Summary
该协议描述了从完整的大豆结节中纯化真核多体的方法。测序后，基因表达分析的标准管道可用于鉴定转录组和翻译组水平的差异表达基因。
Abstract
该协议的目的是为研究大豆（甘氨酸max）共生结节的真核翻译组提供策略。本文描述了优化的方法，以分离植物来源的多核糖体及其相关的mRNA，以使用RNA测序进行分析。首先，通过在保存多小体和RNA的条件下从整个冷冻大豆结节中匀浆获得细胞质裂解物。然后，通过低速离心清除裂解物，并使用15%的上清液进行总RNA（TOTAL）分离。剩余的澄清裂解物用于通过两层蔗糖垫（12%和33.5%）超速离心分离多聚体。重悬后从多粒体沉淀中纯化多聚体相关mRNA（PAR）。TOTAL和PAR均通过高灵敏度毛细管电泳进行评估，以满足RNA-seq测序文库的质量标准。作为下游应用的一个例子，测序后，基因表达分析的标准管道可用于获得转录组和翻译组水平的差异表达基因。总之，该方法与RNA-seq相结合，可以研究复杂组织（例如共生结节）中真核mRNA的翻译调节。
Introduction
豆科植物，如大豆（Glycine max），可以与称为根瘤菌的特定土壤细菌建立共生关系。这种互惠关系导致植物根部形成新的器官，即共生结节。结节是寄存细菌的植物器官，由宿主细胞组成，其细胞质定植于一种称为拟杆菌的特殊形式的根瘤菌。这些拟杆菌催化大气氮（N 2）还原成氨，氨被转移到植物中以换取碳水化合物1，2。
尽管这种固氮共生是研究最充分的植物-微生物共生之一，但许多方面仍有待更好地理解，例如受到不同非生物胁迫条件的植物如何调节它们与共生伙伴的相互作用以及这如何影响结节代谢。通过分析结节翻译组（即主动翻译的信使RNA[mRNA]的子集），可以更好地理解这些过程。多核糖体或多核糖体是与mRNA相关的多个核糖体的复合物，通常用于研究翻译3。多聚体分析方法包括分析与多聚体相关的mRNA，并已成功用于研究控制不同生物过程中发生的基因表达的转录后机制4，5。
从历史上看，基因组表达分析主要集中在确定mRNA丰度6，7，8，9。然而，由于基因表达转录后调控的不同阶段，特别是翻译10，11，12，转录本和蛋白质水平之间缺乏相关性。此外，在转录组水平上的变化与在翻译组水平上发生的变化之间没有观察到依赖性13。对正在翻译的mRNA集的直接分析可以比仅分析mRNA水平时获得的细胞基因表达（其终点是蛋白质丰度）更准确和完整的测量14，15，16。
该协议描述了如何通过两层蔗糖垫的差异离心从完整的大豆结节中纯化植物来源的多聚体（图1）。然而，由于拟杆菌衍生的核糖体也存在于结节中，因此核糖体和RNA物种的混合物被纯化，即使真核糖体占主要部分（90%-95%）。还描述了随后的RNA分离、定量和质量控制（图1）。该协议与RNA-seq相结合，应提供有关复杂组织（例如共生结节）中真核mRNA的翻译调节的实验结果。
图1：从共生结节纯化真核多体的拟议方法的示意图概述。 该方案概述了方案中遵循的步骤，从（1）植物生长和（2）结节收获到（3）制备胞质提取物，（3）获得总样品和（4）PAR样品，以及（5）RNA提取和质量控制。缩写：PEB = 多聚体提取缓冲液;RB = 重悬缓冲液;总 = 总核糖核酸;PAR = 多聚体相关的 mRNA。 请点击此处查看此图的大图。
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Protocol
1. 植物生长和根瘤菌接种
- 为了产生所需的结节，请在受控条件下将所选的大豆种子播种在生长室的选定基质中。
注意：在该协议中，种子播种在装有沙子：蛭石（1：1）混合物的0.5升塑料瓶中。生长室的昼/夜循环温度分别为28 °C / 20 °C，光/暗光周期分别为16 h/8 h。光合有效辐射强度为620 μmol·m−2·s−1. - 提前准备液体酵母提取物甘露醇（YEM）培养基（见 材料表）。高压灭菌介质。
- 在播种的同一天，用缓 根瘤菌 U1302 菌株接种一个含有 100 mL YEM 的烧瓶。将烧瓶在28°C的轨道振荡器上以100rpm孵育。
- 让根瘤菌生长 2 天，并用 2 mL 培养物接种幼苗。
2. 缺水处理（可选）
注意：该协议概述了大豆植物的缺水处理。这部分可以根据手头的实验问题完全更改或省略。
- 将大豆幼苗种植19天（V2-3发育阶段），不受水分限制。用补充有0.5 mM KNO3的B&D-培养基17保持基板的现场容量。
- 第20天，停止浇水。
注意：在这里，在生长和缺水期间，每天通过重量法（水重量含量）测量水分含量。 - 按照制造商的指示（见 材料表），每天在远轴叶表面上测量气孔导度，从第20天到缺水期结束。
注意：当气孔导度值约为播种后第20天获得的气孔导度值的50%时，为每个植物单独确定缺水期的结束。
3. 结核收获
- 将液氮收集在干净的容器中，并标记 15 mL 管（每个植物一个）。
注意：戴上冷冻手套、面罩和安全护目镜处理液氮。 - 单独检索每个植物。切割并丢弃地上部分。用水彻底清洗根部以去除任何残留的基质。
- 将每个结节从根部分离，并将它们收集在预冷的 15 mL 管中。快速冷冻试管并将其储存在-80°C。
4. 胞质提取物的制备
注意：该协议的最终目的是获得高质量的总RNA（TOTAL）和多聚体相关RNA（PAR）。因此，在防止RNA降解的条件下工作，始终将样品保持在4°C并使用不含RNase的实验室设备和溶液。除非另有说明，否则所有溶液均用无菌超纯水制备。
- 缓冲储备溶液的制备
- 制备 表1中列出的可高压灭菌储备溶液，高压灭菌15分钟，并保持在室温下。
- 制备 表1中列出的可过滤灭菌储备溶液，对其进行过滤灭菌，并将其保持在-20°C。
- 制备多聚体提取缓冲液（PEB，见 表1）并将其保存在冰上。
注意：给出的体积适用于六个样品。 - 将离心机冷却至4°C，并将2mL微量离心管置于冰上。
- 在称量培养皿中称取约 0.2 g 完整结节，并将它们转移到预冷的 2 mL 管中。
注意：快速执行此步骤以避免样品解冻。或者，可以使用估计的0.4-0.5mL结节体积代替0.2g。 - 加入 1.2 mL PEB，让样品解冻 2 分钟，并用组织研磨机匀浆，直到结节完全破碎和匀浆。
注意：解冻后一定要研磨结节，因为它们足够柔软，很容易被微量离心管中的组织研磨机（见 材料表）破坏。冷冻结节很难研磨。此外，建议将试管放置在台式冷却器（0°C）中，以便在保持样品冷却的同时进行适当的均质化。 - 将样品在冰上轻轻搅拌孵育10分钟或直到所有样品都已处理完毕。
- 在4°C下以16，000× g 离心15分钟以沉淀碎片。回收上清液并重复离心步骤。
- 小心回收澄清的胞质提取物，并将 200 μL 等分试样转移到干净的 1.5 mL 微量离心管中进行完全分离（总样品;参见第 7 节）。
5.蔗糖垫的制备
注意：本协议在13.2 mL超速离心管中使用两层蔗糖垫（12%和33.5%）（参见 材料表）。所有溶液均用无菌超纯水制备。
- 准备蔗糖和盐储备溶液。
- 制备100 mL的2 M蔗糖溶液（68.5%， 表1）。
- 准备10x盐溶液（表1）。
- 如 表2所述制备两层蔗糖垫。有关抗生素（CHX和CHL）储备溶液的组成，请参见 表1 。
注意：给出的体积适用于六个垫子。 - 将 4.5 mL 的 33.5% 蔗糖层倒入离心管中。然后，用 P1000 微量移液器小心缓慢地加入 4.5 mL 的 12% 层。将试管放在冰上，直到加入澄清的胞质提取物。
6. 多聚体纯化
- 小心地移液到管的侧壁上，将 1 mL 澄清的胞质提取物（步骤 4.8）加载到蔗糖垫的顶部。
- 将超速离心管转移到预冷桶中，并在4°C下以217，874 × g（参考转子中的35，000rpm [参见 材料表]）离心2小时。
- 丢弃剩余的胞质提取物和蔗糖垫，并用200μL预冷RB（先前根据 表1制备）重悬多体沉淀。
- 在冰上孵育30分钟，然后将多体重悬转移到1.5mL预冷管中。继续进行RNA提取（PAR样品）。
7. RNA提取和质量控制
注意：此步骤对 TOTAL（步骤 4.8）和 PAR 样本（步骤 6.4）执行。
- 用无菌超纯水制备75%的EtOH，并将其冷却至-20°C。 此外，将氯仿和异丙醇冷却至-20°C。
- 用 750 μL RNA 分离试剂匀浆样品，并在室温下孵育 5 分钟。
- 加入 200 μL 冷氯仿并剧烈摇动试管 15 秒。在室温下孵育10分钟。
- 在4°C下以12，000× g 离心15分钟以进行相分离。在不干扰粉红色有机相的情况下将 500 μL 上层水相转移到干净的管中，并加入 375 μL 冷异丙醇和 0.5 μL 无 RNase 糖原（参见 材料表）。通过上下移液充分混合。
注意：糖原是一种载体，用作辅助沉淀剂，以增加酒精沉淀中的核酸回收率。 - 将混合物在4°C孵育10分钟，并以12，000× g 离心15分钟。弃去上清液。
- 用 1 mL 冷的 75% EtOH 洗涤 RNA 沉淀。通过短暂的涡旋混合。
注意：此时，样品可以在-20°C下储存过夜。 - 在4°C下以7，500× g 离心5分钟，用微量移液管小心地除去上清液，并风干RNA沉淀。
- 将沉淀溶解在50μL无RNA酶的水中，并在65°C下孵育5分钟。
- 使用高灵敏度毛细管电泳18（参见材料表）和/或在2%无RNA酶琼脂糖凝胶19上电泳（参见材料表）评估RNA浓度和完整性。
注意：如果RNA样品不打算立即使用或将被送到测序设施进行RNA-seq文库制备，建议使用EtOH沉淀它们。
8. 核糖核酸沉淀
- 将离心机和乙基醇冷却至4°C。
- 准备3 M乙酸钠。
- 用无菌超纯水制备70%的EtOH，并将其冷却至-20°C。
- 估计样品量。加入 0.1 体积的 3 M 乙酸钠、3 体积的冷 EtOH 和 0.5 μL 无 RNase 糖原。充分混合。
- 在-20°C下放置直到需要。
注意：RNA沉淀样品可以在-80°C下储存长达1年。
9. 基因表达分析的标准管道
- 平均执行 40M Illumina 配对端读取，读取长度>100 bp，以进行可靠的转录组和翻译组数据分析。
注意：标准RNA-seq数据分析包括以下步骤9.2-9.5。 - 使用 FastQC （https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/） 或多样本MultiQC 20 进行读取质量检测。
- 使用Trimmomatic21，BBDuk（http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/），cutadapt 22，镰刀23或Trim Galore（https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/）等去除适配器和低质量序列。
- 如果该物种有参考基因组，则使用Bowtie224，TopHat225或Salmon 26以及featureCounts 27以及其他开源工具对参考进行读取映射，然后进行丰度定量。
- 使用 edgeR28、DESeq229 或 limma30 等对差异表达基因进行统计分析。
注意：这些开源软件可以通过命令行在本地使用。或者，它们可以通过公共服务器上的Web浏览器进行操作，例如Galaxy31 或GEOexplorer32，它们提供图形用户界面，因此使用它们不需要命令行知识。
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Representative Results
使用上述程序纯化的TOTAL和PAR级分的数量和质量评估是决定其成功与否的关键，因为对于大多数下游应用，例如RNA测序，高质量样品是文库制备和测序的基础。此外，RNA分子的完整性允许在样品收集时捕获基因表达谱的快照18。在这种情况下，使用生物分析仪进行这些测量时会获得RNA完整性数（RIN）。RIN 用于以稳健、可靠且独立于用户的方式分配完整性值，范围从 10（完整）到 1（完全降级）18。
图2A，B 显示了几种TOTAL和PAR样品馏分的高灵敏度毛细管电泳系统（生物分析仪）的标准输出。所有样品的质量都非常好，因为可以可视化清晰的核糖体RNA（rRNA）条带，而不会出现任何拖尾的外观。但是，这并未反映在RIN值中，因为它们的范围在5.9和7.5之间，对应于非完整样品。然而，如前所述，没有样品降解的视觉迹象，如图 2C所示。 图2D 显示了几乎完全降解样品的生物分析仪结果示例，以便进行比较。该设备也未能识别18S和25S峰，如TOTAL和PAR样品的电泳图所示（图2B）。因此，无法计算核糖体条带的比例（25S：18S;RNA完整性的另一个指标）。高质量的RNA通常表现出25S：18S 2：1的比例33。
图 2：总 RNA 和多聚体相关 mRNA 数量和质量评估。 （A） 来自 12 个样品的高灵敏度毛细管电泳（生物分析仪）的代表性虚拟凝胶重建结果，其各自的 RIN 和浓度值。泳道 1 至泳道 6 对应于 6 个结节样品的总 RNA （TOTAL） 级分，泳道 7 至泳道 12 对应于相同样品的多粒体相关 mRNA （PAR） 级分。绿线：所有车道中都存在较低的标记。（B） 显示了样本 4（作为 TOTAL 的示例）和样本 10（作为 PAR 的示例）的电泳图表示。标示了 18S 和 25S 峰值。可能对应于16S和23S（原核rRNA）的峰用*表示。显示了这些峰值的放大（B1 和 B2）。真核生物总RNA纳米测定用于生物分析仪。（C） 来自六个样品的代表性琼脂糖凝胶电泳结果（左）：将 10 μL 总和 PAR 级分上样到 2% 琼脂糖凝胶上并分离（80 V 35 分钟）。在右侧，只有样品2的另一个凝胶，其中原核rRNA可以更清晰地可视化。真核rRNA（18S和25S）由黑色箭头表示，原核rRNA（16S和23S）由灰色箭头表示。（D）降解样品的生物分析仪结果示例。L：标准梯子。绿线：所有车道中都存在较低的标记。缩写：RIN = RNA 完整性数;PAR = 多聚体相关 mRNA;nt = 核苷酸;L = 标准梯子。 请点击此处查看此图的大图。
由于这些样品来自真核和原核RNA共存的共生结节，因此纯化的RNA是两种物种的混合物（尽管真核生物占大多数）。因此，预计在电泳图中观察到对应于16S和23S rRNA的峰（图2B 和 放大B1和B2）。这些“额外”峰可以解释获得的较低RIN值。
该设备还以泳道 1 中的标准梯子为参考来计算样品浓度。正如预期的那样，TOTAL样品的浓度值高于PAR样品。尽管如此，即使对于这些，也有足够的RNA进行文库制备和RNA-seq，因为样品数量要求通常建议至少1.0μg。
| 可在室温下储存的可高压灭菌溶液 |
| 2 M 盐酸三酸 pH 9.0 |
| 2 米 氯化钾 |
| 0.5 M EGTA pH 8.0（用 10 M 氢氧化钠调节） |
| 1 M 氯化镁2 |
| 20% （v/v） PTE（移液前摇瓶） |
| 10% 文档 |
| 20% 洗涤剂混合物：20% （w/v） Brij L23，20% （v/v） Tritón X-100，Igepal CA 360，20% （v/v） 吐温 20（在 60 °C 下加热时溶解） |
| 可在-20°C下冷冻的可过滤灭菌溶液 |
| 0.5 米数字转换器 |
| 0.5 米 PMSF |
| 50 mg.mL-1 环己酰亚胺（CHX）（以乙醚计） |
| 50 mg.mL-1 氯苯尼醇（乙醇） |
| 储备液 | 10 mL PEB 的体积 （μL） | 2 mL RB 的体积 （μL） |
| 2 米 氯化钾 | 1,000 | 200 |
| 0.5 米 EGTA 酸碱度 8.0 | 500 | 100 |
| 1 M 氯化镁2 | 356 | 70 |
| 20% （v/v） PTE | 500 | - |
| 10% 文档 | 1,000 | - |
| 20%洗涤剂混合物 | 500 | - |
| 0.5 米数字转换器 | 100 | 20 |
| 0.5 米 PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M蔗糖溶液（68.5%）：蔗糖水溶液68.5克。在室温 （RT） 下保存。 | ||
| 10x 盐溶液：0.4 M Tris-HCl pH 8.4、0.2 M 氯化钾、0.1 M 氯化镁2;高压灭菌15分钟，在-20°C冷冻。 | ||
表1：本协议中使用的缓冲液和溶液。 给出的体积适用于六个样品。缩写：EGTA = 乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸;PTE = 聚氧乙烯 （10） 十三烷基醚;DOC = 脱氧胆酸钠;DTT = 二硫苏糖醇;PMSF = 苯基甲磺酰氟。
| 蔗糖层（%） | 蔗糖 2 M （毫升） | 盐溶液 10x （mL） | CHX 50 mg.mL-1 （微升） | CHL 50 mg.mL-1 （μL） | H2O （毫升） |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
表2：两种蔗糖层的组成（12%和33.5%）。 给出的体积用于准备六个垫子。
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Discussion
在翻译水平上研究基因表达调控对于更好地理解不同的生物学过程至关重要，因为细胞基因表达的终点是蛋白质丰度13，14。这可以通过分析感兴趣的组织或生物体的翻译组来评估，其中应纯化多体部分并分析其相关的mRNA。
本文介绍了一种通过蔗糖垫纯化大豆共生结节多聚体的方法，然后进行TOTAL和PAR提取。获得两个RNA级分是该协议的一个相关点，因为之后可以实施RNA-seq和基因表达的标准管道。因此，可以研究结节的转录组和翻译组。
多聚体纯化的另一种方法是翻译核糖体亲和纯化（TRAP）方法，其中核糖体蛋白L18的表位标记版本的表达允许核糖体37，38的免疫沉淀。然而，这种方法需要产生转基因植物，这对于大豆等某些物种来说可能具有挑战性。此外，核糖体分析或Ribo-seq方法15，39，40，41涉及在多体纯化后对核糖体保护的mRNA片段进行深度测序，是研究比多聚体分析更高分辨率的翻译组的替代方法，因为可以评估核糖体在单个mRNA上的确切数量和位置。然而，这种方法更费力，需要更多的样品，并且计算密集，因为回收了小的RNA片段。
有几个关键的实验方面需要考虑，例如从中纯化多聚体的样品的质量，特别是如果使用冷冻组织，就像本协议中的情况一样。完整的结节应从根部分离并立即在液氮中冷冻，然后储存在-80°C。 根据我们的经验，多聚体及其相关的mRNA可以在储存后的几个月内成功地从结节中纯化。此外，整个方案必须在防止RNA降解的条件下实施，以获得高质量的TOTAL和PAR，这对于cDNA合成和高通量测序等下游应用至关重要。
该方法的一个主要限制是超速离心步骤，因为超速离心机在许多实验室中并不广泛使用。此外，值得一提的是，离心步骤后获得的沉淀除了多聚体外，还可能含有其他不具有翻译活性的核糖核蛋白复合物。此外，如果使用另一种大豆组织执行此处介绍的方案，一个考虑因素是，它可能需要优化样品量，样品：PEB比率和均质化程序。
考虑到该协议中使用的样品是由于植物根细胞和细菌之间的共生相互作用而形成的器官，执行双RNA-seq分析42 （使用TOTAL和PAR样品）将是有趣的，因为它将允许检查两种生物体的转录和翻译反应。如果优化细菌RNA的提取，这里描述的方法可能对这个问题有所帮助。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由CSIC I + D 2020年第282号资助，FVF 2017年第210号资助和PEDECIBA（玛丽亚·玛莎·塞恩斯）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
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