Summary
Her utviklet vi en human aorta glatt muskelcelle organ-on-a-chip-modell for å replikere in vivo biomekanisk belastning av glatte muskelceller i den menneskelige aortaveggen.
Abstract
Konvensjonelle todimensjonale cellekulturteknikker og dyremodeller har blitt brukt i studiet av human thorax aortaaneurisme og disseksjon (TAAD). Imidlertid kan menneskelig TAAD noen ganger ikke karakteriseres av dyremodeller. Det er et tilsynelatende artsgap mellom kliniske menneskelige studier og dyreforsøk som kan hindre oppdagelsen av terapeutiske legemidler. I motsetning til dette er den konvensjonelle cellekulturmodellen ikke i stand til å simulere in vivo biomekaniske stimuli. For dette formål har mikrofabrikasjon og mikrofluidiske teknikker utviklet seg sterkt de siste årene, og gir nye teknikker for å etablere organoider-on-a-chip-modeller som replikerer det biomekaniske mikromiljøet. I denne studien ble en human aorta glatt muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) -modell utviklet for å simulere de patofysiologiske parametrene for aortabiomekanikk, inkludert amplituden og frekvensen av syklisk belastning opplevd av humane aorta glatte muskelceller (HASMCs) som spiller en viktig rolle i TAAD. I denne modellen ble morfologien til HASMCs langstrakt i form, justert vinkelrett på belastningsretningen, og presenterte en mer kontraktil fenotype under belastningsforhold enn under statiske konvensjonelle forhold. Dette var i samsvar med celleorientering og fenotype i innfødte humane aortavegger. I tillegg, ved hjelp av bicuspid aortaklaff-relaterte TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaff-relaterte TAAD (TAV-TAAD) pasientavledede primære HASMCs, etablerte vi BAV-TAAD og TAV-TAAD sykdomsmodeller, som replikerer HASMC-egenskaper i TAAD. HASMC-OOC-modellen gir en ny in vitro-plattform som er komplementær til dyremodeller for videre å utforske patogenesen til TAAD og oppdage terapeutiske mål.
Introduction
Thorax aortaaneurisme og disseksjon (TAAD) er en lokalisert dilatasjon eller delaminering av aortaveggen som er forbundet med høy morbiditet og dødelighet1. Humane aorta glatte muskelceller (HASMCs) spiller en viktig rolle i patogenesen av TAAD. HASMCs er ikke terminalt differensierte celler, og HASMCs beholder høy plastisitet, slik at de kan bytte fenotyper som svar på forskjellige stimuli2. HASMCs blir hovedsakelig utsatt for rytmisk strekkbelastning in vivo, og dette er en av nøkkelfaktorene som regulerer morfologiske endringer i glatt muskulatur, differensiering og fysiologiske funksjoner 3,4. Derfor kan rollen som syklisk belastning i studien av HASMCs ikke ignoreres. Imidlertid kan konvensjonelle 2D-cellekulturer ikke replikere den biomekaniske stimuleringen av syklisk stamme opplevd av HASMCs in vivo. I tillegg er konstruksjonen av en dyr TAAD-modell ikke egnet for noen typer TAAD, for eksempel bicuspid aortaklaff (BAV)-relatert TAAD. Videre kan artsgapet mellom kliniske menneskelige studier og dyreforsøk ikke ignoreres. Det hindrer farmasøytisk oversettelse i klinisk praksis. Dermed er det et presserende behov for mer komplekse og fysiologiske systemer for å simulere det in vivo biomekaniske miljøet i forskningen av aortasykdommer.
Dyreforsøk som brukes i biomedisinsk forskning og medisinutvikling er kostbare, tidkrevende og etisk tvilsomme. I tillegg unnlater resultatene fra dyreforsøk ofte å forutsi resultatene oppnådd i kliniske studierpå mennesker 5,6. Mangelen på menneskelige prekliniske modeller og høy feilrate i kliniske studier har resultert i få effektive medisiner for klinikken, noe som har økt helsekostnadene7. Dermed er det presserende å finne andre eksperimentelle modeller for å utfylle dyremodeller. Mikrofabrikasjon og mikrofluidiske teknikker har utviklet seg sterkt de siste årene, og gir nye teknikker for å etablere organoider-on-a-chip-modeller som avhjelper ulempene ved tradisjonelle 2D-cellekulturteknikker og etablerer en mer realistisk, rimelig og effektiv in vitro-modell for fysiologiske studier og stoffutvikling. Ved hjelp av mikrofluidiske enheter etableres organer-på-chips for å dyrke levende celler i mikrometerstore kamre med forskjellige stimuli for å replikere nøkkelfunksjonene til et vev eller organ. Systemet består av enkle eller flere mikrofluidiske mikrokanaler, med enten en type celle dyrket i et perfundert kammerreplikerende funksjoner av en vevstype eller forskjellige celletyper dyrket på porøse membraner for å gjenskape grensesnitt mellom forskjellige vev. Mikrofluidisk-baserte organoider kombinert med pasientavledede celler har den unike fordelen av å bygge bro over den store artsforskjellen mellom mus og menneskelige sykdomsmodeller og overvinne ulempene ved tradisjonell 2D-cellekultur for sykdomsmekanismeforskning og narkotikaforskning. Med den raske utviklingen av mikrofluidikk de siste årene har forskere innsett nytten av in vitro organ-on-a-chip (OOC) modeller som replikerer komplekse in vivo biologiske parametere8. Disse mikrofluidiske organoider simulerer in vitro biomekaniske miljøer, for eksempel syklisk belastning, skjærspenning og flytende trykk, og gir et tredimensjonalt (3D) cellekulturmiljø. Til dags dato har flere OOC-modeller blitt etablert for å simulere biomekaniske stimuli i organer som lunge9, nyre 10, lever 11, tarm12 og hjerte 13, men disse har ikke blitt mye brukt til studiet av human aortasykdom.
I denne studien presenterer vi en human aorta glatt muskelcelleorgan-on-a-chip (HASMC-OOC) modell som kan kontrollere de biomimetiske mekaniske kreftene og rytmene som brukes på TAAD pasientavledede primære HASMCs. Brikken består av trelags tykke plater av polydimetylsiloksan (PDMS) etset med kanaler og to kommersialiserte svært fleksible PDMS-membraner. HASMCs dyrkes på PDMS-membranene. Kanalen i midten av brikken er fylt med et kulturmedium for cellekultur. Topp- og bunnkanalene til brikken er koblet til et vakuumtrykkforsyningssystem som kan kontrollere rytmen og frekvensen av mekanisk strekkbelastning av PDMS-membranene. Rytmisk belastning opplevd av HASMCs kan simuleres i HASMC-OOC, replikerer det biomekaniske mikromiljøet av vev eller organ som ikke er funksjonelt oppnåelig med konvensjonelle 2D-kultursystemer. Med fordelen av høyoppløselig, sanntidsavbildning og biomekanisk mikromiljø, kan de biokjemiske, genetiske og metabolske aktivitetene til levende celler studeres for vevsutvikling, organfysiologi, sykdomsetiologi, molekylære mekanismer og biomarkøridentifikasjon, kardiovaskulær sykdom og aortasykdom. Kombinert med vevsspesifikke og pasientceller, kan dette systemet brukes til narkotikascreening, personlig medisin og toksisitetstesting. Denne HASMC-OOC-modellen gir en ny in vitro-plattform for å studere patogenesen av aortasykdommen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menneskelige aortaprøver ble brukt til primær HASMC-isolasjon under godkjenning av Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprøver ble samlet inn fra pasienter som gjennomgikk stigende aortaoperasjon ved Zhongshan Hospital, Fudan University. Det ble innhentet skriftlig informert samtykke fra alle pasientene før medvirkning.
1. Primær human aorta glatt muskelcelle isolasjon
- Vask høyre laterale område av den stigende aorta med steril PBS, 1x-2x.
- Fjern intima- og adventitia-lagene i vevet med to oftalmiske tang og behold medielaget for å høste cellene.
- Legg medielaget på en 10 cm kulturskål og skjær det i små biter (2-3 mm) med saks. Tilsett 5 ml glatt muskelcellekulturmedium (SMCM) som inneholder 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.
- Flytt det lille vevet inn i kulturflasken med en steril dropper, spre vevet jevnt. Kast kulturmediet så mye som mulig, og snu deretter flasken opp ned.
- Tilsett 2 ml SMCM i den omvendte kulturflasken og legg den i inkubatoren (5% CO 2) ved 37 ° C i 1-2 timer, vri den sakte høyre side opp og legg til ytterligere2 ml SMCM.
- Etter 5-7 dager med inkubasjon, bytt SMCM med 4 ml fersk SMCM. Vanligvis sporadiske glatte muskelceller klatre ut i ca 2 uker.
- Kast SMCM sakte og legg den sakte til når du bytter medium. Transporter kulturflasken sakte når du flytter til en mikroskopstasjon; Ellers vil vevet flyte, og cellene vil vokse sakte.
- Når cellene når omtrent 80% sammenheng, vask med 2 ml PBS, fordøy med 2 ml 0,25% trypsin, og del dem i to nye kulturflasker med 4 ml fersk SMCM.
- Identifiser cellene gjennom en immunfluorescensanalyse av fire forskjellige spesifikke markører for glatte muskelceller (CNN1, SM22) 14.
2. Klargjøring av PDMS-brikke
- For å polymerisere PDMS, tilsett herdemiddel (B-komponent) til base (A-komponent) med et vektforhold på A: B = 10: 1 w / w og bland komplekset helt i 5 minutter; Volumet avhenger av behovet for studien.
- Plasser den tilberedte PDMS-gelen i en vakuumekstraksjonstank i 30-60 minutter og hold trykket under -0,8 mPa.
MERK: Høyt trykk vil føre til utilstrekkelig ekstraksjon av små bobler inne i PDMS-gelen som vil påvirke neste trinn i sponfabrikasjon. - Bruk datamaskinstøttet design (CAD) programvare til å designe formen med en 100 mm × 40 mm × 8 mm ekstern rammestruktur og en 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal.
- Tilpass formene til de tre lagene ved hjelp av en numerisk kontrollgraveringsmaskin med høy presisjon. Skjær ut rammen av formene og mikrokanalene ved hjelp av polymetylmetakrylat (PMMA) plater, og lim dem deretter på en annen PMMA-plate.
- Hell den tilberedte PDMS-gelen på en form med en 100 mm × 40 mm × 6 mm ytterramme og 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal, og deretter tverrbinding ved 70 °C i 1-2 timer.
- Skrell av de tverrbundne PDMS-platene fra formen og skjær de kommersialiserte PDMS-membranene i 100 mm × 40 mm seksjoner.
- Behandle de tre tilberedte PDMS-platene og to PDMS-membraner med oksygenplasma i 5 minutter for PDMS overflateaktivering. Bruk følgende spesifikke innstillinger: romluft som prosessgass; trykk satt til -100 kPa; nåværende satt til 180--200 Ma; spenning satt til 200 V; prosesstid til 5 min.
- Stans hull på de tre PDMS-platene ved hjelp av en 1 mm hullstanser for å lage innløp og utløp av luft og middels mikrokanaler på PDMS-brikken.
- Lim tre PDMS-plater og to PDMS-membraner sammen i rekkefølgen: luftkanal PDMS-plate (øverste lag) - PDMS-membran - mellomkanals PDMS-plate (mellomlag) - PDMS-membran- luftkanal PDMS-plate (nederste lag). Utfør dette trinnet under et stereoskopisk mikroskop ved 4x for å overlappe luftmikrokanalene fullt ut med mediummikrokanalene.
- Plasser den monterte PDMS-brikken i en 70 °C inkubator i 1 time.
- Forbered flere 1 mm indre diameter og 3 cm lengde latex slanger. Sett inn en 1 mm ytre diameter og 1 cm lang nål i rustfritt stål i den ene enden av den forberedte slangen, og sett deretter en Luer inn i den andre enden av slangen for å lage røret som er koblet til luft- og mediummikrokanalene til PDMS-brikken.
- Sett de forberedte rørene inn i uttakene og innløpene til luften og mediummikrokanalene på PDMS-brikken.
3. PDMS chipoverflatebehandling og sterilisering
- Tilfør 2 ml 80 mg/ml musekollagen i den middels mikrokanalen til PDMS-brikken ved hjelp av en 2 ml sprøyte og rug ved romtemperatur i 30 minutter.
- Etter inkubering, fjern kollagenet fra kanalen og gjenoppklar med en 2 ml sprøyte. Plasser de kollagenbelagte PDMS-brikkene i en 60 °C inkubator over natten.
- Plasser PDMS-brikkene i en UV-sterilisator i mer enn 1 time. Plasser de steriliserte PDMS-brikkene på en ultraren benk som forberedelse til celleeksperimentet.
4. Cellesåing på PDMS-brikken og cellestrekkprosessen
- Kultur 4 x 10 5 primære humane glatte muskelceller (HASMCs) fra pasienter som bruker glatt muskelcellemedium (SMCM) som inneholder 2% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin i en5 % CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Når HASMC-tettheten når 80%, kast SMCM og vask cellene med 2 ml PBS.
- Fordøy cellene ved hjelp av 1 ml 0,25% trypsin i 2 minutter og sentrifuge ved 100 x g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml fersk SMCM. Bruk 8 ml SMCM til å dyrke cellene på en 10 cm kulturskål.
- Beregn cellenummeret ved hjelp av et cytometer og bruk cellene ved en endelig konsentrasjon på 2 x 105 celler / ml.
- Hell sakte 2 ml PBS i den kollagenbelagte og steriliserte PDMS-chipmediemikrokanalen og kast senere med en 2 ml sprøyte.
- Hell sakte totalt 2 ml 2 x 105 celler/ml HASMC-suspensjon i den middels mikrokanalen til PDMS-brikken ved hjelp av en 2 ml sprøyte. Lukk deretter Luer ved inngangen og utgangen av PDMS-brikken. Plasser PDMS-brikken i en inkubator (5 % CO2) ved 37 °C i 1 dag.
- Etter at cellene er festet til PDMS-membranen i PDMS-brikken, nesten etter 24 timer, kobler du utløpet til luftmikrokanalen på PDMS-brikken til vakuumstyringssystemet. Når cellen er festet, kan en langstrakt, normal cellulær form ses under mikroskopet, i kontrast til de suspenderte runde cellene.
- Slå på magnetventilen og vakuumpumpen. Åpne vakuumregulatoren og juster trykknivået til 10 kPa for 7,18 ± 0,44 % belastning og 15 kPa for 17,28 ± 0,91 % belastning.
- Etter at parametrene til kontrollsystemet er satt, plasser PDMS-brikkene i en inkubator (5% CO2) ved 37 ° C og strekk i 24 timer.
5. Forberedelse av det mekaniske kontrollsystemet
- Forbered flere magnetventiler, vakuumfiltre, vakuumregulatorer, en vakuumpumpe, en peristaltisk pumpe og en programmerbar logisk styring (PLC) som styrer magnetventilen.
- Programmer PLC-kontrolleren og sett av/på-tidsintervallet til 1 Hz. Koble magnetventilene til den programmerte styreenheten.
- Koble innløpet til vakuumpumpen til vakuumfiltrene, og koble deretter utløpet til vakuumfiltrene til vakuumregulatorene. Koble utløpet til vakuumregulatorene til magnetventiler, og til slutt kobler du utløpet til magnetventilene til utløpene til luftmikrokanalene til PDMS-brikkene.
- Koble utløpet til den peristaltiske pumpen til innløpet til den mellomstore mikrokanalen til PDMS-brikken og innløpet til den peristaltiske pumpen til utløpet til PDMS-brikken med medium mikrokanal for utskifting av kulturmedium og legemiddelhåndtering.
- Juster amplituden til belastningen av regulatoren og belastningsfrekvensen av mikrokontrolleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HASMC-OOC-modellen består av et vakuumkontrollsystem, et sirkulasjonssystem og PDMS-brikker, og den skjematiske utformingen av HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumkontrollsystemet består av en vakuumpumpe, magnetventiler og en PLC-regulator. For å fungere som sirkulasjonssystemet ble en peristaltisk pumpe brukt til å oppdatere cellekulturmediet og legge til medisiner. PDMS-brikken besto av to vakuumkamre og et midtkammer fylt med SMCM for cellevekst. I henhold til utformingen av sponstrukturen ble PMMA-formen forberedt, og de tre PDMS-platene ble fremstilt ved å helle i former og tverrbinding ved 70 ° C i 2 timer. Etter plasmabehandling ble de tre PDMS-platene og to PDMS-membranene bundet sammen (figur 2). Når PDMS-brikkene ble klargjort, ble HASMCs dyrket på PDMS-membranen i brikken, og PDMS-brikkene ble koblet til vakuumkontrollsystemet og sirkulasjonssystemet. Et skjema over hele systemet er vist i supplerende figur 1. PDMS-brikkeparametrene er vist i figur 3A, og de mekaniske egenskapene til PDMS-membranen er vist i figur 3B. For å kvantifisere strekkstammene til PDMS-membranen fanget vi sanntidsdeformasjonene av PDMS-membranene fra et tverrsnittsbilde av den mikrofluidiske modellen, med vakuumtrykk på 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa og 30 kPa. Vi målte også lengdeendringene for å evaluere belastningsstørrelsen til PDMS-membranen i forskjellige dyrkingskanalbredder på 2 mm, 4 mm og 6 mm (figur 3C-E). Mikrokanaler 6 mm i bredden ble brukt i PDMS-brikken. Resultatene viste at et vakuumtrykk på 10 kPa induserte 7,18 ± 0,44% belastning og 15 kPa induserte 17,28 ± 0,91% belastning (figur 3E).
For å verifisere cellens levedyktighet av HASMC-cellelinjen (CRL1999) i PDMS-brikken, ble en LIVE/DEAD-analyse utført på dag 3 og 5 etter at cellene ble dyrket. Resultatene viste at cellens levedyktighet var høyere enn 90 % ved dag 3 og dag 5 (figur 4A). Cytoskjelettfarging (F-aktin) av CRL1999 i PDMS-brikken viste normal cellemorfologi og celler justert vinkelrett på stammen etter strekking i 24 timer (figur 4B-C). Immunfluorescensfarging av kontraktile markørene SM22 og CNN1 ble utført med HASMC-OOC etter 24 timers rytmisk belastning (figur 4D-E). Til å begynne med ble 2 ml PBS sakte hellet i kanalen og kastet med en 2 ml sprøyte. Deretter ble 2 ml 4% (v / v) paraformaldehyd hellet i kanalen og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etter dette ble 2 ml 0,2 % (v/v) Triton X-100 hellet i kanalen med en 2 ml sprøyte og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Dette ble etterfulgt av 2 ml PBS som sakte helles i kanalen og kastes av en 2 ml sprøyte etter vasking av cellene. Deretter ble 2 ml 5 % (w/v) bovint serumalbumin langsomt hellet i kanalen og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Etterpå ble 1 ml SM22- eller CNN1-antistoff langsomt helt inn i kanalen og ruget over natten ved 4 °C. Etter inkubasjon ble 1 ml geit anti-kanin sekundært antistoff sakte hellet i kanalen og inkubert i 1 time ved romtemperatur. Til slutt ble 1 ml DAPI-oppløsning sakte hellet i kanalen og inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Resultatene viste at fluorescensintensiteten til SM22 og CNN1 under belastningsforhold var høyere enn under statiske forhold (figur 4F). Sammenlignet med statiske tilstander ble SM22- og CNN1-genene i HASMCs oppregulert i stammeforhold (figur 4G). Disse dataene antydet at CRL1999 justerte vinkelrett på belastningsretningen, og at en kontraktil fenotype var mer uttalt under belastningsforhold enn under konvensjonell celledyrking under statiske forhold.
Ved hjelp av bicuspid aortaklaff-relaterte TAAD (BAV-TAAD) og tricuspid aortaklaff-relaterte TAAD (TAV-TAAD) pasientavledede primære HASMCs, etablerte vi BAV-TAAD og TAV-TAAD sykdomsmodeller. Resultatene av F-aktinfarging av BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledede primære HASMCs viste normal cellemorfologi og celler justert vinkelrett på belastningsretningen etter strekking i 24 timer (figur 5A-B). Immunfluorescensfarging viste at SM22- og CNN1-ekspresjon i BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledede primære hasmc-er var høyere under belastningsforhold enn under statiske forhold (figur 5C-G, I). Genuttrykksnivåene til SM22 og CNN1 i BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledede primære HASMCs ble oppregulert under belastningsforhold i motsetning til statiske forhold (figur 5H, J). Disse resultatene i BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledede primære HASMCs i PDMS-brikken var i samsvar med resultatene fra HASMC-cellelinjen CRL1999, noe som indikerer at kombinasjonen av pasientavledede primære HASMCs og HASMC-OOC-modellen replikerer HASMC-egenskaper i TAAD, som gir en BAV-TAAD og TAV-TAAD in vitro sykdomsmodell for videre undersøkelse av sykdommens molekylære mekanismer og legemiddelscreening.
Figur 1: Skjematisk design av HASMC-OOC-systemet. Systemet består av et vakuumkontrollsystem, et sirkulasjonssystem og PDMS-brikker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: PDMS chip forberedelse prosedyre. PDMS-gelen ble hellet i en PMMA-form og tverrbundet ved 70 °C i 1-2 timer. Deretter ble de tre PDMS-platene og to PDMS-membranene behandlet med plasma i 5 minutter og bundet sammen. Til slutt ble de tilberedte PDMS-brikkene sterilisert, og en konsentrasjon på 2 x 105 celler / ml HASMC-suspensjon ble sakte hellet i den mellomstore mikrokanalen til PDMS-brikken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: De detaljerte parametrene og mekaniske egenskapene til PDMS-brikken. (A) De detaljerte parametrene til PDMS-brikken. PDMS-platestørrelsen var 100 mm × 40 mm × 6 mm, og mikrokanalstørrelsen var 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Parametrene til den kommersielle PDMS-membranen. Den beregnede strekkamplituden til PDMS-membranen ved forskjellige vakuumtrykk for mikrokanalbredder på 2 mm (C), 4 mm (D) og 6 mm (E). Dataene viser gjennomsnittlig ± standardavvik (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cellemorfologi, orientering og fenotypeendring av HASMCs under sykliske belastningsforhold. (A) Representativt bilde av LIVE/DEAD-analysen på dag 3 og dag 5 etter HASMC-cellelinje (CRL1999) som dyrker på en PDMS-brikke. (B) F-aktinfarging av CRL1999 under statiske og belastningsforhold. (C) Celleorienteringen til CRL1999 under statiske og belastningsforhold. Representativt bilde av immunfluorescensfarging av SM22 (D) og CNN1 (E) i CRL1999 under statiske og belastningsforhold. (F) Den relative intensiteten av immunfluorescensfarging av SM22 og CNN1. (G) SM22 og CNN1 mRNA-uttrykk i CRL1999 under statiske forhold og belastningsforhold. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tosidige Elevs t-tester ble brukt til å sammenligne de to gruppene. Dataene viser gjennomsnittlig ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Cellemorfologi og fenotypiske endringer i BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledet HASMC-OOC. Representativt bilde av F-aktinfarging av BAV-TAAD (A)-avledede primære HASMCs og TAV-TAAD (B)-avledede primære HASMCs under statiske og belastningsforhold. SM22 immunfluorescensfarging i BAV-TAAD (C)-avledet primær HASMCs og TAV-TAAD (D)-avledet primær HASMCs under statiske og belastningsforhold. Representativt bilde av immunfluorescensfarging av CNN1 i BAV-TAAD (E)-avledet primær HASMCs og TAV-TAAD (F)-avledet primær HASMCs under statiske og belastningsforhold. (G) Den relative intensiteten av SM22 og CNN1 immunfluorescensfarging i BAV-TAAD-avledede primære HASMCs. (H) SM22 og CNN1 mRNA-uttrykk i BAV-TAAD-avledede primære HASMCs under statiske og belastningsforhold. (I) Den relative intensiteten av SM22 og CNN1 immunfluorescensfarging i TAV-TAAD-avledede primære HASMCs. (J) SM22 og CNN1 mRNA-uttrykk i TAV-TAAD-avledede primære HASMCs under statiske og belastningsforhold. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tosidig Elevs t-tester ble brukt for å sammenligne de to gruppene. Dataene viser gjennomsnitt ± SD. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Skjematisk instruksjon av utstyrsforberedelse. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den raske utviklingen av mikrofluidisk teknologi har OOC-modeller som kan replikere den biologiske funksjonen og strukturen til ett eller flere organer in vitro, dukket opp de siste årene for applikasjoner innen biologi, medisin og farmakologi15. OOC kan simulere nøkkelfunksjoner i det menneskelige fysiologiske mikromiljøet, avgjørende for å utforske sykdomsmekanismer og fremme preklinisk legemiddeloversettelse 8,16. Selv om OOC fortsatt er i en tidlig fase og det er behov for flere innspill for å optimalisere utformingen av OOC, er det gjort store fremskritt de siste årene17,18. I motsetning til andre tredimensjonale cellekulturmodeller, kan OOC etterligne de biomekaniske parametrene i menneskekroppen som er avgjørende for vevsutvikling og vedlikehold av organfunksjon. Organer og vev i kardiovaskulærsystemet blir stadig utsatt for væskestrømningsindusert skjær og syklisk spenning in vivo. Derfor må in vitro cellulære eksperimenter i kardiovaskulærsystemet utføres i en eksperimentell plattform som gir slike biomekaniske parametere for å oppnå realistiske eksperimentelle resultater som er sammenlignbare med de som er oppnådd fra in vivo-studier.
I denne studien etablerte vi en HASMC-OOC som nøyaktig kan kontrollere parametrene for den biomekaniske stammen som HASMCs blir utsatt for. Det er mulig å kontrollere væskehastigheten og væskeskjæret som cellene blir utsatt for, samt å nøyaktig kontrollere amplituden, frekvensen og rytmen til forskjellige mønstre av syklisk belastning. Av de mange materialene som har blitt brukt innen OOC, er PDMS en av de mest vedtatte 19,20,21. PDMS er gjennomsiktig, fleksibel, biokompatibel og pustende, og disse egenskapene bidrar til bred bruk innen mikrofluidiske chips19. Påførte trykkendringer kan deformere PDMS for å oppnå den mekaniske kraften av sammentrekning og avslapning, og permeabiliteten til PDMS sikrer at cellekulturmiljøet på brikken kan være i samsvar med inkubasjonsbetingelsene på 5% CO2 ved 37 ° C i inkubatoren. Derfor gir PDMS ikke bare kontrollert mekanisk kraft til cellene, men gir også et kulturmiljø som er egnet for normal cellevekst. Våre eksperimentelle resultater viser at morfologien og aktiviteten til celler dyrket i PDMS-brikken er i samsvar med 2D-kulturforhold, noe som indikerer at PDMS er biokompatibel.
Under biomimetiske in vivo fysiologiske forhold blir HASMCs i aortaveggen utsatt for den sykliske stammen på ca. 9% 22. Under patologiske forhold, som hypertensjon, aortadilatasjon og aortaaneurisme, blir HASMCs utsatt for syklisk belastning større enn 16%23. Vi karakteriserte strekkegenskapene til PDMS-brikken, og de eksperimentelle resultatene viser at et vakuumtrykk på 10 kPa induserte 7,18 ± 0,44% belastning og 15 kPa induserte 17,28 ± 0,91% belastning. I tillegg kan frekvensen av belastningen og væskeskjærspenningen styres av dette PDMS-brikkesystemet. Ved bruk av BAV-TAAD og TAV-TAAD pasientavledede primære HASMCs, kan molekylære mekanismer og narkotikascreening av disse aortasykdommene utføres ved hjelp av denne HASMC-OOC in vitro-modellen , som kan replikere sykdomspatogenesen av forskjellige aortasykdommer. Ved hjelp av dette systemet har vi etablert en sykdomsmodell for å studere patogenesen til BAV-TAAD og avslørt at mitokondriell fusjonsaktivator delvis kunne redde mitokondriell dysfunksjon i syke celler24.
HASMC-OOC ble designet basert på inspirasjon og referanse til lung-on-a-chip fra Ingbers arbeid9. Enheten deres replikerte fysiologiske pustebevegelser av alveolene i lungen, og brikken besto av tre lag: øvre og nedre mediumkanaler, en porøs PDMS-membran og to sidevakuumkamre. Sidevakuumkamre kan bare lages i spesialiserte laboratorier med avansert mikrofluidisk utstyr. For å muliggjøre montering under mer generelle laboratorieforhold, plasserte vi vakuumkamrene på toppen og bunnen av brikken. Begge strekktilnærmingene har lignende funksjoner, slik at chipstrukturen kan velges i henhold til laboratorieforholdene og forskningsbehovene slik at det er valgt. I tillegg, for å strukturelt etablere den rørformede strukturen til den humane aorta og oppnå flere biologiske prøver fra cellene for å gjennomføre ytterligere komplekse biologiske analyser og eksperimentelle analyser, etablerte vi en femlags PDMS-brikke med større kanaler, som besto av en midtre mediumkanal, to PDMS-membraner og topp- og bunnvakuumkamre. To PDMS-membraner og de store kanalene til PDMS-brikken økte cellekulturområdet opp til 8,4 cm2, og ga nok prøver til proteinanalyse. De tidligere rapporterte plattformene fokuserte hovedsakelig på å undersøke mindre arteriesykdommer, som en cerebral arterie, perifert fartøy eller andre arterielle sykdommer25,26. Aorta er et stort fartøy med en diameter på 25-35 mm, og tunikamediet i aorta består hovedsakelig av glatte muskelceller som er utsatt for høy strekkbelastning. Patologien til aortopati er forbundet med ombygging av aortaveggen, glatt muskelcelleapoptose og fenotypisk bytte, som alle kan reguleres av mekanisk stress. Dermed er pasientavledede HASMCs og strekkbelastning viktige komponenter for suksessen til HASMC-OOC. Det er imidlertid noen begrensninger i denne studien. HASMC-OOC brukte ikke kokulturerte vaskulære celler, inkludert HASMCs, aorta endotelceller og fibroblaster, som bedre kan simulere in vivo mikromiljøet til den humane aorta og kan brukes til å studere samspillet mellom disse cellene. Selv om HASMCs opplever rytmisk belastning, dyrkes cellene fortsatt på en flat PDMS-membran som ikke klarer å etterligne den ekstracellulære matrisen. I fremtidige studier vil vi overvinne disse begrensningene ved å kombinere mikrofluidiske brikker med 3D-bioprintingsteknologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner at dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) og Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
