Summary
Denne protokol beskriver en metode til eukaryot polysomrensning fra intakte sojabønneknuder. Efter sekventering kan standardrørledninger til genekspressionsanalyse bruges til at identificere differentielt udtrykte gener på transkriptom- og translatomniveauerne.
Abstract
Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en strategi til undersøgelse af det eukaryote translatom af sojabønnen (Glycine max) symbiotisk knude. Dette papir beskriver metoder optimeret til at isolere planteafledte polyribosomer og deres tilknyttede mRNA'er, der skal analyseres ved hjælp af RNA-sekventering. For det første opnås cytoplasmatiske lysater gennem homogenisering i polysom- og RNA-bevarende betingelser fra hele, frosne sojabønneknuder. Derefter ryddes lysater ved centrifugering ved lav hastighed, og 15% af supernatanten anvendes til total RNA (TOTAL) isolering. Det resterende ryddede lysat bruges til at isolere polysomer ved ultracentrifugering gennem en tolags saccharosepude (12% og 33,5%). Polysom-associeret mRNA (PAR) renses fra polysomale pellets efter resuspension. Både TOTAL og PAR evalueres ved meget følsom kapillærelektroforese for at opfylde kvalitetsstandarderne for sekventeringsbiblioteker for RNA-seq. Som et eksempel på en downstream-applikation kan standardrørledninger til genekspressionsanalyse efter sekventering anvendes til at opnå differentielt udtrykte gener på transkriptom- og translatomniveauerne. Sammenfattende tillader denne metode i kombination med RNA-seq undersøgelsen af den translationelle regulering af eukaryote mRNA'er i et komplekst væv såsom den symbiotiske knude.
Introduction
Bælgplanter, såsom sojabønner (Glycine max), kan etablere symbiose med specifikke jordbakterier kaldet rhizobia. Dette mutualistiske forhold fremkalder dannelsen af nye organer, de symbiotiske knuder, på plantens rødder. Knuderne er planteorganerne, der er vært for bakterierne og består af værtsceller, hvis cytoplasma koloniseres med en specialiseret form for rhizobia kaldet bakterioider. Disse bakteroider katalyserer reduktionen af atmosfærisk nitrogen (N2) til ammoniak, som overføres til planten til gengæld for kulhydrater 1,2.
Selvom denne kvælstoffikserende symbiose er en af de mest velundersøgte plantemikrobesymbioser, er der stadig mange aspekter, der skal forstås bedre, såsom hvordan planter, der udsættes for forskellige abiotiske stressforhold, modulerer deres interaktion med deres symbiotiske partner, og hvordan dette påvirker knudemetabolismen. Disse processer kunne bedre forstås ved at analysere knudetranslatomet (dvs. delmængden af messenger RNA'er [mRNA'er] aktivt oversat). Polyribosomer eller polysomer er komplekser af flere ribosomer forbundet med mRNA, der almindeligvis anvendes til at studere oversættelse3. Polysomprofileringsmetoden består af analysen af mRNA'erne forbundet med polysomer og er med succes blevet brugt til at studere de posttranskriptionelle mekanismer, der styrer genekspression, der forekommer i forskellige biologiske processer 4,5.
Historisk set har genomekspressionsanalyse primært fokuseret på at bestemme mRNA-overflod 6,7,8,9. Der er imidlertid en mangel på korrelation mellem transkription og proteinniveauer på grund af de forskellige stadier af posttranskriptionel regulering af genekspression, især translation10,11,12. Desuden er der ikke observeret nogen afhængighed mellem ændringerne på transkriptomniveauet og dem, der forekommer på translatomniveau13. Den direkte analyse af det sæt mRNA'er, der oversættes, muliggør en mere nøjagtig og komplet måling af cellegenekspressionen (hvis endepunkt er proteinoverflod) end den, der opnås, når kun mRNA-niveauer analyseres14,15,16.
Denne protokol beskriver, hvordan planteafledte polysomer renses fra intakte sojabønneknuder ved differentiel centrifugering gennem en tolags saccharosepude (figur 1). Men da bakteroidafledte ribosomer også er til stede i knuderne, renses en blanding af ribosomer og RNA-arter, selvom de eukaryote repræsenterer hovedfraktionen (90% -95%). Den efterfølgende RNA-isolering, kvantificering og kvalitetskontrol er også beskrevet (figur 1). Denne protokol skal i kombination med RNA-seq give eksperimentelle resultater om translationel regulering af eukaryote mRNA'er i et komplekst væv, såsom den symbiotiske knude.
Figur 1: Skematisk oversigt over den foreslåede metode til eukaryot polysomrensning fra symbiotiske knuder. Ordningen giver et overblik over de trin, der følges i protokollen fra (1) plantevækst og (2) knudehøst til (3) forberedelse af cytosolekstrakter, (3) opnåelse af TOTAL-prøver og (4) PAR-prøver og (5) RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol. Forkortelser: PEB = polysomekstraktionsbuffer; RB = resuspension buffer; TOTAL = total RNA; PAR = polysom-associeret mRNA. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantevækst og rhizobia podning
- For at generere de krævede knuder, så sojabønnefrøene efter eget valg i det valgte substrat i et vækstkammer under kontrollerede forhold.
BEMÆRK: I denne protokol blev frø sået i en 0,5 L plastflaske fyldt med en blanding af sand:vermiculit (1:1). Vækstkammeret blev indstillet med en dag/nat-cyklustemperatur på henholdsvis 28 °C/20 °C og en lys/mørke-fotoperiode på henholdsvis 16 t/8 timer. Den fotosyntetisk aktive strålingsintensitet var 620 μmol·m−2·s−1. - Forbered på forhånd flydende gærekstrakt mannitol (YEM)-medium (se materialetabellen). Autoklave mediet.
- Samme dag som frøsåning podes en kolbe indeholdende 100 ml YEM med Bradyrhizobium elkanii U1302-stammen. Kolben inkuberes ved 28 °C på en orbital shaker ved 100 omdr./min.
- Lad rhizobia vokse i 2 dage og pode frøplanterne med 2 ml af kulturen.
2. Behandling af vandunderskud (valgfrit)
BEMÆRK: Denne protokol skitserer vandunderskudsbehandlingen af sojabønneplanterne. Denne del kan ændres eller udelades helt afhængigt af det aktuelle eksperimentelle spørgsmål.
- Dyrk sojabønneplanterne i 19 dage (V2-3 udviklingsstadium) uden vandbegrænsning. Hold substratet på feltkapacitet med B&D-medium17 suppleret med 0,5 mM KNO3.
- På dag 20 skal du trække vanding tilbage.
OBS: Her blev vandindholdet målt dagligt ved gravimetri (vandgravimetriindhold) i vækst- og vandunderskudsperioderne. - Mål stomatal konduktans i tre gange dagligt på den abaksiale bladoverflade med et porometer, som instrueret af producenten (se materialetabellen), fra dag 20 til slutningen af vandunderskudsperioden.
BEMÆRK: Slutningen af vandunderskudsperioden blev bestemt individuelt for hver plante, da stomatal konduktansværdien var ca. 50% af den, der blev opnået på dag 20 fra såning.
3. Knude høst
- Saml flydende nitrogen i en ren beholder og mærk 15 ml rør (en for hver plante).
FORSIGTIG: Håndter flydende nitrogen iført cryohandsker, ansigtsskærme og sikkerhedsbriller. - Hent hver plante individuelt. Skær og kassér antennedelen. Vask roden grundigt med vand for at fjerne eventuelt resterende substrat.
- Fjern hver knude fra roden og saml dem i et forkølet 15 ml rør. Snap-frys rørene og opbevar dem ved -80 °C.
4. Fremstilling af cytosolekstrakter
BEMÆRK: Det endelige mål med denne protokol er at opnå total RNA (TOTAL) af høj kvalitet og polysomassocieret RNA (PAR). Arbejd derfor under forhold, der forhindrer RNA-nedbrydning, og hold altid prøverne ved 4 ° C og brug RNase-frit laboratorieudstyr og opløsninger. Medmindre andet er angivet, fremstilles alle opløsninger med sterilt ultrarent vand.
- Fremstilling af stødpudelageropløsninger
- Forbered de autoklaverbare lageropløsninger, der er anført i tabel 1, autoklave dem i 15 minutter, og hold dem på RT.
- De filtersteriliserbare stamopløsninger, der er anført i tabel 1, filtreres, og dem opbevares ved -20 °C.
- Forbered polysomekstraktionsbuffer (PEB, se tabel 1) og hold den på is.
BEMÆRK: De angivne mængder er for seks prøver. - Centrifugen afkøles til 4 °C, og der lægges 2 ml mikrocentrifugerør på is.
- Vej ca. 0,2 g intakte knuder i en vejeskål og overfør dem til et forkølet 2 ml rør.
BEMÆRK: Udfør dette trin hurtigt for at undgå optøning af prøverne. Alternativt kan et anslået knudevolumen på 0,4-0,5 ml anvendes i stedet for 0,2 g. - Tilsæt 1,2 ml PEB, lad prøven tø op i 2 min, og homogeniser med en vævssliber indtil fuldstændig forstyrrelse og homogenisering af knuderne.
BEMÆRK: Sørg for at slibe knuderne, når de er optøet, da de vil være bløde nok til let at blive forstyrret med vævsslibere (se materialetabellen) i mikrocentrifugerør. Frosne knuder er vanskelige at male. Det anbefales også at placere rørene i en bordkøler (0 ° C) for korrekt homogenisering, mens prøverne holdes kølige. - Inkuber prøverne på is med blid omrøring i 10 minutter, eller indtil alle prøver er blevet behandlet.
- Centrifuge ved 16.000 × g i 15 minutter ved 4 °C for at pelletere affaldet. Gendan supernatanten og gentag centrifugetrinnet.
- Det klargjorte cytosolekstrakt genvindes forsigtigt, og en 200 μL aliquot overføres til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør til TOTAL isolering (TOTAL-prøver; se pkt. 7).
5. Tilberedning af saccharosepuder
BEMÆRK: Denne protokol bruger en to-lags saccharosepude (12% og 33,5%) i 13,2 ml ultracentrifugerør (se materialetabellen). Alle opløsninger fremstilles med sterilt ultrarent vand.
- Forbered saccharose- og saltlageropløsningerne.
- Der fremstilles 100 ml 2 M saccharoseopløsning (68,5%, tabel 1).
- Forbered 10x saltopløsning (tabel 1).
- De to lag af saccharosepuden forberedes som beskrevet i tabel 2. Se tabel 1 for sammensætningen af antibiotiske (CHX og CHL) stamopløsninger.
BEMÆRK: De angivne mængder er til seks puder. - Hæld 4,5 ml af 33,5% saccharoselaget i centrifugerørene. Tilsæt derefter 4,5 ml af 12% laget forsigtigt og langsomt med en P1000 mikropipette. Sæt rørene på is indtil tilsætningen af det klarede cytosoliske ekstrakt.
6. Polysomrensning
- Der lægges 1 ml af det klargjorte cytosolekstrakt (trin 4.8) oven på saccharosepuden ved forsigtigt at pipettere på rørets sidevæg.
- Ultracentrifugerørene overføres til forkølede spande og centrifugeres ved 217.874 × g (35.000 omdr./min. i den refererede rotor [se materialetabellen]) i 2 timer ved 4 °C.
- Det resterende cytosolekstrakt og saccharosepuden kasseres, og den polysomale pellet gensuspenderes med 200 μL forkølet RB (tidligere fremstillet i henhold til tabel 1).
- Inkuberes i 30 minutter på is, og overfør derefter den polysomale resuspension til 1,5 ml forkølede rør. Fortsæt med RNA-ekstraktionen (PAR-prøver).
7. RNA-ekstraktion og kvalitetskontrol
BEMÆRK: Dette trin udføres for TOTAL (trin 4.8) og PAR-prøver (trin 6.4).
- Forbered 75% EtOH med sterilt ultrarent vand og afkøl det til -20 °C. Derudover afkøles chloroform og isopropanol til -20 °C.
- Homogeniser prøverne med 750 μL af RNA-isolationsreagenset og inkuberes i 5 minutter ved RT.
- Tilsæt 200 μL kold chloroform og ryst rørene kraftigt i 15 s. Inkuberes ved RT i 10 min.
- Centrifuge ved 12.000 × g i 15 minutter ved 4 °C til faseadskillelse. Overfør 500 μL af den øvre vandige fase til et rent rør uden at forstyrre den lyserøde organiske fase, og tilsæt 375 μL kold isopropanol og 0,5 μL RNase-fri glykogen (se materialetabellen). Bland grundigt ved at pipettere op og ned.
BEMÆRK: Glykogen er en bærer, der anvendes som et co-bundfald for at øge nukleinsyregenvinding fra alkoholudfældning. - Bland i 10 minutter ved 4 °C og centrifuge ved 12.000 × g i 15 min. Kassér supernatanten.
- Vask RNA-bundfaldet med 1 ml koldt 75% EtOH. Bland ved kort hvirvel.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøverne opbevares ved -20 °C natten over. - Centrifuge ved 7.500 × g i 5 minutter ved 4 °C, fjern forsigtigt supernatanten med en mikropipette, og lufttør RNA-pelleten.
- Pelleten opløses i 50 μL RNasefrit vand og inkuberes ved 65 °C i 5 min.
- Vurder RNA-koncentrationen og integriteten med meget følsom kapillærelektroforese18 (se materialetabellen) og / eller elektroforese på en 2% RNase-fri agarosegel19 (se materialetabellen).
BEMÆRK: Hvis RNA-prøverne ikke vil blive brugt med det samme eller vil blive sendt til sekventeringsfaciliteten til RNA-seq-biblioteksforberedelse, anbefales det at bruge EtOH til at udfælde dem.
8. RNA-udfældning
- Centrifugen og EtOH afkøles til 4 °C.
- Forbered 3 M natriumacetat.
- Forbered 70% EtOH med sterilt ultrarent vand og afkøl det til -20 °C.
- Anslå prøvevolumenet. Der tilsættes 0,1 volumener 3 M natriumacetat, 3 volumener kold EtOH og 0,5 μL RNase-fri glykogen. Bland grundigt.
- Lad stå ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
BEMÆRK: RNA-udfældede prøver kan opbevares i op til 1 år ved -80 °C.
9. Standard pipeline til genekspressionsanalyse
- Udfør i gennemsnit 40M Illumina-parrede endelæsninger med læselængde >100 bp for sikker transkriptom- og translatomdataanalyse.
BEMÆRK: Standard RNA-seq dataanalyse omfatter følgende trin 9.2-9.5. - Udfør læsekvalitetskontrol ved hjælp af FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) eller multisample MultiQC20.
- Fjern adapter og sekvenser af lav kvalitet ved hjælp af enten Trimmomatic 21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, segl23 eller Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), blandt andre.
- Hvis der er et referencegenom tilgængeligt for arten, skal du udføre læsekortlægning i forhold til referencen efterfulgt af overflodskvantificering ved hjælp af Bowtie2 24, TopHat225 eller Salmon26 og featureCounts27 foruden andre open source-værktøjer.
- Udfør statistisk analyse til differentiel udtrykt genidentifikation ved hjælp af blandt andet edgeR28, DESeq229 eller limma30.
BEMÆRK: Disse open source-software kan bruges lokalt via kommandolinjen. Alternativt kan de betjenes via en webbrowser på en offentlig server, såsom Galaxy31 eller GEOexplorer32, som tilbyder en grafisk brugergrænseflade, så der ikke kræves nogen kommandolinjeviden til deres brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitets- og kvalitetsvurderingen af TOTAL- og PAR-fraktionerne, der er oprenset med ovennævnte procedure, er nøglen til at bestemme dens succes, da prøver af høj kvalitet er grundlæggende for biblioteksforberedelse og sekventering for de fleste downstream-applikationer, såsom RNA-sekventering. Desuden tillader RNA-molekylernes integritet indfangning af et øjebliksbillede af genekspressionsprofilen på tidspunktet for prøveindsamling18. I denne sammenhæng opnås et RNA-integritetsnummer (RIN) ved udførelse af disse målinger ved hjælp af en bioanalysator. RIN bruges til at tildele integritetsværdier på en robust, pålidelig og brugeruafhængig måde, der spænder fra 10 (intakt) til 1 (totalt nedbrudt)18.
Figur 2A,B viser standardoutputtet for det højfølsomme kapillærelektroforesesystem (Bioanalyzer) for flere TOTAL- og PAR-prøvefraktioner. Meget god kvalitet observeres for alle prøverne, da skarpe ribosomale RNA (rRNA) bånd kan visualiseres uden noget smurt udseende. Dette afspejles dog ikke i RIN-værdierne, da de ligger mellem 5,9 og 7,5, hvilket svarer til ikke-intakte prøver. Ikke desto mindre er der som tidligere nævnt ingen visuelle tegn på nedbrydning af prøver, som det kan ses i figur 2C. Figur 2D viser et eksempel på et bioanalysatorresultat af en næsten fuldstændig nedbrudt prøve til sammenligning. Udstyret kunne heller ikke identificere 18S- og 25S-toppene, som det ses i elektroferogrammerne både for TOTAL- og PAR-prøver (figur 2B). Følgelig kunne andelen af ribosomale bånd (25S: 18S; en anden indikator for RNA-integritet) ikke beregnes. RNA af høj kvalitet udviser normalt et 25S: 18S 2: 1-forhold33.
Figur 2: Total RNA og polysom-associeret mRNA kvantitet og kvalitetsvurdering . (A) Repræsentativ virtuel gelrekonstruktion af højfølsom kapillærelektroforese (Bioanalyzer) resultater fra 12 prøver med deres respektive RIN og koncentrationsværdier. Bane 1 til bane 6 svarer til samlede RNA (TOTAL) fraktioner af seks knudeprøver, og bane 7 til bane 12 svarer til polysom-associerede mRNA (PAR) fraktioner af de samme prøver. Grøn linje: lavere markør til stede i alle baner. (B) Elektroferogramrepræsentation er vist for prøve 4 (som et eksempel på TOTAL) og prøve 10 (som et eksempel på PAR). 18S og 25S toppe er angivet. Toppe, der muligvis svarer til 16S og 23S (prokaryote rRNA'er), er angivet med *. Der vises zoom-ins på disse toppe (B1 og B2). Eukaryote Total RNA Nano assay blev brugt i Bioanalyzer. (C) Repræsentative agarosegelelektroforeseresultater fra seks prøver (til venstre): 10 μL total- og PAR-fraktioner blev lagt på en 2% agarosegel og adskilt (80 V i 35 min). Til højre er der kun en anden gel af prøve 2, hvor de prokaryote rRNA'er kan visualiseres tydeligere. Eukaryot rRNA (18S og 25S) er angivet med sorte pilespidser og prokaryote rRNA'er (16S og 23S) med grå pilespidser. (D) Eksempel på et bioanalysatorresultat af en nedbrudt prøve. L: standard stige. Grøn linje: lavere markør til stede i alle baner. Forkortelser: RIN = RNA-integritetsnummer; PAR = polysom-associeret mRNA; nt = nukleotider; L = standard stige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Da disse prøver er fra symbiotiske knuder, hvor eukaryote og prokaryote RNA'er sameksisterer, er det oprensede RNA en blanding af begge arter (selvom de eukaryote er flertallet). Derfor forventes det at observere toppe svarende til 16S og 23S rRNA i elektroferogrammerne (figur 2B og zoom-in B1 og B2). Disse "ekstra" toppe kunne forklare de opnåede lavere RIN-værdier.
Udstyret beregner også prøvekoncentrationer med standardstigen i bane 1 som reference. Som forventet har de samlede prøver højere koncentrationsværdier end PAR-prøverne. Selv for disse er der stadig nok RNA til at fortsætte med biblioteksforberedelse og RNA-seq, da prøvemængdekrav typisk anbefaler mindst 1,0 μg.
| Autoklaverbare opløsninger, der skal opbevares ved stuetemperatur |
| 2 M Tris-HCl pH 9,0 |
| 2 mio. kr. |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 (justeret med 10 M NaOH) |
| 1 M MgCl2 |
| 20 % (v/v) PTE (ryst flasken inden pipettering af opløsningen) |
| 10% DOC |
| 20% vaskemiddelblanding: 20% (w/v) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (opløses under opvarmning ved 60 °C) |
| Filtersteriliserbare opløsninger, der skal nedfryses ved -20 °C |
| 0,5 mio. DTT |
| 0,5 mio. PMSF |
| 50 mg.mL-1 cycloheximid (CHX) (i EtOH) |
| 50 mg.mL-1 chloranphenicol (CHL) (i EtOH) |
| Lager opløsning | Volumen (μL) for 10 ml PEB | Volumen (μL) for 2 ml RB |
| 2 mio. kr. | 1,000 | 200 |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 M MgCl2 | 356 | 70 |
| 20% (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% vaskemiddelblanding | 500 | - |
| 0,5 mio. DTT | 100 | 20 |
| 0,5 mio. PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M saccharoseopløsning (68,5%): 68,5 g saccharose i vand. Opbevares ved stuetemperatur (RT). | ||
| 10x saltopløsning: 0,4 M Tris-HCl pH 8,4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; autoklave i 15 min, frys ved -20 °C. | ||
Tabel 1: Buffere og opløsninger anvendt i denne protokol. De angivne mængder er for seks prøver. Forkortelser: EGTA = ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraeddikesyre; PTE = polyoxyethylen (10) tridecylether; DOC = natriumdeoxycholat; DTT = dithiothreitol; PMSF = phenylmethanesulfonylfluorid.
| Saccharoselag (%) | Saccharose 2 M (ml) | Saltopløsning 10x (ml) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (ml) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabel 2: Sammensætningen af de to saccharoselag (12% og 33,5%). De angivne mængder er til fremstilling af seks puder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
At studere genekspressionsregulering på translationelt niveau er afgørende for bedre at forstå forskellige biologiske processer, da endepunktet for cellegenekspression er proteinmængde13,14. Dette kan vurderes ved at analysere translatomet af vævet eller organismen af interesse, for hvilket den polysomale fraktion skal oprenses, og dets associerede mRNA'er analyseres 3,4,34,35,36.
En metode præsenteres her for at rense sojabønnesymbiotiske knudepolysomer gennem saccharosepuder efterfulgt af TOTAL- og PAR-ekstraktion. At opnå begge RNA-fraktioner er et relevant punkt i denne protokol, da RNA-seq og standardrørledninger til genekspression kunne implementeres bagefter. Således kan transkriptomet og knudens translatom studeres.
En alternativ metode til polysomrensning er metoden til translating af ribosomaffinitetsrensning (TRAP), hvor ekspressionen af en epitopmærket version af ribosomalt protein L18 muliggør immunoprecipitation af ribosomer37,38. Denne metode kræver imidlertid generering af transgene planter, hvilket kan være udfordrende for nogle arter som sojabønnen. Desuden er ribosomprofilering eller Ribo-seq-metode 15,39,40,41, som involverer dyb sekventering af ribosombeskyttede mRNA-fragmenter efter polysomrensning, et alternativ til at studere translatomet med højere opløsning end polysomprofilering, da det nøjagtige antal og position af ribosomer på individuelle mRNA'er kan vurderes. Ikke desto mindre er denne tilgang mere besværlig, kræver større mængder prøve og er beregningsintensiv, da små RNA-fragmenter genvindes.
Der er flere kritiske eksperimentelle aspekter at overveje, såsom kvaliteten af prøven, hvorfra polysomerne vil blive renset, især hvis der anvendes frosset væv, som det er tilfældet i denne protokol. Intakte knuder skal løsnes fra roden og straks fryses i flydende nitrogen inden opbevaring ved -80 °C. Efter vores erfaring kan polysomer og deres tilknyttede mRNA'er med succes renses fra knuder inden for få måneder efter opbevaring. Desuden skal hele protokollen implementeres under forhold, der forhindrer RNA-nedbrydning for at opnå TOTAL og PAR af høj kvalitet, hvilket er kritisk for downstream-applikationer såsom cDNA-syntese og high-throughput-sekventering.
En væsentlig begrænsning af metoden er ultracentrifugeringstrinnet, da ultracentrifuger ikke er bredt tilgængelige i mange laboratorier. Det er også relevant at nævne, at pelleten opnået efter centrifugeringstrinnet foruden polysomer kan indeholde andre ribonukleoproteinkomplekser, der ikke er translationelt aktive. Desuden er en overvejelse, hvis man udfører protokollen, der præsenteres her med et andet sojabønnevæv, at det sandsynligvis vil kræve optimering af mængden af prøve, prøve: PEB-forholdet og homogeniseringsproceduren.
I betragtning af at prøven, der anvendes i denne protokol, er et organ dannet på grund af en symbiotisk interaktion mellem en planterotcelle og en bakterie, ville det være interessant at udføre en Dual RNA-seq-analyse42 (med TOTAL- og PAR-prøver), da det ville muliggøre undersøgelse af transkriptionelle og translationelle reaktioner fra begge organismer. Metoden beskrevet her kan være nyttig for denne sag, hvis ekstraktionen af de bakterielle RNA'er optimeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af CSIC I + D 2020-bevilling nr. 282, FVF 2017-bevilling nr. 210 og PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
