Summary
Denne protokol beskriver en tilgang til at lette præcise knock-in-redigeringer i zebrafiskembryoner ved hjælp af CRISPR-Cas9-teknologi. En fænotypningsrørledning præsenteres for at demonstrere anvendeligheden af disse teknikker til at modellere en lang QT-syndrom-associeret genvariant.
Abstract
Grupperede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) i dyremodeller muliggør præcis genetisk manipulation til undersøgelse af fysiologiske fænomener. Zebrafisk er blevet brugt som en effektiv genetisk model til at studere adskillige spørgsmål relateret til arvelig sygdom, udvikling og toksikologi på helorgan- og -organismeniveau. På grund af det velannoterede og kortlagte zebrafiskgenom er der udviklet adskillige værktøjer til genredigering. Imidlertid er effektiviteten af at generere og let at opdage præcise knock-in-redigeringer ved hjælp af CRISPR en begrænsende faktor. Beskrevet her er en CRISPR-Cas9-baseret knock-in tilgang med simpel påvisning af præcise redigeringer i et gen, der er ansvarlig for hjerterepolarisering og forbundet med den elektriske lidelse, Long QT Syndrome (LQTS). Denne to-single-guide RNA (sgRNA) tilgang punktafgifter og erstatter målsekvensen og forbinder et genetisk kodet reportergen. Nytten af denne tilgang demonstreres ved at beskrive ikke-invasive fænotypiske målinger af hjerteelektrisk funktion i vildtype- og genredigerede zebrafisklarver. Denne tilgang muliggør effektiv undersøgelse af sygdomsassocierede varianter i en hel organisme. Desuden giver denne strategi muligheder for indsættelse af eksogene sekvenser efter eget valg, såsom reportergener, ortologer eller genredaktører.
Introduction
CRISPR-baserede genredigeringsstrategier i dyremodeller muliggør undersøgelse af genetisk arvelig sygdom, udvikling og toksikologi på hele organismeniveau 1,2,3. Zebrafisk giver en kraftfuld model, der i mange fysiologiske aspekter er tættere på mennesker end murine eller humanafledte cellemodeller4. En bred vifte af genetiske værktøjer og strategier er blevet brugt i zebrafisk til både fremad5 og omvendt genetisk screening6. Omfattende genetisk kortlægning og annotering i zebrafisk har lettet genredigeringsmetoder som en primær teknik til at konstruere målrettede gen-knockouts (KO'er) og præcise knock-ins (KI'er)7.
På trods af dette er generering af præcise KI-redigeringer i zebrafisk begrænset af lav effektivitet og vanskeligheden ved nøjagtig detektion. Selvom transkriptionsfaktorlignende effektornukleaser (TALEN'er) med succes er blevet brugt og optimeret til KIs8, giver CRISPR en forbedret genredigeringsstrategi med enklere sgRNA-målretning. Talrige undersøgelser har brugt CRISPR til at generere præcise KI'er i zebrafisk 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, selvom disse redigeringer genereret gennem CRISPR-medieret homologi-rettet reparation (HDR) har tendens til at være ineffektive med lav iboende succes satser, der kræver genotypning som en primær skærm 9,10,14,21. Dette viser behovet for et effektivt KI CRISPR-system i zebrafisk samt et pålideligt system med høj kapacitet til at detektere præcise redigeringer.
Målet med denne undersøgelse var at beskrive en platform til generering af et præcist hjertegen KI i zebrafiskhjerter med enkel og høj gennemstrømning af vellykkede redigeringer. En CRISPR-Cas9-baseret to-sgRNA exon udskiftningsmetode er beskrevet, som er baseret på en TALEN tilgang8. Denne fremgangsmåde indebærer udskæring af målsekvensen ved hjælp af to-sgRNA-guider og udskiftning med en eksogen skabelonsekvens, der indeholder KI af interesse samt et genetisk kodet intronic reporter-gen (figur 1). Integrationen af en genetisk kodet fluorescerende reporter i målgenet intronic-sekvensen muliggør effektiv påvisning af positive redigeringer. En fænotypeplatform beskrives derefter til vurdering af hjerteelektrisk funktion i zebrafisklarver til ikke-invasiv karakterisering af genvarianterne forbundet med arvelig LQTS, en hjerteelektrisk lidelse, der prædisponerer individer for pludselig hjertedød.
Disse tilgange vil forbedre adgangen til og brugen af zebrafisk KI-genredigeringer til at modellere arvelige sygdomme og adressere biologiske og fysiologiske spørgsmål, såsom kortlægning af genekspressionsmønstre og udviklingsregulering. Da zebrafiskhjerter bedre parallelle menneskelige hjerteelektrofysiologiske egenskaber end murinmodeller, kan de være særligt attraktive som et genetisk medgørligt system til modellering af hjertesygdomme 7,22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelser ved hjælp af zebrafisk blev udført i overensstemmelse med politikkerne og procedurerne fra Simon Fraser University Animal Care Committee og Canadian Council of Animal Care og blev afsluttet under protokol # 1264K-18.
1. Design af CRISPR-komponenter til præcise redigeringer
- For at designe de to sgRNA-guider, der vil blive brugt til at udskære sekvensen, der indeholder KI-målstedet, skal du først identificere zebrafiskens ortolog for genet af interesse.
BEMÆRK: Figur 2 giver et resumé af trinene til at konstruere præcise redigeringer ved hjælp af to-sgRNA CRISPR-Cas9-tilgangen. - Brug derefter et designsoftwareværktøj, såsom CRISPOR24, som inkluderer udvælgelse til Danio rerio som art og af Cas-enzymet, der skal bruges.
BEMÆRK: Genet af interesse for denne undersøgelse var zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), og målmutationen var aminosyre, R56Q.- For to-sgRNA-tilgangen skal du vælge en sgRNA-placering, der går forud for målexonen, og et andet sgRNA, der er placeret inden for den umiddelbare nedstrøms intron.
- Sørg for, at de udvalgte sgRNA'er har høj specificitet og lav forudsagt off-target-binding. Brug CRISPOR-placeringer til at identificere guider med minimal binding uden for målet. Overvej ikke guider uden uoverensstemmelser i frøsekvensen af potentielle off-targets.
- Identificer de mest sandsynlige potentielle off-target-websteder (baseret på CRISPOR-score, vælg de tre bedste exon-potentielle off-target-websteder) til PCR-baseret Sanger-sekventeringsgenotypning i trin 6.1.3.
- Når de to sgRNA'er er blevet valgt, opnås det omvendte komplement for hver, således at der er fire oligonukleotider, der skal anvendes: to komplementære oligoer, der går forud for mutationen og to komplementære oligoer, der er nedstrøms.
- På hver af de fire oligoer skal du tilføje kompatible begrænsningssteder til inkorporering i et vejledende plasmid efter eget valg; til integration i DR274-plasmidet skal du bruge et 5 'BsaI-begrænsningssted til at oprette et udhæng. Sørg for, at Bsa1-genkendelsesstedet er konstrueret i 5'-enden af guiden valgt fra CRISPOR, og Bsa1-genkendelsesstedet er konstrueret i 5'-enden af de komplementære tråde for at sikre korrekt orientering af guiderne i DR274-plasmidet (se figur 3).
- For at designe den eksogene skabelon, der bruges til HDR i zebrafisk (figur 1), skal du vælge to sekvensfragmenter, der vil flankere mVenus YFP-reportergenet, der er anbragt i pKHR5-plasmidet.
BEMÆRK: Den påtænkte ændring/redigering kan inkluderes i enten opstrøms eller nedstrøms fragment.- Ved hjælp af Ensembl skal du finde målstedet inden for gensekvensen af interesse, herunder ca. 2 kb flankerende sekvens (homologiarm), som vil blive brugt til at lave skabelonen.
BEMÆRK: Homologiarme kan være symmetriske eller asymmetriske25,26 og ca. 1 kb hver, opstrøms og nedstrøms for målstedet. - Opdel skabelonen i to segmenter, der indsættes på hver side af mVenus YFP-reportergenet (se figur 4). Sørg for, at det opdelte sted er i en intron, så kodningssekvensen ikke afbrydes.
BEMÆRK: Hvis genet er godt karakteriseret, skal du kontrollere, om der er funktionelle roller i intronen, såsom splejsningssteder eller regulerende regioner. Regioner tæt på 5 'eller 3' enderne er oftere involveret i mRNA-splejsning. - Inkorporer ændringer i skabelonsekvensen, der inkluderer i) tavse mutationer i guideprotospaceren tilstødende motiv (PAM) eller frøsekvens (vær opmærksom på alternative PAM-steder, som Cas-enzymet kan målrette mod) for at forhindre Cas-enzymgenskæring; ii) ændring af renter iii) oprettelse af begrænsningsendonukleasesteder for at lette kloning i pKHR5-plasmidet, som indeholder mVenus YFP-reportergenet (se figur 3).
BEMÆRK: I denne undersøgelse indeholdt det første skabelonsegment XhoI opstrøms for R56Q-mutationsstedet og SalI nedstrøms, mens det andet skabelonsegment havde EcoRI opstrøms for guidemålsekvensen og BamHI nedstrøms. Hvis nogen af de valgte begrænsningssteder er til stede i skabelonsekvensen, kræves mutationer for at dæmpe disse, eller alternative tilgange som Gibson Assembly kan bruges.
- Ved hjælp af Ensembl skal du finde målstedet inden for gensekvensen af interesse, herunder ca. 2 kb flankerende sekvens (homologiarm), som vil blive brugt til at lave skabelonen.
2. Fremstilling af CRISPR-komponenter til embryomikroinjektion
- Forbered Cas9 til mikroinjektion 1 uge før mikroinjektionerne. Brug Cas9-protein eller tilbered Cas9 mRNA via in vitro-transkription .
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev Cas9 mRNA brugt, da effektiviteten havde tendens til at være højere.- Forstærk bakteriekulturer af kommercielt tilgængelige XL1 Blue bakterielle agar stik (indeholdende Cas9 plasmid) ved hjælp af et passende antibiotikum såsom ampicillin. Brug 675 μL flydende kultur (med 325 μL glycerol) til at skabe en backup glycerolbestand til langtidsopbevaring ved -80 °C.
- Brug resten af den flydende kultur til en miniprep-rensning i henhold til protokollen, der fulgte med miniprep-sættet. Det endelige oprensede DNA genudsættes i 50 μL af den tilvejebragte elueringsbuffer. Kvantificer produktet via et spektrofotometer for at undersøge udbyttet og renheden.
- Linearisere 2 μg af det oprensede DNA via restriktionsfordøjelse ved hjælp af et passende restriktionsenzym og ved hjælp af den passende buffer- og inkubationstid som angivet for enzymet af interesse.
- Rens det lineariserede plasmid ved hjælp af et PCR-rensningssæt, og genbrug det i 30 μL af den medfølgende elueringsbuffer.
- Efter kvantificering af produktet skal du bruge dette som en skabelon til in vitro-transkription ved hjælp af det passende transkriptionssæt til promotoren af interesse. Følg den medfølgende protokol og rens via lithiumchloridudfældning27. Det rensede RNA resuspenderes i 10 μL nukleasefritH2O, og kvantificeres inden opbevaring ved -20 °C til brug i mikroinjektionsblandingen.
- Forbered de to sgRNA-guider.
- Forbered sgRNA-plasmidet med et stillads ved at amplificere bakteriekulturer fra det kommercielt tilgængelige XL1 Blue bakterielle agarstik (se materialetabel for detaljer) på samme måde som MLM3613 ovenfor (trin 2.1.1), undtagen brug kanamycin i stedet for ampicillin.
- Anneal de to par komplementære enkeltstrengede oligonukleotider (ssODN'er) til sgRNA-guiderne designet ovenfor ved først at resuere ssODN'erne i 1x udglødningsbuffer til en koncentration på 100 μM.
- I separate reaktioner for hver af de to sgRNA'er udglødes parret af komplementære ssODN'er ved hjælp af en termisk cyklist. Bland 2 μg af hvert komplementært ssODN-par med 50 μL udglødningsbuffer og inkuber ved 95 °C i 2 min., og afkøles derefter til 25 °C over 45 min.
- Fordøje et kommercielt tilgængeligt plasmid, der indeholder et gRNA-stillads. 2 μg af DR274-plasmidet fordøjes ved hjælp af 1 μL BsaI, 2 μL passende buffer og ddH2O til 20 μL ved 37 °C i 1 time. Bekræft linearisering (valgfrit: rengør ved hjælp af et PCR-rensningssæt) ved hjælp af gelelektroforese28.
- I to separate ligationsreaktioner (en for hvert sgRNA) ligeres de udglødede ssODN'er med det lineariserede DR274-plasmid. Brug et molært indsats:vektorforhold på 3:1, og beregn den relevante masse ved hjælp af en online ligationsberegner. Bland den krævede masse af insertet og vektoren med 1 μL T4 DNA-ligase, 2 μL ligeringsbuffer og ddH2O til 12 μL og inkuberes ved stuetemperatur i 12 timer.
- Omdan 2 μL af det ligede produkt til passende kompetente celler (såsom 10β-celler) ved hjælp af standardmetoder, og forstærk og rens derefter produktet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt Miniprep Kit. Valgfrit: Opret en glycerolbestand af dette produkt.
- Transskribere de to sgRNA'er ved at linearisere 2 μg af hver guide ved hjælp af et 3' nedstrøms begrænsningssted, der er så tæt på slutningen af rumsekvensen som muligt. For DR274-plasmidet lineariseres med HindIII, og derefter renses RNA-skabelonen ved hjælp af et PCR-rensningssæt, der resuereres i 30 μL af elueringsbufferen.
- Transskribere de to guider ved hjælp af et RNA-transkriptionssæt. Følg producentens protokol og rens via lithiumchloridudfældning27. De to rensede sgRNA-guider gensuspenderes i 10 μL nukleasefriH2O, kvantificeres og opbevares ved -20 °C til brug i mikroinjektionsblandingen.
BEMÆRK: RNA-transkriptionssættet kan ikke indeholde en 5 'cap eller poly-A hale.
- Forbered den dobbeltstrengede, eksogene HDR-reporterskabelon.
BEMÆRK: Skabelonen er syntetiseret i to dele, en opstrøms og en nedstrøms for mVenus YFP-reportergenet. Disse to segmenter er syntetiske konstruktioner bestilt gennem en kommerciel udbyder og derefter ligeret i pKHR5 (som indeholder mVenus YFP) plasmid sekventielt.- PKHR5-plasmidet forberedes ved at forstærke bakteriekulturer fra den kommercielt tilgængelige DH5α-bakteriestamme (se materialetabellen for detaljer) på samme måde som MLM3613 ovenfor (trin 2.1.1).
BEMÆRK: pKHR5-plasmidet indeholder mVenus YFP-reportergensekvensen. - Resuspender de to skabelonsegmenter, der er designet ovenfor, til 100 μM i TE-buffer, og omdan derefter til 10β-celler.
- Fordøje det første skabelonsegment (det ene opstrøms for mVenus YFP-reportergenet) og pKHR5-plasmidet ved hjælp af de restriktionsenzymer, der er valgt i trin 1.3.3.
BEMÆRK: Sekventiel fordøjelse af pKHR5 er nødvendig på grund af nærheden af de valgte begrænsningssteder i MCS. - For at forberede pKHR5-plasmidet til opstrømsskabelonsegmentet fordøjes 4 μg pKHR5 (i trin 2.2.4) med SalI og renses derefter ved hjælp af et PCR-rensningssæt. Resuspender i 30 μL ddH2O, og brug dette som skabelon for den anden fordøjelsesreaktion med XhoI. Rens produktet ved hjælp af PCR-rensningssættet.
- Det første skabelonsegment forberedes ved at fordøje 2 μg af skabelonsegmentet (trin 2.3.2), 1 μL XhoI, 1 μL SalI, 2 μL passende buffer og ddH2Otil 20 μL i 1 time ved 37 °C og gelrense produktet.
- Opstrømsskabelonsegmentet fra trin 2.3.5 skal føres ind i den forberedte pKHR5 ved hjælp af de reaktionsbetingelser, der er beskrevet i trin 2.2.5. Omdan det ligede produkt til kompetente 10β-celler, forstærk og rens ved hjælp af en miniprep (valgfrit: opret en glycerolbestand af dette produkt).
- Brug det ligede produkt fra trin 2.3.6 (som indeholder det første skabelonsegment ligeret i pKHR5-plasmid opstrøms for mVenus YFP-reportergenet) og fordøje for at forberede det andet (nedstrøms for mVenus-reporteren) skabelonsegment. Der fordøjes 4 μg af det ligede produkt (fra trin 2.3.6, som i trin 2.2.4) med BamHI, og derefter renses ved hjælp af et PCR-rensningssæt. Resuspender i 30 μL ddH2O, og brug dette som skabelon for den anden fordøjelsesreaktion med EcoRI. Rens produktet ved hjælp af PCR-rensningssættet.
- Det andet skabelonsegment forberedes ved at fordøje 2 μg af skabelonsegmentet (trin 2.3.2), 1 μL BamHI, 1 μL EcoRI, 2 μL passende buffer og ddH2O til 20 μL i 1 time ved 37 °C og gelrense produktet.
- Nedstrømsskabelonsegmentet indsættes i den forberedte pKHR5 (fra trin 2.3.7) ved hjælp af de reaktionsbetingelser, der er beskrevet i trin 2.2.5. Omdan det ligede produkt til kompetente celler, forstærk og rens ved hjælp af et miniprep-sæt. Opret et glycerollager af dette slutprodukt, som indeholder begge skabelonsegmenter ligeret på hver side af mVenus YFP-reportergenet inden for pKHR5.
- PKHR5-plasmidet forberedes ved at forstærke bakteriekulturer fra den kommercielt tilgængelige DH5α-bakteriestamme (se materialetabellen for detaljer) på samme måde som MLM3613 ovenfor (trin 2.1.1).
- Forbered mikroinjektionsblandingen ved hjælp af Cas9 mRNA, to sgRNA'er og den eksogene HDR-reporterskabelon.
- Bland 200 ng/μL Cas9 mRNA, 100 ng/μL af hvert sgRNA og 200 ng/μL eksogen HDR-reporterskabelon i 1x injektionsbuffer til et endeligt volumen på 20 μL.
- Mikroinjektionsblandingen opbevares ved -20 °C, og den ubrugte blanding kasseres efter tre fryse-optøningscyklusser.
BEMÆRK: Brug 4 nL af denne mikroinjektionsblanding til mikroinjektion i æggeblommesækken i hvert embryo.
3. Opdræt af zebrafisk og embryomikroinjektion
BEMÆRK: Protokoller for zebrafiskavl og mikroinjektion af enkeltcellede embryoner er tidligere beskrevet 29,30,31.
- Til avl skal du bruge zebrafisk af AB-stammen, og som er 6-12 måneder gamle. Fostrene injiceres i encellestadiet ca. 40 minutter efter befrugtningen (se figur 5).
BEMÆRK: Det biologiske køn af de injicerede embryoner var ikke kendt; seksuel dimorfisme er ikke tydelig før ca. 3 måneder af32 år.
4. Reportergenscreening af CRISPR-Cas9-redigeret larvezebrafisk
- Visualiser YFP-integration i zebrafisklarver efter mikroinjektion af CRISPR-Cas9-komponenter for at screene for vellykkede HDR-redigeringer.
- I en 25 mm petriskål bedøves 24 zebrafisklarver 3 dage efter befrugtning (dpf) i 0,3% tricainmestansulfonat (MS-222, bufferet til pH 7,0-7,4 med HEPES og natriumhydroxid), indtil de mister deres selvoprettende refleks (typisk 1-2 min). Når den er bedøvet, overføres hver larve til en individuel brønd på en 24-brøndsplade.
- Ved hjælp af et mikroskop, der er i stand til at detektere GFP / YFP, screenes for reportergenfluorescens i øjnene på hver enkelt larve.
- Tag billeder af hver larve og dokumenter tilstedeværelsen eller fraværet af reportergenekspression.
5. Fænotypning af CRISPR-Cas9-redigeret larvezebrafisk
- Efter reporter genscreening skal du udføre hjertefænotypning (puls, perikardiale dimensioner, EKG) på hver larve. Fænotype et lige antal reporter gen-positive og -negative larver.
- Brug et CCD-kamera (f.eks. Blackfly USB3) og video- og billedoptagelsessoftware (f.eks. Micromanager til ImageJ) til at måle puls og perikardiale dimensioner, mens larverne bedøves.
- For at måle pulsen ved hjælp af Micromanager skal du oprette en interesseregion (ROI) for at fange hjertet og udelukke andre strukturer.
- Importer videoen til ImageJ som en billedsekvens, og sørg for, at det korrekte antal rammer er indtastet under antal billeder.
- Når filen er åben, skal du bruge rektangelmarkeringsværktøjet til at tegne et investeringsafkast i hjertet, men eksklusive andre bevægelige elementer, og gemme ROI i ROI manager (analysere | værktøjer | ROI manager).
- Klik på plugins | installer, og vælg pulsalgoritmen for at installere koden i standardmappen, og vælg derefter pluginet nederst på fanen Plugins . Optag slagene pr. minut (bpm) fra pop op-vinduet.
BEMÆRK: Billeddetekteringsalgoritmer blev specialskrevet til at detektere puls ved at måle individuelle pixeltæthedsændringer forbundet med ventrikulær systolisk sammentrækning. Koden kan findes på https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
- Mål perikardiale dimensioner ved hjælp af et gratis værktøj som ImageJ for at frigøre ROI'er omkring perikardialsækken og et af øjnene. Åbn billedet i ImageJ, og brug polygonvalgsværktøjet til at tegne et investeringsafkast først rundt om perikardialsækken, gemme det i ROI-manageren som i trin 5.1.2 og gentage for øjet. Vælg disse to investeringsafkastningsmuligheder i ROI manager, og klik derefter på måling. Optag området for hver for senere at beregne arealet af perikardialsækken normaliseret til øjenområdet i hver larve.
- Efter puls- og perikardialmålinger skal du registrere EKG fra individuelle larver.
BEMÆRK: Protokoller til registrering af zebrafisk EKG er tidligere beskrevet33,34,35,36.
6. Genotypning af CRISPR-Cas9-redigeret larvezebrafisk
- Efter fænotypiske analyser skal du udføre genotypning på og potentielt off-target genotypning for at bekræfte nøjagtig og præcis HDR-genredigering.
- Anæstetiser hver 3 dpf larve i 0,3% MS-222 og haleklip for at isolere gDNA ved hjælp af HOTShot-metoden37. Inkuber hver udskåret haleclips i 15 μL 25 mM NaOH ved 95 °C i 20 min. Derefter neutraliseres med 1,5 μL Tris-HCl og centrifuge ved 13.800 x g i 30 s. Bevar supernatanten, som indeholder ekstraheret gDNA.
- Gendan larverne i E3-medier og returner dem til boligsystemet, hvis der er planlagt yderligere udvikling eller undersøgelse.
- Brug det ekstraherede gDNA som skabelon til at udføre PCR-baseret Sanger-sekventering af on-target og potentielle off-target sites.
BEMÆRK: Valgfrit: en indlejret PCR-tilgang kan være gavnlig for nogle genregioner. - Sørg for, at primerdesignet på målet fanger mutationsstedet og det nærmeste sgRNA-bindingssted. Design en separat sekventeringsprimer til at detektere overgangen fra den indsatte homologiarm og målgenet for at bekræfte integration i genet af interesse. Design primere til at sekvensere de tre største potentielle steder uden for målgruppen, der er identificeret i trin 1.2.3.
BEMÆRK: Guide-design softwareprogrammer foreslår ofte primere at bruge, men tilpasning kan være nødvendig for at opnå optimale resultater. - Kompiler genotypning på og uden for mål, puls, perikardiale dimensioner, EKG-fænotypning og reportergendata, der kan identificeres for hver zebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den vellykkede brug af denne to-sgRNA exon erstatning CRISPR tilgang fremhæves af introduktionen og simpel påvisning af en præcis redigering for at konstruere den LQTS-associerede variant, R56Q, i zkcnh6a-genet i zebrafisk. Figur 6 viser en repræsentativ 3 dpf larver injiceret på encellede embryostadiet med CRISPR-komponenter som beskrevet ovenfor. Figur 6A viser tilstedeværelsen af YFP mVenus reporter-genekspressionen i øjenlinsen som en positiv reporter af vellykket skabelonintegration. Figur 6B,C viser Sanger-sekventering af kromatogrammer opnået fra genomisk DNA isoleret fra haleklipprøver af henholdsvis vildtype- og reportergenpositive fisk. Reporter gen-positive fisk viste sig at have den præcise redigering, G til A, som introducerer R56Q-varianten i zkcnh6a. Genotypning viste en 100% korrelation mellem YFP-reportergenekspression og tilstedeværelsen af den præcise R56Q-genredigering, hvilket validerede dette fluorescensscreeningsværktøj.
Fænotypning af gen-redigerede zebrafisklarver blev udført ved 3 dpf. Figur 7 viser repræsentative resultater fra vildtype- og R56Q-genredigerede larver. Pulsen blev registreret ved videooptagelse som beskrevet ovenfor. Et eksempel på måling af perikardiale dimensioner som et forhold mellem øjenareal er vist (figur 7A). Figur 7B plotter puls mod normaliserede perikardiale dimensioner og fremhæver en tendens til bradykardi med stigende perikardieødem, som er forbundet med forstyrrelser i hjerterepolarisering hos zebrafisk 8,38,39,40. Figur 7C viser et repræsentativt eksempel på EKG-optagelser fra 3 dpf larver. Standardintervaller (QT, QRS) blev målt fra gennemsnitlige EKG-signaler.
Figur 1: Integration af HDR-skabelon i zebrafiskgenomet. Mørkegrå, homologi arme; grønne, sgRNA-guidemål med lydløs mutation for at forhindre Cas9-genskæring; lysegrå, mål exon af interesse; rød linje, punktmutation; gul, mVenus YFP reporter gen under en α-krystallinsk promotor; stiplede linjer angiver homologi. Her var den målrettede præcise redigering R56Q i exon 2 af zkcnh6a-genet . Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparation; sgRNA = enkeltstyret RNA; YFP = gult fluorescerende protein; DSB = dobbeltstrenget pause; WT = vild type. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over trin til at konstruere præcise redigeringer i zebrafiskgener ved hjælp af to-sgRNA CRISPR-Cas9-tilgangen (relaterede protokoltrinnumre er angivet i parentes). Forkortelser: sgRNA = single-guide RNA; YFP = gult fluorescerende protein; gDNA = genomisk DNA; EKG = elektrokardiogram; dpf = dage efter befrugtning; MS-222 = tricainmethansulfonat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Udarbejdelse af eksogene skabelonfragmenter og sgRNA-vejledninger . (A) Sekventiel fordøjelse og ligering af skabelonfragmenter opstrøms og nedstrøms for mVenus YFP-reportergensekvensen i pKHR5. (B) Udglødning af komplementære sgRNA-par med restriktionsoverhæng til ligering i DR274. Forkortelser: sgRNA = single-guide RNA; YFP = gult fluorescerende protein. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Konstruktion af HDR-skabelon. Mørkegrå, homologi arme; grønne, sgRNA-guidemål med lydløs mutation for at forhindre Cas9-genskæring; lysegrå, mål exon af interesse; rød linje, punktmutation; gul, mVenus YFP reporter gen under en α-krystallinsk promotor; mørkeblå linje, tilføjede begrænsningssteder. De to skabelonfragmenter er integreret i pKHR5 plasmiddonoren. Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparation; sgRNA = enkeltstyret RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Mikroinjektion af encellede zebrafiskembryoner med CRISPR-Cas9-komponenter. Skala bar = 0,5 mm. Forkortelser: HDR = homologi-rettet reparation; sgRNA = enkeltstyret RNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Nem påvisning af mVenus YFP reporter genfluorescens indikerer positiv HDR eksogen skabelonintegration i målgenet. (A) Eksempel på mVenus YFP-ekspression i et zebrafiskøje (pil) i en redigeret zebrafisklarve. (B) Vellykkede redigeringer bekræftes ved at sekventere kromatogrammer (venstre, WT; højre, R56Q-redigering). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Fænotypisk analyse af hjertekonsekvenser i 3 dpf zebrafisk efter den præcise R56Q-redigering i zkcnh6a-målgenet. (A) Billeddetektion af perikardiale dimensioner i forhold til øjenstørrelse ved hjælp af polygonværktøjet i ImageJ. Grænserne for perikardialsækken blev markeret af brugeren fra en enkelt optagelsesramme baseret på ændringer i gennemskinnelighed og pigmentering. Eksempler på normale perikardiale dimensioner og perikardial effusion vises. Skalastang = 0,5 mm. (B) Korrelation mellem perikardiale dimensioner (i forhold til øjendimension) og puls, R2 = 0,33. (C) Eksempel på EKG-optagelse fra et 3 dpf zebrafisklarvehjerte (venstre) og gennemsnitlige komplekser (højre). Puls, 131 bpm; pulskorrigeret QTc-interval, 460 ms. Forkortelser: dpf = dage efter befrugtning; EKG = elektrokardiogram. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruktionen af præcise genredigeringer ved hjælp af CRISPR-Cas9 udfordres af den lave effektivitet af HDR-mekanismer og deres effektive detektion. Her beskrives en CRISPR-Cas9-baseret to-sgRNA exon-erstatningsmetode, der producerer præcise redigeringer i zebrafisk med ligefrem visuel påvisning af positive redigeringer. Effekten af denne tilgang demonstreres ved at generere præcise redigeringer i zkcnh6a-genet . Dette papir viser, hvordan hjertefunktion i genredigerede zebrafisklarver kan vurderes ved hjælp af ikke-invasive fænotypiske målinger af puls, perikardiale dimensioner og EKG-morfologi. Denne tilgang, fra introduktion af en genredigering til fænotypisk evaluering, kan afsluttes fra start til slut inden for ca. 1 uge.
Fordelene ved ovenstående redigerings- og fænotypemetode er letheden ved CRISPR-modifikationsdesign, den brede anvendelighed i flere fysiologiske systemer, evnen til at indsætte store gener eller genfragmenter og evnen til at spore varianteffekter i længderetningen gennem udvikling og generationer. Succesen med præcise redigeringer i denne tilgang kan være relateret til kombinationen af den store skabelonstørrelse (på grund af reportergenindsatsen og lange homologiarme), som har vist sig at øge effektiviteten af redigeringer i zebrafisk14, og to-sgRNA-guidestrategien, som er blevet brugt effektivt i zebrafisk TALEN-inducerede redigeringer8.
En særlig styrke ved den beskrevne tilgang er evnen til at indsætte store gener eller genfragmenter. Dette kan f.eks. være nyttigt at indsætte humane ortologer41, hvilket giver mulighed for en mere klinisk oversættelig karakterisering og sammenligning mellem orthologs. Alternativt kan gener, der koder for Cas-enzymer, også indsættes, hvilket giver mulighed for en linje zebrafisk med in vivo CRISPR-redigeringsmekanismer, hvilket giver et inducerbart system. På samme måde kan alternative CRISPR-mekanismer, såsom primærredigering, integreres og resultere i en linje af zebrafisk, der let redigeres præcist og effektivt.
På trods af fordelene ved denne tilgang er der nogle begrænsninger. For det første er kun et enkelt gen og et enkelt sted blevet ændret, og yderligere test på andre steder eller i andre gener er nødvendig for at vurdere, hvor bredt anvendelig denne tilgang er. På grund af de lange homologiarme, der kræves, er skabelondesignomkostningerne højere; Dette kan dog opvejes af en effektiv screening. En anden begrænsning er, at screeningsmetoden kræver fluorescensdetekteringskapacitet. Imidlertid er optiske krav relativt lave og kan specialbygges eller købes kommercielt til en rimelig lav pris. Brug af en to-sgRNA-tilgang øger antallet af potentielle off-target-hændelser; dette afbødes dog sandsynligvis af den lavere sandsynlighed for, at de to sgRNA-guider begge vil anneal på en måde, der letter inkorporeringen af skabelonen for at give reportergenekspression. Endelig kan brug af Cas9 mRNA føre til mosaikker, da Cas9 ikke er aktiv før senere udviklingsstadier. Dette kan forklares ved at sekventere bestemte vævstyper; Men i betragtning af zebrafisklarvernes størrelse er dette teknisk udfordrende.
Sammenfattende muliggør denne CRISPR-Cas9 to-sgRNA præcise redigeringsmetode i zebrafisk den enkle visuelle påvisning af positive redigeringer og kan tilpasses til at inkorporere store gener af interesse på ethvert sted. Kombineret med fænotypiske foranstaltninger giver dette mulighed for en pålidelig og høj gennemstrømningsplatform til undersøgelse af klinisk relevante hjertevarianter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af et canadisk institut for sundhedsforskningsprojekttilskud (T.W.C.) og Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery-tilskud (T.W.C.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Program | |||
| CRISPOR | TEFOR Infrastructure | ||
| ENSEMBL | European Bioinformatics Institute | ||
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | ||
| Micro-Manager | Open Source (Github) | ||
| NEBiocalculator | New England Biolabs (NEB) | ||
| EQUIPMENT | |||
| 24-well Plate | VWR | ||
| 25 mm Petri Dish | VWR | ||
| Blackfly USB3 Camera | Teledyne FLIR | ||
| C1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| Centrifuge 5415C | Eppendorf | ||
| EZNA Gel Extraction Kit | Omega Biotek | ||
| MAXIscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | ||
| MaxQ 5000 Incubator | Barnstead Lab Line | ||
| Miniprep Kit | Qiagen | ||
| mMessage mMachine T7 Ultra Transcription Kit | Invitrogen | ||
| ND1000 Spectrophotometer | Nanodrop | ||
| PCR Purification Kit | Qiagen | ||
| PLI 100A Picoinjector | Harvard Apparatus | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | ||
| Stemi 305 Steroscope | Zeiss | ||
| Wide Mini Sub Cell GT Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| ZebTec Zebrafish Housing System | Tecniplast | ||
| SERVICES | |||
| Gene Synthesis | Genewiz | ||
| Sanger Sequencing | Genewiz | ||
| REAGENTS | |||
| 10β Competent Cells | NEB | ||
| 10X PCR Buffer | Qiagen | ||
| 100 mM Nucleotide Mixture | ABM | ||
| Ampicillin | Sigma | ||
| BamHI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| BsaI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| DR274 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| EcoRI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Glycerol | |||
| HEPES | Sigma | ||
| HindIII Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Kanamycin | Sigma | ||
| Methylene Blue | Sigma | ||
| MLM3613 Plasmid (XL1 Blue bacterial agar stab) | Addgene | ||
| MS-222 (Tricaine) | Sigma | ||
| pKHR5 Plasmid (DH5α bacterial agar stab) | Addgene | ||
| PmeI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| SalI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma | ||
| T4 Ligase w/ buffer | Sigma | ||
| Taq Polymerase | Qiagen | ||
| TE Buffer | Sigma | ||
| Tris Hydrochloride | Sigma | ||
| XhoI Endonuclease w/ buffer | NEB | ||
| RECIPES | |||
| Solution | Component | Supplier | |
| Annealing Buffer (pH 7.5-8.0) | 10 mM Tris | Sigma | |
| 50 mM NaCl | Sigma | ||
| 1 mM EDTA | Sigma | ||
| E3 Media (pH 7.2) | 5 mM NaCl | Sigma | |
| 0.17 mM KCl | Sigma | ||
| 0.33 mM CaCl2 | Sigma | ||
| 0.33 mM MgSO4 | Sigma | ||
| Injection Buffer (pH 7.5) | 20 mM HEPES | Sigma | |
| 150 mM KCl | Sigma |
References
- Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082 (2019).
- Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
- Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
- Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
- Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
- Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
- González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
- Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188 (2016).
- Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67 (2020).
- de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429 (2021).
- Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340 (2020).
- Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545 (2014).
- Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
- Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102 (2018).
- Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968 (2020).
- Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
- Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
- Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
- Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
- Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
- Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552 (2013).
- Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
- Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
- Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
- Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
- MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).
