Summary
我们描述了一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选的方法，以分离和分析外周血单核细胞（单核细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和自然杀伤细胞）的已定义免疫细胞亚群。使用这种方法，可以纯化和分析磁性和荧光标记的细胞。
Abstract
传染性单核细胞增多症 （IM） 是一种急性综合征，主要与原发性 EB 病毒 （EBV） 感染有关。主要临床症状包括不规则发热、淋巴结肿大和外周血淋巴细胞明显增多。IM的致病机制尚不清楚;目前尚无有效的治疗方法，主要有对症治疗。EBV免疫生物学中的主要问题是，为什么只有一小部分感染者表现出严重的临床症状，甚至发展为EBV相关的恶性肿瘤，而大多数人在病毒中终生无症状。
B细胞首先参与IM，因为EBV受体存在于其表面。自然杀伤（NK）细胞是细胞毒性先天淋巴细胞，对杀死EBV感染的细胞很重要。在急性EBV感染期间，CD4 + T细胞的比例降低，而CD8 + T细胞的比例急剧扩大，CD8 + T细胞的持久性对于IM的终身控制很重要。这些免疫细胞在IM中起着重要作用，它们的功能需要单独识别。为此，首先使用CD14微珠，色谱柱和磁分离器从IM个体的外周血单核细胞（PBMC）中分离单核细胞。
其余PBMC用peridinin-叶绿素蛋白（PerCP）/花青素5.5抗CD3、别藻蓝蛋白（APC）/花青7抗CD4、藻红蛋白（PE）抗CD8、异硫氰酸荧光素（FITC）抗CD19、APC抗CD56和APC抗CD16抗体染色，以使用流式细胞仪分选CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和NK细胞。此外，对5个亚群进行转录组测序，探讨其在IM中的功能和致病机制。
Introduction
EB 病毒 （EBV） 是一种γ疱疹病毒，也称为人类疱疹病毒 4 型，在人群中普遍存在，并在 90% 以上的成年人口中建立终生潜伏感染1。大多数 EBV 原发性感染发生在儿童期和青春期，少数患者表现为传染性单核细胞增多症 （IM）2，表现出特征性免疫病理学，包括血液中 CD8+ T 细胞的激活免疫应答和口咽部 EBV 感染的 B 细胞短暂增殖3。IM的病程可能持续2-6周，大多数患者恢复良好4。然而，有些人会出现持续性或复发性IM样症状，发病率和死亡率很高，这被归类为慢性活动性EBV感染（CAEBV）5。此外，EB病毒是一种重要的致癌病毒，与多种恶性肿瘤密切相关，包括鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤（HL）和T/NK细胞淋巴瘤6等上皮样和淋巴恶性肿瘤。尽管EB病毒已经研究了50多年，但其发病机制和诱导淋巴细胞增殖的机制尚未完全阐明。
一些研究已经通过转录组测序研究了EBV感染免疫病理学的分子特征。钟等分析了中国IM或CAEBV患儿外周血单核细胞（PBMC）的全转录组分析，发现CD8+T细胞扩增主要见于IM组7，提示CD8+T细胞可能在IM中起主要作用。同样，另一项研究发现，与由EBV再激活和其他药物引起的IM患者相比，原发性EBV感染引起的IM患者中EBV特异性细胞毒性T和CD19 + B细胞的比例较低，CD8 + T细胞的百分比较高8。B细胞首先参与IM，因为EBV受体存在于其表面。Al Tabaa等人发现B细胞在IM9期间被多克隆激活和分化的原浆母细胞（CD19+，CD27+和CD20−以及CD138−细胞）和浆细胞（CD19+，CD27+和CD20−以及CD138+）。此外，Zhong等人发现单核细胞标志物CD14和CD64在CAEBV中上调，表明单核细胞可能通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和过度活跃的吞噬作用在CAEBV的细胞免疫应答中发挥重要作用7。Alka等人对来自四名IM或HL患者的MACS分选CD56暗CD16 + NK细胞的转录组进行了表征，发现来自IM和HL的NK细胞具有下调的先天免疫和趋化因子信号基因，这可能是NK细胞低反应的原因10。此外，Greenough等人分析了来自IM个体的10个PBMC的分选CD8 + T细胞的基因表达。他们报告说，IM中很大一部分CD8 + T细胞具有病毒特异性，激活，分裂，并已准备好发挥效应活性11。在原发性 EBV 感染期间，T 细胞介导的 EBV 特异性反应和 NK 细胞介导的非特异性应答都起着至关重要的作用。然而，这些研究仅研究了免疫细胞多种混合物或仅研究特定淋巴细胞亚群的转录组结果，不足以全面比较同一疾病状态下IM患儿不同免疫细胞亚群的分子特征和功能。
本文描述了一种结合免疫磁珠和荧光激活细胞分选（FACS）来分离和分析PBMC的明确免疫细胞亚群（单核细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，B细胞和NK细胞）的方法。使用这种方法，可以使用磁选机和FACS纯化磁性和荧光标记的细胞或通过流式细胞术进行分析。可以从纯化的细胞中提取RNA进行转录组测序。该方法将使IM个体在相同疾病状态下的不同免疫细胞的表征和基因表达成为可能，这将扩展我们对EBV感染免疫病理学的理解。
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Protocol
从IM患者（n = 3），健康EBV携带者（n = 3）和未感染EBV的儿童（n = 3）获得血液样本。志愿者来自首都医科大学附属北京儿童医院，所有研究均获得伦理认可。获得首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会伦理认证（批准文号：[2021]-E-056-Y）。由于该研究仅使用剩余样本进行临床试验，因此放弃了患者的知情同意。所有数据都经过完全去识别化和匿名化处理，以保护患者隐私。
1. 从外周血中分离PBMC
- 通过标准静脉穿刺将肌内注射患者的新鲜外周血 （2 mL） 收集到 K3EDTA 管中。
注意：该过程需要快速以保持细胞活力。 - 用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 将外周血稀释至两倍体积，并将其分层在 15 mL 离心管中的人淋巴细胞分离培养基（密度：1.077 ± 0.001 g/mL）上。
注意：血液，PBS和分离介质的体积比为1：1：1。将血液缓慢加入分离介质中，并立即离心以避免血液沉淀到分离介质中。 - 在室温下以800× g 离心20分钟。将中间层（富集的 PBMC）转移到另一个 15 mL 离心管中。
注意：离心后，管底部为红细胞，中间层为分离介质，顶层为血浆，血浆层与分离液层之间为PBMC（包括淋巴细胞和单核细胞）。 - 用10mL PBS洗涤PBMC，并在室温下以800× g 离心20分钟;小心丢弃上清液。
- 重复洗涤和离心（步骤1.4）2 x。用 1 mL PBS 重悬于 1.5 mL 微量离心管中，并用台盼蓝自动计数器计数细胞。
2. 使用 CD14 微珠从 PBMC 中分离 CD14 + 单核细胞
- 在PBS（pH 7.2）中制备含有0.5%胎牛血清（FBS）和2mM EDTA的缓冲溶液。保持缓冲液低温（2-8°C）。
注意：使用前对缓冲液进行脱气，因为气泡可能会阻塞色谱柱。保持细胞低温，以防止抗体在细胞表面封盖和非特异性细胞标记。 - 在室温下以300× g 离心PBMCs10分钟。小心丢弃上清液。用 80 μL 缓冲液重悬细胞。向细胞悬液中加入 20 μL CD14 微珠。
注意：如果有 ≤107 PBMC，请使用上述音量。如果有 >107 PBMC，则按比例增加所有试剂体积和总体积。 - 将CD14微珠和细胞在1.5mL微量离心管中充分混合，并在4°C冰箱中孵育15分钟。用 1 mL 缓冲液洗涤 PBMC，并在室温下以 300 × g 离心 10 分钟。完全弃去上清液。用 500 μL 缓冲液重悬细胞。
注意：如果有 ≤108 PBMC，请使用上述音量。如果有 >10个 8 PBMC，请按比例增加缓冲液体积。 - 色谱柱磁选：
- 将色谱柱放在磁珠分离器上，并用3 mL缓冲液洗涤色谱柱。将细胞悬液（来自步骤2.3）添加到色谱柱中。
- 将穿过色谱柱的未标记细胞收集到15 mL离心管中，并用3 mL缓冲液洗涤色谱柱。用 3 x 3 mL 缓冲液洗涤色谱柱。将总流出物收集在 15 mL 离心管中。
- 将色谱柱放入新的 15 mL 离心管中。向色谱柱中加入 5 mL 缓冲液。将柱塞牢固地推入色谱柱中，立即将磁性标记的细胞冲洗到 15 mL 离心管中。
- 将磁性标记的细胞以300 ×g 离心5分钟并除去上清液。将细胞重悬于 1.5 mL 微量离心管中的 500 μL PBS 中，用于后续转录组测序。
3. 通过荧光标记的抗体染色和 FACS 从 PBMC 中分离淋巴细胞群
- 将未标记的细胞（步骤2.4.2）以300× g 离心5分钟并除去上清液。将细胞重悬于 1.5 mL 微量离心管中的 100 μL PBS 中。
- 将 2 μL 每种标记抗体（CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD56）加入 100 μL 细胞悬液中（抗体的体积和偶联荧光团信息如 表 1 所示），在冰上孵育 30 分钟，避光。
- 通过加入 1 mL PBS 并在室温下以 300 × g 离心 5 分钟来洗涤细胞 2 次。将细胞重悬于 1.5 mL 微量离心管中的 500 μL PBS 中。在流式细胞分选仪上获取数据之前，轻轻涡旋细胞悬液。
4. 流式细胞术参数设置
- 根据需要在 1.5 mL 微量离心管中取 100 μL 细胞悬液（参见第 1 节），并设置阴性对照样品、CD3 单染色样品、CD4 单染色样品、CD8 单染色样品、CD19 单染色样品和 CD56/CD16 染色样品。
- 每 100 μL 细胞悬液和涡旋加入 2 μL 相应的荧光标记抗体。在黑暗中在冰上孵育30分钟。以300× g 离心5分钟并吸出上清液。用 500 μL PBS 重悬沉淀并涡旋。
- 委托分选流并使用荧光珠延迟液滴，如下所示：
- 打开细胞分选系统，运行 通电程序，安装 85 μm喷嘴，然后打开 分选流。将 分拣电压 设置为 4，500 V，将 频率 设置为 47。
- 调整参数主要根据制造商的说明调整主流液滴断点和液滴延迟 12.在中断窗口中将第一个液滴断点位置 （Drop1） 设置为 275，将间隙设置为 8。打开最佳点自动分选模式，让细胞仪自动确定液滴振幅值以稳定流。
- 通过加载荧光珠，在侧流窗口中将液滴延迟调整为 30.31，确保磁珠在初始或微调模式下实现 >99% 的侧流偏转。
- 请参考 图 1 中所示的门控策略来执行门控，如下所示：
- 使用前向散射区域 （FSC-A）/侧散射区域 （SSC-A） 点图，绘制 多边形门 （P1） 以识别 完整的淋巴细胞 群。
- 使用 FSC-A/FSC-HEIGHT （FSC-H） 点图，绘制多边形门 （P2） 以识别 单个单元格 并排除双峰（图 1A）。
- 使用 CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A 点图，绘制矩形门 （P3） 以选择 CD3+ T 细胞和 CD19+ B 细胞（图 1A，B）。
- 使用CD4 APC-Cy7-A / CD8 PE-A点图，绘制矩形门以选择CD4 + T细胞和CD8 + T细胞（分别具有这些标记物的高荧光细胞）。
- 使用 CD56/CD16 APC-A/SSC-A 点图，绘制一个矩形门以选择 CD56+/CD16+ NK 细胞（图 1C）。
- 使用阴性对照样品调整仪器参数：
- 将负对照管安装到装载端口上，然后单击采集仪表板中的装载。在软件中选择细胞仪设置。
- 在“检查器”窗口中，单击 “参数 ”选项卡，然后调整FSC，SSC和不同荧光染料的电压; FSC：231，SSC：512，PE：549，APC：615，APC-花青7：824，FITC：555，PerCP-花青5.5：663。
- 使用单染色样品调整补偿13.
- 将单染色管依次加载到细胞仪上，并在软件中选择 细胞仪设置 。单击补偿选项卡以调整 补偿 。
注意：流式细胞术的补偿参考如 表2所示。
- 将单染色管依次加载到细胞仪上，并在软件中选择 细胞仪设置 。单击补偿选项卡以调整 补偿 。
5. 通过流式细胞术进行 细胞分选和收集数据
- 在将试管装入细胞仪之前，短暂涡旋细胞悬液（根据第1-3节分离的PBMC）以重悬细胞。将剩余的试管放在冰上。
- 向四个收集流管中加入 200 μL FBS，以避免分选的细胞粘附在管壁上，并将其放入细胞仪收集室中。
- 从四个流管中的IM患者样本中分别收集CD3 + CD4 + T细胞，CD3 + CD8 + T细胞，CD3−CD19 + B细胞和CD3 - CD56 + / CD16 + NK细胞（图2A）。
- 将分离的细胞以300 ×g 离心5分钟并除去上清液。向细胞中加入 200 μL RNA 分离试剂进行转录组测序。
- 根据上述步骤，从健康EBV携带者和EBV未感染的儿童中分离样品的免疫细胞亚群（图2B，C）。
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Representative Results
门控策略参考
用于对四个淋巴细胞亚群进行分类的门控策略如图1所示。简而言之，在显示颗粒度（SSC-A）与大小（FSC-A）的点图上选择淋巴细胞（P1）。然后，在显示大小（FSC-A）与前向散射（FSC-H）的点图上选择单个单元格（P2），同时排除双联单元格。CD3 + T细胞（P3）和CD19 + B细胞（图1B）在点图上分别选择，显示CD3 PerCP-Cy5.5-A与CD19 FITC-A。CD8 + T细胞和CD4 + T细胞在点图上分别选择，显示CD8 PE-A与来自P3的CD4 APC-Cy7-A。在点图上选择CD16 + / CD56 + NK细胞，显示CD56 / CD16 APC-A与来自P4的SSC-A（图1C）。
通过所述方法从IM患者样本中分选的四个细胞亚群的代表性结果如图2A所示。我们还对来自健康EBV携带者和未感染EBV的儿童作为对照组的样本进行了细胞分选，以确认该实验的可行性。从健康EBV携带者样本中分离的细胞亚群的代表性结果如图2B所示。从未感染EBV的儿童样本中分选的细胞亚群的代表性结果如图2C所示。如图2所示，对P1进行门控以鉴定淋巴细胞，并通过P2排除双联细胞;对P3进行门控以选择CD3 + T细胞，对P5进行门控以选择CD19 + B细胞;CD3+ CD8+ T细胞（P6）和CD3+ CD4 + T细胞（P7）分别与P3分开选择;从P4中选择CD16 + / CD56 + NK细胞（P8）。这些亚群中的每一个都可以单独分类和收集以进行下游实验。该系统用于通过RNA提取和转录组测序分析基因表达。
如表3所示，与健康EBV携带者和未感染EBV的儿童相比，IM患者观察到CD3 + CD8 + T细胞增加（46.5±4.0 vs. 27.0 ± 0.1和46.5 ± 4.0 vs. 24.7 ± 2.9，CD3 + CD8 + T细胞百分比/总淋巴细胞）;与健康EBV携带者和未感染EBV的儿童相比，IM患者中观察到CD3 + CD4 + T细胞和CD19 + B细胞的比例降低（13.4±1.5±1.5和13.4±1.5对23.6 ±3.2，每总淋巴细胞%CD3 + CD4 + T细胞;1.4± 0.3 vs. 7.6 ± 0.7和1.4 ± 0.3 vs. 9.0 ± 1.5，每总淋巴细胞%CD19 + B细胞）。与未感染EBV的儿童相比，IM患者中观察到CD16 + / CD56 + NK细胞的比例降低（7.5±0.5 vs. 10.7±0.4，CD16 + / CD56 + NK细胞/总淋巴细胞的百分比）。这些结果验证了该分选方案的有效性，并证明IM和EBV未感染儿童患者的淋巴细胞亚群比例不同。
图1：用于从PBMC中分离免疫细胞亚群的整体门控策略。 （A）PerCP-Cy5.5过滤器用于分离CD3 + T细胞。CD8 + T细胞和CD4 + T细胞分别在点图上选择，显示CD8 PE-A与来自P3的CD4 APC-Cy7-A。（B）FITC过滤器用于识别CD19 + B细胞。（C）APC过滤器用于从P4中分离CD16 + / CD56 + NK细胞。缩写：PBMC=外周血单核细胞;FSC-A = 前向散射区域;SSC-A = 侧向散射区域;FSC-H = 前向散射高度;PerCP = 佩里地宁-叶绿素-蛋白;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。请点击此处查看此图的大图。
图2：通过所述方法成功分离的四个细胞亚群的代表性结果。 （A）IM患者外周血样本中的代表性细胞分选图。（B）来自健康EBV携带者的外周血样本的代表性细胞分选图。（C）来自EBV未感染儿童的外周血样本的代表性细胞分选数字。P1，点阵图门识别淋巴细胞;P2、点阵图门选择单细胞;P3、点阵图门选择CD3+T细胞;P4，点阵图门识别CD3-CD19-淋巴细胞;P5，点阵图门选择CD19+ B细胞;P6，点阵图门从P3中选择CD3+ CD8+ T细胞;P7，点阵图门从P3中选择CD3+ CD4+ T细胞;P8，点阵图门从P4中选择CD16 + / CD56 + NK细胞。缩写：EBV = 爱泼斯坦-巴尔病毒;IM = 传染性单核细胞增多症;FSC-A = 前向散射区域;SSC-A = 侧向散射区域;FSC-H = 前向散射高度;PerCP = 佩里地宁-叶绿素-蛋白;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。请点击此处查看此图的大图。
| 抗体靶标 | 共轭荧光基团 | 剂量 | 克隆 | 同种型 |
| CD3 | 全氯乙烯/花青5.5 | 2 微升 | SK7 | 小鼠IgG1， κ |
| CD4 | APC/花青7 | 2 微升 | SK3 | 小鼠IgG1， κ |
| CD8 | 体育 | 2 微升 | SK1 | 小鼠IgG1， κ |
| CD19 | FITC | 2 微升 | HIB19 | 小鼠IgG1， κ |
| CD56 | 装甲运兵车 | 2 微升 | 5.1H11 | 小鼠IgG1， κ |
| CD16 | 装甲运兵车 | 2 微升 | 3G8 | 小鼠IgG1， κ |
表1：用于流式细胞术的抗体。 缩写：PerCP = 佩里地宁-叶绿素-蛋白质;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。
| 流式细胞术补偿参考（%） | |||||
| 体育 | 装甲运兵车 | APC-Cy7 | FITC | 全氯乙烯5.5 | |
| 体育 | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| 装甲运兵车 | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| FITC | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| 全氯乙烯5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
表2：流式细胞术的补偿参考。 缩写：PerCP = 佩里地宁-叶绿素-蛋白质;PE = 藻红蛋白;APC = 别藻蓝蛋白;FITC = 异硫氰酸荧光素。
| 不同亚群淋巴细胞占总分选淋巴细胞的比例（%） | |||
| 淋巴细胞亚群 | 我 | 健康的EB病毒携带者 | 未感染EBV的儿童 |
| CD3+ T 细胞 | 80.5 ± 1.8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3+ CD8+ T 细胞 | 46.5 ± 4.0 | 27.0 ± 0.1 | 24.7 ± 2.9 |
| CD3+ CD4+ T 细胞 | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK细胞 | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3-CD19+ B细胞 | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
表3：不同组的分选淋巴细胞比例。 缩写：EBV = 爱泼斯坦-巴尔病毒;IM = 传染性单核细胞增多症;NK = 自然杀手。
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Discussion
该协议代表了对外周血免疫细胞亚群进行分类的有效方法。本研究选取IM患者、健康EBV携带者和EBV未感染儿童的静脉血样作为研究目标。本工作使用IM患者的外周血，主要侧重于通过多色流式细胞术分析和确定不同细胞亚群的比例。转录组测序主要用于检测和分析同一疾病状态下IM患儿不同免疫细胞亚群中不足以全面、特异性比较不同免疫细胞亚群的淋巴细胞亚群。因此，从外周血中分离出几种类型的细胞并进行转录组测序，以比较这些免疫细胞的表达基因和功能的差异，可以为IM发病机制的研究提供重要数据。
FACS分选的另一个好处是能够处理活的分馏细胞，以进行进一步的体外或体内实验14。保持细胞活力对于后续实验至关重要。我们已经优化了分选步骤以提高该协议中的细胞活力 - 实验操作已在冰上或4°C冰箱中进行。适当的离心速度和时间对于细胞分离也至关重要。分选细胞的产量也是该方法的主要制约因素，在分选过程中使用FBS包被的试管可以大大减少粘附在试管上的细胞的损失。为 FACS 分选机提供适当的设置可以避免收集管中的细胞堵塞或交叉污染，从而提高分选的整体效率。通过优化实验步骤和设置，该协议可以通过替换磁性或荧光标记来推断到其他免疫细胞的分选。然而，由于儿童样本的特异性（低采血量），由于流分选通道的限制，我们只研究了免疫细胞的主要群体（单核细胞、CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞和 NK 细胞），而没有进行亚群的分选。本研究表明，免疫功能正常的儿童的外周血样本和IM的样本可以成功分选出这五组免疫细胞;然而，血液系统恶性肿瘤（例如，白血病，淋巴瘤），淋巴组织增生性疾病（例如，移植后淋巴组织增生性疾病，CAEBV）或原发性免疫缺陷/获得性免疫缺陷综合征患者的血液样本可能无法根据该方案成功分选。
IM被认为是一种自限性疾病，免疫细胞如γδ T细胞、NKT细胞和NK细胞在抗病毒免疫应答中起重要作用15。EBV 特异性 CD8+ T 细胞在很大程度上分化为效应表型10，16，并且晚期效应记忆和效应细胞从 IM 收缩到恢复期 17。同时，IM中的NK细胞似乎存在功能缺陷，包括缺乏细胞活化10，失去活化受体信号传导和脱颗粒18。有研究发现，CD4+T细胞不仅可以协助CD8+T细胞杀死和消除EBV感染的B细胞，还可以通过分泌细胞因子抑制B细胞的增殖，甚至在EBV感染过程中直接起到杀伤作用19，20。如本研究所示，与健康EBV携带者和未感染EBV的儿童相比，IM患者中CD3 + CD8 + T细胞的比例增加。相比之下，与未感染EBV的儿童相比，IM患者中观察到CD3 + CD4 + T细胞，CD19 + B细胞和CD16 + / CD56 + NK细胞的比例降低。然而，这些不同亚型免疫细胞在IM相同疾病状态下的功能和基因表达尚不清楚。进一步分析IM中特定免疫细胞亚群的基因表达谱有助于深入了解IM的致病机制。
我们提供了一种结合免疫磁珠分选和 FACS 的策略，以分离和分析 PBMC 中定义的免疫细胞亚群。 首先使用 CD14 微珠分离单核细胞，其余 PBMC 用相应的荧光标记抗体染色，以通过 FACS 分选 CD4+ T 细胞、CD8+ T 细胞、B 细胞和 NK 细胞。我们进一步使用这些分选的细胞进行RNA提取和转录组测序，以表征IM免疫病理学中不同免疫细胞的功能和基因表达。分选细胞的纯度和产量通常足以进行基因表达研究（数据未显示）。因此，分离免疫细胞亚群的分选方法可用于进一步探索EBV相关的淋巴组织增生性疾病，如CAEBV，移植后淋巴组织增生性疾病，以检测致病基因，致病蛋白和潜在的治疗靶点。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（82002130）、北京自然科学基金（7222059）和中国医学科学院医学创新基金（2019-I2M-5-026）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
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