Summary
Detta protokoll beskriver en metod för eukaryot polysomrening från intakta sojabönor. Efter sekvensering kan standardpipelines för genuttrycksanalys användas för att identifiera differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna.
Abstract
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en strategi för att studera det eukaryota överlatomet av sojabönan (Glycine max) symbiotisk knöl. Detta dokument beskriver metoder optimerade för att isolera växtbaserade polyribosomer och deras associerade mRNA som ska analyseras med RNA-sekvensering. Först erhålls cytoplasmatiska lysater genom homogenisering i polysom- och RNA-bevarande förhållanden från hela, frysta sojabönknutor. Därefter rensas lysater genom låghastighetscentrifugering, och 15% av supernatanten används för total RNA (TOTAL) isolering. Det återstående rensade lysatet används för att isolera polysomer genom ultracentrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (12% och 33,5%). Polysomassocierat mRNA (PAR) renas från polysomala pellets efter resuspension. Både TOTAL och PAR utvärderas av mycket känslig kapillärelektrofores för att uppfylla kvalitetsstandarderna för sekvenseringsbibliotek för RNA-seq. Som ett exempel på en nedströms applikation, efter sekvensering, kan standardrörledningar för genuttrycksanalys användas för att erhålla differentiellt uttryckta gener på transkriptom- och translatomnivåerna. Sammanfattningsvis möjliggör denna metod, i kombination med RNA-seq, studier av translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.
Introduction
Baljväxter, såsom sojabönor (Glycine max), kan etablera symbios med specifika jordbakterier som kallas rhizobia. Detta mutualistiska förhållande framkallar bildandet av nya organ, de symbiotiska knölarna, på växtrötterna. Knölarna är växtorganen som är värd för bakterierna och består av värdceller vars cytoplasma koloniseras med en specialiserad form av rhizobia som kallas bakterioider. Dessa bakterioider katalyserar reduktionen av atmosfäriskt kväve (N2) till ammoniak, som överförs till växten i utbyte mot kolhydrater 1,2.
Även om denna kvävefixerande symbios är en av de mest välstuderade växt-mikrobsymbioserna, återstår många aspekter att förstå bättre, till exempel hur växter som utsätts för olika abiotiska stressförhållanden modulerar deras interaktion med sin symbiotiska partner och hur detta påverkar knölmetabolismen. Dessa processer kan förstås bättre genom att analysera knöltranslatomet (dvs. delmängden av budbärar-RNA [mRNA] som aktivt översätts). Polyribosomer eller polysomer är komplex av flera ribosomer associerade med mRNA, som vanligtvis används för att studera översättning3. Polysomprofileringsmetoden består av analys av mRNA associerade med polysomer och har framgångsrikt använts för att studera de posttranskriptionella mekanismerna som styr genuttryck som förekommer i olika biologiska processer 4,5.
Historiskt sett har genomuttrycksanalys främst fokuserat på att bestämma mRNA-överflöd 6,7,8,9. Det finns emellertid en brist på korrelation mellan transkript- och proteinnivåer på grund av de olika stadierna av posttranskriptionell reglering av genuttryck, särskilt översättning10,11,12. Dessutom har inget beroende observerats mellan förändringarna på transkriptomets nivå och de som uppträder vid translatomets nivå13. Den direkta analysen av den uppsättning mRNA som översätts möjliggör en mer exakt och fullständig mätning av cellgenuttrycket (vars slutpunkt är proteinmängd) än den som erhålls när endast mRNA-nivåer analyseras14,15,16.
Detta protokoll beskriver hur växtbaserade polysomer renas från intakta sojabönknutor genom differentiell centrifugering genom en tvåskikts sackaroskudde (figur 1). Men eftersom bakterioid-härledda ribosomer också finns i knölarna, renas en blandning av ribosomer och RNA-arter, även om de eukaryota representerar huvudfraktionen (90% -95%). Den efterföljande RNA-isoleringen, kvantifieringen och kvalitetskontrollen beskrivs också (figur 1). Detta protokoll, i kombination med RNA-seq, bör ge experimentella resultat om translationell reglering av eukaryota mRNA i en komplex vävnad såsom den symbiotiska knölen.
Figur 1: Schematisk översikt över den föreslagna metoden för eukaryot polysomrening från symbiotiska knölar. Schemat ger en översikt över de steg som följs i protokollet från (1) växttillväxt och (2) knölskörd till (3) beredning av cytosolextrakten, (3) erhållande av TOTAL-prover och (4) PAR-prover och (5) RNA-extraktion och kvalitetskontroll. Förkortningar: PEB = polysomextraktionsbuffert; RB = resuspensionsbuffert; TOTALT = totalt RNA; PAR = polysomassocierat mRNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växttillväxt och rhizobia inokulering
- För att generera de nödvändiga knölarna, så de sojabönor som valts i det valda substratet i en tillväxtkammare under kontrollerade förhållanden.
OBS: I detta protokoll såddes frön i en 0,5 L plastflaska fylld med en blandning av sand: vermikulit (1: 1). Tillväxtkammaren ställdes in med en dag/natt-cykeltemperatur på 28 °C /20 °C respektive en ljus/mörkerfotoperiod på 16 h/8 h. Den fotosyntetiskt aktiva strålningsintensiteten var 620 μmol·m−2·s−1. - Förbered i förväg flytande jäst-extrakt mannitol (YEM)-medium (se materialtabellen). Autoklavera mediet.
- Samma dag som utsäde sådd, inokulera en kolv som innehåller 100 ml YEM med Bradyrhizobium elkanii U1302-stammen. Inkubera kolven vid 28 °C i en orbitalskakapparat vid 100 rpm.
- Låt rhizobia växa i 2 dagar och ympa plantorna med 2 ml av kulturen.
2. Behandling av vattenbrist (valfritt)
OBS: Detta protokoll beskriver vattenbristbehandlingen av sojabönplantorna. Denna del kan ändras eller utelämnas helt beroende på den aktuella experimentella frågan.
- Odla sojabönorna i 19 dagar (V2-3 utvecklingsstadium) utan vattenbegränsning. Håll underlaget på fältkapacitet med B&D-medium17 kompletterat med 0,5 mM KNO3.
- På dag 20, dra tillbaka vattningen.
OBS: Här mättes vattenhalten dagligen med gravimetri (vattengravimetrisk halt) under tillväxt- och vattenunderskottsperioderna. - Mät stomatal konduktans i tre exemplar dagligen på den abaxiella bladytan med en porometer, enligt tillverkarens anvisningar (se materialförteckningen), från dag 20 till slutet av vattenunderskottsperioden.
OBS: Slutet av vattenunderskottsperioden bestämdes individuellt för varje växt när stomatalkonduktansvärdet var cirka 50% av det som erhölls på dag 20 från sådd.
3. Nodule skörd
- Samla flytande kväve i en ren behållare och märk 15 ml rör (ett för varje växt).
VARNING: Hantera flytande kväve med kryohandskar, ansiktsskydd och skyddsglasögon. - Hämta varje växt individuellt. Klipp och kassera antenndelen. Tvätta roten noggrant med vatten för att ta bort eventuellt kvarvarande substrat.
- Lossa varje knöl från roten och samla dem i ett förkylt 15 ml rör. Snäppfrys rören och förvara dem vid −80 °C.
4. Beredning av cytosoliska extrakt
OBS: Det slutliga målet med detta protokoll är att erhålla högkvalitativt totalt RNA (TOTAL) och polysomassocierat RNA (PAR). Arbeta därför under förhållanden som förhindrar RNA-nedbrytning, håll alltid proverna vid 4 ° C och använd RNas-fri laboratorieutrustning och lösningar. Om inget annat anges bereds alla lösningar med sterilt ultrarent vatten.
- Beredning av buffertlagerlösningar
- Förbered de autoklaverbara lagerlösningarna som anges i tabell 1, autoklavera dem i 15 minuter och håll på RT.
- Bered de filtersteriliserbara stamlösningar som anges i tabell 1, filtrera dem och förvara dem vid −20 °C.
- Förbered polysomextraktionsbuffert (PEB, se tabell 1) och håll den på is.
OBS: De angivna volymerna är för sex prover. - Kyl centrifugen till 4 °C och placera 2 ml mikrocentrifugrör på is.
- Väg cirka 0,2 g intakta knölar i en vägningsskål och överför dem till ett förkylt 2 ml rör.
OBS: Utför detta steg snabbt för att undvika upptining av proverna. Alternativt kan en uppskattad knölvolym på 0,4-0,5 ml användas istället för 0,2 g. - Tillsätt 1,2 ml PEB, låt provet tina i 2 minuter och homogenisera med en vävnadskvarn tills fullständig störning och homogenisering av knölarna.
OBS: Var noga med att slipa knölarna när de tinas eftersom de kommer att vara tillräckligt mjuka för att lätt störas med vävnadsslipmaskiner (se materialtabellen) i mikrocentrifugrör. Frysta knölar är svåra att slipa. Det rekommenderas också att placera rören i en bänkkylare (0 °C) för korrekt homogenisering samtidigt som proverna hålls svala. - Inkubera proverna på is med försiktig omrörning i 10 minuter eller tills alla prover har bearbetats.
- Centrifugera vid 16 000 × g i 15 minuter vid 4 °C för att pelletera skräpet. Återställ supernatanten och upprepa centrifugsteget.
- Återvinn försiktigt det klarade cytosolextraktet och överför en alikvot på 200 μl till ett rent 1,5 ml mikrocentrifugrör för total isolering (TOTAL-prover; se avsnitt 7).
5. Beredning av sackaroskuddar
OBS: Detta protokoll använder en tvåskikts sackaroskudde (12% och 33.5%) i 13.2 ml ultracentrifugrör (se materialtabellen). Alla lösningar framställs med sterilt ultrarent vatten.
- Förbered sackaros- och saltlösningarna.
- Förbered 100 ml 2 M sackaroslösning (68,5%, tabell 1).
- Förbered 10x saltlösning (tabell 1).
- Förbered de två lagren av sackaroskudden enligt beskrivningen i tabell 2. Se tabell 1 för sammansättningen av stamlösningarna av antibiotika (CHX och CHL).
OBS: De angivna volymerna är för sex kuddar. - Häll 4,5 ml av 33,5% sackarosskiktet i centrifugrören. Tillsätt sedan 4,5 ml av 12% -skiktet försiktigt och långsamt med en P1000 -mikropipett. Lägg rören på is tills tillsatsen av det klarade cytosoliska extraktet.
6. Polysomrening
- Fyll 1 ml av det klarade cytosolextraktet (steg 4.8) ovanpå sackaroskudden genom att försiktigt pipettera på rörets sidovägg.
- Överför ultracentrifugrören till förkylda skopor och centrifugera vid 217 874 × g (35 000 rpm i referensrotorn [se materialförteckningen]) i 2 timmar vid 4 °C.
- Kassera det återstående cytosolextraktet och sackaroskudden och återsuspendera den polysomala pelleten med 200 μl förkyld RB (tidigare beredd enligt tabell 1).
- Inkubera i 30 minuter på is och överför sedan den polysomala resuspensionen till 1,5 ml förkylda rör. Fortsätt med RNA-extraktionen (PAR-prover).
7. RNA-extraktion och kvalitetskontroll
OBS: Detta steg utförs för TOTAL (steg 4.8) och PAR-prover (steg 6.4).
- Förbered 75% EtOH med sterilt ultrarent vatten och kyla det till −20 °C. Kyl dessutom kloroform och isopropanol till −20 °C.
- Homogenisera proverna med 750 μl av RNA-isoleringsreagenset och inkubera i 5 minuter vid rtf.
- Tillsätt 200 μl kall kloroform och skaka rören kraftigt i 15 s. Inkubera vid RT i 10 min.
- Centrifugera vid 12 000 × g i 15 minuter vid 4 °C för fasseparation. Överför 500 μL av den övre vattenfasen till ett rent rör utan att störa den rosa organiska fasen och tillsätt 375 μl kall isopropanol och 0,5 μL RNas-fritt glykogen (se materialtabellen). Blanda noggrant genom att pipettera upp och ner.
OBS: Glykogen är en bärare som används som en co-fällning för att öka nukleinsyraåtervinningen från alkoholutfällning. - Inkubera blandningen i 10 min vid 4 °C och centrifugera vid 12 000 × g i 15 minuter. Kassera supernatanten.
- Tvätta RNA-fällningen med 1 ml kall 75% EtOH. Blanda med kort virvel.
OBS: Vid denna tidpunkt kan proverna förvaras vid −20 °C över natten. - Centrifugera vid 7 500 × g i 5 minuter vid 4 °C, avlägsna försiktigt supernatanten med en mikropipett och lufttorka RNA-pelleten.
- Lös pelleten i 50 μl RNasfritt vatten och inkubera vid 65 °C i 5 minuter.
- Bedöm RNA-koncentrationen och integriteten med mycket känslig kapillärelektrofores18 (se materialtabellen) och / eller elektrofores på en 2% RNas-fri agarosgel19 (se materialtabellen).
OBS: Om RNA-proverna inte kommer att användas omedelbart eller kommer att skickas till sekvenseringsanläggningen för beredning av RNA-seq-bibliotek, rekommenderas att använda EtOH för att fälla ut dem.
8. RNA-utfällning
- Kyl centrifugen och EtOH till 4 °C.
- Förbered 3 M natriumacetat.
- Förbered 70% EtOH med sterilt ultrarent vatten och kyla det till −20 °C.
- Uppskatta provvolymen. Tillsätt 0,1 volymer 3 M natriumacetat, 3 volymer kallt EtOH och 0,5 μL RNasfritt glykogen. Blanda noggrant.
- Låt stå vid −20 °C tills det behövs.
OBS: RNA-utfällda prover kan lagras i upp till 1 år vid −80 °C.
9. Standardpipeline för genuttrycksanalys
- Utför i genomsnitt 40M Illumina parade slutläsningar, med läslängd >100 bp, för säker transkriptom och översättningsdataanalys.
OBS: Standard RNA-seq-dataanalys inkluderar följande steg 9.2-9.5. - Utför läskvalitetsinspektion med FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) eller multisample MultiQC20.
- Ta bort adapter och lågkvalitativa sekvenser med antingen Trimmomatic21, BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), cutadapt22, sickle23 eller Trim Galore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), bland andra.
- Om ett referensgenom är tillgängligt för arten, utför läskartläggning mot referensen, följt av kvantitet av överflöd, med hjälp av Bowtie224, TopHat2 25 eller Salmon 26 och featureCounts27, förutom andra verktyg med öppen källkod.
- Utföra statistisk analys för identifiering av differentiellt uttryckta gener med bland annat edgeR28, DESeq229 eller limma30.
OBS: Dessa program med öppen källkod kan användas lokalt, via kommandoraden. Alternativt kan de drivas via en webbläsare på en offentlig server, till exempel Galaxy31 eller GEOexplorer32, som erbjuder ett grafiskt användargränssnitt, så att ingen kommandoradskunskap krävs för deras användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvantitets- och kvalitetsbedömningen av TOTAL- och PAR-fraktionerna renade med ovannämnda förfarande är nyckeln till att bestämma dess framgång, eftersom för de flesta nedströmsapplikationer, såsom RNA-sekvensering, är högkvalitativa prover grundläggande för biblioteksberedning och sekvensering. Dessutom möjliggör RNA-molekylernas integritet att fånga en ögonblicksbild av genuttrycksprofilen vid tidpunkten för provsamlingen18. I detta sammanhang erhålls ett RNA-integritetsnummer (RIN) när dessa mätningar utförs med hjälp av en bioanalysator. RIN används för att tilldela integritetsvärden på ett robust, tillförlitligt och användaroberoende sätt, från 10 (intakt) till 1 (helt försämrat)18.
Figur 2A,B visar standardutgången för det högkänsliga kapillärelektroforessystemet (Bioanalyzer) för flera TOTAL- och PAR-provfraktioner. Mycket god kvalitet observeras för alla prover eftersom skarpa ribosomala RNA (rRNA) band kan visualiseras utan något utsmetat utseende. Detta återspeglas dock inte i RIN-värdena, eftersom de varierar mellan 5,9 och 7,5, vilket motsvarar icke-intakta prover. Som tidigare nämnts finns det dock inga visuella tecken på provnedbrytning, vilket kan ses i figur 2C. Figur 2D visar ett exempel på ett bioanalysatorresultat av ett nästan helt nedbrutet prov för jämförelse. Utrustningen misslyckades också med att identifiera topparna 18S och 25S, vilket ses i elektroferogrammen både för TOTAL- och PAR-prover (figur 2B). Följaktligen kunde andelen ribosomala band (25S: 18S; en annan indikator på RNA-integritet) inte beräknas. Högkvalitativt RNA uppvisar vanligtvis ett 25S: 18S 2: 1-förhållande33.
Figur 2: Total RNA- och polysomassocierad mRNA-kvantitet och kvalitetsbedömning . (A) Representativ virtuell gelrekonstruktion av högkänslig kapillärelektrofores (Bioanalyzer) resultat från 12 prover med deras respektive RIN och koncentrationsvärden. Fält 1 till körfält 6 motsvarar totala RNA (TOTAL) fraktioner av sex knölprover, och körfält 7 till körfält 12 motsvarar polysomassocierade mRNA (PAR) fraktioner av samma prover. Grön linje: nedre markör som finns i alla körfält. (B) Elektroferogramrepresentation visas för prov 4 (som ett exempel på TOTAL) och prov 10 (som ett exempel på PAR). 18S och 25S toppar anges. Toppar som möjligen motsvarar 16S och 23S (prokaryota rRNA) indikeras med *. Inzoomningar på dessa toppar visas (B1 och B2). Eukaryote Total RNA Nano-analysen användes i Bioanalyzer. (C) Representativa akarosgelelektroforesresultat från sex prover (vänster): 10 μL TOTAL- och PAR-fraktioner laddades på en 2% agarosgel och separerades (80 V i 35 min). Till höger finns det endast en annan gel av prov 2, där de prokaryota rRNA kan visualiseras tydligare. Eukaryot rRNA (18S och 25S) indikeras av svarta pilspetsar och prokaryota rRNA (16S och 23S) med grå pilspetsar. (D) Exempel på ett bioanalysatorresultat av ett nedbrutet prov. L: standard stege. Grön linje: nedre markör som finns i alla körfält. Förkortningar: RIN = RNA-integritetsnummer; PAR = polysomassocierat mRNA; nt = nukleotider; L = standard stege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Eftersom dessa prover kommer från symbiotiska knölar där eukaryota och prokaryota RNA samexisterar, är det renade RNA en blandning av båda arterna (även om de eukaryota är majoriteten). Därför förväntas den observera toppar motsvarande 16S och 23S rRNA i elektroferogrammen (figur 2B och zooma in B1 och B2). Dessa "extra" toppar kan förklara de lägre erhållna RIN-värdena.
Utrustningen beräknar också provkoncentrationer med tanke på standardstegen i körfält 1 som referens. Som förväntat uppvisar TOTAL-proverna högre koncentrationsvärden än PAR-proverna. Ändå, även för dessa, finns det tillräckligt med RNA för att fortsätta med biblioteksberedning och RNA-seq eftersom provmängdskrav vanligtvis rekommenderar minst 1,0 μg.
| Autoklaverbara lösningar som ska förvaras vid rumstemperatur |
| 2 M Tris-HCl pH 9,0 |
| 2 miljoner kaliumklorid |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 (justerat med 10 M NaOH) |
| 1 M MgCl2 |
| 20% (v/v) PTE (skaka flaskan innan du pipetterar lösningen) |
| 10% DOC |
| 20% Tvättmedelsblandning: 20% (w/v) Brij L23, 20% (v/v) Tritón X-100, Igepal CA 360, 20% (v/v) Tween 20 (lös upp under uppvärmning vid 60 °C) |
| Filtersteriliserbara lösningar som ska frysas vid -20 °C |
| 0,5 M DTT |
| 0,5 m PMSF |
| 50 mg.mL-1 cykloheximid (CHX) (i EtOH) |
| 50 mg.mL-1 kloranfenikol (CHL) (i EtOH) |
| Lagerlösning | Volym (μL) för 10 ml PEB | Volym (μL) för 2 ml RB |
| 2 miljoner kaliumklorid | 1,000 | 200 |
| 0,5 M EGTA pH 8,0 | 500 | 100 |
| 1 M MgCl2 | 356 | 70 |
| 20 % (v/v) PTE | 500 | - |
| 10% DOC | 1,000 | - |
| 20% tvättmedelsblandning | 500 | - |
| 0,5 M DTT | 100 | 20 |
| 0,5 m PMSF | 20 | - |
| 50 mg.mL-1 CHX | 10 | 2 |
| 50 mg.mL-1 CHL | 10 | 2 |
| H2O | 5,004 | 1,406 |
| 2 M sackaroslösning (68,5%): 68,5 g sackaros i vatten. Förvara vid rumstemperatur (RT). | ||
| 10x saltlösning: 0,4 M Tris-HCl pH 8,4, 0,2 M KCl, 0,1 M MgCl2; autoklav i 15 min, frys vid -20 °C. | ||
Tabell 1: Buffertar och lösningar som används i detta protokoll. De angivna volymerna är för sex prover. Förkortningar: EGTA = etylenglykol-bis(2-aminoetyleter)-N,N,N',N'-tetraättiksyra; PTE = polyoxietylen (10) tridecyleter; DOC = natriumdeoxikolat; DTT = ditiotreitol; PMSF = fenylmetansulfonylfluorid.
| Sackarosskikt (%) | Sackaros 2 M (ml) | Saltlösning 10x (ml) | CHX 50 mg.mL-1 (μL) | CHL 50 mg.mL-1 (μL) | H2O(ml) |
| 12 | 5.25 | 3 | 3 | 3 | 21.75 |
| 33.5 | 14.7 | 3 | 3 | 3 | 12.3 |
Tabell 2: Sammansättning av de två sackarosskikten (12% och 33,5%). De angivna volymerna är för beredning av sex kuddar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att studera genuttrycksreglering på translationell nivå är avgörande för att bättre förstå olika biologiska processer eftersom slutpunkten för cellgenuttryck är proteinförekomst13,14. Detta kan bedömas genom att analysera translatomet hos vävnaden eller organismen av intresse för vilken den polysomala fraktionen ska renas och dess associerade mRNA analyseras 3,4,34,35,36.
En metod presenteras här för att rena sojabönor symbiotiska knölpolysomer genom sackaroskuddar, följt av TOTAL och PAR-extraktion. Att erhålla båda RNA-fraktionerna är en relevant punkt i detta protokoll eftersom RNA-seq och standardrörledningar för genuttryck kan implementeras efteråt. Således kan transkriptomet och översättningen av knölen studeras.
En alternativ metod för polysomrening är metoden att översätta ribosomaffinitetsrening (TRAP), där uttrycket av en epitopmärkt version av ribosomalt protein L18 möjliggör immunoprecipitation av ribosomer37,38. Denna metod kräver dock generering av transgena växter, vilket kan vara utmanande för vissa arter som sojabönan. Dessutom är ribosomprofilering eller Ribo-seq-metoden 15,39,40,41, som involverar djup sekvensering av ribosomskyddade mRNA-fragment efter polysomrening, ett alternativ för att studera translatemet med högre upplösning än polysomprofilering, eftersom det exakta antalet och positionen för ribosomer på enskilda mRNA kan bedömas. Ändå är detta tillvägagångssätt mer mödosamt, kräver högre mängder prov och är beräkningsintensivt eftersom små RNA-fragment återvinns.
Det finns flera kritiska experimentella aspekter att överväga, såsom kvaliteten på provet från vilket polysomerna kommer att renas, särskilt om frusen vävnad används, vilket är fallet i detta protokoll. Intakta knölar ska lossna från roten och omedelbart frysas i flytande kväve före förvaring vid −80 °C. Enligt vår erfarenhet kan polysomer och deras associerade mRNA framgångsrikt renas från knölar inom några månader efter lagring. Dessutom måste hela protokollet implementeras under förhållanden som förhindrar RNA-nedbrytning för att erhålla högkvalitativ TOTAL och PAR, vilket är avgörande för nedströmsapplikationer som cDNA-syntes och sekvensering med hög genomströmning.
En viktig begränsning av metoden är ultracentrifugeringssteget, eftersom ultracentrifuger inte är allmänt tillgängliga i många laboratorier. Det är också relevant att nämna att pelleten erhållen efter centrifugeringssteget kan, förutom polysomer, innehålla andra ribonukleoproteinkomplex som inte är translationellt aktiva. Dessutom är ett övervägande om man utför protokollet som presenteras här med en annan sojabönvävnad att det förmodligen kommer att kräva optimering av mängden prov, prov: PEB-förhållandet och homogeniseringsproceduren.
Med tanke på att provet som används i detta protokoll är ett organ som bildas på grund av en symbiotisk interaktion mellan en växtrotcell och en bakterie, skulle det vara intressant att utföra en Dual RNA-seq-analys42 (med TOTAL- och PAR-prover) eftersom det skulle möjliggöra undersökning av transkriptionella och translationella svar från båda organismerna. Metoden som beskrivs här kan vara till hjälp för denna fråga om extraktionen av bakteriella RNA optimeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av CSIC I + D 2020 bidrag nr 282, FVF 2017 bidrag nr 210 och PEDECIBA (María Martha Sainz).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plant growth and rhizobia inoculation | |||
| Orbital shaker | Daihan Scientific | Model SHO-1D | |
| YEM-medium | Amresco | J850 (yeast extract) 0122 (mannitol) | |
| Water deficit treatment | |||
| KNO3 | Merck | 221295 | |
| Porometer | Decagon Device | Model SC-1 | |
| Scalpel | |||
| Preparation of cytosolic extracts | |||
| Brij L23 | Sigma-Aldrich | P1254 | |
| Centrifuge | Sigma | Model 2K15 | |
| Chloranphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| DOC | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Igepal CA 360 | Sigma-Aldrich | I8896 | |
| KCl | Merck | 1.04936 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Plastic tissue grinder | Fisher Scientific | 12649595 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| PTE | Sigma-Aldrich | P2393 | |
| Tris | Invitrogen | 15504-020 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Weighing dish | Deltalab | 1911103 | |
| Preparation of sucrose cushions | |||
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| SW 40 Ti rotor | Beckman-Coulter | ||
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Optima L-100K | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman-Coulter | 344059 | 13.2 mL tubes |
| RNA extraction and quality control | |||
| Agarose | Thermo scientific | R0492 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Model 2100. Eukaryote total RNA nano assay | |
| Chloroform | DI | 41191 | |
| Ethanol | Dorwil | UN1170 | |
| Isopropanol | Mallinckrodt | 3032-06 | |
| Glycogen | Sigma | 10814-010 | |
| TRIzol LS | Ambion | 102960028 | |
| Miscellaneous | |||
| Falcon tubes 15 mL | Biologix | 10-0152 | |
| Filter tips 10 µL | BioPointe Scientific | 321-4050 | |
| Filter tips 1000 µL | BioPointe Scientific | 361-1050 | |
| Filter tips 20 µL | BioPointe Scientific | 341-4050 | |
| Filter tips 200 µL | Tarsons | 528104 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Tarsons | 500010-N | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL | Tarsons | 500020-N | |
| Sequencing company | Macrogen | ||
| Sterile 250 mL flask | Marienfeld | 4110207 |
References
- Limpens, E., et al. Cell- and tissue-specific transcriptome analyses of Medicago truncatula root nodules. PLoS ONE. 8 (5), 64377 (2013).
- Masson-Boivin, C., Giraud, E., Perret, X., Batut, J. Establishing nitrogen-fixing symbiosis with legumes: How many rhizobium recipes. Trends in Microbiology. 17 (10), 458-466 (2009).
- King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: Methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in Functional Genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
- Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Research. 45 (3), 15 (2017).
- Yángüez, E., Castro-Sanz, A. B., Fernández-Bautista, N., Oliveros, J. C., Castellano, M. M. Analysis of genome-wide changes in the translatome of Arabidopsis seedlings subjected to heat stress. PloS ONE. 8 (8), 71425 (2013).
- Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
- Krishnamurthy, A., Ferl, R. J., Paul, A. -L. Comparing RNA-Seq and microarray gene expression data in two zones of the Arabidopsis root apex relevant to spaceflight. Applications in Plant Sciences. 6 (11), 1197 (2018).
- Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Reports. 27 (7), 2241-2247 (2019).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: A revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Kawaguchi, R., Girke, T., Bray, E. A., Bailey-Serres, J. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 38 (5), 823-839 (2004).
- Larsson, O., Tian, B., Sonenberg, N. Toward a genome-wide landscape of translational control. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), 012302 (2013).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into regulation of protein abundance from proteomics and transcriptomis analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2013).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (220), 1-15 (2012).
- Wang, T., et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Research. 41 (9), 4743-4754 (2013).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: New views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
- Lukoszek, R., Feist, P., Ignatova, Z. Insights into the adaptive response of Arabidopsis thaliana to prolonged thermal stress by ribosomal profiling and RNA-Seq. BMC Plant Biology. 16 (1), 1-13 (2016).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J.
- Schroeder, A., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 1-14 (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA nondenaturing agarose gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), 1-3 (2012).
- Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Marcel, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Joshi, J., Fass, N. Sickle: A sliding-window, adaptive, quality-based trimming tool for FastQ files (Version 1.33). , Available from: https://github.com/najoshi/sickle (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Kim, D., et al. TopHat2: Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14 (4), 1-13 (2013).
- Patro, R., Duggal, G., Love, M. I., Irizarry, R. A., Kingsford, C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nature Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. featureCounts: An efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2013).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (550), 1-21 (2014).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
- Hunt, G. P., et al. GEOexplorer: A webserver for gene expression analysis and visualisation. Nucleic Acids Research. , (2022).
- Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1-12 (2005).
- Di Paolo, A., et al. PDCD4 regulates axonal growth by translational repression of neurite growth-related genes and is modulated during nerve injury responses. RNA. 26 (11), 1637-1653 (2020).
- Smircich, P., et al. Ribosome profiling reveals translation control as a key mechanism generating differential gene expression in Trypanosoma cruzi. BMC Genomics. 16 (1), 443 (2015).
- Eastman, G., Sharlow, E. R., Lazo, J. S., Bloom, G. S., Sotelo-Silveira, J. R. Transcriptome and translatome regulation of pathogenesis in Alzheimer's disease model mice. Journal of Alzheimer's Disease. 86 (1), 365-386 (2022).
- Zanetti, M. E., Chang, I. -F., Gong, F., Galbraith, D. W., Bailey-Serres, J. Immunopurification of polyribosomal complexes of Arabidopsis for global analysis of gene expression. Plant physiology. 138 (2), 624-635 (2005).
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18843-11848 (2009).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 16 (11), 651-664 (2015).
- Eastman, G., Smircich, P., Sotelo-Silveira, J. R. Following ribosome footprints to understand translation at a genome wide level. Computational and Structural Biotechnology Journal. 16, 167-176 (2018).
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 618-630 (2012).
