Summary
Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning for kunstig intelligens-drevet segmentering av patologibekreftede interesseområder fra fargede, tynne vevsseksjonsbilder for berikelse av histologi-løste cellepopulasjoner ved hjelp av lasermikrodisseksjon. Denne strategien inkluderer en ny algoritme som muliggjør overføring av avgrensninger som betegner cellepopulasjoner av interesse direkte til lasermikroskoper.
Abstract
Tumormikromiljøet (TME) representerer et komplekst økosystem som består av dusinvis av forskjellige celletyper, inkludert tumor-, stroma- og immuncellepopulasjoner. For å karakterisere variasjon på proteomnivå og tumor heterogenitet i stor skala, er det nødvendig med høy gjennomstrømningsmetoder for å selektivt isolere diskrete cellulære populasjoner i faste tumor maligniteter. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt med høy gjennomstrømning, aktivert av kunstig intelligens (AI), som segmenterer bilder av hematoksylin og eosin (H&E)-fargede, tynne vevsseksjoner i patologibekreftede interesseområder for selektiv høsting av histologi-løste cellepopulasjoner ved hjelp av lasermikrodisseksjon (LMD). Denne strategien inkluderer en ny algoritme som muliggjør overføring av regioner som betegner cellepopulasjoner av interesse, kommentert ved hjelp av digital bildeprogramvare, direkte til lasermikroskoper, og dermed muliggjør flere facile samlinger. Vellykket implementering av denne arbeidsflyten ble utført, og demonstrerte nytten av denne harmoniserte metoden for selektiv høsting av tumorcellepopulasjoner fra TME for kvantitativ, multiplekset proteomisk analyse ved høyoppløselig massespektrometri. Denne strategien integreres fullt ut med rutinemessig histopatologigjennomgang, og utnytter digital bildeanalyse for å støtte berikelse av cellulære populasjoner av interesse og er fullt generaliserbar, noe som muliggjør harmoniserte høstinger av cellepopulasjoner fra TME for multiomiske analyser.
Introduction
TME representerer et komplekst økosystem befolket av et svært variert utvalg av celletyper, for eksempel tumorceller, stromale celler, immunceller, endotelceller, andre mesenchymale celletyper og adipocytter, sammen med en kompleks ekstracellulær matrise1. Dette cellulære økosystemet varierer innenfor og på tvers av forskjellige sykdomsorganer, noe som resulterer i kompleks tumor heterogenitet 2,3. Nyere studier har vist at heterogene svulster og svulster med lav tumor cellulæritet (lav renhet) ofte korrelerer med dårlig sykdom prognose 2,3.
For å forstå det molekylære samspillet mellom tumor- og ikke-tumorcellepopulasjoner i TME i stor skala, er standardiserte og høygjennomstrømningsstrategier nødvendig for selektiv høsting av distinkte cellulære populasjoner av interesse for nedstrøms multiomisk analyse. Kvantitativ proteomikk representerer en raskt utviklende og stadig viktigere teknikk for å fremme forståelsen av kreftbiologi. Til dags dato har overvekten av studier som bruker proteomikk gjort det med proteiner ekstrahert fra hele tumorvevspreparater (f.eks. kryopulverisert), noe som fører til en paucity i forståelsen av proteome-nivå heterogenitet i TME 4,5,6.
Utviklingen av prøveinnsamlingsstrategier som sømløst integreres med og utnytter informasjon fra kliniske patologiske arbeidsflyter, vil muliggjøre en ny generasjon histologi-løst proteomikk som er svært komplementære til gullstandardiserte, diagnostiske patologiske arbeidsflyter. LMD muliggjør direkte og selektiv innsamling av cellulære subpopuleringer eller interesseområder (ROIer) gjennom mikroskopisk inspeksjon av histologisk farget vev tynne seksjoner7. Nylige store fremskritt innen digital patologi og AI-aktivert analyse har vist evnen til å identifisere unike komposisjonsegenskaper og ROIer innen TME på en automatisert måte, hvorav mange korrelerer med molekylære endringer og kliniske sykdomsfunksjoner, for eksempel resistens mot terapi og sykdomsprognose8.
Arbeidsflyten som er beskrevet i protokollen som presenteres her, utnytter kommersielle programvareløsninger for å selektivt kommentere tumor-ROIer i digitale histopatologibilder, og bruker programvareverktøy utviklet internt for å overføre disse tumor-ROIene til lasermikroskoper for automatisert innsamling av diskrete cellulære populasjoner av interesse som sømløst integreres med nedstrøms multiomiske analysearbeidsflyter. Denne integrerte strategien reduserer LMD-operatørtiden betydelig og minimerer varigheten som vev er nødvendig for å være ved omgivelsestemperatur. Integrasjonen av automatisert funksjonsvalg og LMD-høsting med kvantitativ proteomikk med høy gjennomstrømning demonstreres gjennom en differensialanalyse av TME fra to representative epitelale ovarialkreft histologiske undertyper, høyverdig serøs eggstokkkreft (HGSOC) og ovarialklart cellekarsinom (OCCC).
Protocol
Alle studieprotokoller ble godkjent for bruk i henhold til en vestlig IRB-godkjent protokoll "En integrert molekylær analyse av endometrial og eggstokkkreft for å identifisere og validere klinisk informative biomarkører" som anses unntatt i henhold til US Federal regulation 45 CFR 46.102(f). Alle eksperimentelle protokoller som involverte menneskelige data i denne studien var i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Informert samtykke ble innhentet fra alle som var involvert i studien.
FORSIKTIG: Følgende reagenser som brukes i hele protokollen er kjente eller mistenkte kreftfremkallende stoffer og/eller inneholder farlige materialer: etanol, DEPC-vann, Mayers Hematoxylin-løsning, Eosin Y-oppløsning, metanol, acetonitril og maursyre. Riktig håndtering, som beskrevet i de respektive sikkerhetsdatabladene (SDS), og bruk av passende personlig verneutstyr (PVU) er obligatorisk.
1. Generere standard figurlistedatafil (SLD) som inneholder kalibratorfiducials
MERK: Protokolltrinnene som er beskrevet i denne delen, er spesifikke for bruk med et invertert lasermikroskop og tilhørende programvare (se materialtabellen). Opprettelse av en standard SLD-fil er bare nødvendig én gang per lasermikroskop. Den resulterende filen kan brukes til å kutte fiducials i alle PEN lysbilder som brukes deretter. Omtrentlig tid: 5 min (kun én gang).
- Åpne LMD-programvaren og last inn membranen av polyetylennatatalat (PEN) på LMD-scenen med forsiden ned, med etiketten nærmest brukeren. Fjern merket for Lukk linje(r) til høyre i programvinduet.
- Bruk PtoP-funksjonen (punkt-til-punkt) under høy forstørrelse (63x) til å tegne tre V-piler for å fungere som kalibreringsfiducials. Start ved ett eksternt punkt på V, tegn en linje til midtpunktet på V og enkeltklikk. Deretter tegner du en ny linje fra det sentrale punktet på V til slutten av det andre eksterne V-punktet, og dobbeltklikker for å opprette én enkelt V-figur uten sidestykke fra de to linjene.
MERK: Disse kalibreringsfiducials bør plasseres i tre hjørner av lysbildet: foran høyre, bakre høyre, bakre venstre. - Velg AF (autofokus) før du klipper ut alternativet. Klipp lysbildet i posisjon 1, flytt det inn i hver av de gjenværende skyveposisjonene, og spor nøyaktig over kalibreringskuttene.
- Lagre SLD-filen, og velg alternativet Lagre uten kalibrering fra popup-dialogboksen for å unngå å skjære kalibreringsfiducials inn i membranen.
MERK: En representativ .sld-fil som inneholder standard kalibratorfiducials for fire lysbildestillinger er gitt i Supplemental File 1.
2. Forberedelse(e) til LMSD-lysbilde(er)
MERK: Protokolltrinnene som er beskrevet i denne delen, er spesifikke for bruk med et invertert lasermikroskop og tilhørende programvare (se materialtabellen). Omtrentlig tid: 5 min.
- Påse at skredet er helt tørt før du skjærer referansekalibreringsfiducials. Åpne LMD-programvaren, og åpne standardkalibreringsfilen sld under alternativet Importer figurer .
- Velg AF (autofokus) før du klipper ut alternativet. Legg lysbildet(e) med vevet vendt ned, og etiketten glir nærmere operatøren inn i skyveholderen på LMD-stadiet.
- Bruk lasermikroskopet og standard kalibreringsfilen sld til å kutte kalibreringsfiducials i PEN-membranen.
- VALGFRITT: Skjær kalibreringsfiducials i PEN membranen enten før eller etter at vevsdelen(e) er plassert på lysbildet. Hvis kalibreringsfiducials er kuttet før vev plassering, sørg for at vevet og / eller fixative ikke overlapper med kalibratorene når vevet er plassert på lysbildet i trinn 2.5. Hvis kalibreringsfiducials kuttes etter vevsplassering, stopp etter ferdigstillelse av trinn 2.4 og fortsett til avsnitt 3.
- Gjennomgå alle kalibratorer individuelt for å sikre at hvert kutt er komplett og synlig.
MERK: Bruk Move and Cut-funksjonen til å dirigere laseren manuelt over eventuelle kalibreringsfiducials som ikke kuttet helt gjennom PEN-membranen. - Plasser den frosne eller formalin-faste, parafin-innebygde (FFPE) vevsdelen på lysbildet som inneholder kalibreringsfiducials.
3. Vev flekker
MERK: Omtrentlig tid: 30 min.
- Fest de frosne LMD-vevssklier i 70% etanol (EtOH) som inneholder fosfatasehemmer cocktailreagenser i 5 min.
- Vask lysbildene i dietyl pyrokarbomat (DEPC) vann som inneholder fosfatasehemmer cocktailreagenser i 1 min.
- Vask skliene i DEPC vann i 1 min.
- Inkuber lysbildene i Mayers Hematoxylin-løsning i 3 min.
- Skyll skliene i DEPC-vann i 3 min.
- Skyll skliene i en ny utveksling av DEPC-vann i 1 min.
- Inkuber lysbildene i vandig Eosin Y-løsning i 1 s.
- Skyll lysbildene 2 x 5 s i 95% EtOH.
- Skyll lysbildene 3 x 10 s i 100% EtOH.
- Tørk av overflødig EtOH fra baksiden av lysbildene og la lysbildene lufttørke.
- Oppbevar skliene ved -80 °C hvis LMD ikke skal utføres umiddelbart.
4. Lysbildebilder
MERK: Protokolltrinnene som er beskrevet i denne delen, er spesifikke for skannede lysbilder (se materiallisten) og de resulterende bildene som er lagret som SVS-filer. Bruk en skanner og tilhørende programvare som genererer bildefiler i et format som bildeanalyseprogramvaren (se materialfortegneren) kan åpne. Filtyper som bruker pyramidale tiffs som støttes inkluderer JPG, TIF, MRXS, QPTIFF, komponent TIFF, SVS, AFI, SCN, LIF, DCM, OME. TIFF, ND2, VSI, NDPI, NDPIS, CZI, BIF, KFB og ISYNTAX. Omtrentlig tid: 5 min.
- Slå på skanneren, og åpne programvaren for lysbildeskanneren. Legg lysbildet med vevet vendt opp på det ene lysbildetrinnet i skanneren. Sørg for at gliden er helt tørr og legg forsiktig en deksle over vevet. Ikke bruk etanol eller nedsenkningsolje under dekslene.
- Ta opp mikrografbildet ved hjelp av innstillinger kalibrert for å justere for PEN-membranen i stedet for glassbakgrunn og for å ignorere bakgrunnsmembranfarging, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Juster bildeområdet ved å dra og endre størrelse på den indre grønne omkretsen for å fange opp hele PEN-membranområdet etter behov. Legg til fire fokuspunkter på vevet ved å dobbeltklikke på bildet av øyeblikksbildeoversikten, og tre fokuspunkter på membranen nær kalibreringsfiducials (ett fokuspunkt per hver av de tre kalibreringsfiducials).
MERK: De fire fokuspunktene kan plasseres nesten hvor som helst på vevsdelen, selv om det å plassere på vev som er for mørkt farget og ser svart ut, kan føre til at skanningen mislykkes. - Velg Videoovervåking på Vis-menyen. Juster fokuset manuelt ved hjelp av glidebryteren for fin- og/eller makrofokus etter behov for hvert punkt rundt LMD-vevet. Ta bildeskanningen under høy forstørrelse (20x). Kontroller at alle kalibreringsfiducials er synlige og klare i det lagrede bildet.
5. Automatisert funksjonsvalg ved hjelp av bildeanalyseprogramvare
- For hele tumorsamlinger (omtrentlig tid: 5 min; caseavhengig):
- Åpne bildeanalyseprogramvaren (se materialfortegneren). Velg Åpne bilder , og velg SVS-bildefilen som genereres fra skanningen av lysbildet på AT2-skanneren, i popup-vinduet.
MERK: En representativ SVS-bildefil finnes i tilleggsfil 2. - Gå til Merknader-fanen . Velg pennverktøyet på merknadsverktøylinjen , og tegn en form rundt vevet.
- Merk figuren, og høyreklikk bildet. Velg Partisjonering (side ved side) på rullegardinmenyen Avansert. Angi flisstørrelse og avstand mellom henholdsvis 500 og 40, og velg OK for å generere flisene. Merk og slett perimeterfiguren som brukes til å generere flisene i trinn 5.1.2.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Eksporter for å lagre merknadene side ved side som en MERKNAD-fil.
MERK: En representativ .annotation-fil for en hel tumorvevssamling er gitt i Supplemental File 3. - Opprett en mappe for økten eller prosjektet, og lagre MERKNAD-filen i en undermappe merket med den unike identifikatoren for lysbildet.
- Gå til Merknader-fanen . Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Slett alle lag for å fjerne alle merknader fra bildet. Velg pennverktøyet , og tegn en kort linje fra den indre spissen av pilspissen for hver kalibreringsfiducial. Tegn linjene fra merkene i følgende rekkefølge: øverst til venstre, øverst til høyre, nederst til høyre.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Eksporter for å lagre linjemerknadene som en MERKNAD-fil. Legg til _calib i filnavnet, og plasser filen i undermappen som inneholder koordinatene for figurene side ved side.
MERK: En representativ _calib.annotation-fil finnes i tilleggsfil 4. - Kopier adressen for hovedprosjektet eller øktmappen. Åpne XML-importgenererende skript, "Malleator" (tilgjengelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), bruk det integrerte utviklingsmiljøet i IDLE og lim inn prosjektmappeadressen mellom anførselstegnene nederst i skriptet.
- Velg rullegardinmenyen Kjør | Kjør modul for å kjøre skriptet.
MERK: Den .xml LMD-importfilen genereres inne i undermappen som er opprettet for bildet/lysbildet. Du finner en representant .xml fil i tilleggsfil 5.
- Åpne bildeanalyseprogramvaren (se materialfortegneren). Velg Åpne bilder , og velg SVS-bildefilen som genereres fra skanningen av lysbildet på AT2-skanneren, i popup-vinduet.
- Bare for LMD-berikede samlinger (omtrentlig tid: 15 min; caseavhengig):
- Åpne bildeanalyseprogramvaren (se materialfortegneren). Velg Åpne bilder , og velg SVS-bildefilen som genereres fra skanningen av lysbildet, i popup-vinduet.
- Gå til Merknader-fanen . Merk og bruk rektangelmerknadsverktøyet til å tegne en boks rundt vevet.
- Merk av i boksen merknad og høyreklikk på bildet. Velg rullegardinmenyen Avansert | Partisjoneringsalternativ (side ved side). Angi flisstørrelse og avstand mellom henholdsvis 500 og 40, og velg OK for å generere flisene. Merk og slett perimeterboksmerknaden som brukes til å generere flisene i trinn 5.2.2.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Eksporter for å lagre merknadene side ved side som en MERKNAD-fil.
- Plasser en lagret kopi av Python "Dapọ" (tilgjengelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022) algoritme, utviklet for å slå sammen AI-klassifiserte merknadslag, i samme mappe som flislagte merknadsfilen.
- Kopier navnet på merknadsfilen side ved side. Åpne Python-programmet ved hjelp av det integrerte utviklingsmiljøet i IDLE, og lim inn navnet på merknadsfilen side ved side mellom sitatene nederst i programmet.
- Velg rullegardinmenyen Kjør | Kjør modul. Vent til det genereres en ny fil som vil få alle merknadene side ved side slått sammen under ett enkelt lag.
- Åpne bildeanalyseprogramvaren og naviger til Merknader-fanen . Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Slett alle lag for å fjerne alle merknader fra bildet.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Importer lokal merknadsfil. I popup-vinduet velger du den flettede MERKNAD-filen som ble generert av skriptet. Kontroller at alle importerte fliser er under samme merknadslag.
- Gå til Klassifiserer-fanen , og følg produsentens instruksjoner for å generere figurer for ROIene. Før du kjører klassifisereren, velger du ønsket(e) merknadslag (dvs. svulst- eller stromalaget) ved å merke av i ROI-boksen eller boksene i kategorien Merknader under Avanserte klassifisereralternativer. Bruk alternativet Merknadslag på Klassifisererhandlinger-menyen til å kjøre klassifisereren.
- Når klassifisereranalysen er fullført, navigerer du til Merknader-fanen og velger merknadslaget som genereres fra analysen. Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Slett alle lag unntatt gjeldende for å fjerne alle andre merknadslag fra bildet.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Eksporter for å lagre merknadene som en MERKNAD-fil. Opprett en mappe for økten eller prosjektet, og lagre MERKNAD-filen i en undermappe merket med den unike identifikatoren for lysbildet.
MERK: En representativ .annotation-fil for en klassifisert LMD-beriket vevssamling er gitt i Supplemental File 6. - Gå til Merknader-fanen, velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Slett alle lag for å fjerne alle merknader fra bildet. Velg pennverktøyet og tegn en kort linje fra hver kalibreringsfiducial. Tegn linjer fra merkene i følgende rekkefølge: øverst til venstre, øverst til høyre, nederst til høyre.
- Velg rullegardinmenyen Laghandlinger | Eksporter for å lagre linjemerknadene som en MERKNAD-fil. Legg til _calib i filnavnet, og plasser filen i undermappen som inneholder koordinatene for figurene side ved side.
- Kopier adressen for hovedprosjektet eller øktmappen. Åpne XML-importgenererende skript, "Malleator" (tilgjengelig via https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022), ved hjelp av det integrerte utviklingsmiljøet IDLE, og lim deretter inn prosjektmappeadressen mellom anførselstegnene nederst i skriptet.
- Velg rullegardinmenyen Kjør | Kjør modul for å kjøre skriptet.
MERK: Den .xml LMD-importfilen vil generere innsiden av undermappen som er opprettet for bildet / lysbildet.
6. Laser mikrodissection
MERK: Protokolltrinnene som er beskrevet i denne delen, er spesifikke for bruk med et invertert lasermikroskop og tilhørende programvare (se materialtabellen). Omtrentlig tid: 2 timer; avhengig av sak.
- Legg den merkede membranskuffen (som inneholder kalibreringsfiducials) med vevet vendt ned og etikettsiden nærmere operatøren inn i skyveholderen på lasermikroskopstadiet.
- Velg Importer figurer på rullegardinmenyen Fil . Velg .xml LMD-importfil som genereres for lysbildet. Velg Nei i popup-vinduet for å unngå å laste inn referansepunkter fra fil og Nei i det andre popup-vinduet for å unngå å bruke tidligere lagrede referansepunkter for kalibrering.
- Følg instruksjonene fra LMD-programmet og juster kalibreringskrysset til hver av de tre kalibreringsfiducialene på lysbildet. Se etter kalibreringsfiducials som vises øverst til venstre, øverst til høyre og nederst til høyre i lysbildebildet i bildeanalyseprogramvaren som tilsvarer referansepunktene henholdsvis foran til høyre, bak til høyre og bakre venstre hjørner av det inverterte LMD-lysbildet på mikroskopstadiet. Bytt mellom å bruke det 5x objektive objektivet for å finne og 63x-målet for å justere hver kalibreringsfiducial. Velg Nei i popup-vinduet for å unngå å lagre referansepunktene til filen og OK i det andre popup-vinduet for å bekrefte at lysbildet er satt inn.
- Flytt objektivet med 5x objektiv på plass, og velg Ja i popup-vinduet for å bruke den faktiske forstørrelsen. Når de importerte figurene vises, fokuserer du kameraet på vevet.
- Merk og merk alle figurene i figurlistevinduet , dra dem på plass ved hjelp av én eller to merknader i synsfeltet som referanser, og juster den loddrette z-aksen for kutting med laseren.
- Se gjennom de importerte figurene, og tilordne dem til riktig rørposisjon for innsamling. Trykk startkutt for å starte laseren.
MERK: Importerte figurer i .xml-filen tilordnes automatisk til "ingen hette"-posisjonen i Figurliste-vinduet . For å høste vev må de importerte formene tilordnes på nytt til en posisjon som inneholder et lastet rør.
7. Protein fordøyelse ved trykksyklus teknologi (PCT)
MERK: Omtrentlig tid: 4 timer (3 timer uten vakuumsentrifugeringstid).
- Plasser 0,5 ml rør som inneholder de avkappede PCT MicroTubes som inneholder LMD høstet vev i 20 μL 100 mM TEAB/10% acetonitril i en termosycler og varme ved 99 °C i 30 minutter, og avkjøl deretter til 50 °C i 10 minutter.
- Snurr rørene i 30 s ved 4000 × g og fjern deretter MicroTubes fra 0,5 ml rørene. Bruk MicroCap-verktøyet til å fjerne og kaste MicroCaps fra PCT MicroTubes. Legg til trypsin (se materialtabellen) med et forhold på 1 μg per 30 mm2 vev og sett en MikroPestle inn i MicroTube ved hjelp av MicroCap-verktøyet.
- Overfør MicroTube-ene til en barocycler-patron og monter hele patronen. Sett patronen inn i barocyclertrykkkammeret og fest lokket. Barocycle ved 45.000 psi i 50 s og atmosfærisk trykk i 10 s ved 50 °C i 60 sykluser.
- Når barocycling er fullført, overfør mikrorørene til et 0,5 ml mikrosenterrør og sentrifuge i 2 minutter ved 4000 × g.
- Fjern MicroTube fra 0,5 ml mikrosenterrør ved hjelp av hetteverktøyet. Fjern forsiktig pestle ved hjelp av hetteverktøyet og skyll den nederste halvdelen av pestle med 20 μL flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS)-grade vann og samle vasken i et rent 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Trykk forsiktig på MicroTube på benkeplaten for å flytte væsken til bunnen og overføre all løsningen fra MicroTube til 0,5 ml mikrosenterrør.
- Tilsett 20 μL LC-MS-grade vann til MicroTube og trykk forsiktig på benkeplaten. Overfør vaskeløsningen til 0,5 ml-røret og gjenta dette vasketrinnet igjen.
- Støvsug sentrifugen for å tørke ned prøvene til ~2 μL og tilsett 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0.
- Bestem peptidkonsentrasjonen ved hjelp av en kolorimetrisk analyse (bicinchoninic acid (BCA) analyse; se materialtabellen) i henhold til produsentens protokoll.
8. Tandemmassemerke (TMT) merking og EasyPep-opprydding
MERK: Omtrentlig tid: 7 t 20 min (2 t 20 min uten vakuum sentrifugering tørketid).
- Bring de isobariske TMT-merkingsreagensene til omgivelsestemperatur før åpning. Tilsett 500 μL 100 % acetonitril til hvert TMT-hetteglass (5 mg). Inkuber i 10 min med sporadisk virvel.
- Løs opp 5 μg av peptidprøven i 100 μL 100 mM TEAB, pH 8,0, og tilsett 10 μL av et gitt TMT-reagens. Konstruer og inkluder referanseutvalg som representerer hvert enkelt utvalg i eksperimentet i hvert TMT multiplekssett med prøver for å lette kvantifisering av prøver på tvers av flere TMT-multiplekser9. Inkuber reaksjoner i 1 time ved omgivelsestemperatur med sporadisk risting/tapping.
- Slukk TMT-merkingsreaksjonen ved å tilsette 10 μL 5 % hydroksylamin og inkubere i 30 minutter ved omgivelsestemperatur med sporadisk tapping. Etter slukking kombinerer du TMT-merkede prøver i ett rør og tørker til ca. 200 μL.
- Tilsett 1800 μL 0,1% maursyre. Kontroller pH med pH-papir: Hvis pH ~ 3, tilsett 1 ml 0,1% maursyre; Hvis pH >3, tilsett 10-20 μL 5 % maursyre til pH ~3. Tilsett 0,1% maursyre for å bringe til et endelig volum på 3 ml.
- Fjern tappen nederst på Peptide Clean-up Column, fjern hetten og legg den i et 15 ml konisk rør. Overfør den TMT-merkede prøven til kolonnen og fortsett med opprydding i henhold til produsentens protokoll.
- Vakuum sentrifuge å tørke ned de eluted peptider til ~ 20 μL, overføre til et LC hetteglass ved hjelp av 25 mM ammonium bikarbonat for et endelig volum på 80 μL, og fortsett til offline fraksjonering.
9. TMT multiplex prøvefraksjonering og sammenslåing
MERK: Omtrentlig tid: 3 t 30 min (1 t 30 min uten vakuumsentrifugeringstid).
- Fraksjoner TMT-merkede peptid multiplekser ved grunnleggende omvendt fasekromatografi til 96 fraksjoner ved å utvikle en økende lineær gradient (0,69% min-1) av mobil fase B (acetonitril) i mobil fase A (10 mM NH4HCO3, pH 8.0).
- Generer 36 sammenkoblede brøker ved å samle prøvebrønner. Vakuum sentrifuge til tørre fraksjoner til ~ 2 μL og resuspend i 25 mM ammoniumbikarbonat (sluttkonsentrasjon 1,5 μg / 10 μL), sentrifuge ved 15.000 × g i 10-15 min, og overfør til LC-hetteglass for MS-analyse.
10. Flytende kromatografi tandem masse spektrometri (LC-MS / MS)
MERK: Omtrentlig tid: Instrumentmetode og eksperimentell designavhengig.
- Kalibrer massespektrometeret i henhold til produsentens instruksjoner/protokoller.
- Forbered ferske mobile faser og standarder og utfør passende LC-forløpspreparater (inkludert, men ikke begrenset til, rense løsemidler, spyleluft og lekkasjetestskript for det refererte instrumentet [se materialtabellen]). Likevekts pre- og analytiske kolonner og prøvesløyfe før oppstart av analyser.
- Før og mellom serielle TMT multiplex-analyser, må du kontrollere at LC-MS-systemet oppfyller tidligere benchmarkede ytelsesmålinger ved hjelp av kvalitetssikring/kvalitetskontroll (QA/QC) TMT-merkede peptidsammendrag og (f.eks. MSPE (se materialtabellen), HeLa).
- Last inn autosampler hetteglass i riktige posisjoner i LC autosampler. Analyser individuelle brøker med en passende gradient/MS-metode. Intersperse en "vask" løp med peptid standard (f.eks peptid oppbevaring tid kalibrering [PRTC]) omtrent en gang daglig for å evaluere kromatografisk og masse spektral ytelse. Etter analysen av hver TMT multiplex utvalgsfraksjonsserie, kjør QA / QC TMT benchmark-standarder for å evaluere systemytelsen.
- Kjør evalueringsrutiner for massespektrometer etter QA/QC TMT-benchmark-standarder for å vurdere ytelsen etter prøven og deretter kalibrere systemet som i trinn 10.1 for neste prøvesett.
11. Bioinformatisk dataanalyse
MERK: Omtrentlig tid: Eksperimentell designavhengig.
- Overfør alle eksempeldata (f.eks. .raw filer) til en passende nettverkslagrings-/datastasjon.
- Søk alle brøker sammen ved hjelp av ønsket dataanalyseapplikasjon (f.eks. Proteome Discover, Mascot) ved hjelp av passende parametere9 mot en artsspesifikk proteinreferansedatabase for å generere peptidspektralkamper (PSMer) og trekke ut TMT-reporterionsignalintensiteter. Filtrer PSMer basert på passende kvalitetskontrollmålinger, og aggreger normalisert, median logg 2-transformert TMT-reporterion ratio overflod til globale proteinnivåoverflod, som tidligere beskrevet 3,9.
- Sammenlign proteinendringer i interesseforhold ved hjelp av ønsket differensialanalyseprogramvare.
Representative Results
Ferske frosne vevstynne seksjoner fra to HGSOC- og to OCCC-pasienter ble analysert ved hjelp av denne integrerte AI-drevne vevs-ROI-identifikasjonen, segmenteringen, LMD og kvantitativ proteomisk analysearbeidsflyt (figur 1). Representative H&E-farget vevsseksjoner for hver svulst ble gjennomgått av en styresertifisert patolog; tumor cellulæritet varierte fra 70% til 99%. Vev ble tynnseksjonert på PEN membran lysbilder (Supplemental File 2) og precut med calibrator fiducials (Supplemental File 1), muliggjør integrering av posisjonsorienterte data fra merknader generert i bildeanalyse programvare (se tabell over materialer) med kartesisk koordinat orientering i LMD programvare. Etter H&E-farging ble høyoppløselige bilder (20x) av PEN-lysbildene som inneholder vevet pluss kalibratorer, tatt.
Tumor- og stromalcellepopulasjoner i mikrografene ble segmentert ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (se materialtabellen) for selektiv høsting av LMD, sammen med innhøstinger som representerer hele vevets tynne seksjon (f.eks. hele tumorvevet) (figur 1). Ikke-diskriminerende merknader for hele tumorvevssamlinger ble generert ved å partisjonere hele vevsdelen med fliser på 500 μm2, og etterlot et 40 μm gap mellom fliser for å opprettholde PEN-membranintegriteten og forhindre membranen i å krølle seg under LMD. På lysbilder for histologi-løst LMD-berikelse ble AI-klassifisereren i bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen) opplært til å diskriminere mellom tumor- og stromalceller, sammen med den tomme glassskliebakgrunnen. Representative tumor-, stroma- og blanke glassregioner ble manuelt fremhevet, og klassifisererverktøyet ble brukt til å segmentere disse ROIene gjennom hele vevsdelen. De segmenterte lagene som representerer hele vevet, tumorepitelet og stroma ble lagret separat som individuelle .annotation-filer (Supplemental File 3 og Supplemental File 6). I en egen kopi av bildefilen (uten de partisjonerte ROI-merknadene) ble en kort linje fra den midtste spissen av hver av de tre fiduciale kalibratorene kommentert og lagret som en .annotation-fil med samme filnavn som hver av LMD-merknadslagfilene, men tilføyd med suffikset "_calib" (Supplemental File 4). Disse linjene ble brukt til å samtidig registrere posisjonen til PEN-membrankalibratorene med merknadsfigurlistedataene som er tegnet i bildeanalyseprogramvaren.
Den nåværende studien gir to algoritmer, "Malleator" og "Dapọ" i Python for å støtte denne AI-drevne LMD-arbeidsflyten, som er tilgjengelig på https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022. Malleator-algoritmen trekker ut de spesifikke kartesiske koordinatene for alle individuelle merknader (vevs-ROI og kalibratorer) fra de sammenkoblede .annotation-filene og slår sammen disse til en enkelt XML-importfil (Extensible Markup Language) (tilleggsfil 5). Nærmere bestemt bruker Malleator-algoritmen katalognavnet fra en overordnet mappe som inndata for å søke i alle undermapper og genererer .xml filer for undermapper som ikke allerede har en .xml sammenslåtte filen. Malleator-algoritmen slår sammen alle merknadslag i bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen) til ett enkelt lag og konverterer de AI-genererte formlistedataene, som lagres som proprietær .annotation-filtype, til .xml format som er kompatibelt med LMD-programvaren. Etter å ha slått sammen merknads- og kalibratorfilene, lagres og importeres den algoritmegenererte .xml filen til LMD-programvaren. Små justeringer er nødvendige for å justere justeringen av merknader manuelt, som også tjener til å registrere den vertikale (z-plan) posisjonen til glidetrinnet på lasermikroskopet. Den Dapọ algoritmen brukes spesielt for LMD-berikede samlinger. Partisjonerte fliser tilordnes automatisk til individuelle merknadslag av bildeanalyseprogramvaren. Den Dapọ algoritmen slår sammen alle partisjonerte fliser til ett enkelt merknadslag før bruk av klassifisererverktøyet, og reduserer dermed kjøretiden for klassifisereranalyse for LMD-berikede samlinger.
Hele tumor- og LMD-berikede vevsprøvene ble fordøyd, merket med TMT-reagenser, multipleksede, fraksjonerte offline og analysert via kvantitativ MS-basert proteomikk som tidligere beskrevet9. Gjennomsnittlig peptidutbytte (43-60 μg) og utvinning (0,46-0,59 μg/mm2) for prøver høstet ved hjelp av denne AI-drevne arbeidsflyten var sammenlignbar med tidligere rapporter 9,10. Totalt 5971 proteiner ble kvantifisert på tvers av alle prøver (Supplemental Table S1). Uovervåket hierarkisk klynge ved hjelp av de 100 mest variable proteinene resulterte i segregering av HGSOC- og OCCC-histotypene fra de LMD-berikede og hele tumorprøvene (figur 2A), tilsvarende det som tidligere er beskrevet11. Til sammenligning grupperte de LMD-berikede stromaprøvene fra både HGSOC og OCCC sammen og uavhengig av LMD-beriket svulst og hele tumorprøver. Blant de 5 971 kvantifiserte proteinene ble 215 signifikant endret (LIMMA adj. p < 0,05) mellom hele tumorsamlinger fra HGSOC- og OCCC-prøver (Supplemental Table S2). Disse endrede proteinene ble sammenlignet med de som ble identifisert for å skille HGSOC og OCCC tumorvev av Hughes et al.11. Av de 76 signaturproteinene som ble kvantifisert av Hughes et al., ble 57 co-kvantifisert i dette datasettet og var svært korrelert (Spearman Rho = 0,644, p < 0,001) (figur 2B).
Figur 1: Sammendrag av den integrerte arbeidsflyten for automatisert vevsregion av interessevalg for lasermikrodeisseksjon for nedstrøms kvantitativ proteomikk. Kalibreringsfiducials er kuttet på PEN membran lysbilder for å samtidig registrere posisjonsretningsdata fra AI-avledede segmenter av vev avkastning i bildeanalyse programvare, HALO, med horisontal posisjonering på LMD mikroskop. Malleator-algoritmen brukes til å slå sammen de kommenterte segmenteringsdataene på tvers av alle merknadslag for et lysbilde med _calib referansefilen, og til å konvertere den til en .xml fil som er kompatibel med LMD-programvaren. LMD-høstet vev for proteomisk analyse fordøyes og analyseres av kvantitativ proteomikk med høy gjennomstrømning som tidligere beskrevet9. Forkortelser: LMD = lasermikrodisseksjon; AVKASTNING = interesseområde; TMT = tandemmassemerke; Kvant. = kvantifisering; Ident. = identifikasjon; LC-MS/MS = flytende kromatografi-tandem massespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Analyse av proteinene i LMD-berikede og hele tumorprøver. (A) Uovervåket hierarkisk klyngeanalyse av de 100 mest varierte rikelige proteinene i HGSOC og OCCC LMD beriket og hele tumorprøver. (B) Korrelasjon av log2 fold-change protein overflod mellom HGSOC og OCCC hele tumor høster i den nåværende studien (Mitchell et al., x-axis) og en lignende studie av Hughes et al. (y-axis)11. Forkortelser: LMD = lasermikrodisseksjon; HGSOC = høyverdig serøs eggstokkkreft; OCCC = ovarial klarcellekarsinom; log2FC = logg2-transformert proteomisk overflod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende tabell S1: Overflod av 5971 proteiner kvantifisert på tvers av alle LMD-berikede og hele tumorprøver fra HGSOC- og OCCC-vevsprøver. Forkortelser: LMD = lasermikrodisseksjon; HGSOC = høyverdig serøs eggstokkkreft; OCCC = ovarial klarcellekarsinom. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell S2: Differensialt uttrykte proteiner (215) i hele tumorsamlinger fra HGSOC vs OCCC (LIMMA adj. p < 0,05). Forkortelser: HGSOC = høyverdig serøs eggstokkkreft; OCCC = ovarial klarcellekarsinom. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Representativ figurlistedatafil (SLD) som inneholder standard kalibratorfiducials for fire lysbildestillinger. Filen kan importeres til LMD-programvaren. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Representativ .svs bildefil av en H&E-farget høyoppløselig (20x) vevsseksjon. Filen kan åpnes og vises ved hjelp av bildeanalyse programvare eller LMD programvare. Forkortelse: H&E = hematoksylin og eosin; LMD = lasermikrodisseksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Representativ .annotation-fil av partisjonerte hele tumorsegmenter. Filen kan importeres til bildeanalyseprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Representativ _calib.annotation-fil av kalibratorfidusialsegmenter. Koordinatinformasjon representerer orientalsk posisjonering av de korte kalibratorlinjene som trekkes fra hver pilspissfiducial. Filen kan importeres til bildeanalyseprogramvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Representativt utvidbart kodespråk (.xml) fil generert av Malleator-algoritmen. Filen kan importeres til laser mikrodissection programvare. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Representativ .annotation-fil av partisjonerte AI-klassifiserte segmenter for LMD-berikede samlinger. Filen kan importeres til bildeanalyseprogramvare. Forkortelser: AI = kunstig intelligens; LMD = lasermikrodisseksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Mens det har vært flere studiepresedenser som tar sikte på å utvikle og/eller forbedre arbeidsflyter for berikelse av målcelleunderbefolkninger fra FFPE og/eller ferskfrossen vev og metoder for å opprettholde prøvekvaliteten under behandling av 9,12,13,14,15, er det et betydelig behov for å utvikle automatiserte strategier for å forberede kliniske vevsprøver for molekylære analyser for å redusere variasjon og øke reproduserbarheten. Denne arbeidsflyten beskriver en standardisert, halvautomatisert protokoll som integrerer eksisterende programvareverktøy for bildeanalyse (se materialtabellen) for histologi-løst høsting av diskrete cellepopulasjoner av LMD fra kliniske vevsprøver.
Romlig løst LMD-berikelse av ROIer som fanger diskrete cellepopulasjoner representerer et neste generasjons vevsbehandlingstrinn før multiomiske analyser for å forbedre molekylær karakterisering og identifisering og legge til rette for celleselektiv biomarkøroppdagelse. Denne protokollen forbedrer eksisterende metoder ved å redusere den ofte lange eksponeringen av vevsseksjoner til omgivelsesmiljøet som er forbundet med manuell segmentering av avkastning av en histolog (som kan ta > 1-2 timer før LMD-samlingen). Denne arbeidsflyten gjør det i stedet mulig for avkastning å bli preidentifisert av AI-veiledet klassifisering og segmentering. Begrensning av vevsboende tid vil redusere falske variasjoner i vurderingene av svært labile molekylære mål, som fosfopeptider og mRNA, eller for antistoffbaserte analytiske teknikker som er avhengige av at et målprotein er i sin opprinnelige konformasjon for deteksjon.
Å kutte ryddige kalibratorfiducials på PEN-membranlysbildet som er tydelig synlige i det skannede lysbildebildet, er en av nøkkelkomponentene som muliggjør integrering av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen) med LMD-arbeidsflyten. Ved å sikre at kalibratorene har et presist ("rent") punkt nederst på "V"-formen, kan du velge et presist punkt i bildeanalyseprogramvaren for kalibratorlinjene som skal trekkes fra, som beskrevet i trinn 5.1.6 og 5.2.13. Justering av disse punktene under import til LMD-programvaren er avgjørende for å legge merknadene riktig over (tilrettelagt gjennom genereringen av en kompatibel .xml fil ved hjelp av algoritmene "Malleator" og/eller "Dapọ" ) på den relevante vevs-ROI på det fysiske LMD-lysbildet. Det er nødvendig å markere alle former og kollektivt "dra og slipp" på plass selv når justeringen er presis ved import til LMD-programvaren for å registrere den vertikale (z-plan) posisjonen til lysbildetrinnet på lasermikroskopet. Mindre justeringer av plasseringen av merknadene over vevet ROI kan også gjøres i løpet av dette trinnet, om nødvendig.
En begrensning av den nåværende versjonen av Malleator-algoritmen er at den ikke er kompatibel med de forhåndsdefinerte merknadsformverktøyene som tilbys av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen), selv om fremtidige oppdateringer / versjoner av algoritmen vil ta sikte på å forbedre denne kompatibiliteten. MERKNAD-filen for figurer som tegnes ved hjelp av disse verktøyene, inneholder bare to sett med sammenkoblede x- og y-koordinater for hver merknad, uten fullstendig romlig retning rundt disse punktene. Gjeldende bruk av disse verktøyene fører til at merknadene konverteres til rette linjer som er definert av bare to punkt under importprosessen. Manuell definisjon av vevs-ROI-segmenter kreves for vellykket konvertering til XML-format og LMD-import. Dette kan enten utføres ved å definere hver avkastning manuelt med individuelle frihånds polygonale merknader som er spesifikke for målområdet, eller ved å bruke en tilnærmet sirkulær eller rektangulær merknad på tvers av alle vevs-ROI-segmenter, om ønskelig, og vil være kompatible med denne arbeidsflyten.
Mens arbeidsflyten som presenteres her ble demonstrert for proteomisk analyse av ferskfrossen humane kreftvevsprøver, kan denne AI-drevne LMD-arbeidsflyten brukes tilsvarende med FFPE-vev, ikke-kreftfremkallende vevstyper og de fra ikke-menneskelige kilder. Den kan også støtte andre nedstrøms molekylære profileringsarbeidsflyter, inkludert transkripsjons-, genomiske eller fosfoproteomiske analyser. Denne arbeidsflyten kan også utnytte annen bruk av bildeanalyseprogramvaren (se materialtabellen), inkludert med funksjoner knyttet til celletelling eller andre analytiske moduler, inkludert "Multiplex IHC"-modulen eller "Tissue Microarray (TMA) Add-on". Fremtidige anvendelser av denne arbeidsflyten kan også dra nytte av å forhåndsdefinere antall celler per AVKASTNING-segment, og dermed sikre tilsvarende cellulære inndata på tvers av flere samlinger, eller ved å bruke alternative metoder for å definere cellulære ROIer av interesse, for eksempel ved immunhiistokjemi eller cellesosiologi.
Disclosures
T.P.C. er medlem av ThermoFisher Scientific, Inc SAB og mottar forskningsmidler fra AbbVie.
Acknowledgments
Støtten til dette prosjektet ble delvis gitt av Defense Health Program (HU0001-16-2-0006 og HU0001-16-2-00014) til Uniformed Services University for Gynecologic Cancer Center of Excellence. Sponsorene hadde ingen rolle i utformingen, utførelsen, tolkningen eller skrivingen av studien. Ansvarsfraskrivelse: Synspunktene som uttrykkes her er forfatternes og gjenspeiler ikke den offisielle politikken til Department of Army / Navy / Air Force, Department of Defense eller U.S. Government.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1260 Infinity II System | Agilent Technologies Inc | Offline LC system | |
| 96 MicroCaps (150uL) in bulk | Pressure Biosciences Inc | MC150-96 | |
| 96 MicroPestles in bulk | Pressure Biosciences Inc | MP-96 | |
| 96 MicroTubes in bulk (no caps) | Pressure Biosciences Inc | MT-96 | |
| 9mm MS Certified Clear Screw Thread Kits | Fisher Scientific | 03-060-058 | Sample vial for offline LC frationation and mass spectrometry |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A995-4 | Mobile phase solvent |
| Aperio AT2 | Leica Microsystems | 23AT2100 | Slide scanner |
| Axygen PCR Tubes with 0.5 mL Flat Cap | Fisher Scientific | 14-222-292 | Sample tubes; size fits PCT tubes and thermocycler |
| Barocycler 2320EXT | Pressure Biosciences Inc | 2320-EXT | Barocycler |
| BCA Protein Assay Kit | Fisher Scientific | P123225 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Easy-nLC 1200 | Thermo Fisher Scientific | Liquid Chromatography | |
| EasyPep Maxi Sample Prep Kit | Thermo Fisher Scientific | NCI5734 | Post-label sample clean up column |
| EASY-SPRAY C18 2UM 50CM X 75 | Fisher Scientific | ES903 | Analytical column |
| Eosin Y Solution Aqueous | Sigma Aldrich | HT110216 | |
| Formic Acid, 99+ % | Thermo Fisher Scientific | 28905 | Mobile phase additive |
| ggplot2 version 3.3.5 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/ | |
| HALO | Indica Labs | Image analysis software | |
| IDLE (Integrated Development and Learning Environment) | Python Software Foundation | ||
| iheatmapr version 0.5.1 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/ | |
| iRT Kit | Biognosys | Ki-3002-1 | LC-MS QAQC Standard |
| limma version 3.42.2 | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html | |
| LMD Scanning stage Ultra LMT350 | Leica Microsystems | 11888453 | LMD stage model outfitted with PCT tube holder |
| LMD7 (software version 8.2.3.7603) | Leica Microsystems | LMD apparatus (microscope, laser, camera, PC, tablet) | |
| Mascot Server | Matrix Science | Data analysis software | |
| Mass Spec-Compatible Human Protein Extract, Digest | Promega | V6951 | LC-MS QAQC Standard |
| Mayer’s Hematoxylin Solution | Sigma Aldrich | MHS32 | |
| PEN Membrane Glass Slides | Leica Microsystems | 11532918 | |
| Peptide Retention Time Calibration Mixture | Thermo Fisher Scientific | 88321 | LC-MS QAQC Standard |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma Aldrich | P5726 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma Aldrich | P0044 | |
| Pierce LTQ Velos ESI Positive Ion Calibration Solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | Instrument calibration solution |
| PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK | Fisher Scientific | 164535 | Pre-column |
| Proteome Discoverer | Thermo Fisher Scientific | OPTON-31040 | Data analysis software |
| Python | Python Software Foundation | ||
| Q Exactive HF-X | Thermo Fisher Scientific | Mass spectrometer | |
| R version 3.6.0 | CRAN | https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/ | |
| RColorBrewer version 1.1-2 | CRAN | https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/ | |
| Soluble Smart Digest Kit | Thermo Fisher Scientific | 3251711 | Digestion reagent |
| TMTpro 16plex Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | A44520 | isobaric TMT labeling reagents |
| Veriti 60 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4384638 | Thermocycler |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | W6-4 | Mobile phase solvent |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 12.5 mm, 5 µm, guard cartridge (ZGC) | Agilent Technologies Inc | 821125-932 | Offline LC trap column |
| ZORBAX Extend 300 C18, 2.1 x 150 mm, 3.5 µm | Agilent Technologies Inc | 763750-902 | Offline LC analytical column |
References
- Motohara, T., et al. An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment. Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).
- Aran, D., Sirota, M., Butte, A. J. Systematic pan-cancer analysis of tumour purity. Nature Communications. 6, 8971 (2015).
- Hunt, A. L., et al. Extensive three-dimensional intratumor proteomic heterogeneity revealed by multiregion sampling in high-grade serous ovarian tumor specimens. iScience. 24 (7), 102757 (2021).
- Dou, Y., et al.
- Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
- Gillette, M. A., et al. Proteogenomic characterization reveals therapeutic vulnerabilities in lung adenocarcinoma. Cell. 182 (1), 200-225 (2020).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory Investigation. 90 (5), 787-796 (2010).
- Echle, A., et al. Deep learning in cancer pathology: a new generation of clinical biomarkers. British Journal of Cancer. 124 (4), 686-696 (2021).
- Lee, S., et al. Molecular analysis of clinically defined subsets of high-grade serous ovarian cancer. Cell Reports. 31 (2), 107502 (2020).
- Xuan, Y., et al. Standardization and harmonization of distributed multi-center proteotype analysis supporting precision medicine studies. Nature Communications. 11 (1), 5248 (2020).
- Hughes, C. S., et al. Quantitative profiling of single formalin fixed tumour sections: proteomics for translational research. Scientific Reports. 6 (1), 34949 (2016).
- Espina, V., et al. A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1998-2018 (2008).
- Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A.
- Havnar, C. A., et al. Automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues. Journal of Visualized Experiments. (169), e62394 (2021).
- Mueller, C., et al. One-step preservation of phosphoproteins and tissue morphology at room temperature for diagnostic and research specimens. PLoS One. 6 (8), (2011).
