Summary
ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.
Abstract
Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.
Introduction
Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala1. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs 2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyd-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, und der Schwerpunkt dieser Arbeit, ATAC-seq (Assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq kartiert zugängliche Regionen durch die Verwendung eines Schlüsselmerkmals von DNase, nämlich der bevorzugten Verdauung von nackter DNA, die frei von Histonen und anderen Proteinen wie Transkriptionsfaktoren5 ist. FAIRE-seq, ähnlich wie ChIP-seq, nutzt Formaldehydvernetzung und Beschallung, außer dass keine Immunpräzipitation beteiligt ist, und die nukleosomenfreien Regionen werden durch Phenol-Chloroform-Extraktion isoliert6. Die MAPit-Methode verwendet eine GC-Methyltransferase, um die Chromatinstruktur bei Einzelmolekülauflösung7 zu untersuchen. ATAC-seq basiert auf der hyperaktiven Transposase Tn58. Die Tn5-Transposase bindet bevorzugt an offene Chromatinbereiche und fügt Sequenzierungsadapter in zugängliche Bereiche ein. Tn5 arbeitet durch einen DNA-vermittelten "Cut and Paste"-Mechanismus, wobei die mit Adaptern vorgeladene Transposase an offene Chromatinstellen bindet, DNA schneidet und die Adapter8 ligiert. Tn5-gebundene Regionen werden durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Primern wiederhergestellt, die an diese Adapter angeglüht werden. FAIRE-seq und DNase-seq erfordern eine große Menge an Ausgangsmaterial (~100.000 Zellen bis 225.000 Zellen) und einen separaten Bibliotheksvorbereitungsschritt vor der Sequenzierung9. Auf der anderen Seite ist das ATAC-seq-Protokoll relativ einfach und erfordert eine kleine Anzahl von Zellen (<50.000 Zellen)10. Im Gegensatz zu den FAIRE-seq- und DNase-seq-Techniken ist die Sequenzierungsbibliotheksvorbereitung von ATAC-seq relativ einfach, da die isolierte DNA-Probe bereits mit den Sequenzierungsadaptern von Tn5 markiert wird. Daher ist nur der PCR-Amplifikationsschritt mit geeigneten Primern erforderlich, um die Bibliotheksvorbereitung abzuschließen, und die vorherigen Verarbeitungsschritte wie Endreparatur und Adapterligatur müssen nicht durchgeführt werden, was Zeit spart11. Zweitens vermeidet ATAC-seq die Notwendigkeit einer Bisulfitumwandlung, Klonierung und Amplifikation mit regionsspezifischen Primern, die für MAPit7 erforderlich sind. Aufgrund dieser Vorteile ist ATAC-seq zu einer sehr beliebten Methode zur Definition offener Chromatinregionen geworden. Obwohl die ATAC-seq-Methode einfach ist, erfordern mehrere Schritte eine Optimierung, um qualitativ hochwertige und reproduzierbare Daten zu erhalten. Dieses Manuskript diskutiert Optimierungsverfahren für die Standard-ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung und hebt insbesondere drei Parameter hervor: (1) Lysepufferzusammensetzung, (2) Tn5-Transposase-Konzentration und (3) Zellzahl. Darüber hinaus liefert dieser Artikel Beispieldaten aus den Optimierungsbedingungen unter Verwendung von krebsartigen und nicht-kanzerösen adhärenten Epithelzellen.
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Protocol
1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments
- Lysepufferlager vorbereiten.
HINWEIS: Der optimale nukleare Isolationspuffer kann für jeden Zelltyp unterschiedlich sein. Wir empfehlen, sowohl den im Originalpapier8 verwendeten hypotonischen Puffer als auch einen CSK-Puffer12,13 für jeden Zelltyp unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zu testen.- Zur Herstellung des hypotonischen Puffers (Greenleaf-Puffer) mischen Sie 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 und 0,1% NP-40.
- Zur Herstellung des CSK-Puffers mischen Sie 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM Saccharose, 3 mMMgCl2 und 0,1% Triton X-100.
- Stellen Sie sicher, dass die Zellkulturbedingungen optimal sind; Untersuchen Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass es keine erhöhten Apoptosewerte gibt.
- Schalten Sie die Zentrifuge ein, damit sie 4 °C erreicht.
2. Zellernte
- Absaugen von Medien aus einer Zellkultur bei <80% Konfluenz. Zellen werden typischerweise in einer 35 mm oder 60 mm Schale gezüchtet, basierend auf der Anzahl der benötigten Zellen, Behandlungen usw.
- Waschen Sie die Zellen mit 1 ml oder 3 ml PBS.
- Fügen Sie 0,5 ml oder 1 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie für 2-3 min (abhängig von den Zelltypen). Verwenden Sie vorsichtig eine 1-ml-Pipette, um gut zu mischen.
- Geben Sie 1 ml oder 2 ml Medien auf die Platte und mischen Sie gut. Transfer in ein 15 ml konisches Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen für 3 min bei 300 x g.
HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. - Saugen Sie das Medium ab und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml oder 2 ml Medium.
HINWEIS: Es ist wichtig, eine homogene Einzelzelllösung herzustellen. Für Gewebe kann ein Dounce-Homogenisator verwendet werden, um Gewebe zu homogenisieren und große Zellklumpen oder Aggregate zu minimieren. Einige Gewebe erfordern Filtration (z. B. Zellsiebe) und/oder FACS-Zellsortierung, um lebensfähige Zellen zu isolieren und eine Einzelzelllösung zu erhalten. - Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Zellzählers.
HINWEIS: In dieser Studie wurde ein automatisierter Zellzähler (Table of Materials) verwendet. - Zentrifugieren Sie das erforderliche Zellvolumen (z. B. ein Volumen mit 1 x 106 Zellen basierend auf der Zellzahl) bei 300 x g für 3 min bei Raumtemperatur (RT).
- Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 1 x 106 Zellen in 1 ml kaltem PBS.
HINWEIS: Wenn die Zellzahlen kleiner als 1 x 10 6 Zellen sind, verringern Sie das kalte PBS-Volumen, um die Zelllösung in der gleichen Konzentration (1 x 106 Zellen / ml) herzustellen.
3. Zelllyse
- 25 μL (= 2,5 x 104 Zellen) in ein neues 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen
HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden. - Fügen Sie 25 μL Lysepuffer hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch sanftes Pipettieren auf und ab. 5 min auf Eis inkubieren
- 5 min bei 500 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand vorsichtig verwerfen.
HINWEIS: Ein schwingender Schaufelrotor wird empfohlen, um den Zellverlust zu minimieren. Lassen Sie etwa 3 μL Überstand, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht verworfen werden.
4. Tn5-Tagmentation
- Das Pellet wird sofort in 25 μL Tn5-Reaktionsgemisch resuspendiert. Die Tn5-Reaktionsmischung ist wie folgt: 12,5 μL 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25-5 μL Tn5-Transposase und 11,25-7,5 μL nukleasefreies Wasser.
HINWEIS: Die Standardkonzentration von Tn5 beträgt 2,5 μL für 2,5 x 104 Zellen. - 30 min bei 37 °C inkubieren.
HINWEIS: Mischen Sie die Lösung alle 10 Minuten.
5. DNA-Reinigung
HINWEIS: Vor der Verstärkung ist eine Reinigung erforderlich. Die DNA-Aufreinigung erfolgt mit dem MinElute PCR-Reinigungskit (Table of Materials).
- Fügen Sie 5 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) hinzu.
- Sofort 125 μL Buffer PB hinzufügen und gut mischen.
- Befolgen Sie ab Schritt 2 das Protokoll des PCR-Aufreinigungskits .
- Legen Sie die Spin-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen.
- Die Probe auf die Spinsäule auftragen und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
- 750 μL Puffer-PE in die Spin-Säule geben und 1 min bei 17.900 x g RT zentrifugieren.
- Verwerfen Sie den Durchfluss, und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Sammelrohr ein.
- Zentrifugieren Sie die Spin-Säule für 5 min, um die Membran vollständig zu trocknen.
- Verwerfen Sie den Durchfluss und legen Sie die Spin-Säule in ein neues 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- Eluieren Sie die DNA-Fragmente mit 10 μL Buffer EB.
- Lassen Sie die Säule 1 min bei RT stehen.
- Zentrifugieren Sie für 1 min bei 17.900 x g RT, um die DNA zu eluieren.
6. PCR-Amplifikation
HINWEIS: Die PCR-Amplifikation transponierter (markierter) DNA ist für die Sequenzierung notwendig. In diesem Beispiel wurden Nextera-Kit-Adapter (Table of Materials) verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Die folgende PCR-Reaktion in 200 μL PCR-Röhrchen (50 μL für jede Probe) einrichten. Die PCR-Reaktionsmischung ist wie folgt: 10 μL eluierte DNA (Schritt 5.), 2,5 μL 25 mM Adapter 1, 2,5 μL 25 mM Adapter 2, 25 μL 2x PCR-Mastermix und 10 μL nukleasefreies Wasser
- Führen Sie das PCR-Amplifikationsprogramm Teil 1 durch (Tabelle 2).
HINWEIS: Für die anfängliche Amplifikation werden für alle Proben mit einem Standard-Thermocycler die gleichen Bedingungen verwendet. - Real-time qPCR (insgesamt 14,5 μL pro Probe)
- Richten Sie unter Verwendung von 5 μL des Produkts aus der PCR-Amplifikation Teil 1 (Schritt 6.2) die folgende Reaktion ein, diesmal einschließlich SYBR-Gold und Nachweis in einer Echtzeit-PCR-Maschine.
- Das PCR-Reaktionsgemisch wird wie folgt hergestellt: 5 μL PCR-Produkt aus Schritt 6.2., 0,75 μL SYBR-Gold (1000x verdünnt), 5 μL 2x PCR-Mastermix und 3,75 μL nukleasefreies Wasser.
HINWEIS: Die genauen Zykluszahlen für die Bibliotheksamplifikation vor Erreichen der Sättigung für jede Probe werden durch qPCR bestimmt (Tabelle 3), um den GC- und Größenbias in PCR10 zu reduzieren. SYBR Gold wurde mit nukleasefreiem Wasser verdünnt. Zur Herstellung der verdünnten Lösung wurde 1 μL SYBR Gold (Stammkonzentration 10.000x) zu 999 μL nukleasefreiem Wasser gegeben. Die in Tabelle 3 erwähnte Laufzeit der RT-qPCR beträgt ca. 60 min.
- Ermitteln Sie die erforderliche Anzahl zusätzlicher PCR-Zyklen anhand der Laufparameter aus Schritt 6.3.
- Anzahl der Zyklen = 1/4 maximale (gesättigte) Fluoreszenzintensität (typischerweise 3 oder 4 PCR-Zyklen)
- PCR-Amplifikationsprogramm Teil 2 (Volumen = 45 μL; Tabelle 4): Sobald Sie die Zyklusnummer ermittelt haben, richten Sie PCRs mit zusätzlichen Zyklen ein, die in Schritt 6.4.1 berechnet werden. Wenn die berechnete Zykluszahl beispielsweise 3 ist, richten Sie im folgenden Programm 3 Zyklen ein. Die Gesamtzyklen wären 8 (5 in Schritt 6.2., plus 3 zusätzliche Zyklen in Schritt 6.5).
7. Reinigung von Perlen
HINWEIS: Hier wurden AMPure XP (Table of Materials) Perlen verwendet.
- Zu den im vorherigen Schritt amplifizierten PCR-Produkten werden 150 μL Perlen bei RT hinzugefügt.
HINWEIS: Hausgemachte AMPure-Perlen14 können in diesem Prozess verwendet werden. - Inkubieren Sie für 15 min bei RT.
- Legen Sie die Röhrchen für 5 min auf einen Magnetständer.
- Entfernen Sie den Überstand vorsichtig.
- Waschen Sie die Perlen mit 200 μL 80% Ethanol.
HINWEIS: 80% Ethanol sollte frisch zubereitet werden. - Wiederholen Sie Schritt 7.4.
- Entfernen Sie das Ethanol vollständig.
- Trocknen Sie die Proben 10 min an der Luft bei RT.
- Resuspendieren mit 50 μL Elutionspuffer (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
- Wiederholen Sie die Perlenreinigung (Schritte 7.1.-7.9.), um die Verunreinigung des Primers weiter zu minimieren.
8. DNA-Konzentration und Qualitätskontrolle
- Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Nukleinsäure-Quantifizierungskit (Table of Materials).
- Überprüfen Sie die amplifizierten DNA-Fragmente durch Gelelektrophorese mit SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% Agarosegel) oder einem automatisierten Elektrophoresesystem (z.B. TapeStation, Bioanalyzer).
9. Sequenzierung
- Durchführung einer Hochdurchsatzsequenzierung unter Verwendung der amplifizierten DNA-Proben12,13.
HINWEIS: Amplifizierte DNA-Proben sind bereit für die Hochdurchsatzsequenzierung. Um nukleosomale DNA-Fragmentinformationen zu erhalten, wird die Paar-End-Sequenzierung gegenüber der Single-End-Sequenzierung empfohlen. Beide Enden der DNA-Fragmente zeigen an, wo die Transposase bindet. Für die Kartierung offener Chromatinbereiche sind in der Regel 30 Millionen Lesevorgänge/Probe ausreichend.
10. Datenanalyse
- Datenfilterung basierend auf der Qualität von Basisanrufen: Legen Sie den minimalen durchschnittlichen Basisqualitätsfaktor auf 20 fest (Genauigkeit von 99 %).
- Adapterzuschnitt: Entfernen Sie die Adaptersequenzen mit einem geeigneten Werkzeug.
HINWEIS: Das Wrapper-Werkzeug "Galore trimmen" (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) wurde verwendet, um Adaptersequenzen zu entfernen. Für ATAC-seq-Bibliotheken, die von Illumina Tn5 vorbereitet wurden, wird die folgende Sequenz als Adaptersequenz verwendet: CTGTCTCTTATACACATCT. Die minimale Sequenzlänge zur Erkennung von Adapterverunreinigungen ist auf 5 festgelegt. - Genomkartierung: Ordnen Sie die Messwerte dem entsprechenden Genom mit Bowtie unter Verwendung der folgenden Parameter "-I 0 -X 2000 -m 1"15 zu. Ein Beispiel für die Kartierungsqualität von MDA-MB-231 basalen Brustkrebszellen ist unten:
Lesevorgänge mit mindestens einer gemeldeten Ausrichtung: 52,79 %
Lesevorgänge, die nicht ausgerichtet werden konnten: 13,10 %
Lesevorgänge mit unterdrückten Ausrichtungen aufgrund von -m: 34,11 % - Deduplizierung: Markieren Sie die PCR-Duplikate mit Picard-Tools16.
- Generieren einer Genomabdeckungsdatei für die Datenvisualisierung: Konvertieren Sie die deduplizierten Paired-End-Lesevorgänge in Single-End-Lesefragmente. Genomabdeckungsspuren werden mit genomeCoverageBed von Bettwerkzeugen17 erhalten.
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Representative Results
Um erfolgreiche und qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten zu erhalten, ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung kann in die fünf Hauptschritte unterteilt werden (Abbildung 1), nämlich Zelllyse, Tagmentation (Fragmentierung und Adapterinsertion durch Tn5), genomische DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation und Datenanalyse. Als ersten Prozess muss zunächst der Zelllysepuffer (Kernisolierung) für jeden Zelltyp optimiert werden. Zur Lyse von Brustkrebszellen wurde entweder der im ursprünglichen ATAC-seq-Paper8 beschriebene hypotonische Puffer oder der CSK-Puffer12,13 verwendet. Trypanblau-Färbung kann verwendet werden, um die Kernisolierung zu bestätigen18. Für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in menschlichen Krebszelllinien wie MDA-MB-231-, T47D-, MCF7- und A375-Zellen wurde der CSK-Puffer von mehreren Gruppen12,13,19,20 verwendet. CSK-Puffer wurde auch für die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung in anderen Zelltypen wie embryonalen Stammzellen 21,22 und Drosophila S2-Zellen 23 verwendet. Für die Optimierung des Lysepuffers ist die Trypanblau-Färbung nützlich, um die Effizienz der Zelllyse zu beurteilen. Wenn NMuMG, nicht-krebsartige Brustdrüsenepithelzellen der Maus, mit dem hypotonen Puffer8 (siehe Schritt 1) und dem CSK-Puffer behandelt wurden, wurde eine höhere Zelllyseeffizienz in CSK-behandelten Zellen beobachtet (Abbildung 2). Für gefrorenes Gewebe wurde gezeigt, dass Omni-ATAC die ATAC-seq-Signale verbessert24. Im Omni-ATAC wird ein Puffer verwendet, der 0,1% NP40, 0,1% Tween-20 und 0,01% Digitonin für die Zelllyse enthält. Obwohl bekannt ist, dass der Digitonin-basierte Puffer den Anteil der mitochondrialen DNA verringert, erwiesen sich die Signal-Rausch-Verhältnisse und TSS-Lesezahlen von ATAC-seq mit CSK-Puffer als besser als die von Omni-ATAC in Brustkrebszellen12. Daher konzentriert sich der Rest dieses Manuskripts hauptsächlich auf die Ergebnisse aus ATAC-seq-Daten mit CSK-Puffer.
Nach der Bestimmung der besten Zelllysepufferbedingungen (Kernisolierung) ist es wichtig, das Verhältnis zwischen der Anzahl der Eingangszellen und der Tn5-Transposase-Konzentration12,25 zu optimieren. Typischerweise kann die Tn5-Konzentration titriert werden, indem das Volumen von Tn5 von 1,25 μL, 2,5 μL bis 5 μL in einem Gesamtvolumen von 25 μL Reaktionsgemisch variiert wird. Alternativ können die Anzahl der Eingangszellen geändert werden (z. B. von 10.000 auf 100.000), während das Enzym Tn5 unverändert bei 2,5 μL bleibt, um die Tn5-Tagmentationsreaktion zu optimieren. Um die Qualität von ATAC-seq-Bibliotheken und die Effizienz des Tn5-induzierten Chromatinaufschlusses zu bewerten, können die Bibliotheks-PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert werden. Abbildung 3 zeigt Beispiele für erfolgreiche ATAC-seq-Bibliotheken. Typischerweise führt die PCR-Amplifikation von 8 oder 9 Zyklen (gesamte PCR-Zyklen einschließlich initialer PCR) zu einer Konzentration der ATAC-seq-Bibliothek von 3-6 ng/μL. Da Tn5 bevorzugt nukleosomenfreie Regionen bei offenem Chromatin "angreift" (Abbildung 1), sollten die Nukleosomenleitern auf dem Gelbild deutlich sichtbar sein (Abbildung 3). Ethidiumbromid oder SYBR Gold kann verwendet werden, um amplifizierte DNA auf dem Agarosegel nachzuweisen.
Als nächstes kann die qPCR-Analyse mit ATAC-seq-Bibliotheken verwendet werden, um die Qualität der Bibliotheken und die Fragmentanreicherung an offenen Chromatinregionen wie Promotoren aktiver Gene kurz zu überprüfen (Abbildung 4). Primer können so konzipiert werden, dass sie <80 bp Amplikone erzeugen, wobei Promotoren bekannter aktiver Gene als Positivkontrollen und bekannte "geschlossene" (inaktive) Chromatinregionen als Negativkontrollen verwendet werden (Abbildung 4A). Unter den getesteten Bedingungen wurde eine höhere Anreicherung in den T47D ATAC-seq-Bibliotheken mit CSK-Puffer beobachtet (Abbildung 4B). Wie erwartet, fanden wir eine stärkere Anreicherung mit den Primern K und L an der Östrogenrezeptor alpha (ESR1) Genpromotorregion im Vergleich zu einer geschlossenen Region stromaufwärts von ESR1 mit Primer C (Abbildung 4B)26. Abbildung 5 zeigt Beispiele für ATAC-seq-Daten mit unterschiedlichen Tn5-Konzentrationen (25.000 Zellen wurden verwendet). In diesem Fall wurde ein höheres Hintergrundrauschen im niedrigsten Tn5-Zustand (1,25 μL Tn5) festgestellt (Abbildung 5, vertikale Balken). ATAC-seq-Daten von 2,5 μL oder 5 μL Tn5 zeigten ähnliche Niveaus von ATAC-seq-Signalen in offenen Chromatinregionen mit niedrigeren Hintergrundsignalen. Unter Berücksichtigung der möglichen Überverdauung durch Tn5 in der höheren Konzentration kann geschlossen werden, dass 2,5 μL Tn5 für diesen Zelltyp geeignet sind.
Wir führten auch die ATAC-seq mit verschiedenen Zellzahlen in NMuMG-Zellen durch, die häufig zur Untersuchung des epithelial-mesenchymalen Übergangs verwendet werden (Abbildung 6). Zur Optimierung des Startvolumens wurden vier verschiedene Zellzahlen (25.000, 50.000, 75.000 und 100.000) für die ATAC-seq-Bibliotheksoptimierung verwendet. Die Zellen wurden mit CSK-Puffer lysiert, und Kerne wurden mit 2,5 μL Tn5-Transposase in 25 μL des Reaktionsgemisches inkubiert. Um die Wirksamkeit der Tn5-Verdauung und nukleosomalen Leitern zu untersuchen, wurde die Größenverteilung der eingefügten DNAs bioinformatisch analysiert (Abbildung 6A). Wenn niedrigere Zellzahlen verwendet wurden, waren nukleosomenfreie DNA-Fragmente (<100 bp) in den Sequenzierungsdaten stärker angereichert. Auf der anderen Seite war der Anteil der mononukleosomalen DNA-Fragmente (175-225 bp) in den Low-Cell-Input-Proben (25.000 Zellen und 50.000 Zellen) geringer als in höheren Zelleingangsbedingungen (75.000 Zellen und 100.000 Zellen). Obwohl differentielle DNA-Fragmentmuster zwischen den Proben beobachtet wurden, scheint die Anzahl der Eingangszellen einen minimalen Einfluss auf die Anreicherung von ATAC-seq-Signalen an Promotoren und anderen offenen Chromatinregionen zu haben (Abbildung 6B). Um den Einfluss der Eingangszellenzahlen auf die nachgeschaltete Analyse weiter zu untersuchen, wurden ATAC-seq-Peaks definiert. Die ATAC-seq-Peaks wurden vom PeaKDEck-Peakaufrufprogramm27 unter Verwendung der folgenden Parameter bestimmt: -sig 0,0001 -bin 300 -back 3.000 -npBack 2.500.000. Von ~4,9 Millionen eindeutig zugeordneten Lesevorgängen wurden 38.878, 43.832, 41.509 und 45.530 Spitzen in ATAC-seq-Daten von 25.000, 50.000, 75.000 bzw. 100.000 Zelleingaben beobachtet. Die Eingangsbedingung mit 100.000 Zellen zeigte die höchste Anzahl von Spitzen. Da der TSS-Anreicherungswert (Transcription Start Site) verwendet wurde, um die Qualität der ATAC-seq-Daten zu bewerten, wurde der TSS-Score jeder ATAC-seq-Bedingung mit dem GitHub-Programm Jiananlin/TSS_enrichment_score_calculation28 berechnet. Die TSS-Werte für die Eingangsbedingungen 25.000, 50.000, 75.000 und 100.000 Zellen betrugen 9,03, 9,02, 8,82 bzw. 8,28 (der TSS-Anreicherungswert gilt als ideal, wenn er größer als 728 ist). Dies deutete auf eine allmähliche Abnahme des TSS-Anreicherungsscores mit steigender Zellzahl hin. Während die größte Spitzenzahl in der Eingangsbedingung von 100.000 Zellen beobachtet wurde, ergab die Eingangsbedingung von 25.000 Zellen einen besseren TSS-Wert. Die Peak-Annotationsanalyse von Homer29 zeigte, dass die Mehrheit der erhöhten Peaks als distale Promotor-Peaks kategorisiert werden (Abbildung 6C). Basierend auf diesen Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die höheren Zellzahleingaben eine höhere Anzahl von Peaks erzeugen und häufiger Nicht-Promotor-Peaks erkennen können als die niedrigeren Zellzahl-Inputs in diesem Zustand.
Abbildung 1: Überblick über die ATAC-seq-Methode. (A) ATAC-seq misst die Chromatinzugänglichkeit unter Verwendung einer hyperaktiven Tn5-Transposase, die mit vorinstallierten Vorwärts- und Rückwärtsadaptern vorgeladen ist. Die verschiedenen Schritte im Prozess umfassen (B) Zelllyse (einschließlich Optimierung der Lysepufferzusammensetzung, Titration von Tn5 und der Anzahl der verwendeten Zellen); (C) Transposition (Bindung von Tn5 an offenes/zugängliches Chromatin); d) Tagmentation von Chromatin; (E) DNA-Fragmentreinigung und -amplifikation von Bibliotheken und (F) Sequenzierung von Bibliotheken und Datenanalyse. Die Analyse der Fragmentlängenverteilung von ATAC-seq-Bibliotheken zeigt typischerweise einen anfänglichen Peak um ~50 bp (nukleosomenfreie Regionen) und einen weiteren Peak bei ~200 bp (Mononukleosom). Daher enthalten ATAC-seq-Signale ohne rechnerische oder experimentelle Größenfiltration sowohl nukleosomenfreie als auch nukleosomale Bereiche in offenem Chromatin. Erstellt mit BioRender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Vergleich der Zelllyseeffizienz mit Trypanblau. (A) NMuMG-Zellen wurden mit dem hypotonen Puffer8 behandelt und mit Trypanblau angefärbt. (B) NMuMG-Zellen wurden mit CSK-Puffer behandelt und mit Trypanblau angefärbt. Die Maßstabsbalken zeigen 50 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Amplifizierte DNA-Fragmentanalyse von ATAC-seq-Bibliotheken. ATAC-seq-Bibliotheken wurden aus MDA-MB-231-Brustkrebszellen hergestellt. (A) Nach PCR-Amplifikation wurden PCR-Produkte auf einem 0,5x FSME, 1,5% Agarosegel vor und nach der Reinigung der Perlen analysiert. Grundierungen werden meist durch die anfängliche Perlenreinigung entfernt. DNA-Bandenmuster aus (B) 1x TAE, 1% Agarose-Gelelektrophorese und (C) einer automatisierten Elektrophorese sind ebenfalls indiziert. SYBR Gold wurde verwendet, um die in A und B gezeigten DNA-Fragmente sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Anreicherungsanalyse von ATAC-seq-Bibliotheken . (A) Genom-Browserspur mit dem ESR1-Locus. Die Genomabdeckung der ATAC-seq-Daten in T47D-Zellen20 wird gezeigt. Primer aus einer früheren Publikation wurden26 verwendet, und ihre Zielregionen sind gelb hervorgehoben. (B) Balkendiagramm zur Darstellung der Primeramplikonanreicherung in ATAC-seq-Bibliotheken. ATAC-seq-Bibliotheken wurden durch den hypotonischen Puffer oder CSK-Puffer vorbereitet. Verschiedene Konzentrationen von Tn5 wurden auch verwendet, um ATAC-seq-Bibliotheken zu erzeugen. 1 ng jeder Bibliothek wurde verwendet, um qPCR durchzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Genom-Browser-Visualisierung zur ATAC-seq-Optimierung. Während der Bibliotheksvorbereitung wurden unterschiedliche Mengen an Tn5-Transposase zugegeben. Die 1,25 μL Tn5-Bedingung zeigt höhere Hintergrundsignale (gelb hervorgehoben), während die anderen beiden Bedingungen ähnlich aussehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: DNA-Fragmentgrößenverteilung von ATAC-seq-Bibliotheken. (A) ATAC-seq-Bibliotheken wurden unter Verwendung der angegebenen Zellnummern hergestellt. Die ATAC-seq-Daten aus der 25.000-Zell-Eingangsbedingung zeigten die höchste Anreicherung nukleosomenfreier Fragmente, während die 100.000-Zell-Eingangsbedingung die höchsten mononukleosomalen DNAs aufwiesen. (B) Genom-Browser-Tracks, die ATAC-seq-Daten von verschiedenen Zellnummern zeigen. (C) Homer-Peak-Annotationsanalyse. Jeder Peak wurde von Homer29 als promotorproximaler oder distaler Peak klassifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name | Reihenfolge |
| ESR1 C Vorwärts | TGGTGACTCATATTTGAACAAGCC |
| ESR1 C Rückwärtsgang | CTCCTCCGTTGAATGTGTCTCC |
| ESR1 K vorwärts | TGTGGCTGGCTGCGTATG |
| ESR1 K Rückwärtsgang | TGTCTCTCTTTCTGTTTGATTCCC |
| ESR1 L Vorwärts | TGTGCCTGGAGTGATGTTTAAG |
| ESR1 L Rückwärtsgang | CATTACAAAGGTGCTGGAGGAC |
Tabelle 1: Liste der in dieser Studie verwendeten Primer.
| Schritte | Temperatur | Zeit | Zyklus |
| Lückenfüllung | 72 °C | 5 Minuten | 1 |
| Erste Denaturierung | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 °C | 10 s | 5 |
| Glühen | 63 °C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 °C | 1 min | |
| Halten | 4 °C | ewig |
Tabelle 2: PCR-Amplifikationsprogramm Teil 1.
| Schritte | Temperatur | Zyklus |
| Erste Denaturierung | 98 °C 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 °C 10 s | 20 |
| Glühen | 63 °C 30 s | |
| Erweiterung | 72 °C 1 min | |
| Platte gelesen |
Tabelle 3: qPCR-Einstellungen.
| Schritte | Temperatur | Zeit | Zyklus |
| Erste Denaturierung | 98 °C | 30 s | 1 |
| Denaturierung | 98 °C | 10 s | In Schritt 6.4 berechnete Gesamtzyklen |
| Glühen | 63 °C | 30 s | |
| Erweiterung | 72 °C | 1 min | |
| Halten | 4 °C | ewig |
Tabelle 4: PCR-Amplifikationsprogramm Teil 2.
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Discussion
ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogrammierungsprozesse während der Tumormetastasierung bekannt sind30. Ein weiteres Beispiel ist der Erwerb von Arzneimittelresistenzen gegen Hormontherapien, der häufig bei luminalen Brusttumoren beobachtetwird 31. ATAC-seq ist nützlich, um solche zellphänotypischen Veränderungen auf Chromatinebene zu überwachen und kann verwendet werden, um eine Ursprungszelle und Krebssubtypenvorherzusagen 4.
Um das Chromatin-Remodeling mittels ATAC-seq präzise messen zu können, ist die Etablierung eines reproduzierbaren und konsistenten Protokolls notwendig. In diesem Manuskript wird eine Standardstrategie zur Optimierung der ATAC-seq-Bibliothek beschrieben. Die ATAC-seq-Daten von MDA-MB-231- und NMuMG-Zelllinien dienen als Beispiele für Optimierungsprozesse. NMuMG-Zellen wurden verwendet, um EMT zu untersuchen, und MDA-MB-231-Zellen wurden verwendet, um ihren umgekehrten Prozess, MET, zu untersuchen. Diese zellulären Modelle wurden zuvor verwendet, um epigenetische Veränderungen während EMT und MET13,32 zu untersuchen. Die Verwendung eines geeigneten Puffers für die Zelllyse und Tn5-Konzentration ist die Schlüsselkomponente einer erfolgreichen ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung. Neben diesen Komponenten sind auch ein hoher Prozentsatz (>90%) der Zelllebensfähigkeit, geeignete Konzentrationen von Detergens im Lysepuffer und die Herstellung der Einzelzellsuspension sehr wichtig. Wenn die Tn5-Aufschlusseffizienz in den Proben signifikant unterschiedlich ist, ist es schwierig, Datenschwankungen zu korrigieren. Dies ist auf das Fehlen interner und externer Kontrollen zur quantitativen Bewertung der Verdauungseffizienz zurückzuführen. Zelluläre Eigenschaften oder Eigenschaften können sich auch zwischen den Zellen aus der Kontrollgruppe und den Zellen aus der Testgruppe unterscheiden. Daher ist eine sorgfältige Berücksichtigung der experimentellen Bedingungen, einschließlich der Wahl des Lysepuffers, notwendig, um qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten von beiden experimentellen Gruppen zu erhalten (Abbildung 5 und Abbildung 6).
Neben dem offenen Chromatin-Profiling wurde ATAC-seq verwendet, um Transkriptionsfaktor-Fußabdrücke und Nukleosomenpositionierungzu identifizieren 8,33. Es ist wichtig zu beachten, dass solche Informationen hauptsächlich aus offenen Chromatinbereichen stammen (Abbildung 1F). Daher wären die Ergebnisse auf offene Chromatinregionen ausgerichtet. Nichtsdestotrotz ist ATAC-seq ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Chromatinarchitektur. Dieses revolutionäre Werkzeug wurde in jüngerer Zeit für die Einzelzellgenomik eingesetzt und trägt weiterhin dazu bei, unser Verständnis der Genregulation und der Chromatinbiologie zu verbessern.
DATENVERFÜGBARKEIT:
Die in diesem Protokoll dargestellten Daten sind unter Gene Expression Omnibus unter der Zugangsnummer GSE202791 verfügbar. Die ATAC-seq-Daten von GSE72141 und GSE99479 wurden ebenfalls in die Analyse einbezogen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen gibt, die sich auf die in diesem Papier beschriebene Forschung beziehen.
Acknowledgments
Wir danken der UND Genomics Core Facility für die hervorragende technische Unterstützung.
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [P20GM104360 bis M.T., P20 GM104360 bis A.D.] und Anschubfonds der University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, Department of Biomedical Sciences [bis M.T.] finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Natural |
| 10 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-3810 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1182-1830 | Filtered and low-retention |
| 100 µL XL TipOne tips | USA Scientific | 1120-1840 | Filtered and low-retention. Beveled Grade |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | |
| 20 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1183-1810 | Filtered and low-retention |
| 200 µL TipOne RPT tips | USA Scientific | 1180-8810 | Filtered and low-retention |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Fisherbrand | 06-443-19 | |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | YBP136010 | Genetic Analysis Grade |
| All the cell lines used in this study are obtained from ATCC | ATCC | ||
| Allegra X-30R Centrifuge | Beckman Coulter | 364658 | SX2415 |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Bead purification kit |
| CellDrop Cell Counter | DeNovix | CellDrop FL | Cell counter |
| EDTA | MilliporeSigma | EDS | BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) |
| EGTA | MilliporeSigma | E3889 | |
| Ethanol 100% | ThermoFisher Scientific | AC615100020 | Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products |
| Fetal Bovine Serum - TET Tested | R&D Systems | S10350 | Triple 0.1 µm filtered |
| Gibco DMEM 1x | ThermoFisher Scientific | 11965092 | [+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate |
| Gibco PBS 1x | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 |
| Gibco Trypsin-EDTA 1x | ThermoFisher Scientific | 25200056 | (0.25%), phenol red |
| Glycerol | IBI Scientific | 56-81-5 | |
| Glycine | MilliporeSigma | G8898 | |
| HCl | MilliporeSigma | H1758 | |
| HEPES | MilliporeSigma | H3375 | |
| Invitrogen Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q32857 | |
| MgCl2 | MilliporeSigma | M3634 | |
| MinElute PCR Purification kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| NaCl | IBI Scientific | 7647-14-5 | |
| NaOH | MilliporeSigma | S8045 | BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous) |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | New England Biolabs | M0541 | |
| Nextera DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-121-1030 | 2x TD and Tn5 Transposase |
| NP - 40 (IGEPAL CA-630) | MilliporeSigma | I8896 | for molecular biology |
| PCR Detection System | BioRad | 1855484 | CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler |
| PIPES | MilliporeSigma | P1851 | BioPerformance Certified, suitable for cell culture |
| Qubit dsDNA HS Assay kit | ThermoFisher Scientific | Q32854 | Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit |
| Quibit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | Invitrogen |
| SDS | MilliporeSigma | L3771 | |
| Sodium Acetate | Homemade | - | pH 5.2 |
| Sucrose | IBI Scientific | 57-50-1 | |
| SYBR Gold | ThermoFisher Scientific | S11494 | |
| SYBR Green Supermix, 1.25 mL | BioRad | 1708882 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips | USA Scientific | 1402-4700 | Flex-free, natural, polypropylene |
| TempPlate 384-WELL PCR PLATE | USA Scientific | 1438-4700 | Single notch. Natural polypropylene |
| Tris Base | MilliporeSigma | 648311 | ULTROL Grade |
| Triton x-100 | IBI Scientific | 9002-93-1 | |
| TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit | Illumina | PE-121-1003 | paired-end |
| Trypan Blue Stain | ThermoFisher Scientific | Q32851 | |
| Tween-20 | MilliporeSigma | P7949 | BioXtra, viscous liquid |
| Water | MilliporeSigma | W3500 | sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
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