Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor eukaryote polysoomzuivering van intacte sojabonenknobbels. Na sequencing kunnen standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te identificeren.
Abstract
Het doel van dit protocol is om een strategie te bieden voor het bestuderen van het eukaryote translatoom van de symbiotische knobbel van sojabonen (Glycine max). Dit artikel beschrijft methoden die zijn geoptimaliseerd om van planten afgeleide polyribosomen en de bijbehorende mRNA's te isoleren die moeten worden geanalyseerd met behulp van RNA-sequencing. Ten eerste worden cytoplasmatische lysaten verkregen door homogenisatie in polysomische en RNA-conserverende omstandigheden van hele, bevroren sojabonenknobbels. Vervolgens worden lysaten gewist door centrifugatie met lage snelheid en wordt 15% van het supernatant gebruikt voor totale RNA (TOTAL) isolatie. Het resterende geklaarde lysaat wordt gebruikt om polysomen te isoleren door ultracentrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%). Polysoom-geassocieerd mRNA (PAR) wordt gezuiverd uit polysomale pellets na resuspensie. Zowel TOTAL als PAR worden geëvalueerd door zeer gevoelige capillaire elektroforese om te voldoen aan de kwaliteitsnormen van sequencingbibliotheken voor RNA-seq. Als voorbeeld van een downstream-toepassing kunnen na sequencing standaardpijplijnen voor genexpressieanalyse worden gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen op transcriptoom- en translatoomniveau te verkrijgen. Samenvattend maakt deze methode, in combinatie met RNA-seq, de studie mogelijk van de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
Introduction
Vlinderbloemige planten, zoals sojabonen (Glycine max), kunnen symbiose tot stand brengen met specifieke bodembacteriën die rhizobia worden genoemd. Deze mutualistische relatie lokt de vorming uit van nieuwe organen, de symbiotische knobbeltjes, op de plantenwortels. De knobbeltjes zijn de plantenorganen die de bacteriën herbergen en bestaan uit gastheercellen waarvan het cytoplasma wordt gekoloniseerd met een gespecialiseerde vorm van rhizobia die bacteroïden wordt genoemd. Deze bacteroïden katalyseren de reductie van atmosferische stikstof (N2) tot ammoniak, die wordt overgebracht naar de plant in ruil voor koolhydraten 1,2.
Hoewel deze stikstofbindende symbiose een van de meest bestudeerde plant-microbe symbioses is, moeten veel aspecten nog beter worden begrepen, zoals hoe planten die worden blootgesteld aan verschillende abiotische stressomstandigheden hun interactie met hun symbiotische partner moduleren en hoe dit het knobbelmetabolisme beïnvloedt. Deze processen kunnen beter worden begrepen door het nodule-translatoom te analyseren (d.w.z. de subset van messenger RNA's [mRNA's] actief vertaald). Polyribosomen of polysomen zijn complexen van meerdere ribosomen geassocieerd met mRNA, vaak gebruikt om translatie te bestuderen3. De polysoomprofileringsmethode bestaat uit de analyse van de mRNA's geassocieerd met polysomen en is met succes gebruikt om de posttranscriptionele mechanismen te bestuderen die genexpressie beheersen die voorkomt in diverse biologische processen 4,5.
Historisch gezien heeft de analyse van genoomexpressie zich voornamelijk gericht op het bepalen van mRNA-abundantie 6,7,8,9. Er is echter een gebrek aan correlatie tussen transcriptie- en eiwitniveaus als gevolg van de verschillende stadia van posttranscriptionele regulatie van genexpressie, met name translatie 10,11,12. Bovendien is er geen afhankelijkheid waargenomen tussen de veranderingen op het niveau van het transcriptoom en die op het niveau van het translatoom13. De directe analyse van de set mRNA's die worden vertaald, maakt een nauwkeurigere en volledigere meting van de celgenexpressie mogelijk (waarvan het eindpunt eiwitrijkdom is) dan degene die wordt verkregen wanneer alleen mRNA-niveaus worden geanalyseerd 14,15,16.
Dit protocol beschrijft hoe plantaardige polysomen worden gezuiverd uit intacte sojaknollen door differentiële centrifugatie door een tweelaags sucrosekussen (figuur 1). Omdat van bacteroïden afgeleide ribosomen echter ook in de knobbeltjes aanwezig zijn, wordt een mix van ribosomen en RNA-soorten gezuiverd, ook al vertegenwoordigen de eukaryote de belangrijkste fractie (90% -95%). De daaropvolgende RNA-isolatie, kwantificering en kwaliteitscontrole worden ook beschreven (figuur 1). Dit protocol, in combinatie met RNA-seq, moet experimentele resultaten opleveren over de translationele regulatie van eukaryote mRNA's in een complex weefsel zoals de symbiotische knobbel.
Figuur 1: Schematisch overzicht van de voorgestelde methodologie voor eukaryote polysoomzuivering uit symbiotische knobbeltjes. Het schema geeft een overzicht van de stappen die in het protocol worden gevolgd van (1) plantengroei en (2) nodule-oogst tot (3) bereiding van de cytosolische extracten, (3) het verkrijgen van TOTAL-monsters en (4) PAR-monsters, en (5) RNA-extractie en kwaliteitscontrole. Afkortingen: PEB = polysoom extractiebuffer; RB = resuspensiebuffer; TOTAAL = totaal RNA; PAR = polysoom-geassocieerd mRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plantengroei en rhizobia-inenting
- Om de benodigde knobbeltjes te genereren, zaait u de sojabonenzaden van keuze in het geselecteerde substraat in een groeikamer onder gecontroleerde omstandigheden.
OPMERKING: In dit protocol werden zaden gezaaid in een plastic fles van 0,5 L gevuld met een mengsel van zand: vermiculiet (1: 1). De groeikamer werd ingesteld met een dag/nachtcyclustemperatuur van respectievelijk 28 °C /20 °C en een licht/donkerheid fotoperiode van respectievelijk 16 h/8 h. De fotosynthetisch actieve stralingsintensiteit was 620 μmol·m−2·s−1. - Bereid van tevoren vloeibaar gist-extract mannitol (YEM) -medium (zie de tabel met materialen). Autoclaaf het medium.
- Ent op dezelfde dag van het zaaien van zaad één kolf met 100 ml YEM met de Bradyrhizobium elkanii U1302-stam. Incubeer de kolf bij 28 °C op een orbitale schudder bij 100 tpm.
- Laat de rhizobia 2 dagen groeien en ent de zaailingen in met 2 ml van de cultuur.
2. Behandeling van watertekorten (optioneel)
OPMERKING: Dit protocol schetst de behandeling van het watertekort van de sojaplanten. Dit deel kan worden gewijzigd of volledig worden weggelaten, afhankelijk van de experimentele vraag die voorhanden is.
- Laat de sojabonenzaden gedurende 19 dagen groeien (V2-3 ontwikkelingsfase) zonder waterbeperking. Houd het substraat op veldcapaciteit met B&D-medium17 aangevuld met 0,5 mM KNO3.
- Trek op dag 20 water op.
OPMERKING: Hier werd het watergehalte dagelijks gemeten door gravimetrie (water gravimetrische inhoud) tijdens de groei- en watertekortperioden. - Meet de stomatale geleiding in drievoud dagelijks op het abaxiale bladoppervlak met een porometer, zoals geïnstrueerd door de fabrikant (zie de tabel met materialen), vanaf dag 20 tot het einde van de periode van watertekort.
OPMERKING: Het einde van de periode van het watertekort werd voor elke installatie afzonderlijk bepaald wanneer de stomatale geleidingswaarde ongeveer 50% bedroeg van de waarde die op dag 20 werd verkregen door zaaien.
3. Nodule oogst
- Verzamel vloeibare stikstof in een schone container en label 15 ml buizen (één voor elke plant).
LET OP: Behandel vloeibare stikstof met cryohandschoenen, gezichtsschermen en veiligheidsbrillen. - Haal elke plant afzonderlijk op. Knip en gooi het bovengrondse deel weg. Was de wortel grondig met water om het resterende substraat te verwijderen.
- Maak elke knobbel los van de wortel en verzamel ze in een vooraf gechilleerde buis van 15 ml. Vries de buizen uit en bewaar ze bij −80 °C.
4. Bereiding van cytosolische extracten
OPMERKING: Het uiteindelijke doel van dit protocol is het verkrijgen van hoogwaardig totaal RNA (TOTAL) en polysoom-geassocieerd RNA (PAR). Werk daarom onder omstandigheden die RNA-afbraak voorkomen, houd de monsters altijd op 4 °C en gebruik RNase-vrije laboratoriumapparatuur en -oplossingen. Tenzij anders vermeld, worden alle oplossingen bereid met steriel ultrapuur water.
- Voorbereiding van buffervoorraadoplossingen
- Bereid de in tabel 1 vermelde autoclaveerbare stamoplossingen, autoclaaf ze gedurende 15 minuten en bewaar ze op RT.
- Bereid de in tabel 1 vermelde filtersteriliseerbare stamoplossingen, filtreer ze en houd ze op −20 °C.
- Bereid polysoomextractiebuffer (PEB, zie tabel 1) voor en houd deze op ijs.
OPMERKING: De opgegeven volumes zijn voor zes monsters. - Koel de centrifuge af tot 4 °C en plaats 2 ml microcentrifugebuizen op ijs.
- Weeg ongeveer 0,2 g intacte knobbeltjes in een weegschaal en breng ze over in een voorgekoelde buis van 2 ml.
OPMERKING: Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat de monsters ontdooien. Als alternatief kan een geschat nodulevolume van 0,4-0,5 ml worden gebruikt in plaats van de 0,2 g. - Voeg 1,2 ml PEB toe, laat het monster gedurende 2 minuten ontdooien en homogeniseer met een weefselslijper tot volledige verstoring en homogenisatie van de knobbeltjes.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de knobbeltjes maalt zodra ze zijn ontdooid, omdat ze zacht genoeg zijn om gemakkelijk te worden verstoord met weefselslijpmachines (zie de tabel met materialen) in microcentrifugebuizen. Bevroren knobbeltjes zijn moeilijk te malen. Ook wordt aanbevolen om de buizen in een benchtop koeler (0 °C) te plaatsen voor een goede homogenisatie terwijl de monsters koel blijven. - Incubeer de monsters op ijs met zachte roering gedurende 10 minuten of totdat alle monsters zijn verwerkt.
- Centrifugeer bij 16.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om het vuil te pelleteren. Herstel het supernatant en herhaal de centrifugestap.
- Herstel het geklaarde cytosolische extract zorgvuldig en breng een aliquot van 200 μL over naar een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml voor TOTALE isolatie (TOTAL-monsters; zie rubriek 7).
5. Bereiding van sucrosekussens
OPMERKING: Dit protocol gebruikt een tweelaags sucrosekussen (12% en 33,5%) in ultracentrifugebuizen van 13,2 ml (zie de tabel met materialen). Alle oplossingen worden bereid met steriel ultrapuur water.
- Bereid de sucrose en zoutbouillonoplossingen.
- Bereid 100 ml sucrose-oplossing van 2 M (68,5%, tabel 1).
- Bereid 10x zoutoplossing (tabel 1).
- Bereid de twee lagen van het sucrosekussen zoals beschreven in tabel 2. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de antibiotische (CHX en CHL) stamoplossingen.
OPMERKING: De opgegeven volumes zijn voor zes kussens. - Giet 4,5 ml van de 33,5% sucroselaag in de centrifugebuizen. Voeg vervolgens voorzichtig en langzaam 4,5 ml van de 12% laag toe met een P1000 micropipette. Zet de buisjes op ijs tot de toevoeging van het geklaarde cytosolische extract.
6. Polysoomzuivering
- Laad 1 ml van het geklaarde cytosolische extract (stap 4.8) op het sucrosekussen door voorzichtig op de zijwand van de buis te pipetteren.
- Breng de ultracentrifugebuizen over in voorgekoelde emmers en centrifugeer met 217.874 × g (35.000 tpm in de genoemde rotor [zie de materiaaltabel]) gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Gooi het resterende cytosolische extract en sucrosekussen weg en resuspenseer de polysomale pellet met 200 μL voorgekoelde RB (eerder bereid volgens tabel 1).
- Incubeer gedurende 30 minuten op ijs en breng vervolgens de polysomale resuspensie over naar 1,5 ml voorgekoelde buizen. Ga verder met de RNA-extractie (PAR-monsters).
7. RNA-extractie en kwaliteitscontrole
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd voor TOTAL (stap 4.8) en PAR-monsters (stap 6.4).
- Bereid 75% EtOH met steriel ultrapuur water en koel het af tot −20 °C. Koel daarnaast chloroform en isopropanol af tot −20 °C.
- Homogeniseer de monsters met 750 μL van het RNA-isolatiereagens en incubeer gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg 200 μL koude chloroform toe en schud de buisjes krachtig gedurende 15 s. Incubeer bij RT gedurende 10 min.
- Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C voor fasescheiding. Breng 500 μL van de bovenste waterige fase over naar een schone buis zonder de roze organische fase te verstoren en voeg 375 μL koud isopropanol en 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe (zie de Tabel van Materialen). Meng grondig door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Glycogeen is een drager die wordt gebruikt als een co-precipitant om het nucleïnezuurherstel van alcoholprecipitatie te verhogen. - Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 4 °C en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 × g . Gooi het supernatant weg.
- Was het RNA neerslag met 1 ml koude 75% EtOH. Meng door korte vortexing.
OPMERKING: Op dit punt kunnen de monsters 's nachts bij −20 °C worden bewaard. - Centrifugeer op 7.500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant voorzichtig met een micropipette en droog de RNA-pellet aan de lucht.
- Los de pellet op in 50 μL RNase-vrij water en incubeer bij 65 °C gedurende 5 min.
- Beoordeel de RNA-concentratie en integriteit met zeer gevoelige capillaire elektroforese18 (zie de tabel met materialen) en/of elektroforese op een 2% RNase-vrije agarosegel19 (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: Als de RNA-monsters niet onmiddellijk worden gebruikt of naar de sequencingfaciliteit worden gestuurd voor RNA-seq-bibliotheekvoorbereiding, wordt het aanbevolen om EtOH te gebruiken om ze te bespoedigen.
8. RNA neerslag
- Koel de centrifuge en EtOH af tot 4 °C.
- Bereid 3 M natriumacetaat.
- Bereid 70% EtOH met steriel ultrapuur water en koel het af tot −20 °C.
- Schat het monstervolume. Voeg 0,1 volumes 3 M natriumacetaat, 3 volumes koude EtOH en 0,5 μL RNase-vrij glycogeen toe. Meng.
- Laat bij −20 °C staan totdat het nodig is.
OPMERKING: RNA-geprecipiteerde monsters kunnen maximaal 1 jaar worden bewaard bij −80 °C.
9. Standaardpijplijn voor genexpressieanalyse
- Voer een gemiddelde van 40M Illumina paired-end reads uit, met leeslengte > 100 bp, voor betrouwbare transcriptoom- en translatoomgegevensanalyse.
OPMERKING: Standaard RNA-seq data-analyse omvat de volgende stappen 9.2-9.5. - Voer leeskwaliteitsinspectie uit met FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) of de multisample MultiQC20.
- Verwijder adapters en sequenties van lage kwaliteit met behulp van trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, sikkel23 of Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/).
- Als er een referentiegenoom beschikbaar is voor de soort, voer dan leesmapping uit tegen de referentie, gevolgd door kwantificering van de abundantie, met behulp van Bowtie224, TopHat225 of Salmon26 en featureCounts27, naast andere open source-tools.
- Voer statistische analyse uit voor differentiële tot expressie gebrachte genenidentificatie met behulp van edgeR28, DESeq229 of limma30, onder anderen.
OPMERKING: Deze open-source software kan lokaal worden gebruikt, via de opdrachtregel. Als alternatief kunnen ze worden bediend via een webbrowser op een openbare server, zoals Galaxy31 of GEOexplorer32, die een grafische gebruikersinterface bieden, zodat er geen opdrachtregelkennis vereist is voor hun gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling van de TOTAL- en PAR-fracties die volgens de bovengenoemde procedure zijn gezuiverd, is van cruciaal belang om het succes ervan te bepalen, aangezien voor de meeste downstream-toepassingen, zoals RNA-sequencing, hoogwaardige monsters van fundamenteel belang zijn voor bibliotheekvoorbereiding en -sequencing. Bovendien maakt de integriteit van de RNA-moleculen het mogelijk om een momentopname van het genexpressieprofiel vast te leggen op het moment van monsterverzameling18. In deze context wordt een RNA-integriteitsnummer (RIN) verkregen bij het uitvoeren van deze metingen met behulp van een bioanalyzer. Het RIN wordt gebruikt voor het toewijzen van integriteitswaarden op een robuuste, betrouwbare en gebruikersonafhankelijke manier, variërend van 10 (intact) tot 1 (volledig gedegradeerd)18.
Figuur 2A,B toont de standaarduitgang van het zeer gevoelige capillaire elektroforesesysteem (Bioanalyzer) voor verschillende TOTAL- en PAR-monsterfracties. Voor alle monsters wordt een zeer goede kwaliteit waargenomen, omdat scherpe ribosomale RNA (rRNA) banden kunnen worden gevisualiseerd zonder enig uitgesmeerd uiterlijk. Dit komt echter niet tot uiting in de RIN-waarden, aangezien deze variëren tussen 5,9 en 7,5, wat overeenkomt met niet-intacte monsters. Niettemin is er, zoals eerder vermeld, geen visueel teken van degradatie van het monster, zoals te zien is in figuur 2C. Figuur 2D toont een voorbeeld van een bioanalyzerresultaat van een bijna volledig afgebroken monster ter vergelijking. De apparatuur slaagde er ook niet in om de 18S- en 25S-pieken te identificeren, zoals te zien is in de elektroferogrammen voor zowel TOTAL- als PAR-monsters (figuur 2B). Bijgevolg kon het aandeel van de ribosomale banden (25S:18S; een andere indicator van RNA-integriteit) niet worden berekend. Hoogwaardig RNA vertoont meestal een 25S:18S 2:1 verhouding33.
Figuur 2: Totale RNA- en polysoom-geassocieerde mRNA-kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling. (A) Representatieve virtuele gelreconstructie van hoogsensitieve capillaire elektroforese (Bioanalyzer) resultaten van 12 monsters met hun respectieve RIN- en concentratiewaarden. Lane 1 tot en met lane 6 komen overeen met total RNA (TOTAL) fracties van zes nodule samples, en lane 7 tot lane 12 corresponderen met polysome-associated mRNA (PAR) fracties van dezelfde samples. Groene lijn: lagere markering aanwezig in alle rijstroken. (B) Elektroferogramrepresentatie wordt weergegeven voor monster 4 (als voorbeeld van TOTAL) en monster 10 (als voorbeeld van PAR). 18S en 25S pieken worden aangegeven. Pieken die mogelijk overeenkomen met 16S en 23S (prokaryote rRNA's) worden aangegeven met *. Zoom-ins op deze pieken worden getoond (B1 en B2). De Eukaryote Total RNA Nano assay werd gebruikt in de Bioanalyzer. (C) Representatieve agarose gel-elektroforeseresultaten van zes monsters (links): 10 μL TOTAL- en PAR-fracties werden geladen op een 2% agarose-gel en gescheiden (80 V gedurende 35 minuten). Aan de rechterkant is er nog een gel van alleen monster 2, waar de prokaryote rRNA's duidelijker kunnen worden gevisualiseerd. Eukaryote rRNA (18S en 25S) worden aangegeven met zwarte pijlpunten en prokaryote rRNA's (16S en 23S) met grijze pijlpunten. (D) Voorbeeld van een bioanalyzer die het resultaat is van een afgebroken monster. L: standaard ladder. Groene lijn: lagere markering aanwezig in alle rijstroken. Afkortingen: RIN = RNA-integriteitsnummer; PAR = polysoom-geassocieerd mRNA; nt = nucleotiden; L = standaard ladder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Omdat deze monsters afkomstig zijn van symbiotische knobbeltjes waar eukaryote en prokaryote RNA's naast elkaar bestaan, is het gezuiverde RNA een mix van beide soorten (hoewel de eukaryote de meerderheid zijn). Daarom wordt verwacht dat het pieken zal waarnemen die overeenkomen met 16S- en 23S-rRNA in de elektroferogrammen (figuur 2B en inzoom B1 en B2). Deze "extra" pieken zouden de lagere RIN-waarden kunnen verklaren.
De apparatuur berekent ook de monsterconcentraties met de standaardladder in baan 1 als referentie. Zoals verwacht vertonen de TOTAL-monsters hogere concentratiewaarden dan de PAR-monsters. Toch is er zelfs voor deze genoeg RNA om door te gaan met bibliotheekvoorbereiding en RNA-seq, omdat de vereisten voor monsterhoeveelheid doorgaans ten minste 1,0 μg aanbevelen.
| Autoclaveerbare oplossingen voor opslag bij kamertemperatuur |
| 2 M Tris-HCl pH 9,0 |
| 2 MKCl |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 (aangepast met 10 M NaOH) |
| 1 m mgCl2 |
| 20% (v/v) PTE (schudfles voor het pipetteren van de oplossing) |
| 10% DOC |
| 20% Wasmiddel mix: 20% (w/v) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (oplossen tijdens verhitting bij 60 °C) |
| Filtersteriliseerbare oplossingen voor invriezen bij -20 °C |
| 0,5 M DTT |
| 0,5 M PMSF |
| 50 mg.mL-1 cycloheximide (CHX) (in EtOH) |
| 50 mg.mL-1 chloorranfenicol (CHL) (in EtOH) |
| Stock oplossing | Volume (μL) voor 10 ml PEB | Volume (μL) voor 2 ml RB |
| 2 MKCl | 1,000 | 200 |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 m mgCl2 | 356 | 70 |
| 20% (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% Wasmiddel mix | 500 | - |
| 0,5 M DTT | 100 | 20 |
| 0,5 M PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 chx | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M sucrose-oplossing (68,5%): 68,5 g sucrose in water. Bewaren op kamertemperatuur (RT). | ||
| 10x zoutoplossing: 0,4 M Tris-HCl pH 8,4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; autoclaaf gedurende 15 min, vries in bij -20 °C. | ||
Tabel 1: Buffers en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt. De opgegeven volumes zijn voor zes monsters. Afkortingen: EGTA = ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetra-azijnzuur; PTE = polyoxyethyleen (10) tridecylether; DOC = natriumdeoxycholaat; DTT = dithiothreitol; PMSF = fenylmethanesulfonylfluoride.
| Sucroselaag (%) | Sucrose 2 M (ml) | Zoutoplossing 10x (ml) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O (ml) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabel 2: Samenstelling van de twee sucroselagen (12% en 33,5%). De gegeven volumes zijn voor de bereiding van zes kussens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bestuderen van genexpressieregulatie op translationeel niveau is van cruciaal belang om verschillende biologische processen beter te begrijpen, aangezien het eindpunt van celgenexpressie eiwitrijkdom is13,14. Dit kan worden beoordeeld door het translatoom te analyseren van het weefsel of organisme van belang waarvoor de polysomale fractie moet worden gezuiverd en de bijbehorende mRNA's moet worden geanalyseerd 3,4,34,35,36.
Hier wordt een methode gepresenteerd om sojasymbiotische knobbelpolysomen te zuiveren door middel van sucrosekussens, gevolgd door TOTAL- en PAR-extractie. Het verkrijgen van beide RNA-fracties is een relevant punt van dit protocol, omdat RNA-seq en standaardpijplijnen voor genexpressie achteraf kunnen worden geïmplementeerd. Zo kunnen het transcriptoom en het translatoom van de knobbel worden bestudeerd.
Een alternatieve methode voor polysoomzuivering is de translating ribosoomaffiniteitszuiveringsmethode (TRAP), waarbij de expressie van een epitoop-gelabelde versie van ribosomaal eiwit L18 de immunoprecipitatie van ribosomenmogelijk maakt 37,38. Deze methode vereist echter de generatie van transgene planten, wat een uitdaging kan zijn voor sommige soorten zoals de sojaboon. Bovendien is de ribosoomprofilering of Ribo-seq-methode 15,39,40,41, waarbij ribosoombeveiligde mRNA-fragmenten na polysoomzuivering diep worden gesequenceerd, een alternatief voor het bestuderen van het translatoom met een hogere resolutie dan polysoomprofilering, omdat het exacte aantal en de positie van ribosomen op individuele mRNA's kunnen worden beoordeeld. Niettemin is deze aanpak bewerkelijker, vereist hogere hoeveelheden monster en is rekenintensief, omdat kleine RNA-fragmenten worden teruggevonden.
Er zijn verschillende kritische experimentele aspecten om te overwegen, zoals de kwaliteit van het monster waaruit de polysomen zullen worden gezuiverd, vooral als bevroren weefsel wordt gebruikt, zoals het geval is in dit protocol. Intacte knobbeltjes moeten van de wortel worden losgemaakt en onmiddellijk worden ingevroren in vloeibare stikstof voordat ze bij −80 °C worden bewaard. In onze ervaring kunnen polysomen en de bijbehorende mRNA's binnen enkele maanden na opslag met succes worden gezuiverd uit knobbeltjes. Bovendien moet het hele protocol worden geïmplementeerd onder omstandigheden die RNA-afbraak voorkomen om hoogwaardige TOTAL en PAR te verkrijgen, wat van cruciaal belang is voor downstream-toepassingen zoals cDNA-synthese en high-throughput sequencing.
Een belangrijke beperking van de methode is de ultracentrifugatiestap, omdat ultracentrifuges in veel laboratoria niet op grote schaal beschikbaar zijn. Ook is het relevant om te vermelden dat de pellet verkregen na de centrifugatiestap, naast polysomen, andere ribonucleoproteïnencomplexen kan bevatten die niet translationeel actief zijn. Bovendien is een overweging bij het uitvoeren van het protocol dat hier wordt gepresenteerd met een ander sojabonenweefsel dat het waarschijnlijk het optimaliseren van de hoeveelheid monster, de monster: PEB-verhouding en de homogenisatieprocedure vereist.
Gezien het feit dat het monster dat in dit protocol wordt gebruikt een orgaan is dat is gevormd als gevolg van een symbiotische interactie tussen een plantenwortelcel en een bacterie, zou het uitvoeren van een Dual RNA-seq-analyse42 (met TOTAL- en PAR-monsters) interessant zijn omdat het onderzoek van de transcriptionele en translationele reacties van beide organismen mogelijk zou maken. De hier beschreven methode kan hierbij nuttig zijn als de extractie van de bacteriële RNA's wordt geoptimaliseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door CSIC I+D 2020 subsidie nr. 282, FVF 2017 subsidie nr. 210 en PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
