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Developmental Biology

सोयाबीन सहजीवी नोड्यूल से पॉलीसोम शुद्धिकरण

Published: July 1, 2022 doi: 10.3791/64269
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1, 1, 1, 2,4
1Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, 2Departamento de Genómica, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Department of Biology, University of Virginia, 4Departamento de Biología Celular y Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

Summary

यह प्रोटोकॉल बरकरार सोयाबीन नोड्यूल से यूकेरियोटिक पॉलीसोम शुद्धिकरण के लिए एक विधि का वर्णन करता है। अनुक्रमण के बाद, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मानक पाइपलाइनों का उपयोग ट्रांसक्रिप्टोम और ट्रांसलेटोम स्तरों पर अलग-अलग व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सोयाबीन (ग्लाइसिन अधिकतम) सहजीवी नोड्यूल के यूकेरियोटिक अनुवाद का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति प्रदान करना है। यह पत्र पौधे-व्युत्पन्न पॉलीराइबोसोम और उनके संबंधित एमआरएनए को आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग करके विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित तरीकों का वर्णन करता है। सबसे पहले, साइटोप्लाज्मिक लाइसेट्स पूरे, जमे हुए सोयाबीन नोड्यूल से पॉलीसोम- और आरएनए-संरक्षण स्थितियों में होमोजेनाइजेशन के माध्यम से प्राप्त किए जाते हैं। फिर, लाइसेट्स को कम गति वाले सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा साफ किया जाता है, और सतह पर तैरनेवाला का 15% कुल आरएनए (कुल) अलगाव के लिए उपयोग किया जाता है। शेष साफ़ लाइसेट का उपयोग दो-परत सुक्रोज कुशन (12% और 33.5%) के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पॉलीसोम को अलग करने के लिए किया जाता है। पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए (पीएआर) को पुन: निलंबन के बाद पॉलीसोमल छर्रों से शुद्ध किया जाता है। आरएनए-सेक के लिए अनुक्रमण पुस्तकालयों के गुणवत्ता मानकों को पूरा करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा कुल और पीएआर दोनों का मूल्यांकन किया जाता है। डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के उदाहरण के रूप में, अनुक्रमण के बाद, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मानक पाइपलाइनों का उपयोग ट्रांसक्रिप्टोम और ट्रांसलेटोम स्तरों पर अलग-अलग व्यक्त जीन प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। संक्षेप में, यह विधि, आरएनए-सेक के साथ संयोजन में, सहजीवी नोड्यूल जैसे जटिल ऊतक में यूकेरियोटिक एमआरएनए के ट्रांसलेशनल विनियमन के अध्ययन की अनुमति देती है।

Introduction

फलीदार पौधे, जैसे सोयाबीन (ग्लाइसिन अधिकतम), राइज़ोबिया नामक विशिष्ट मिट्टी के बैक्टीरिया के साथ सहजीवन स्थापित कर सकते हैं। यह पारस्परिक संबंध पौधे की जड़ों पर उपन्यास अंगों, सहजीवी नोड्यूल के गठन को प्राप्त करता है। नोड्यूल बैक्टीरिया की मेजबानी करने वाले पौधे के अंग होते हैं और इसमें मेजबान कोशिकाएं होती हैं जिनके साइटोप्लाज्म को राइज़ोबिया के एक विशेष रूप के साथ उपनिवेशित किया जाता है जिसे बैक्टीरॉइड कहा जाता है। ये बैक्टीरॉइड वायुमंडलीय नाइट्रोजन (एन2) को अमोनिया में कम करने के लिए उत्प्रेरित करते हैं, जिसे कार्बोहाइड्रेट 1,2 के बदले में पौधे में स्थानांतरित किया जाता है।

यद्यपि यह नाइट्रोजन-फिक्सिंग सहजीवन सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए पौधे-सूक्ष्मजीव सहजीवी में से एक है, कई पहलुओं को बेहतर ढंग से समझा जाना बाकी है, जैसे कि विभिन्न अजैविक तनाव स्थितियों के अधीन पौधे अपने सहजीवी साथी के साथ अपनी बातचीत को कैसे संशोधित करते हैं और यह नोड्यूल चयापचय को कैसे प्रभावित करता है। नोड्यूल ट्रांसलेटोम (यानी, मैसेंजर आरएनए [एमआरएनए] के सबसेट का सक्रिय रूप से अनुवाद किया गया) का विश्लेषण करके इन प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझा जा सकता है। पॉलीराइबोसोम या पॉलीसोम एमआरएनए से जुड़े कई राइबोसोम के परिसर हैं, जिनका उपयोग आमतौर पर अनुवाद का अध्ययन करने के लिए किया जाताहै 3. पॉलीसोम प्रोफाइलिंग विधि में पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए का विश्लेषण होता है और इसका उपयोग जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले पोस्टट्रांसक्रिप्शनल तंत्रका अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया जाता है जो विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं 4,5 में होता है।

ऐतिहासिक रूप से, जीनोम अभिव्यक्ति विश्लेषण ने मुख्य रूप से एमआरएनए बहुतायत 6,7,8,9 का निर्धारण करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हालांकि, जीन अभिव्यक्ति के पोस्टट्रांसक्रिप्शनल विनियमन के विभिन्न चरणों के कारण प्रतिलेख और प्रोटीन के स्तर के बीच सहसंबंध की कमी है, विशेष रूप से अनुवाद 10,11,12। इसके अलावा, ट्रांसक्रिप्टोम के स्तर पर परिवर्तनों और अनुवाद13 के स्तर पर होने वाले परिवर्तनों के बीच कोई निर्भरता नहीं देखी गई है। एमआरएनए के सेट का प्रत्यक्ष विश्लेषण जिसका अनुवाद किया जा रहा है, सेल जीन अभिव्यक्ति (जिसका समापन बिंदु प्रोटीन बहुतायत है) के अधिक सटीक और पूर्ण माप की अनुमति देता है, जब केवल एमआरएनए स्तरों का विश्लेषण 14,15,16 किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल बताता है कि पौधे-व्युत्पन्न पॉलीसोम को दो-परत सुक्रोज कुशन (चित्रा 1) के माध्यम से अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बरकरार सोयाबीन नोड्यूल से कैसे शुद्ध किया जाता है। हालांकि, चूंकि बैक्टीरॉइड-व्युत्पन्न राइबोसोम नोड्यूल में भी मौजूद होते हैं, इसलिए राइबोसोम और आरएनए प्रजातियों का मिश्रण शुद्ध होता है, भले ही यूकेरियोटिक वाले मुख्य अंश (90% -95%) का प्रतिनिधित्व करते हैं। बाद के आरएनए अलगाव, मात्रा का ठहराव, और गुणवत्ता नियंत्रण भी वर्णित हैं (चित्रा 1)। यह प्रोटोकॉल, आरएनए-सेक के साथ संयोजन में, सहजीवी नोड्यूल जैसे जटिल ऊतक में यूकेरियोटिक एमआरएनए के ट्रांसलेशनल विनियमन पर प्रयोगात्मक परिणाम प्रदान करना चाहिए।

Figure 1
चित्रा 1: सहजीवी नोड्यूल से यूकेरियोटिक पॉलीसोम शुद्धिकरण के लिए प्रस्तावित पद्धति का योजनाबद्ध अवलोकन। योजना (1) पौधे की वृद्धि और (2) नोड्यूल फसल से (3) साइटोसोलिक अर्क की तैयारी, (3) कुल नमूने और (4) पीएआर नमूने प्राप्त करने, और (5) आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण से प्रोटोकॉल में पीछा किए गए चरणों का अवलोकन देती है। संक्षिप्त नाम: पीईबी = पॉलीसोम निष्कर्षण बफर; आरबी = पुन: निलंबन बफर; कुल = कुल आरएनए; पीएआर = पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Protocol

1. पौधे की वृद्धि और राइजोबिया टीकाकरण

  1. आवश्यक नोड्यूल उत्पन्न करने के लिए, नियंत्रित परिस्थितियों में विकास कक्ष में चयनित सब्सट्रेट में पसंद के सोयाबीन बीज बोएं।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, बीज रेत के मिश्रण से भरे 0.5 एल प्लास्टिक की बोतल में बोए गए थे: वर्मीक्यूलाइट (1: 1)। विकास कक्ष क्रमशः 28 डिग्री सेल्सियस / 20 डिग्री सेल्सियस के दिन / रात चक्र तापमान और क्रमशः 16 घंटे / 8 घंटे के प्रकाश / अंधेरे फोटोपीरियड के साथ सेट किया गया था। प्रकाश संश्लेषक रूप से सक्रिय विकिरण तीव्रता 620 μmol·m−2·s−1 थी।
  2. अग्रिम तरल खमीर-निकालें मैनिटोल (वाईईएम) -मध्यम में तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। माध्यम को आटोक्लेव करें।
  3. बीज बुवाई के उसी दिन, ब्रैडीरिज़ोबियम एल्केनी यू 1302 तनाव के साथ 100 मिलीलीटर वाईईएम युक्त एक फ्लास्क को टीका लगाएं। 100 आरपीएम पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 28 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं।
    1. राइजोबिया को 2 दिनों के लिए बढ़ने दें और संस्कृति के 2 एमएल के साथ रोपाई को टीका लगाएं।

2. पानी की कमी उपचार (वैकल्पिक)

नोट: यह प्रोटोकॉल सोयाबीन पौधों के पानी की कमी के उपचार को रेखांकित करता है। हाथ में प्रयोगात्मक प्रश्न के आधार पर इस भाग को पूरी तरह से बदला या छोड़ा जा सकता है।

  1. पानी के प्रतिबंध के बिना 19 दिनों (वी 2-3 विकास चरण) के लिए सोयाबीन के अंकुर उगाएं। सब्सट्रेट को बी एंड डी-मध्यम17 के साथ क्षेत्र क्षमता पर रखें जो 0.5 एमएम केएनओ 3 के साथ पूरकहै।
  2. 20 वें दिन, पानी निकालें।
    नोट: यहां, पानी की मात्रा को विकास और पानी की कमी की अवधि के दौरान ग्रेविमेट्री (पानी ग्रेविमेट्रिक सामग्री) द्वारा दैनिक रूप से मापा गया था।
  3. निर्माता द्वारा निर्देशित पोरोमीटर के साथ अबाक्सियल पत्ती की सतह पर दैनिक रूप से ट्रिप्लिकेट में स्टोमेटल चालकता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें), दिन 20 से पानी की कमी की अवधि के अंत तक।
    नोट: पानी की कमी की अवधि का अंत प्रत्येक पौधे के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया गया था जब रंध्र चालकता मूल्य बुवाई से 20 दिन पर प्राप्त एक का लगभग 50% था।

3. नोड्यूल फसल

  1. एक साफ कंटेनर में तरल नाइट्रोजन ले लीजिए और 15 एमएल ट्यूब (प्रत्येक पौधे के लिए एक) लेबल।
    सावधानी: क्रायो दस्ताने, फेस शील्ड और सुरक्षा चश्मे पहने हुए तरल नाइट्रोजन को संभालें।
  2. प्रत्येक पौधे को व्यक्तिगत रूप से पुनः प्राप्त करें। हवाई भाग को काटें और त्यागें। किसी भी शेष सब्सट्रेट को हटाने के लिए जड़ को पानी से अच्छी तरह से धो लें।
  3. जड़ से प्रत्येक नोड्यूल को अलग करें और उन्हें 15 एमएल ट्यूब में इकट्ठा करें। ट्यूबों को स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

4. साइटोसोलिक अर्क की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल का अंतिम उद्देश्य उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए (कुल) और पॉलीसोम से जुड़े आरएनए (पीएआर) प्राप्त करना है। इसलिए, उन स्थितियों के तहत काम करें जो आरएनए गिरावट को रोकते हैं, हमेशा नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखते हैं और आरएनएएसई मुक्त प्रयोगशाला उपकरण और समाधान का उपयोग करते हैं। जब तक निर्दिष्ट नहीं किया जाता है, सभी समाधान बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के साथ तैयार किए जाते हैं।

  1. बफर स्टॉक समाधान तैयार करना
    1. तालिका 1 में सूचीबद्ध आटोक्लेवेबल स्टॉक समाधान तैयार करें, उन्हें 15 मिनट के लिए आटोक्लेव करें, और आरटी पर रखें।
    2. तालिका 1 में सूचीबद्ध फ़िल्टर-निष्फल स्टॉक समाधान तैयार करें, उन्हें फ़िल्टर-निष्फल करें, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  2. पॉलीसोम निष्कर्षण बफर तैयार करें (पीईबी, तालिका 1 देखें) और इसे बर्फ पर रखें।
    नोट: दिए गए वॉल्यूम छह नमूनों के लिए हैं।
  3. अपकेंद्रित्र को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें और बर्फ पर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब रखें।
  4. एक वजन पकवान में बरकरार नोड्यूल के लगभग 0.2 ग्राम वजन करें और उन्हें एक प्रीकोल्ड 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    नोट: नमूनों के विगलन से बचने के लिए इस चरण को जल्दी से करें। वैकल्पिक रूप से, 0.2 ग्राम के बजाय 0.4-0.5 एमएल की अनुमानित नोड्यूल मात्रा का उपयोग किया जा सकता है।
  5. पीईबी के 1.2 एमएल जोड़ें, नमूना को 2 मिनट के लिए पिघलने दें, और नोड्यूल के पूर्ण व्यवधान और समरूपता तक ऊतक चक्की के साथ होमोजेनाइज़ करें।
    नोट: एक बार पिघलने के बाद नोड्यूल को पीसना सुनिश्चित करें क्योंकि वे माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में ऊतक चक्की ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ आसानी से बाधित होने के लिए पर्याप्त नरम होंगे। जमे हुए नोड्यूल को पीसना मुश्किल होता है। इसके अलावा, नमूनों को ठंडा रखते हुए उचित समरूपता के लिए ट्यूबों को बेंचटॉप कूलर (0 डिग्री सेल्सियस) में रखने की सिफारिश की जाती है।
  6. 10 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ बर्फ पर नमूने सेते हैं या जब तक सभी नमूने संसाधित किया गया है।
  7. मलबे गोली करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला पुनर्प्राप्त करें और अपकेंद्रित्र चरण दोहराएं।
  8. ध्यान से स्पष्ट साइटोसोलिक निकालने को ठीक करें और कुल अलगाव के लिए एक साफ 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के लिए एक 200 μL विभाज्य स्थानांतरण (कुल नमूने; अनुभाग 7 देखें)।

5. सुक्रोज कुशन की तैयारी

नोट: यह प्रोटोकॉल 13.2 एमएल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में दो-परत सुक्रोज कुशन (12% और 33.5%) का उपयोग करता है (सामग्री की तालिका देखें)। सभी समाधान बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के साथ तैयार किए जाते हैं।

  1. सुक्रोज और नमक स्टॉक समाधान तैयार करें।
    1. 2 एम सुक्रोज समाधान के 100 मिलीलीटर तैयार करें (68.5%, तालिका 1)।
    2. 10x नमक का घोल तैयार करें (तालिका 1)।
  2. तालिका 2 में वर्णित सुक्रोज कुशन की दो परतें तैयार करें। एंटीबायोटिक (सीएचएक्स और सीएचएल) स्टॉक समाधान की संरचना के लिए तालिका 1 देखें।
    नोट: दिए गए वॉल्यूम छह कुशन के लिए हैं।
  3. अपकेंद्रित्र ट्यूबों में 33.5% सुक्रोज परत के 4.5 मिलीलीटर डालो। फिर, 12% परत के 4.5 एमएल को ध्यान से और धीरे-धीरे पी 1000 माइक्रोपिपेट के साथ जोड़ें। स्पष्ट साइटोसोलिक निकालने के अलावा तक ट्यूबों को बर्फ पर रखें।

6. पॉलीसोम शुद्धिकरण

  1. ट्यूब के साइडवॉल पर सावधानीपूर्वक पाइपिंग करके सुक्रोज कुशन के शीर्ष पर स्पष्ट साइटोसोलिक अर्क (चरण 4.8) के 1 एमएल लोड करें।
  2. अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 217,874 × ग्राम (संदर्भित रोटर में 35,000 आरपीएम [ सामग्री की तालिका देखें]) पर प्रीकोल्ड बाल्टी और अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें।
  3. शेष साइटोसोलिक अर्क और सुक्रोज कुशन को त्यागें, और प्रीकोल्ड आरबी (पहले तालिका 1 के अनुसार तैयार) के 200 μL के साथ पॉलीसोमल गोली को फिर से निलंबित करें।
  4. बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं और फिर पॉलीसोमल पुन: निलंबन को 1.5 एमएल प्रीकोल्ड ट्यूबों में स्थानांतरित करें। आरएनए निष्कर्षण (पीएआर नमूने) के साथ आगे बढ़ें।

7. आरएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: यह चरण कुल (चरण 4.8) और PAR नमूने (चरण 6.4) के लिए किया जाता है।

  1. बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के साथ 75% ईटीओएच तैयार करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। इसके अतिरिक्त, क्लोरोफॉर्म और आइसोप्रोपेनॉल को -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. आरएनए अलगाव अभिकर्मक के 750 μL के साथ नमूनों को समरूप करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. ठंडे क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें और 15 एस के लिए ट्यूबों को सख्ती से हिलाएं। 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. चरण पृथक्करण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। गुलाबी कार्बनिक चरण को परेशान किए बिना एक साफ ट्यूब में ऊपरी जलीय चरण के 500 μL को स्थानांतरित करें, और ठंड आइसोप्रोपेनॉल के 375 μL और आरएनएएसई मुक्त ग्लाइकोजन के 0.5 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें)। ऊपर-नीचे पाइप करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    नोट: ग्लाइकोजन एक वाहक है जिसका उपयोग अल्कोहल वर्षा से न्यूक्लिक एसिड वसूली को बढ़ाने के लिए सह-अवक्षेपक के रूप में किया जाता है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं और 15 मिनट के लिए 12,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. आरएनए अवक्षेप को 1 मिलीलीटर ठंड 75% ईटीओएच के साथ धो लें। संक्षिप्त भंवर द्वारा मिलाएं।
    नोट: इस बिंदु पर, नमूने रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 7,500 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र, ध्यान से एक माइक्रोपिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और आरएनए गोली को हवा से सूखा दें।
  8. आरएनएएसई मुक्त पानी के 50 μL में गोली भंग करें और 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  9. अत्यधिक संवेदनशील केशिका वैद्युतकणसंचलन18 ( सामग्री की तालिका देखें) और / या वैद्युतकणसंचलन के साथ आरएनए एकाग्रता और अखंडता का आकलन करें 2% आरएनए-मुक्त अगारोज जेल19 पर ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यदि आरएनए नमूनों का तुरंत उपयोग नहीं किया जा रहा है या आरएनए-सेक लाइब्रेरी तैयारी के लिए अनुक्रमण सुविधा में भेजा जा रहा है, तो उन्हें अवक्षेपित करने के लिए ईटीओएच का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

8. आरएनए वर्षा

  1. अपकेंद्रित्र और ईटीओएच को 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  2. 3 एम सोडियम एसीटेट तैयार करें।
  3. बाँझ अल्ट्राप्योर पानी के साथ 70% ईटीओएच तैयार करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  4. नमूना मात्रा का अनुमान लगाएं। 3 एम सोडियम एसीटेट के 0.1 वॉल्यूम, ठंडे ईटीओएच के 3 वॉल्यूम और आरएनएएसई मुक्त ग्लाइकोजन के 0.5 μL जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स करें।
  5. जरूरत पड़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
    नोट: आरएनए अवक्षेपित नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक संग्रहीत किए जा सकते हैं।

9. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए मानक पाइपलाइन

  1. आत्मविश्वास ट्रांसक्रिप्टोम और ट्रांसलेटोम डेटा विश्लेषण के लिए पढ़ने की लंबाई >100 बीपी के साथ औसतन 40 एम इलुमिना युग्मित-अंत पढ़ता है।
    नोट: मानक आरएनए-एसईक्यू डेटा विश्लेषण में निम्नलिखित चरण 9.2-9.5 शामिल हैं।
  2. फास्टक्यूसी (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) या मल्टीसैंपल मल्टीक्यूसी20 का उपयोग करके पढ़ने की गुणवत्ता निरीक्षण करें।
  3. ट्रिमोमैटिक21, बीबीडीयूके (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), कटएडैप्ट 22, सिकल23, या ट्रिम गैलोर (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) का उपयोग करके एडाप्टर और कम गुणवत्ता वाले अनुक्रमों को हटा दें।
  4. यदि प्रजातियों के लिए एक संदर्भ जीनोम उपलब्ध है, तो संदर्भ के खिलाफ पढ़ने का मानचित्रण करें, इसके बाद बहुतायत मात्रा का ठहराव, बोटी 224, टॉपहैट 225 या सैल्मन26, और फीचरकाउंट्स27 का उपयोग करके, अन्य ओपन सोर्स टूल के अलावा।
  5. दूसरों के बीच एजआर28, डीईएसईक्यू 229, या लिम्मा30 का उपयोग करके अंतर व्यक्त जीन पहचान के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
    नोट: इन ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग कमांड लाइन के माध्यम से स्थानीय रूप से किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, उन्हें सार्वजनिक सर्वर पर एक वेब ब्राउज़र के माध्यम से संचालित किया जा सकता है, जैसे कि गैलेक्सी31 या जीईओएक्सप्लोर32, जो ग्राफिकल यूजर इंटरफेस प्रदान करते हैं, ताकि उनके उपयोग के लिए कोई कमांड लाइन ज्ञान की आवश्यकता न हो।

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Representative Results

उपर्युक्त प्रक्रिया के साथ शुद्ध कुल और पीएआर अंशों की मात्रा और गुणवत्ता मूल्यांकन इसकी सफलता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि आरएनए अनुक्रमण जैसे अधिकांश डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, उच्च गुणवत्ता वाले नमूने पुस्तकालय की तैयारी और अनुक्रमण के लिए मौलिक हैं। इसके अलावा, आरएनए अणुओं की अखंडता नमूना संग्रह18 के समय जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के स्नैपशॉट को पकड़ने की अनुमति देती है। इस संदर्भ में, बायोएनालाइज़र का उपयोग करके इन मापों को करते समय एक आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) प्राप्त की जाती है। आरआईएन का उपयोग 10 (बरकरार) से 1 (पूरी तरह से अपमानित) 18 तक एक मजबूत, विश्वसनीय और उपयोगकर्ता-स्वतंत्र तरीके से अखंडता मूल्यों को निर्दिष्ट करने के लिए किया जाता है।

चित्रा 2 ए, बी कई कुल और पीएआर नमूना अंशों के लिए उच्च संवेदनशीलता केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली (बायोएनालाइज़र) के मानक उत्पादन को दर्शाता है। सभी नमूनों के लिए बहुत अच्छी गुणवत्ता देखी जाती है क्योंकि तेज राइबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) बैंड को बिना किसी धुंधली उपस्थिति के कल्पना की जा सकती है। हालांकि, यह आरआईएन मानों में परिलक्षित नहीं होता है, क्योंकि वे 5.9 और 7.5 के बीच होते हैं, जो गैर-बरकरार नमूनों से मेल खाती है। फिर भी, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, नमूना गिरावट का कोई दृश्य संकेत नहीं है, जैसा कि चित्रा 2 सी में देखा जा सकता है। चित्रा 2 डी तुलना के लिए लगभग पूरी तरह से अपमानित नमूने के बायोएनालाइज़र परिणाम का एक उदाहरण दिखाता है। उपकरण 18 एस और 25 एस चोटियों की पहचान करने में भी विफल रहे, जैसा कि कुल और पीएआर नमूनों (चित्रा 2 बी) दोनों के लिए इलेक्ट्रोफेरोग्राम में देखा गया है। नतीजतन, राइबोसोमल बैंड (25 एस: 18 एस; आरएनए अखंडता का एक और संकेतक) के अनुपात की गणना नहीं की जा सकी। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए आमतौर पर 25 एस: 18 एस 2: 1 अनुपात33 प्रदर्शित करता है।

Figure 2
चित्रा 2: कुल आरएनए और पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए मात्रा और गुणवत्ता मूल्यांकन ( ए ) उच्च संवेदनशीलता केशिका वैद्युतकणसंचलन (बायोएनालाइज़र) के प्रतिनिधि आभासी जेल पुनर्निर्माण उनके संबंधित आरआईएन और एकाग्रता मूल्यों के साथ 12 नमूनों से परिणाम। लेन 1 से लेन 6 छह नोड्यूल नमूनों के कुल आरएनए (कुल) अंशों के अनुरूप है, और लेन 7 से लेन 12 एक ही नमूने के पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए (पीएआर) अंशों के अनुरूप है। ग्रीन लाइन: सभी गलियों में मौजूद निचला मार्कर। (बी) इलेक्ट्रोफेरोग्राम प्रतिनिधित्व नमूना 4 (कुल के उदाहरण के रूप में) और नमूना 10 (पीएआर के उदाहरण के रूप में) के लिए दिखाया गया है। 18 एस और 25 एस चोटियों को इंगित किया गया है। संभवतः 16 एस और 23 एस (प्रोकैरियोटिक आरआरएनए) के अनुरूप चोटियों को * के साथ इंगित किया गया है। इन चोटियों पर ज़ूम-इन दिखाए गए हैं (बी 1 और बी 2)। यूकेरियोट कुल आरएनए नैनो परख का उपयोग बायोएनालाइज़र में किया गया था। (सी) प्रतिनिधि अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन छह नमूनों (बाएं) से परिणाम: कुल और PAR अंशों के 10 μL एक 2% अगरोज़ जेल पर लोड किया गया था और अलग (35 मिनट के लिए 80 वी)। दाईं ओर, केवल नमूना 2 का एक और जेल है, जहां प्रोकैरियोटिक आरआरएनए को अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। यूकेरियोटिक आरआरएनए (18 एस और 25 एस) को ग्रे एरोहेड्स द्वारा ब्लैक एरोहेड्स और प्रोकैरियोटिक आरआरएनए (16 एस और 23 एस) द्वारा इंगित किया जाता है। (डी) एक अपमानित नमूने के बायोएनालाइज़र परिणाम का उदाहरण। एल: मानक सीढ़ी। ग्रीन लाइन: सभी गलियों में मौजूद निचला मार्कर। संक्षिप्त नाम: आरआईएन = आरएनए अखंडता संख्या; पीएआर = पॉलीसोम से जुड़े एमआरएनए; एनटी = न्यूक्लियोटाइड; एल = मानक सीढ़ी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चूंकि ये नमूने सहजीवी नोड्यूल से हैं जहां यूकेरियोटिक और प्रोकैरियोटिक आरएनए सह-अस्तित्व में हैं, शुद्ध आरएनए दोनों प्रजातियों का मिश्रण है (हालांकि यूकेरियोटिक वाले बहुमत हैं)। इसलिए, इलेक्ट्रोफेरोग्राम (चित्रा 2 बी और ज़ूम-इन बी 1 और बी 2) में 16 एस और 23 एस आरआरएनए के अनुरूप चोटियों का निरीक्षण करने की उम्मीद है। ये "अतिरिक्त" चोटियाँ प्राप्त निचले आरआईएन मूल्यों की व्याख्या कर सकती हैं।

उपकरण एक संदर्भ के रूप में लेन 1 में मानक सीढ़ी पर विचार करते हुए नमूना सांद्रता की गणना भी करता है। जैसा कि अपेक्षित था, कुल नमूने PAR नमूनों की तुलना में उच्च एकाग्रता मान प्रस्तुत करते हैं। फिर भी, इनके लिए भी, पुस्तकालय की तैयारी और आरएनए-सेक के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त आरएनए है क्योंकि नमूना मात्रा आवश्यकताएं आमतौर पर कम से कम 1.0 μg की सिफारिश करती हैं।

कमरे के तापमान पर संग्रहीत किए जाने वाले आटोक्लेवेबल समाधान
2 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 9.0
2 एम केसीएल
0.5 एम ईजीटीए पीएच 8.0 (10 एम एनएओएच के साथ समायोजित)
1 एम एमजीसीएल2
20% (वी /वी) पीटीई (समाधान पाइप करने से पहले शेक बोतल)
10% डॉक
20% डिटर्जेंट मिश्रण: 20% (डब्ल्यू / वी) बृज एल 23, 20% (वी / वी) ट्रिटोन एक्स -100, इगेपल सीए 360, 20% (वी / वी) ट्वीन 20 (60 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग करते समय भंग)
-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए होने के लिए फ़िल्टर-निष्फल समाधान
0.5 एम डीटीटी
0.5 एम पीएमएसएफ
50 mg.mL -1 साइक्लोहेक्सिमाइड (सीएचएक्स) (ईटीओएच में)
50 mg.mL -1 क्लोरैनफेनिकॉल (सीएचएल) (ईटीओएच में)

स्टॉक समाधान 10 एमएल पीईबी के लिए वॉल्यूम (μL) 2 एमएल आरबी के लिए वॉल्यूम (μL)
2 एम केसीएल 1,000 200
0.5 एम ईजीटीए पीएच 8.0 500 100
1 एम एमजीसीएल2 356 70
20% (वी/वी) पीटीई 500 -
10% डॉक 1,000 -
20% डिटर्जेंट मिश्रण 500 -
0.5 एम डीटीटी 100 20
0.5 एम पीएमएसएफ 20 -
50 mg.mL-1 सीएचएक्स 10 2
50 mg.mL-1 सीएचएल 10 2
एच2ओ 5,004 1,406
2 एम सुक्रोज समाधान (68.5%): पानी में 68.5 ग्राम सुक्रोज। कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें।
10 एक्स नमक समाधान: 0.4 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.4, 0.2 एम केसीएल, 0.1 एम एमजीसीएल2; 15 मिनट के लिए आटोक्लेव, -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।

तालिका 1: बफ़र्स और समाधान इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। दिए गए वॉल्यूम छह नमूनों के लिए हैं। संक्षिप्त नाम: ईजीटीए = एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (2-एमिनोएथिलेथर) -एन, एन, एन', एन '-टेट्राएसेटिक एसिड; पीटीई = पॉलीऑक्सीथिलीन (10) ट्राइडेसिल ईथर; डीओसी = सोडियम डीऑक्सीकोलेट; डीटीटी = डाइथियोथ्रिटोल; पीएमएसएफ = फिनाइलमेथेनसल्फोनील फ्लोराइड।

सुक्रोज परत (%) सुक्रोज 2 एम (एमएल) नमक का घोल 10x (एमएल) सीएचएक्स 50 mg.mL-1 (μL) सीएचएल 50 mg.mL-1 (μL) एच2ओ (एमएल)
12 5.25 3 3 3 21.75
33.5 14.7 3 3 3 12.3

तालिका 2: दो सुक्रोज परतों की संरचना (12% और 33.5%)। दिए गए वॉल्यूम छह कुशन की तैयारी के लिए हैं।

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Discussion

ट्रांसलेशनल स्तर पर जीन अभिव्यक्ति विनियमन का अध्ययन विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि सेल जीन अभिव्यक्ति का समापन बिंदु प्रोटीन बहुतायत13,14 है। इसका आकलन ऊतक या ब्याज के जीव के अनुवाद का विश्लेषण करके किया जा सकता है जिसके लिए पॉलीसोमल अंश को शुद्ध किया जाना चाहिए और इसके संबंधित एमआरएनए ने 3,4,34,35,36 का विश्लेषण किया।

सुक्रोज कुशन के माध्यम से सोयाबीन सहजीवी नोड्यूल पॉलीसोम को शुद्ध करने के लिए यहां एक विधि प्रस्तुत की गई है, इसके बाद कुल और पीएआर निष्कर्षण किया जाता है। दोनों आरएनए अंशों को प्राप्त करना इस प्रोटोकॉल का एक प्रासंगिक बिंदु है क्योंकि जीन अभिव्यक्ति के लिए आरएनए-सेक और मानक पाइपलाइनों को बाद में लागू किया जा सकता है। इस प्रकार, नोड्यूल के ट्रांसक्रिप्टोम और अनुवाद का अध्ययन किया जा सकता है।

पॉलीसोम शुद्धिकरण के लिए एक वैकल्पिक विधि अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धि (ट्रैप) विधि है, जिसमें राइबोसोमल प्रोटीन एल 18 के एपिटोप-टैग किए गए संस्करण की अभिव्यक्ति राइबोसोम37,38 के इम्यूनोप्रेसिपिटेशन की अनुमति देती है। हालांकि, इस विधि के लिए ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी की आवश्यकता होती है, जो सोयाबीन जैसी कुछ प्रजातियों के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसके अलावा, राइबोसोम प्रोफाइलिंग या राइबो-सेक विधि 15,39,40,41, जिसमें पॉलीसोम शुद्धिकरण के बाद राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों की गहरी अनुक्रमण शामिल है, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग की तुलना में उच्च रिज़ॉल्यूशन के साथ अनुवाद का अध्ययन करने के लिए एक विकल्प है, क्योंकि व्यक्तिगत एमआरएनए पर राइबोसोम की सटीक संख्या और स्थिति का आकलन किया जा सकता है। फिर भी, यह दृष्टिकोण अधिक श्रमसाध्य है, नमूने की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, और कम्प्यूटेशनल रूप से गहन है, क्योंकि छोटे आरएनए टुकड़े बरामद किए जाते हैं।

विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पहलू हैं, जैसे कि नमूने की गुणवत्ता जिसमें से पॉलीसोम को शुद्ध किया जाएगा, खासकर यदि जमे हुए ऊतक का उपयोग किया जाता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में होता है। बरकरार नोड्यूल को जड़ से अलग किया जाना चाहिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले तरल नाइट्रोजन में तुरंत जमे हुए होना चाहिए। हमारे अनुभव में, पॉलीसोम और उनके संबंधित एमआरएनए को भंडारण के कुछ महीनों के भीतर नोड्यूल से सफलतापूर्वक शुद्ध किया जा सकता है। इसके अलावा, पूरे प्रोटोकॉल को उन स्थितियों के तहत लागू किया जाना चाहिए जो उच्च गुणवत्ता वाले कुल और पीएआर प्राप्त करने के लिए आरएनए गिरावट को रोकते हैं, जो सीडीएनए संश्लेषण और उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है।

विधि की एक प्रमुख सीमा अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण है, क्योंकि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज कई प्रयोगशालाओं में व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। इसके अलावा, यह उल्लेख करना प्रासंगिक है कि सेंट्रीफ्यूजेशन चरण के बाद प्राप्त गोली में पॉलीसोम के अलावा, अन्य राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स हो सकते हैं जो अनुवाद रूप से सक्रिय नहीं हैं। इसके अलावा, एक विचार अगर एक और सोयाबीन ऊतक के साथ यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रदर्शन यह है कि यह शायद नमूना की मात्रा, नमूना: पीईबी अनुपात, और समरूपता प्रक्रिया का अनुकूलन करने की आवश्यकता होगी।

यह देखते हुए कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला नमूना एक पौधे की जड़ कोशिका और एक बैक्टीरिया के बीच एक सहजीवी बातचीत के कारण गठित एक अंग है, एक दोहरी आरएनए-सेक विश्लेषण42 (कुल और पीएआर नमूनों के साथ) करना दिलचस्प होगा क्योंकि यह दोनों जीवों से ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल प्रतिक्रियाओं की परीक्षा की अनुमति देगा। यहां वर्णित विधि इस मामले के लिए सहायक हो सकती है यदि बैक्टीरिया आरएनए के निष्कर्षण को अनुकूलित किया जाता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को सीएसआईसी आई + डी 2020 अनुदान संख्या 282, एफवीएफ 2017 अनुदान संख्या 210 और पीईडीईसीआईबीए (मारिया मार्था सैंज) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plant growth and rhizobia inoculation
Orbital shaker Daihan Scientific Model SHO-1D
YEM-medium Amresco J850 (yeast extract) 0122 (mannitol)
Water deficit treatment
KNO3 Merck 221295
Porometer Decagon Device Model SC-1
Scalpel
Preparation of cytosolic extracts
Brij L23 Sigma-Aldrich P1254
Centrifuge Sigma Model 2K15
Chloranphenicol Sigma-Aldrich C0378
Cycloheximide Sigma-Aldrich C7698
DOC Sigma-Aldrich 30970
DTT Sigma-Aldrich D9779
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Igepal CA 360 Sigma-Aldrich I8896
KCl Merck 1.04936
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
Plastic tissue grinder Fisher Scientific 12649595
PMSF Sigma-Aldrich P7626
PTE Sigma-Aldrich P2393
Tris Invitrogen 15504-020
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Weighing dish  Deltalab 1911103
Preparation of sucrose cushions
Sucrose Invitrogen 15503022
SW 40 Ti rotor Beckman-Coulter
Ultracentrifuge Beckman-Coulter Optima L-100K
Ultracentrifuge tubes Beckman-Coulter 344059 13.2 mL tubes
RNA extraction and quality control
Agarose Thermo scientific R0492
Bioanalyzer Agilent Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay
Chloroform DI 41191
Ethanol Dorwil UN1170
Isopropanol Mallinckrodt 3032-06
Glycogen Sigma 10814-010
TRIzol LS Ambion 102960028
Miscellaneous
Falcon tubes 15 mL Biologix 10-0152
Filter tips 10 µL BioPointe Scientific 321-4050
Filter tips 1000 µL BioPointe Scientific 361-1050
Filter tips 20 µL BioPointe Scientific 341-4050
Filter tips 200 µL Tarsons 528104
Microcentrifuge tubes 1.5 mL Tarsons 500010-N
Microcentrifuge tubes 2.0 mL Tarsons 500020-N
Sequencing company Macrogen
Sterile 250 mL flask Marienfeld 4110207

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 185
सोयाबीन सहजीवी नोड्यूल से पॉलीसोम शुद्धिकरण
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