고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
포유류 심장의 발달을 뒷받침하는 세포 및 분자 메커니즘에 대한 연구는 인간의 선천성 심장병을 해결하는 데 필수적입니다. 원시 심장 판막의 개발은 국소 유도 성 심근 및 심내막 신호에 반응하여 심장의 방실 관 (AVC) 및 유출로 (OFT) 영역에서 심내막 세포의 상피 - 중간 엽 전이 (EMT)를 포함합니다. 세포가 박리되어 심내막과 심근 사이에 위치한 세포 외 기질 (심장 젤리)을 침범하면 원시 심내막 쿠션 (EC)이 형성됩니다. 이 과정은 심내막이 박리 된 세포가 남긴 틈을 채워야하며 축을 따라 수렴 (좁게) 또는 확장 (길게)하기 위해 스스로를 재구성해야 함을 의미합니다. 현재의 연구는이 과정에 관여하는 요인의 세포 내 국소화를 조절하는 데 평면 세포 극성 (PCP) 경로를 연루시켰다. 고전적으로, 심장 판막 발달의 초기 단계는 배아 심장의 단면 또는 콜라겐 젤에서 배양 된 생체 외 AVC 또는 OFT 체 외 이식편에서 연구되었습니다. 이러한 접근법은 apico-basal 극성의 분석을 허용하지만 상피면 내의 세포 거동 또는 이동하는 세포의 형태 학적 변화에 대한 분석은 허용하지 않습니다. 여기에서는 판막 생성 영역에서 심내막을 세포의 평면 필드로 시각화 할 수있는 실험적 접근 방식을 보여줍니다. 이 실험적 접근법은 판막 개발 중에 OFT 및 AVC의 심내막 내에서 PCP, 평면 토폴로지 및 세포 간 통신을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 심장 판막 형태 형성과 관련된 새로운 세포 메커니즘을 해독하면 심내막 쿠션 결함과 관련된 선천성 심장 질환을 이해하는 데 기여할 수 있습니다.
서론
심장은 포유류 배아의 첫 번째 기능 기관입니다. 마우스에서 배아일(E) 7.5 전후, 양측 심장전 중배엽 세포는 복부 쪽에서 심장 초승달을 형성한다1. 심장 초승달에는 심근과 심내막2의 전구 세포를 포함하는 두 개의 심장 전 세포 집단이 있습니다. E8.0 주변에서 심장 전구체는 정중선에서 융합되어 두 개의 상피 조직인 외부 심근과 심장 젤리라는 세포외 기질로 분리된 특수 내피인 내부 심내막으로 구성된 원시 심장 튜브를 형성합니다. 나중에 E8.5에서 심장 튜브는 오른쪽으로 반복됩니다. 루프가 있는 심장은 유출로(OFT), 심실 및 심실관(AVC)과 같은 특정 분자 서명을 가진 다양한 해부학적 영역을 가지고 있습니다.3. 처음에는 심장 튜브가 세포4의 추가를 통해 유입 측에서 확장되지만, E9.5에서 집중적 인 심장 증식은 챔버의 팽창 및 섬유주 네트워크5의 확립을 초래한다. 판막 형성은 AVC (미래의 승모판 및 삼첨판 판막)와 OFT (미래의 대동맥 및 폐동맥 판막)에서 발생합니다.
심내막은 판막 발달에 중요한 역할을합니다. 심....
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프로토콜
동물 연구는 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) 동물 실험 윤리위원회와 마드리드 공동체 (참조 PROEX 155.7 / 20)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 실제 법령 1201/2005에 따라 스페인 법률에서 제정된 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 EU 지침 2010/63EU 및 권장 사항 2007/526/EC를 준수했습니다.
1. AVC 및 / 또는 OFT의 준수 (Xiao et al. 25)
- 오후에 여성 mTmG 와 남성 VE-Cadherin-Cre-ERT/+ 사이에 십자가를 설정하십시오.
- 다음날 아침, 질 플러그를 확인하십시오. 질 플러그가있는 경우 반나절 (E0.5)로 계산하십시오. 관심 있는 실험에 따라 8일 또는 9일을 계산합니다.
- 해부 24 시간 전에 옥수수 기름에 희석 한 5mg / mL 4-OH- 타목시펜 50μL로 임산부를 경구 위관 영양하십시오.
참고: 이 용량은 GFP 양성 클론의 존재에 의해 밝혀진 제한된 양의 CRE 매개 ....
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결과
이 프로토콜을 사용하여 생성 된 데이터는 수행 할 수 있음을 보여줍니다 en AVC의 심내막의 얼굴 영상. 첫 번째 목표는 세포 분해능에서 판막을 형성하는 동안 심내막의 세포 모양을 분석하는 것이 었습니다 (그림 1). E9.5에서 개별 심내막 세포를 강조하기 위해, 우리는 두 개의 트랜스제닉 마우스 균주를 사용하였다. (1) ROSA mT / mG는 세포막에서 형광이 검출되는 2 색 형광 Cre 리포터 대립 유전자 (tdTomato / mT 및 EGFP / mG)입니다. Cre-매개 활성화가 없으면 전이유전자는 tdTomato (mT)를 발현합니다. Cre-매개 활성화 시, tdTomato 발현은 특정 세포 및 클론 유도체27에서 EGFP 형광 발현 (mG)으로 대체된다. (2) Cdh5CreE.......
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토론
심내막은 배아 심장 튜브의 전체 내부 표면을 덮는 상피 단층입니다. 판막 발달 동안 장래의 판막 부위의 심내막 세포는 EMT를 겪으므로 심내막 세포는 세포 골격을 변형시키고 재배열하여 심내막에서 심장 젤리쪽으로 박리됩니다. 우리와 다른 사람들은 심내막이 세포 6,8,24,32의 행으로 표시되는 E8.5 및 E9.5 배아 심장의 횡단 절편을 분석하여 마우스 배아의 판막 발달에 대한 관련 데이터를 얻었습니다. 이 접근법은 신호 전달 경로 및 판막 발달에 관여하는 다른 분자의 발현을 분석 할 수 있었지만 판막 전 심내막의 공간적 측면을 분석하는 것은 불가능했습니다.
AVC 또는 OFT 외식편은 주로 3D 콜라겐 겔 상에서 형질전환 EC를 연구하는 데 사용되.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 MCIN/AEI/10.13039/501100011033에서 J. L. P. J.G.-B에 대한 보조금 PID2019-104776RB-I00 및 CB16/11/00399(CIBER CV)의 지원을 받았습니다. 마드리드 코무니다드 (2020-5ª/BMD-19729)의 프로그램 데 아트라시온 데 탤런토가 자금을 지원했습니다. TG-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054)가 자금을 지원했습니다. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 및 FEDER "A way to make Europe"(#ICTS-2018-04-CNIC-16)이 공동 자금을 지원한 CNIC 단위의 현미경 및 동적 이미징, CNIC, ICTS-ReDib에 감사드립니다. 우리는 또한 마우스 사육에 대해 A. Galicia와 L. Méndez에게 감사드립니다. 이 출판물의 비용은 유럽 지역 개발 기금의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. CNIC는 ISCIII, MCIN 및 Pro CNIC 재단의 지원을 받으며 MCIN/AEI /10.13039/501100011033에서 자금을 지원하는 세베로 오초아 우수 센터(보조금 CEX2020-001041-S)입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16% Paraformaldheyde | 전자 현미경 과학 | 157-10 | 물에 4%로 희석 |
| Anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| 염소 안티 마우스 Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| 슬라이드 Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| 트윈 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield 마운팅 미디엄 | 벡터 연구소 | H-1000-10 |
참고문헌
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbou....
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재인쇄 및 허가
