanguíneos que contienen HRP bajo un microscopio óptico (Figura 3A) y como precipitado denso en electrones indicativo de vesículas transcitóticas que contienen HRP (Figura 3B, C) utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM), demostrando así la transcitosis EC a través del iBRB. Las vesículas grandes reflejan potencialmente macropinocitosis (punta de flecha blanca; Figura 3B), y las vesículas pequeñas probablemente representan vesículas caveolares (puntas de flecha blancas; Figura 3C). Además, la localización de caveolas en los vasos sanguíneos de la retina puede verse como la co-tinción del marcador de caveolas anticuerpo CAV-1 con isolectina (marcador CE) en el vaso sanguíneo bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 3D). Las vesículas caveolares positivas para CAV-1 se identificaron bajo TEM mediante anticuerpos CAV-1 marcados con inmunooro (puntos negros; Figura 3E) dentro de las células endoteliales vasculares de la retina. Los protocolos para los estudios in vivo pueden obtenerse de Wang et al.24.

El tratamiento con VEGF aumenta la permeabilidad vascular en los HRMEC medidos por la resistencia eléctrica transendotelial (TEER)
Antes de realizar ensayos de transcitosis CE, los HRMEC deben cultivarse hasta la confluencia completa, mostrando una morfología de adoquines característica, que se puede observar bajo un microscopio óptico. La confluencia celular completa puede validarse mediante la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) (Figura 4A), con lecturas que alcanzan ~ 20 Ω · cm2 para HRMEC confluentes30, lo que sugiere bajos niveles de transporte paracelular a través de la monocapa a través de uniones estrechas o de brecha. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se utilizó como ejemplo para demostrar la medición de TEER. El tratamiento de los HRMEC con VEGF redujo significativamente los niveles de TEER, lo que refleja una mayor permeabilidad del HRMEC (Figura 4B). También se observó una reducción en los valores de TEER en las células control, potencialmente debido a la duración del cultivo y múltiples mediciones tomadas en diferentes intervalos de tiempo que podrían ser perjudiciales para las células31.

El transporte de Cy3-transferrina se puede utilizar para evaluar la transcitosis EC mediada por clatrina en HRMEC
Para la transcitosis EC mediada por clatrina, los HRMEC confluentes cultivados en membrana porosa se incubaron con transferrina marcada con fluorescencia (Cy3) para detectar su transporte a través de CE (Figura 5A). Este ensayo explota el hecho de que el transporte de transferrina es un proceso de transcitosis mediado por receptores. Se observó endocitosis de Cy3-transferrina (rojo) en monocapa HRMEC co-teñida con tinción nuclear, DAPI (azul) (Figura 5B), confirmando su captación en las células. La intensidad de fluorescencia de la transferrina marcada con (Cy3) puede cuantificarse a partir de imágenes para evaluar el proceso de endocitosis y/o medirse a partir del medio recogido de la cámara basolateral de los pocillos para cuantificar los niveles de transcitosis mediada por clatrina27.

La vía de señalización Wnt regula la transcitosis EC mediada por caveolas a través de HRMEC en un ensayo basado en HRP
Anteriormente, se ha encontrado que la señalización Wnt regula la transcitosis mediada por caveolas dependientes de MFSD2A a través de las CE vasculares de la retina para mantener iBRB24. Los efectos de los moduladores Wnt se evaluaron en un ensayo de transcitosis in vitro basado en HRP (Figura 6A). Los HRMEC totalmente confluentes se trataron con activadores de la vía Wnt: medio condicionado por Wnt3a (Wnt3a-CM) o Norrina recombinante humana, con o sin inhibidor de señalización de Wnt/β-catenina XAV939, y se detectaron los niveles de HRP transcitosados a través de HRMEC. El tratamiento con Wnt3a-CM o Norrin reveló niveles significativamente disminuidos de HRP transcitada, indicativo de transcitosis caveolar reducida. Además, el tratamiento combinado con el inhibidor de señalización Wnt XAV939 demostró niveles regulados al alza de HRP transcitosada en HRMECs, borrando así los efectos de los activadores Wnt sobre la permeabilidad HRMEC (Figura 6B,C)24.

Figure 1
Figura 1: Diferentes vías de transporte a través del endotelio vascular retiniano. Ilustración esquemática que muestra diferentes rutas de flujo molecular a través de células endoteliales microvasculares retinianas (RMEC). El transporte a través de las células endoteliales vasculares de la retina dentro de la barrera interna sangre-retina tiene lugar a través de dos rutas principales: vías paracelulares y transcelulares, incluida la transcitosis. Esta figura fue adaptada con permiso de Yemanyi et al.5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Visión general de las vías de transporte vesicular transcitótico a través de las células endoteliales y su respectiva evaluación in vitro . En las células endoteliales (CE), la translocación transcelular de macromoléculas ocurre a través de tres tipos principales de vesículas: vesículas caveolares (50-100 nm), vesículas recubiertas de clatrina (70-150 nm) o macropinosomas independientes de clatrina (200-500 nm). Las caveolas son microdominios en forma de matraz, esféricos en lípidos en la membrana plasmática, compuestos de caveolina y cavinas. Los niveles de transcitosis a través de estas vesículas se pueden determinar mediante ensayos in vitro basados en fluorescencia en cultivo EC utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP) combinada con sustrato fluorescente, transferrina marcada con fluorescencia (Cy3-Tf) o albúmina sérica bovina marcada con tetrametilrodamina (TMR-BSA) para transcitosis mediada por caveolas, transcitosis mediada por clatrina y macropinocitosis, respectivamente, para evaluar la permeabilidad de la barrera retiniana sanguínea interna (iBRB). Si bien cada vía tiene características y mecanismos de transporte distintos, pueden ocurrir funciones superpuestas y transporte de sustancias, particularmente entre el transporte caveolar y la macropinocitosis, siendo ambos independientes de la clatrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Visualización de la transcitosis EC en la retina. (A) La imagen del microscopio óptico muestra una luz de vaso sanguíneo llena de HRP de una sección retiniana de ratón de tipo salvaje (WT) de 3 meses de edad, teñida con 3,3'-diamino bencidina (DAB) (negro). HRP se inyectó retroorbitalmente en ratones WT, seguido de aislamiento ocular e incrustación de tejido. Las secciones delgadas se tiñeron con sustrato DAB denso en electrones para la detección colorimétrica de HRP como precipitado marrón oscuro y se obtuvieron imágenes bajo un microscopio óptico para revelar HRP dentro de la luz del vaso sanguíneo retiniano. (B,C) Luego, las muestras se procesaron con una sección ultrafina de microscopio electrónico de transmisión (TEM) para visualizar vesículas transcitóticas que contienen HRP, que representan la transcitosis EC a través del iBRB. Las imágenes de TEM muestran una sección retiniana de un ratón WT de 3 meses de edad con luz de vaso sanguíneo llena de HRP y vesículas que contienen HRP dentro de RMEC. (B) Una vesícula grande ocasional refleja potencialmente macropinosoma (punta de flecha) dentro de los CE, con la presencia de glóbulos rojos (asterisco) en el lado luminal. (C) Las vesículas pequeñas son probablemente vesículas caveolares (puntas de flecha). (D) La cotinción inmunohistoquímica del anticuerpo CAV-1 (verde) y la isolectina B 4 (IB4, rojo, marcador CE) demuestra la localización de CAV-1 en los vasos sanguíneos de la retina en la retina del ratón WT de 3 meses de edad (DAPI, azul). (E) imagen TEM de CAV-1 marcado con inmunooro (puntos negros, flechas) dentro de las CE retinianas; el recuadro muestra una imagen ampliada de una vesícula caveolar positiva CAV-1. Abreviaturas: HRP = peroxidasa de rábano picante; GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; ONL = capa nuclear externa; EPR = epitelio pigmentario de la retina; E = célula endotelial; y L = luz de los vasos sanguíneos. Ampliación: (A, D) 20x. Barras de escala: (A) 50 μm, (B) 2 μm, (D) 100 μm y (C,E) 200 nm. El panel (E) fue adaptado con permiso de Wang et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Validación de HRMECs totalmente confluentes y aumento de la permeabilidad vascular en HRMECs después del tratamiento con VEGF. (A) Diagrama esquemático que muestra el posicionamiento de los electrodos en las cámaras apical y basolateral de los pocillos para la medición de la resistencia eléctrica transendotelial (TEER) como una evaluación de la permeabilidad vascular y la integridad de la monocapa celular. (B) Gráfico que muestra los registros TEER de HRMEC totalmente confluentes con y sin tratamiento previo con factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). El tratamiento con VEGF después de 18 h (18 H) resulta en una reducción de los TEER en HRMEC totalmenteconfluentes 31. p≤0,001. El panel (B) fue adaptado con permiso de Tomita et al.31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Una ilustración esquemática del ensayo de transcitosis CE mediada por clatrina en HRMEC utilizando transferrina (Tf). (A) Los HRMEC se cultivaron hasta la confluencia completa en insertos recubiertos de gelatina y se privó de suero durante la noche a 37 °C antes del ensayo. Las células se incubaron apicalmente con transferrina conjugada Cy3 fluorescente (Cy3-Tf) durante 60 min a 37 °C. Después de la incubación, las células se lavaron intensamente con un medio fresco para eliminar el Cy3-Tf extracelular no unido. Los insertos que contenían medio fresco se transfirieron a una nueva placa que contenía medio caliente en la cámara basolateral, y las células se incubaron a 37 °C durante 90 minutos adicionales para liberar Cy3-Tf endocitosado. Se puede recolectar el medio de la cámara basolateral y se puede medir la intensidad de fluorescencia correspondiente a la transcitosis EC dependiente de clatrina (Cy3-Tf) utilizando un lector de placas de fluorescencia. (B) Se observó Cy3-transferrina (rojo) en HRMECs teñidos con DAPI (azul), confirmando endocitosis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La señalización Wnt regula la transcitosis HRMEC mediada por caveolas en un ensayo in vitro basado en HRP. (A) Ilustración esquemática que demuestre el ensayo basado en HRP para evaluar la transcitosis mediada por caveolas. Los HRMEC totalmente confluentes cultivados en insertos recubiertos de gelatina se privaron de suero durante la noche en suero bovino fetal al 0,5% (FBS) + medio EBM a 37 °C antes del tratamiento. La monocapa EC en la cámara apical se trató con el tratamiento deseado durante 24 h a 37 °C. Posteriormente, las células se incubaron con peroxidasa de rábano picante (HRP) a 37 °C durante 15 min y se lavaron intensamente para eliminar la HRP extracelular libre. Los insertos que contenían medio fresco se transfirieron a una nueva placa que contenía medio caliente en cámaras basolaterales, y las células se incubaron durante 90 minutos adicionales a 37 °C. Se recogió el medio de la cámara basolateral y se cuantificaron los niveles de HRP por reacción con sustrato de peroxidasa fluorogénica. La fluorescencia correspondiente a la transcitosis EC mediada por caveolas se midió utilizando un lector de placas de fluorescencia. (B,C) En este ejemplo, las células fueron tratadas con moduladores de la vía Wnt: medio condicionado por Wnt3a (Wnt3a-CM) o su medio condicionado por control (Ctrl-CM), Norrina recombinante humana o su solución de control (Ctrl), y con o sin inhibidor de señalización Wnt/β-catenina (XAV939) o su control del vehículo (vehículo). Sus efectos sobre la transcitosis caveolar HRMEC se evaluaron en el ensayo basado en HRP. Después del tratamiento, se midieron los niveles de HRP transferidos a la cámara basolateral, lo que indica niveles de transcitosis CE mediados por caveolas en los HRMEC. Los activadores Wnt redujeron los niveles de transcitosis basada en HRP, que fueron revertidos por XAV939. * p≤0.05, ** p≤0.01. Los paneles (B) y (C) fueron adaptados con permiso de Wang et al.24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

BRB juega un papel esencial en la salud y la enfermedad de la retina. Las técnicas in vitro que evalúan la permeabilidad vascular han demostrado ser herramientas cruciales en los estudios relacionados con el desarrollo y la función de la barrera (BRB/BBB). El procedimiento descrito aquí podría utilizarse para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la transcitosis EC o evaluar los moduladores moleculares relacionados que afectan la permeabilidad del BRB. In vitro Los ensayos de transcitosis EC tienen múltiples ventajas sobre los ensayos in vivo o las técnicas utilizadas para evaluar la permeabilidad vascular. Son rápidos de realizar con alto rendimiento y se pueden utilizar para analizar los efectos de muchas variables diferentes o moléculas aisladas de vías de señalización específicas con modulación genética y farmacológica. El sistema de cultivo de EC pura destruye la variación animal como se observa a menudo in vivo y también limita los efectos de la posible modificación o endocitosis de las moléculas diana por otros tipos de células32. El manejo de las células HRMEC es fácil, requiere equipos básicos de cultivo celular disponibles en la mayoría de los laboratorios, y el cultivo celular es a menudo más rentable en comparación con los experimentos con animales in vivo. Aunque los ensayos de transcitosis in vitro no replican completamente las condiciones fisiológicas in vivo33, pueden ser herramientas valiosas para complementar los estudios in vivo y avanzar en nuestro conocimiento sobre el control de BRB.

Varios parámetros técnicos importantes requieren consideración, incluido el tamaño de poro del inserto del filtro, el tipo de sustrato y la densidad de siembra celular. Un tamaño de poro más grande de los insertos filtrantes permeables podría resultar en una migración y crecimiento indeseables de células en la parte inferior del inserto, confundiendo la medición resultante y su interpretación. Si bien esta propensión puede variar con los diferentes tipos de células, los diámetros de poro ≤1 μm sirven bien para la mayoría de los tipos de células, incluidas las CE34. La elección de un sustrato adecuado es un segundo paso crucial porque algunas células demuestran una mayor polaridad y una mayor diferenciación cuando se cultivan en sustrato poroso y se bañan en un medio de cultivo en ambos lados35,36. Los filtros de policarbonato microporoso tratados son una mejor alternativa para los CE porque son más delgados y proporcionan un mayor acceso de los reactivos a la zona basolateral de la monocapa con fluorescencia de fondo mínima para inmunoensayos35. Finalmente, para lograr una monocapa completamente confluente, la densidad de siembra celular debe optimizarse en función del tipo de célula específico. Mientras que una densidad de siembra demasiado baja podría afectar el estado de diferenciación, una densidad de siembra demasiado alta, por otro lado, podría favorecer la unión rápida de células formando múltiples capas celulares en lugar de una monocapa, alterando eventualmente la morfología celular y resultando en una medición inexacta de la transcitosis37.

La formación y la integridad de la monocapa EC son cruciales para este ensayo y pueden validarse midiendo los valores de TEER para garantizar el logro del TEER deseado. Siempre se debe incluir un control en blanco, es decir, un inserto de filtro sin células, para medir los niveles basales de resistencia a través de la membrana permeable que se restará de los de los insertos celulares. Varios factores como la temperatura, el número de paso celular, la composición del medio de cultivo, la duración del cultivo y los cambios en la longitud de la unión pueden causar variaciones menores en los valores de TEER 25,38,39. Los valores de TEER también se ven muy afectados por ciertos tratamientos, como el VEGF. Descubierto inicialmente como un potente inductor de la permeabilidad de los vasos40, el VEGF afecta la permeabilidad vascular mediante la regulación del transporte paracelular, es decir, a través de la fosforilación de las proteínas de unión estrecha ZO-1, ocludina, y la interrupción de la proteína de unión estrecha claudina-5 41,42, así como el transporte transcelular 43 . Se puede realizar una validación adicional de la formación de monocapa con el examen morfológico y la presencia de proteínas de unión características con tinción. A lo largo del cultivo, se recomienda cambiar los medios en las cámaras apical y basolateral a intervalos regulares para mantener las células en la condición óptima de cultivo con el rango de pH ideal y la disponibilidad de nutrientes.

Los investigadores que utilizan este ensayo deben prestar atención a una característica inherente crítica de las CE cerebrales y retinianas: la polaridad apicobasal, que es un sello celular distintivo de la BBB44 y, de manera similar, del BRB. La dirección de la transcitosis está determinada por la distribución relativa de los receptores diana de proteínas de interés y la maquinaria de transcitosis asociada en los dominios apical/luminal vs. basolateral/abluminal de la membrana de la CE. Las CE cerebrales y retinianas son capaces de liberar muchos factores de las membranas apical/luminal y basolateral/abluminal44. Curiosamente, la transcitosis de transferrina dependiente de la clotrina parece ocurrir principalmente unidireccionalmente desde el lado de la sangre hasta el cerebro o la retina, ya que los receptores de transferrina se localizan predominantemente en la membrana apical/luminal45. La transcitosis caveolar, por otro lado, ocurre bidireccionalmente y puede originarse desde la membrana apical/luminal o basolateral/abluminal y a través del otro lado dependiendo de la localización de la carga vesicular y sus receptores46. MFSD2A, un receptor lipídico transmembrana (para el ácido graso omega-3 ácido docosahexaenoico) y supresor de la transcitosis caveolar, también se encuentra en los dominios apical/luminal de las CE23,47. La expresión de MFSD2A está regulada transcripcionalmente por la señalización Wnt para mediar su impacto en el control de BRB, como se ilustra como ejemplo en este protocolo24. La técnica descrita aquí, por lo tanto, implica la detección de una molécula trazadora colocada en la cámara superior / apical después de la absorción por la monocapa EC y la liberación en la cámara inferior / basolateral, imitando la transcitosis en la dirección apical/luminal/sanguínea a basolateral/abluminal/tisular. Este protocolo se puede modificar para detectar la transcitosis en la dirección opuesta mediante la colocación de moléculas trazadoras en la cámara inferior y el monitoreo de la absorción y liberación en la cámara apical para satisfacer las necesidades de los investigadores. Además, si fuera necesario, un paso adicional para determinar la acumulación/degradación intracelular de la molécula diana unida al trazador endocitos produciría una medición adicional de las vesículas transcitóticas que quedan en el citosol32.

El ensayo descrito tiene muchas ventajas y sirve como una herramienta esencial en los estudios relacionados con BRB/BBB, pero existen algunas limitaciones. Es un sistema aislado desprovisto de interacciones de otros tipos de células del iBRB, como pericitos y células gliales, y por lo tanto no podría imitar exactamente el entorno fisiológico in vivo. Los valores TEER pueden variar entre mediciones debido a un cambio de temperatura o posicionamiento de los electrodos25,38. Sin embargo, equilibrar las celdas de 37 °C a temperatura ambiente antes de las mediciones, manejar cuidadosamente los electrodos e incluir controles en blanco puede ayudar a minimizar la fluctuación. Además, incluso con un lavado suficiente, la fuga de la ruta paracelular, aunque en una cantidad traza, no se puede descartar por completo. También puede ocurrir una superposición del transporte de HRP entre diferentes rutas de transcitosis, por ejemplo, entre el transporte caveolar y la macropinocitosis, ambas independientes de la clatrina. Según sea necesario, la distinción puede investigarse más a fondo utilizando moduladores específicos y / o inhibidores de caveolas y micropinocitosis.

En resumen, este artículo describe un ensayo de transcitosis in vitro que permite cuantificar la transcitosis mediada por caveolas o portadores a través del BRB / BBB. El ensayo in vitro podría ser de gran ayuda en el cribado de diversas moléculas pro/antiangiogénicas31, moduladores de la vía de señalización24 o sistemas de administración de fármacos27,48 pertenecientes al control BRB/BBB. La investigación de la polaridad EC y la transcitosis direccional también puede beneficiarse de este sistema fácil de usar. Teniendo en cuenta la disponibilidad limitada de modelos in vitro para iBRB e investigación ocular, el procedimiento descrito aquí también podría modificarse como un sistema de cocultivo junto con pericitos, astrocitos y cultivos organotípicos 3D49, o utilizando modelos avanzados basados en células como sistemas neurovasculares microfisiológicos50, para investigar más a fondo las interacciones celulares e imitar mejor las condiciones fisiológicas in vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses o intereses financieros que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH (R01 EY028100, EY024963 y EY031765) a JC. ZW fue apoyado por una Beca de Iniciación de Carrera de la Fundación del Ojo de los Caballeros Templarios.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

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Medicina Número 184 Barrera hematoretiniana caveolas células endoteliales transcitosis Wnt
Ensayo de transcitosis de células endoteliales como modelo <em>in vitro</em> para evaluar la permeabilidad de la barrera interna sangre-retina
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